CN103688173A - 肌炎 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于鉴定处于发展特发性炎性肌病的风险中的受试者和/或诊断患有特发性炎性肌病的受试者的方法,优选其中所述特发性炎性肌病是包涵体肌炎。本发明提供了用于研究(自身)抗体在来源于受试者的样品中的存在或不存在的诊断方法、特定抗原的用途以及试剂盒。
Description
发明领域
本发明涉及肌病的领域,特别地涉及包涵体肌炎(IBM)的诊断。特别地,本发明公开了5’-核苷酸酶在肌病(特别地IBM)的诊断中的用途。还提供了监测疾病进展和对治疗的响应的方法,区分炎性肌病的不同亚型的方法,以及用于诊断肌病(特别地包涵体肌炎)的试剂盒。
发明背景
特发性炎性肌病(IIM),也称为肌炎,是(骨骼)肌的自身免疫疾病的总称。皮肌炎(DM)、多肌炎(PM)和IBM是所述特发性炎性肌病的主要亚型(http://www.ninds.nih.gov/disorders/inflammatory_myopathies/detail_inflammatory_myopathies.htm;http://www.myositis.org/template/page.cfm?id=2;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6196/)。
DM是特征在于肌肉炎症和特殊皮疹的肌肉疾病。DM最常见地在5-15岁的儿童和40-60岁的成人中发生。女性比男性更常发生该病况。典型症状包括吞咽困难、肌无力、僵硬或酸痛、紫红色或紫色上眼睑、紫红色皮疹和/或呼吸短促。心脏受累和肺功能障碍是可能的,此外DM与升高的发展癌症的风险相关。利用皮质类固醇和抑制免疫系统的其它药物治疗DM。
PM是相似的病况,但可发生症状而无特定皮疹。其最常见地在年龄50至70岁之间发生,或5至15岁的儿童中发生,且女性患病是男性的2倍。主要治疗方案也是利用皮质类固醇药剂。
IBM是称为炎性肌病的肌肉疾病的第三大亚型。该名称最早由Yunis和Samaha于1971年用于肌病的特殊病例,所述病例在表型上显示慢性PM的存在,但在肌肉活检中显示细胞质空泡和包涵体。
肌无力在IBM中的发作通常是渐进的(经历数月或数年)并且影响近端(靠近身体的躯干)和远端(远离躯干)肌肉。对于一些个体,该病症始于引起捏、按和握物体困难的腕和指的乏力。此外,吞咽困难也在约一半的IBM病例中发生。患者可最终止于轮椅中,且在疾病的更晚期,大部分患者需要许多帮助以进行日常生活。
IBM是在45岁以上的人中最常获得的肌肉疾病,尽管疾病可更早地发生。IBM在男性中比在女性中更常发生并且特征在于肌肉变性和炎症的组合(参见Needham M,Neuromuscul Disord.2008;18:6-16和Amato AA,Journal of neurology,neurosurgery,and psychiatry.2009;80:1186-1193)。与DM和PM相反,IBM通常抗所有疗法,并且其进展速度似乎不受目前可获得的治疗影响。
WO2006115448提出,使用生长激素、其促泌素或其混合物来治愈IBM或抑制与其相关的症状。
已在DM和PM中检测到循环自身抗体(关于综述,参见Mammen AL(2010)Ann N Y Acad Sci1184:134–153和Van Dooren等人(2011)Autoimmun Highlights2:5-20)。这些抗体(例如针对氨酰基-tRNA合成酶的抗体)以不同的流行率存在。肌炎特异性自身抗体(MSA)例如抗-Jo-1和抗-Mi-2与PM和DM中的特定临床表型相关,但仅罕见地发现于IBM中。这一点用于这些病况的诊断。
目前,IBM的诊断依赖于侵入性诊断法,所述方法包括,就边缘空泡和蛋白质包涵体的存在,检查患者的肌肉活检组织或重复进行肌肉活组织检查。由于选择偏爱性的原因,空泡可在活组织检查的肌肉组织中缺失,在该情况下重复的活组织检查是建立诊断所必需的。不幸地,由于活组织检查的错误解释而造成的误诊在区分PM和/或DM与IBM方面造成严重问题。此外,肌肉活组织检查是侵入性方法。这些方面强调了对新型的、更具特异性的和更加患者友好的诊断炎性肌病,特别地诊断IBM和区分其与PM和/或DM的方法的需要。人受试者的正确亚型的确立将防止不必要地应用潜在有毒的疗法。
发明概述
本发明人现已将抗原5-核苷酸酶及其片段鉴定为IBM的自身抗体的靶。此外,本发明人已鉴定可用作此类自身抗体的靶和可包含自身抗体所识别的一个或多个表位的5’-核苷酸酶的区域。
