CN103074426A

CN103074426A - 一种鸡Pax7基因31 bp indel多态性的快速检测方法及其应用

Info

Publication number: CN103074426A
Application number: CN2013100021709A
Authority: CN
Inventors: 康相涛; 张锁; 韩瑞丽; 王乐乐; 田亚东; 孙桂荣; 李国喜; 蒋瑞瑞
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2013-01-05
Filing date: 2013-01-05
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2033-01-05
Also published as: CN103074426B

Abstract

本发明公开了一种鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法及其应用，其中检测方法包括以下步骤：根据鸡Pax7基因的第3外显子及第3内含子的基因序列，设计一对引物，然后进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳检测该基因31bp indel多态性，当第3内含子31bp插入时为II基因型，31bp缺失时为DD基因型，该位点为杂合的个体时，为ID基因型。同时，本发明利用检测结果与鸡经济性状进行关联性分析，用于鸡的辅助选择和分子育种。本发明方法检测DNA大片段时不仅分辨率高，检测灵敏，判型准确，且操作简单，节约时间、成本低，可广泛推广。

Description

一种鸡Pax7基因31 bp indel多态性的快速检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法，同时还涉及该快速检测方法的应用，属于分子遗传学领域。

背景技术

动物为人类提供了稳定的蛋白来源，是人类生活所必需的物质基础。随着肉禽业禽类生长速度的提高和饲料效率的选育，肉禽的生产性能得到了很大的提高，但同时也产生了使肉质性状下降的负面影响，如腹脂的过多沉积，风味的降低，肌纤维直径变粗、嫩度下降等。我国是养鸡和鸡肉消费大国，随着人们生活水平的提高，人们对鸡肉的需求不仅仅是产量，更重要的是其风味和适口性。因此，在鸡的生长速度、产蛋率得以改善的同时，如何提高鸡肉品质已成为家禽育种工作者的新目标。Pax7基因是Pax基因家族中的III组，参与机体中枢神经和骨骼肌的发育过程，在骨骼肌的发育和再生过程中起着至关重要的作用。同时，Pax7基因对于肌肉的生成及分化都发挥着非常重要的作用，影响动物的生长性状。然而，目前，关于Pax7基因多态性的研究比较少，在鸡上还没有Pax7基因多态性的相关报道。

单核苷酸多态性即SNPs（Single Nucleotide Polymorphisms）是指在基因组DNA序列上单个核苷酸（A，G，C，T）的变化，包括置换、颠换、缺失和插入，从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不同的变化形式，但实际上发生的只有转换和颠换。SNPs是继限制性酶切片断长度多态性（RFLP）以及可变数串联重复序列（VNTR）和微卫星多态性（SSR）之后的新一代多态性遗传标记，自1994年第一次被提出之后，它渐渐成为了与分子标记有关的各领域研究的焦点。对于单个碱基的转换（以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤）以及颠换（嘌呤与嘧啶互换）所引起多态性的检测方法，最常见的有单链构象多态技术（SSCP）、PCR-RFLP和直接测序技术等。但SSCP操作繁琐、耗时长，影响因素较多，且实验过程中存在假阴性问题，所以，并非理想的SNP检测手段；普通的PCR-RFLP方法要求待测多态性位点是某一特定酶切位点，应用范围局限；直接测序技术成本较高。且上述方法不适用于基因组DNA几十个碱基的插入/缺失多态的检测，对于基因组DNA序列插入缺失的检测，许多研究运用了PCR-RFLP方法或PCR与聚丙烯酰胺电泳检测相结合的方法，PCR-RFLP方法需要一种针对突变位点的特殊的内切酶，且酶切产物最终还需用琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳检测，成本较高，耗时长。PCR与聚丙烯酰胺检测的方法可以检测基因几个碱基序列的插入/缺失，但对于几十个bp的插入/缺失来说，实验操作复杂，耗费时间长。总之，需要探索一种快速检测基因组DNA序列中几十个核苷酸插入/缺失多态的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法，包括以下步骤：

