CN114350820B - 一种与猪胴体性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与猪胴体性状相关的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与猪胴体性状相关的分子标记及其应用,属于猪分子标记制备领域。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,该序列的第371bp处存在A/G碱基突变;SEQ ID NO:1所示序列的第371bp处存在AA、AG或GG三种基因型,其中A等位基因为优势等位基因。本发明还提供了用于检测该位点的引物对,并建立了相应的检测方法,为猪胴体品质的遗传改良提供了新的分子标记,实现了对猪胴体性状进行早期选择;检测方法高效、准确,从而加速了猪遗传改良的进程,提高了猪育种的经济效益。

Description

一种与猪胴体性状相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及猪分子标记制备领域,特别是涉及一种与猪胴体性状相关的分子标记及其应用。
背景技术
猪胴体性状一直是猪重要的经济性状,是遗传改良的目标性状之一。胴体性状主要有屠宰率、内脂率、背膘厚、瘦肉率、眼肌面积等。屠宰率和胴体瘦肉率高的猪能带来更高的经济效益。由于胴体性状无法进行活体测定,常规育种方法对这类性状的改良无法实施个体选择,往往采用同胞选择进行改良,其改良效果不佳。分子标记辅助选择(Marker-assisted sel ection,MAS)的出现大大加速了猪育种的进程,它是利用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行选择育种,具有快速、准确、不受环境影响等优点,不仅能大大减少育种的人力物力消耗,而且能缩短育种时限。
用于MAS的分子标记包括蛋白质标记,微卫星标记,单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,简称SNP)标记等。SNP标记指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性,包括碱基转换、颠换、缺失或插入等。随着猪基因组测序和高密度SNP的开发,发掘了一些与猪胴体性状相关的基因和SNP标记,然而,仍缺少功能明确、效应显著且可直接用于育种的与胴体性状相关的SNP标记。因此,有必要深入挖掘与猪胴体性状相关的SNP分子标记,以利用其选育高品质猪肉的猪种,实现我国猪育种理论和技术水平的提升。
胞质5′核苷酸酶1A(cytosolic 5'-nucleotidase 1A,NT5C1A)基因,在人的骨骼肌和小鼠的胫骨前肌表达量较高(Hunsucker et al.,2001;Sala-N ewby et al.,1999);抗NT5C1A自身抗体可以作为包涵体肌炎(一种肌肉疾病)的标记物(Amlani et al.,2019)。迄今为止,尚无有关NT5C1A基因作为猪胴体性状分子标记的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种与猪胴体性状相关的分子标记及其应用,以解决上述现有技术存在的问题,为猪胴体性状的分子标记辅助育种提供一种新的分子标记,以缩短育种进程,提高育种效率。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种与猪胴体性状相关的分子标记,所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,该序列的第371bp处存在A/G碱基突变。
优选的是,SEQ ID NO:1所示序列的第371bp处存在AA、AG或G G三种基因型,其中A等位基因为优势等位基因。
本发明还提供一种扩增所述的分子标记的引物对,所述引物对包括如SEQ ID NO:2所示的上游引物和如SEQ ID NO:3所示的下游引物。
本发明还提供一种检测猪胴体性状的试剂盒,包括所述的分子标记,或者所述的引物对。
本发明还提供一种检测猪胴体性状的方法,包括如下步骤:
步骤1:以待测猪个体的DNA为模板,利用权利要求3所述的引物对扩增,获取扩增产物;
步骤2:对所述扩增产物进行测序,并使用基因分析软件对测序结果进行基因分型。
优选的是,扩增体系为:DNA模板100ng、PCR mix 25μL、上游引物和下游引物各1μL、加ddH2O补至总体积50μL。
优选的是,扩增程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,58℃退火35s,72℃延伸35s,35个循环;72℃延伸10min;4℃保存。
本发明还提供所述的分子标记,或者所述的引物对,或者所述的试剂盒,或者所述的方法在辅助猪育种中的应用。
本发明公开了以下技术效果:
本发明发掘了与猪性状关联的分子标记,位于猪NT5C1A基因3′UTR,该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,序列长度为518bp,在该序列中第371bp处存在一处A/G碱基突变,其与屠宰率、花油重、内脂率、臀部膘厚和平均背膘厚具有显著的相关性(P<0.05),其中,AA基因型个体屠宰率显著高于AG和GG基因型个体(P<0.05);AA基因型个体的花油重、内脂率、臀部膘厚和平均背膘厚都显著低于AG和GG基因型个体(P<0.05),并且A等位基因对提高屠宰率和臀部膘厚具有显著的加性效应(P<0.05)。本发明首次发掘了该分子标记,并与猪胴体性状相关联,实现了对猪胴体性状进行早期选择;检测方法高效、准确,从而加速了猪遗传改良的进程,提高了猪育种的经济效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明猪NT5C1A基因SEQ ID NO:1序列片段琼脂糖凝胶电泳图,其中M为100bp DNA Ladder(分子量标准,从下至上依次为100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,1000bp和1500bp),1、2表示扩增的DNA片段,片段大小为518bp;
图2为本发明中筛选的SNP位点的测序图谱,其中箭头表示突变位点。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1猪NT5C1A基因SNP检测片段的获得及检测方法的建立
1、猪基因组DNA的提取
试验猪品种为硒都黑猪和法系大白猪,样品均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所种猪场提供。
猪基因组DNA采用北京天根生化科技有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒(货号:DP348)进行提取,具体步骤参照试剂盒说明书。对提取出的DNA进行浓度和质量检测,置于-20℃下保存备用。
2、猪NT5C1A基因SNP遗传标记检测片段的获得
(1)PCR扩增
根据猪NT5C1A基因(GenBank ID:NC_010448)的基因组序列,设计扩增如SEQ IDNO:1所示序列(包括SNP位点)的引物对:
正向引物(SEQ ID NO:2):5′-GCACATCTTCTTTGACGACCAG-3′,
反向引物(SEQ ID NO:3):5′-AGAGCTTAGAAGCCAGATCCC-3′。
SEQ ID NO:1如下:
序列中标注N的为突变位点,标有下划线(括号中为突变碱基),在该序列的首尾加粗显示为引物序列位置。
以硒都黑猪和法系大白猪基因组DNA为模板,利用上述引物进行PCR扩增,PCR反应体系50μL,体系中各组分为:基因组DNA 100ng、PCR mix 25μL、正反向引物各1μL、加ddH2O补至总体积50μL。
PCR的运行程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,58℃退火35s,72℃延伸35s,35个循环;72℃延伸10min;4℃保存。
PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果如图1所示,成功扩增出预期的片段,片段大小为518bp。
(2)PCR产物纯化
用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒(货号:B6 10353)对上述PCR扩增产物进行纯化,具体步骤见试剂盒说明书。
3、利用PCR产物直接测序法检测分子标记
将上述获得的PCR纯化产物直接送到北京奥科公司进行测序,根据测序结果判定该位点在检测群体中的基因型。利用Chromas软件进行分析,结果如图2所示,发现在该序列中的第371bp存在一处A/G等位基因突变,引起NT5C1A基因的多态性。
实施例2分子标记在不同猪群中的多态性分布检测
本实施例分别在硒都黑猪和法系大白猪群体中,检测猪NT5C1A基因SEQ ID NO:1的371bp处的A/G位点的多态性,检测结果如表1所示。
表1 NT5C1A基因3′UTR区371A/G多态性在不同猪群中的分布
由表1结果可知,NT5C1A基因3’UTR的371A/G位点在不同猪群中均表现为三种基因型,在国外猪种中A等位基因占主要优势,中国地方猪品种中G等位基因占主要优势,中、外猪品种中存在显著差异。
实施例3克隆的分子标记与猪胴体性状的关联分析及应用
为了确定猪NT5C1A基因3′UTR的371A/G多态性与猪胴体性状是否相关,选择404头法系大白猪×硒都黑猪F2代资源群体为试验材料,采用实施例1建立的方法进行多态性检测,采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 9.1)GLM程序进行单标记方差分析,分析猪NT5C1A基因3′UTR的371A/G位点三种基因型与猪胴体性状的相关关系,所采用模型为:
Yijkl=μ+Gi+Sj+Nk(+bijkXijk)+eijkl