因此,在第一方面,本发明涉及用于鉴定处于发展特发性炎性肌病的风险中的受试者和/或诊断患有特发性炎性肌病的受试者的方法,优选其中所述特发性炎性肌病是包涵体肌炎,所述方法包括步骤:
a)提供所述受试者的测试样品;
b)确定抗5’-核苷酸酶抗体是否存在于所述样品中。
可在本发明的方法中确定水平和存在或仅仅存在。所述抗5’-核苷酸酶抗体和/或其片段的存在表明,发展特发性炎性肌病包涵体肌炎的风险或患有所述疾病。同时,所述抗5’-核苷酸酶抗体和/或其片段的存在也表明,不存在发展特发性炎性肌病皮肌炎和/或多肌炎的风险或不患有所述疾病。因此,本发明还提供了用于区分特发性炎性肌病的亚型的方法。
受试者可以是,怀疑处于发生特发性炎性肌病的风险中和/或怀疑患有特发性炎性肌病的的受试者,优选其中所述特发性炎性肌病是包涵体肌炎。
在第二方面,本发明提供了用于监测受试者的包涵体肌炎的进展和/或测定受试者对治疗包涵体肌炎的疗法的响应的方法,所述方法包括步骤:
a)在第一时间点提供所述受试者的第一测试样品,和在第二时间点提供所述受试者的第二测试样品;
b)测定所述第一和第二样品中的抗5’-核苷酸酶抗体的水平;
c)将所述第一样品中的抗5’-核苷酸酶抗体的水平与所述第二样品相比较。
该方法可包括,(d)基于所述第一样品与所述第二样品之间的抗5’-核苷酸酶抗体或其片段的水平的比较,测定所述受试者的包涵体肌炎的进展和/或对治疗包涵体肌炎的疗法的响应。所述受试者的包涵体肌炎的进展和/或对治疗包涵体肌炎的疗法的响应,基于所述第一样品与所述第二样品之间的抗5’-核苷酸酶抗体和片段的水平的比较。
本发明的方法优选是这样的方法,其中5’-核苷酸酶是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB),优选NT5C1A或从其获得的片段。
或者,根据本发明的方法优选为这样的方法,其中5’-核苷酸酶包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的、或与SEQ ID NO:1和/或SEQ IDNO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸。例如,有利地,5’-核苷酸酶可包含一个或多个区域,所述区域可用作自身抗体的靶,和可包含本文中显示的自身抗体的一个或多个表位。此类区域的非限定性实例包括5’-核苷酸酶IA的氨基酸25-50、221-243和341-368的区域。
在本发明的优选方面,提供了方法,其中测定抗5’-核苷酸酶抗体的存在和/或水平的实际步骤是通过测定所述抗体与5’-核苷酸酶和/或与所述5’-核苷酸酶的片段之间的相互作用、结合、缔合来进行的,其中所述片段是具有来源于所述5’-核苷酸酶的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个连续氨基酸的片段。5’-核苷酸酶或片段可来自哺乳动物来源,可以是合成的,或可通过任何方法产生,只要其能够(特异性)识别并且结合可存在于获自包涵体肌炎患者的样品中的(自身)抗体,所述(自身)抗体结合人5’-核苷酸酶,优选NT5C1A或NT5C1B蛋白。一般而言,抗体在样品中的存在的测定,如本文中公开的,优选离体进行,当受试者是人或动物时,体外或非原位进行。
在优选实施方案中,用于测定与抗体的相互作用,或用于测定与抗体的相互作用的片段所源自的5’-核苷酸酶是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB)。在另一个优选实施方案中,用于测定与抗体的相互作用,或用于测定与抗体的相互作用的片段所源自的5’-核苷酸酶,包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的,或与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸。在一个实施方案中,用于测定与抗体的相互作用的5’-核苷酸酶包含一个或多个区域,所述区域可用作自身抗体的靶,和可包含本文中显示的自身抗体的一个或多个表位。此类区域的非限定性实例包括5’-核苷酸酶IA的氨基酸25-50、221-243和341-368的区域。
用于根据本发明的方法的测试样品优选是血液样品,所述血液样品可在测定抗5’-核苷酸酶的(自身)抗体的存在之前,进行进一步处理或纯化。受试者优选是人受试者。