1）根据鸡Pax7基因的第3外显子及第3内含子的基因序列，设计一对引物；

2）以包含鸡Pax7基因的DNA序列为模板，利用步骤1）设计的引物，进行PCR扩增；

3）通过琼脂糖凝胶电泳检测鸡Pax7基因31bp indel的核苷酸多态性，当第3内含子包含31bp插入时，PCR扩增产物为一条带，条带大小为588bp，命名为II基因型；当第3内含子31bp缺失时，PCR扩增产物为一条带，条带大小为557bp，命名为DD基因型；当该位点为杂合的个体时，PCR扩增产物为两条带，条带大小分别为588bp和557bp，命名为ID基因型。

所述31bp indel位点位于鸡Pax7基因序列的第3194-3224区域，其中鸡Pax7基因序列的GenBank登录号：NC_006108。

所述一对引物为：

上游引物：5'-CTTTTTCTCTCTCCCCTTCC-3′；

下游引物：5'-CAGACCCTCAGCACAACTCA-3′。

PCR扩增反应体系为：包含鸡Pax7基因序列的DNA50ng，10μmol/L的上下游引物各1.0μL，2×Taq PCR Master Mix12μL，灭菌超纯水10.5μL。

PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，72℃退火、延伸60s，72℃充分延伸10min，其中，变性、退火、延伸循环30次。

所述琼脂糖凝胶电泳检测所用的琼脂的质量分数为1.5-2%。

本发明的目的还在于提供一种鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法的应用。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法的应用，所述的检测方法可用于鸡的辅助选择和分子育种。通过将基因型与鸡的不同性状进行关联性分析，确定基因与性状的对应关系，用于鸡的分子育种。

所述性状为经济性状，包括生长性状、屠宰性状和肉质性状。

鸡Pax7基因31bp indel位于鸡Pax7基因扩增目的片段588bp的364-394位置上（第3内含子），II基因型插入了31bp的‘AAAGTAGGGTCGAGGGGACGTCAGCCCATGG’序列， DD基因型相应位置缺失了31bp的‘AAAGTAGGGTCGAGGGGACGTCAGCCCATGG’序列。在F₂资源群体中，Pax7基因31bp indel的I等位基因频率为0.511，D等位基因频率为0.489。Pax7基因31bp indel多态性与鸡经济性状的关联性分析表明：31bp indel多态性与鸡的大部分重要生产性状有显著关联，I等位基因即31bp的插入利于鸡的生长，D等位基因即31bp的缺失不利于鸡的生长发育，但有利于提高肉质质量。

本发明采用PCR与琼脂糖凝胶电泳结合的方法，检测Pax7基因中31bp indel的多态性，相对于PCR-RFLP方法，节约了购买内切酶的成本，且大大节约了酶切的时间；又克服了聚丙酰胺凝胶电泳实验操作复杂的局限性。本发明的检测方法检测DNA大片段时不仅分辨率高，检测灵敏，判型准确，且操作简单，节约时间、成本低，可广泛推广。因此，PCR-琼脂糖凝胶电泳方法是一种检测基因组DNA序列几十个核苷酸插入缺失的非常理想的遗传标记方法。

本发明的检测方法是一种在DNA水平上筛查和检测与鸡生长性状密切相关的分子遗传标记，以用于鸡的辅助选择和分子育种，对提高鸡的生长性状具有重要的作用。

附图说明

图1为鸡Pax7基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为鸡Pax7基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为鸡Pax7基因31bp插入基因型测序图，其中箭头下划线部分表示‘AAAGTAGGGTCGAGGGGACGTCAGCCCATGG’序列的插入；

图4为鸡Pax7基因31bp缺失基因型测序图，其中箭头处表示‘AAAGTAGGGTCGAGGGGACGTCAGCCCATGG’序列的缺失；

图5为鸡Pax7基因31bp indel基因型序列分析图。

具体实施方式

动物材料：固始鸡、安卡鸡

固始鸡属于我国黄鸡类型的一种优良地方品种，它以固始县为中心，在非凡的生态环境和饲养条件下，经过长期闭锁繁衍而自然形成。固始鸡是蛋肉兼用型鸡种，具有优良的性状：一是耐粗饲，抗病力强，适宜野外放牧散养；二是肉质细嫩，肉味鲜美，汤汁醇厚，营养丰富，具有较强的滋补功效；三是母鸡产蛋较多，蛋大，蛋清较稠，蛋黄色深，蛋壳厚，耐贮运。