Yijkl为性状表型值,μ为平均值,Gi为基因型效应,Sj为性别效应、Nk为年度效应,bijk为屠宰体重的回归系数,胴体性状以屠宰体重为协变量,eijkl为残差效应。
关联分析结果如表2所示。
表2猪NT5C1A基因3′UTR区371A/G多态性与胴体性状的关联分析
注:以上数值为最小二乘均值±标准误;同行含有相同字母表示差异不显著,不同小写字母表示差异显著(P<0.05);基因型效应*表示P<0.05。
由表2可知,上述NT5C1A基因3’UTR的371A/G位点与屠宰率、花油重、内脂率、臀部膘厚和平均背膘厚具有显著的相关性(P<0.05)。AA基因型个体屠宰率显著高于AG和GG基因型个体(P<0.05);AA基因型个体的花油重、内脂率、臀部膘厚和平均背膘厚都显著低于AG和GG基因型个体(P<0.05),并且A等位基因对提高屠宰率和臀部膘厚具有显著的加性效应(P<0.05)。由此可见,在猪群体中,选育AA基因型个体,可以从一定程度上为提高屠宰率,降低背膘厚提供切实可行的方案,加速优良猪种的培育进程,提高猪生产企业的经济效益。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种与猪胴体性状相关的分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 518
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcacatcttc tttgacgacc agatgttcca cgtggctggg gctcaggaga tgggcaccgt 60
ggcggcccac gtgccttacg gtgtggcgca gaccccccgg cggaccacac ctacgaagca 120
ggccccctct gcccagtagc tgagccacca gcttcactga ccacatggct ccaggcatgg 180
ctccctgtca catgtgtcat ccagtggccc cttccagttc cccaccaccc tgcctatttg 240
catgtccgcc tgcatcgctg agagtgaggt acttgtagga aattatgcag actgagccgg 300
cattgtcacc agccctcctt ttgggcaaac gctgtgccat gatcctggct aggaaagtaa 360
gactgtgcag ngtagctggg tttcaggggg aagttgatgg gcctgagagt gggagggtca 420
gagcagccag gatgcctcaa aaggggggtt atgagactag ctcagtgtag tataaagaac 480
gctgcttgga gaaagaaggg atctggcttc taagctct 518
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcacatcttc tttgacgacc ag 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagcttaga agccagatcc c 21

Claims (4)

1.一种检测猪胴体性状的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:以待测猪个体的DNA为模板,利用引物对扩增分子标记,获取扩增产物;
步骤2:对所述扩增产物进行测序,并使用基因分析软件对测序结果进行基因分型;
所述引物对包括如SEQ ID NO:2所示的上游引物和如SEQ ID NO:3所示的下游引物;
所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,该序列的第371bp处存在A/G碱基突变,且存在AA、AG和GG三种基因型,其中,AA基因型个体屠宰率显著高于AG和GG基因型个体,AA基因型个体的臀部膘厚和平均背膘厚都显著低于AG和GG基因型个体,AA基因型个体的花油重、内脂率显著低于GG基因型个体。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,扩增体系为:DNA模板100ng、PCR mix 25μL、上游引物和下游引物各1μL、加ddH2O补至总体积50μL。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,扩增程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,58℃退火35s,72℃延伸35s,35个循环;72℃延伸10min;4℃保存。
4.如权利要求1-3中任一项所述的分子标记在辅助猪育种中的应用,其特征在于,所述辅助猪育种为辅助选育猪如下胴体性状:猪屠宰率、花油重、内脂率、臀部膘厚和平均背膘厚。
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