还公开的是,本发明的方法还包括,测定抗至少一种抗原的抗体在测试样品中的存在的步骤,所述抗原选自Mi-2、Ku、PM/Scl-100、PM/Scl-75、SRP、OJ、EJ、PL-12、PL-7、Ro-52、Jo-1、HisRS、ThrRS、AlaRS、GlyRS、IleRS、AsnRS、TyrRS、PheRS、tRNAHis、tRNAAla、Mi-2α、Mi-2β、SRP54、SRP68、SRP72、Tif1-γ、MDA5、SAE1、SAE2、丝氨酸-tRNASec-蛋白质复合物、Ro60、La、U1A、U1C、U1-70k、PMS1、PMS2、Ku70、Ku80、eEF1、核RNP和NXP-2。
上述抗原包含通常在IIM患者中发现的自身抗体的靶。后者包括肌炎相关自身抗体(MAA)(其不是特异性的并且还可发现于其它风湿性障碍中),以及肌炎特异性自身抗体(MSA)(其主要发现于IIM患者中)(参见Van Dooren等人(2011)Autoimmun Highlights2:5-20)。通过测定抗这类另外的抗原的抗体和/或其片段的存在或不存在,进一步改善了受试者的诊断。
在其它方面,本发明涉及5’-核苷酸酶和/或所述5’-核苷酸酶的片段用于检测存在于获自受试者的测试样品中的抗体的用途,其中所述片段是具有至少5个,优选至少6个,更优选至少7,例如8、9、10、11、12、13、14、15或更多个来源于所述5’-核苷酸酶,优选来自上文提及的区域的连续氨基酸的片段。在一个实施方案中,5’-核苷酸酶或片段可来自哺乳动物来源,可以是合成的,或通过任何方法产生,只要其能够(特异性)识别并且结合可存在于获自包涵体肌炎患者的样品中的(自身)抗体,所述(自身)抗体结合人5’-核苷酸酶,优选NT5C1A或NT5C1B蛋白。一般而言,如本文中所公开的,抗体在样品中的存在的测定优选离体进行,当受试者是人或动物时,体外或非原位进行。换句话说,具有来源于所述5’-核苷酸酶的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个连续氨基酸的片段是这样的片段,它们可用于结合存在于获自包涵体肌炎患者的样品中的(自身)抗体或与其相互作用,所述(自身)抗体通常可结合5’-核苷酸酶,从而检测此类抗体在样品中的存在和允许诊断包涵体肌炎。
用于测定与存在于样品中的抗体的相互作用的5’-核苷酸酶或源自其的片段优选是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB)。
或者,用于检测抗体的或用于测定与抗体的相互作用的片段所源自的5’-核苷酸酶包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的、或与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸。
根据上述方面的用途特别地可用于鉴定处于发展特发性炎性肌病的风险中的受试者和/或诊断患有特发性炎性肌病的受试者,其中特发性炎性肌病选自包涵体肌炎、皮肌炎和/或多肌炎,最优选特发性炎性肌病是包涵体肌炎,和/或监测受试者的包涵体肌炎的进展。
在优选实施方案中,测试样品是血液样品。在优选实施方案中,受试者是人受试者。
在最后的方面,本发明涉及试剂盒,其包括用于检测存在于获自受试者的测试样品中的抗5’-核苷酸酶抗体的工具,优选其中5’-核苷酸酶是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB),或包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸,或与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的5’-核苷酸酶。
根据本发明的试剂盒特别地可用于鉴定处于发展特发性炎性肌病的风险中的受试者和/或诊断患有特发性炎性肌病的受试者,优选其中特发性炎性肌病选自包涵体肌炎、皮肌炎和/或多肌炎,最优选特发性炎性肌病是包涵体肌炎,和/或监测受试者的包涵体肌炎的进展。
在一个实施方案中,试剂盒包括用作检测抗5’-核苷酸酶抗体的工具的5’-核苷酸酶,优选其中5’-核苷酸酶是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB),或包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸,或与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的5’-核苷酸酶,或所述5’-核苷酸酶或所述氨基酸序列的片段,其中所述片段是来源于所述5’-核苷酸酶或所述氨基酸序列的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个连续氨基酸的片段。