安卡肉鸡是当今世界优良的肉用鸡种之一，也是目前国内生长速度最快的红黄羽肉鸡，具有适应性强，耐应激，长速快，饲料报酬高等特点。

动物的培育：

本发明所用固始鸡-安卡鸡资源群按F-2远缘半同胞设计方案组建，试验共建立7个家系，其中正交系4个为

反交系3个为固始鸡

F₀代是从蛋肉兼用型固始鸡和肉用型安卡鸡纯系中分别选取种鸡，按公母鸡1：6比例配组而成，要求所选公母鸡具有本品种特征，产蛋量高，体重中等，血统纯正，以保证F₁代个体在各个位点的杂合。从每个家系的F₁后代中选留一只公鸡，按公母1：9比例与其他家系母鸡交配产生F₂代，要求与配公母鸡之间没有亲缘关系，F₁代的种用母鸡也尽量散布在各个家系中，选种时尽量选择外貌表现丰富，呈现杂合的个体，保证F₂代性状产生较大分离。该群体共包括F₀代42只鸡，F₁代70只鸡，F₂代860只鸡，资源群体中F₂代有完整经济性状的772个个体。具体饲养方法如下：

鸡群饲养于河南农业大学试验鸡场，后期试验在河南农业大学家禽遗传改良实验室完成。鸡群饲养期营养水平：0～4周龄能量水平为12.40MJ/kg，蛋白质水平为20.1%；5～8周龄能量水平为12.70MJ/kg，蛋白质水平为18.2%；9～12周龄能量水平为12.75MJ/kg，蛋白质水平16.0%。各家系混群，笼养，自由采食，充足饮水。

实施例1、鸡基因组DNA的提取、纯化

1、鸡基因组DNA的提取

以固始鸡-安卡鸡资源群体F₂代共772只鸡为材料，抽取每只鸡的颈静脉血5mL，装入离心管中，在室温下倾斜放置30min，待有血清析出后放入离心机中，以3000r/min的速度离心30min，分离出血清后，置于-80℃冰箱中保存备用。

采用酚氯仿抽提法从F₂代资源群体血液样本中提取基因组DNA，溶于TE中，4℃保存备用，具体方法如下：

2、基因组DNA的纯化

1）500μL的DNA溶液中加入10%SDS使其终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL，5℃保温10h左右。

2）加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和氯仿分别抽提一次。

3）12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

4）加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

5）倒掉液体，70%乙醇洗涤后凉干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3、琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA

1）将凝胶电泳槽洗干净，插上梳子。

2）称取0.30g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入1×TAE30mL使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾2次拿出。

3）迅速向另一个三角瓶加入EB溶液至终浓度为0.5μg/mL，然后快速将琼脂糖溶液倒入，轻微摇动，防止出现气泡。

4）完全冷却凝固后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸，将凝胶移入电泳槽中。

5）取DNA样品2～4μL，加2μL上样缓冲液后混匀，统一上样，120V电压电泳30min。

6）在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解不能用，需重新提取相应样品的DNA。

本发明的鸡基因组DNA的检测结果如图1所示。从图1中可以看出，本发明提取的鸡基因组DNA的质量非常高。

4、分光光度法检测基因组DNA浓度

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如果OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度（ng）=50×OD₂₆₀值×稀释倍数

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至100ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

实施例2、PCR扩增

1、PCR扩增引物

以鸡Pax7基因在Genbank中的基因组序列（登录号为NC006108）为参考，利用Primer5.0设计鸡Pax7基因第3外显子及第3内含子片段PCR引物，其引物序列如下：

上游引物：5'-CTTTTTCTCTCTCCCCTTCC-3′；

下游引物：5'-CAGACCCTCAGCACAACTCA-3′。

2、PCR扩增反应体系

以固始鸡-安卡鸡资源群体F₂代共772只鸡基因组DNA为模板，在Taq PCR Master Mix存在的情况下，利用设计的PCR扩增引物，进行PCR扩增。PCR反应体系见表1：

表1PCR反应体系

组分	加入量
		灭菌超纯水（H₂O）	10.5μL
2×Taq PCR Master Mix	12.0μL
		上游引物（10μmol/L）	1.0μL
下游引物（10μmol/L）	1.0μL
		DNA模板（100ng/μL）	0.5μL
总体积	25.0μL

3、PCR扩增反应程序

PCR扩增反应程序见表2：

表2PCR反应程序

程序名称	温度	时间
			预变性	95℃	5min
变性	94℃	30s
			退火、延伸	72℃	60s
充分延伸	72℃	10min

其中，变性、退火、延伸循环30次。

实施例3、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳检测：

1）制作2.0%的琼脂糖凝胶：称取2g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入1×TAE100mL使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾2次拿出，迅速向另一个三角瓶加入EB溶液至终浓度为5μg/mL，然后快速将琼脂糖溶液倒入，轻微摇动，防止出现气泡。

2）待胶完全冷却凝固后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸，将凝胶移入电泳槽中。

3）取DNA样品3μL，加2μL上样缓冲液后混匀，统一上样，100V电压电泳60min，EB染色。

4）在GBOX凝胶成像系统成像，见图2。

从图2中可以看出，泳道5、6为PCR扩增产物，其片段大小为588bp，与理论设计的大小一致，因此可以证明已成功扩增出鸡Pax7基因第3外显子区域和第3内含子的DNA片段。其中，泳道8：DNA Marker(600，500，400，300，200和100bp)；泳道5、6：PCR扩增产物为一条带，条带大小为588bp，命名为II基因型；泳道3、4：PCR扩增产物为一条带，条带大小为557bp，命名为DD基因型；泳道1、2：PCR扩增产物为两条带，条带大小分别为588bp和557bp，命名为ID基因型。

实施例4、PCR扩增产物测序

选取不同基因型个体的PCR扩增产物进行测序，发现鸡Pax7基因第3内含子中存在31bp indel位点（第3194-3224区域），结果见图3、4、5。图3为鸡Pax7基因31bp插入的测序结果，其中，下划线部分表示‘AAAGTAGGGTCGAGGGGACGTCAGCCCATGG’序列的插入；图4为鸡Pax7基因31bp缺失的测序结果，其中，箭头表示‘AAAGTAGGGTCGAGGGGACGTCAGCCCATGG’序列的缺失；图5为鸡Pax7基因31bp indel基因型序列分析图，图5可以看出，在Pax7基因扩增目的片段588bp的364-394位置上（第3内含子）发生了31bp indel。测序结果与琼脂糖凝胶电泳判别的基因型完全相同，证实了本检测方法的有效性和准确性。

鸡Pax7基因31bp indel位点的基因型频率统计分析

本方法检测的基因，其结果是共显性等位基因，故表型频率与基因型频率一致。

等位基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率，取值在0-1之间。

Pi＝[2（ii）＋（ij1）＋（ij2）＋………＋（ijn）]/2N

Pi：第i个等位基因频率；

i：为纯合复等位基因；

j1、j2、………jn：与i共显的第1到第n个等位基因。

基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的相对比率。

基因型频率＝基因型个体数/测定群体总数

对F₂资源群体中Pax7基因31bp indel位点的基因型频率统计分析结果见表3。表3结果显示，在F₂资源群体中，Pax7基因31bp indel的I等位基因频率为0.511，D等位基因频率为0.489。

表3F₂资源群体中Pax7基因31bp indel等位基因的频率分布表

鸡Pax7基因31bp indel多态性与鸡经济性状的关联分析

关联分析样本：资源群体中体F₂代有完整经济性状的772个个体。

基因型数据：II型，ID型，DD型。

经济性状57项：33项生长性状，13项屠宰性状，11项肉质性状。

经济性状测定方法如下：每2周测定体重、每4周测量体尺指标，饲喂至12周龄时屠宰。宰前停料12小时（不停水）后称重，测定屠宰指标及肉质指标共57项指标。33项生长性状包括0，2，4，6，8，10，12周体重；4，8，12周胫长、胫围、胸角度、骨盆宽、体斜长、胸宽、胸深、胸骨长等。13项屠宰指标包括宰前活重、屠宰重、全净膛重、半净膛重、胸肌重、腿肌重、脂肪带宽、皮下脂厚、头重、肝重、心脏重、肌胃重、脾重等；11项肉质性状包括胸腿肌pH、剪切值、系水力、肌纤维密度、肌纤维直径、胸肌肌内脂肪含量等。

关联分析模型：利用SPSS（17.0）软件分析基因位点与经济性状的相关性。确保每个性状数据呈正态分布，再利用最小二乘法分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应和benferroni多重比较法比较各基因型间的差异，结果见表4、5。

表4F₂资源群体中Pax7基因31bp indel多态性与鸡生长性状的关联分析

注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

其中，BW2，BW4，BW6，BW8，BW10和BW12为2，4，6，8，10，12周体重；SL4，SL8和SL12为4，8，12周胫长；SG4，SG8和SG12为4，8，12周胫围；CD4，CD8和CD12为4，8，12周胸宽；CW4，CW8和CW12为4，8，12周胸深；BBL4，BBL8和BBL12为4，8，12周胸骨长；PB4，PB8和PB12为4，8，12周骨盆宽；BSL4，BSL8和BSL12为4，8，12周体斜长。

表5F₂资源群体中Pax7基因31bp indel多态性与鸡屠宰肉质性状的关联分析

注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

其中，SEW=半净膛重；EW=全净膛重；CW=屠宰重；LW=肝重；HW=心脏重；GW=肌胃重；SW=脾重；BMW=胸肌重；LMW=腿肌重；FDL=腿肌纤维直径；FDB=胸肌纤维直径；LFD=腿肌纤维密度；BFD=胸肌纤维密度。

表4、5结果表明：31bp indel多态性与鸡的4、6、8、10和12周体重，8和12周的胫长、胫围、胸宽、胸骨长、骨盆宽和体斜长等生长性状，与屠宰重、半净膛重、全净膛重、心脏重，肌胃重和脾重等屠宰性状，与胸肌纤维直径、胸肌纤维密度和腿肌纤维密度等肉质性状都达到了极显著的相关水平(P<0.01)，与8周胸深达到了显著的相关水平(P<0.05)。II基因型个体生长性能和屠宰性能显著的高于DD基因型个体，由胸腿肌纤维直径和密度可知，DD基因型的肌纤维直径小，密度大，即肉的嫩度较好，可推测DD基因型个体的肉质质量好于II基因型个体。由此看出，31bp indel多态性与鸡的大部分重要生产性状有显著关联，I等位基因即31bp的插入利于鸡的生长，D等位基因即31bp的缺失不利于鸡的生长发育，但有利于提高肉质质量。

Claims

1.一种鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法，其特征在于，所述31bp indel位点位于鸡Pax7基因序列的第3194-3224区域，其中鸡Pax7基因序列的GenBank登录号：NC_006108。

3.根据权利要求1所述的一种鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法，其特征在于，所述一对引物为：

上游引物：5'-CTTTTTCTCTCTCCCCTTCC-3'；

下游引物：5'-CAGACCCTCAGCACAACTCA-3'。

4.根据权利要求1所述的一种鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为：包含鸡Pax7基因序列的DNA50ng，10μmol/L的上下游引物各1.0μL，2×Taq PCR Master Mix12μL，灭菌超纯水10.5μL；

5.根据权利要求1所述的一种鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳检测所用的琼脂的质量分数为1.5-2%。

6.一种如权利要求1所述的鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法的应用，其特征在于，所述的检测方法可用于鸡的辅助选择和分子育种。

7.根据权利要求6所述的一种鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法的应用，其特征在于，通过将基因型与鸡的不同性状进行关联性分析，确定基因与性状的对应关系，用于鸡的分子育种。

8.根据权利要求6所述的一种鸡Pax7基因31bp indel多态性的快速检测方法的应用，其特征在于，所述性状为经济性状，包括生长性状、屠宰性状和肉质性状。