根据本发明的试剂盒在一个实施方案中是这样的试剂盒,其中将检测抗5’-核苷酸酶抗体的所述5’-核苷酸酶和/或片段附着至媒介物,所述媒介物优选选自适合用于体外免疫测定,优选免疫印迹的膜、珠粒、磁珠、载体、蛋白质-接头。
在一个实施方案中,试剂盒还包括,用于检测抗5’-核苷酸酶抗体的结合的测定,优选所述测定选自分子相互作用测定、ELISA、免疫印迹、微阵列、免疫沉淀、免疫扩散、对流免疫电泳或多重分析技术。
本发明的试剂盒可有利地还包括,用于检测抗至少一种抗原的抗体的工具,所述抗原选自Mi-2、Ku、PM/Scl-100、PM/Scl-75、SRP、OJ、EJ、PL-12、PL-7、Ro-52、Jo-1、HisRS、ThrRS、AlaRS、GlyRS、IleRS、AsnRS、TyrRS、PheRS、tRNAHis、tRNAAla、Mi-2α、Mi-2β、SRP54、SRP68、SRP72、Tif1-γ、MDA5、SAE1、SAE2、丝氨酸-tRNASec-蛋白质复合物、Ro60、La、U1A、U1C、U1-70k、PMS1、PMS2、Ku70、Ku80、eEF1、核RNP和NXP-2。例如,试剂盒可以以与上述对于5’-核苷酸酶所述的方式相同的方式包括这些抗原或其片段。这些工具例如抗原或其片段在试剂盒中与上述检测抗5’-核苷酸酶(自身)抗体的存在的工具一起的组合允许检测存在于样品中的一组抗体。如果样品来源于受试者,则这允许改善受试者的诊断,并且显著减少误诊或获得的数据的误解的概率。
一般定义
在下列描述和实施例中,使用许多术语。为了提供对说明书和权利要求(包括赋予此类术语的范围)的清楚一致的理解,提供下列定义。除非本文中另外定义,否则使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的含义相同的含义。将所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料的公开内容通过引用整体并入本文。
在本文及其权利要求中,动词"包含"及其变化形式以其非限定意义使用,意指单词之后的项被包括,但不排除未明确提及的项。该术语还涵盖“基本上由……组成”和“由……组成”。此外,除非上下文明确要求存在一个并且仅存在一个元素,否则通过不定冠词“一种/一个(a)”或“一种/一个(an)”提及的元素不排除存在超过一个元素的可能性。不定冠词"一种/一个(a)"或“一种/一个(an)”从而通常意指“至少一个”。还应理解,当在本文中提及“序列”时,其通常是指具有某一亚单位(例如,氨基酸)序列的实际物理分子。
术语“和/或”表示,可发生一个或多个所述情况。换句话说,所述情况可单独发生,或与所述情况的至少一个,直至与全部所述情况组合地发生。术语“和/或”公开单独的各个所述情况,以及所述情况与至少一个其它所述情况的特定组合,直至所有所述情况的组合。
本文中使用的术语“抗体”是指,任何免疫球蛋白或其片段,包括含有具有至少一个互补决定区(CDR)的抗原结合位点的任何多肽。该术语包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体、单链抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植抗体和体外产生的抗体。术语“抗体”还包括抗体片段例如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原结合功能的包含CDR的其它抗体片段或其它构建体。通常地,这样的片段包含抗原结合结构域。此类抗体的制备的细节及其用作结合成员(特别地特异性结合成员)的适合性对于本领域技术人员来说是公知的。
抗体或其片段可以具有任何已知的抗体同种型及其构象,例如,IgA例如IgA1或IgA2、IgD、IgE、IgG例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4或IgM种类,或可以以任意组合构成其混合物,例如来自IgG1和IgG2a种类的抗体的混合物。
术语"合成的"意指非天然存在的、通过基因工程、合成、计算机化、文库筛选等体外、离体或体内产生的材料。"合成的"还包括人工材料,其代表天然存在的材料的全部或部分,任选地包含修饰结构或部分。
基因意指任何编码核酸分子。术语"基因"不仅包括基因组DNA,而且还包括cDNA、合成DNA、RNA等。
术语蛋白质与“多肽”可互换使用,并且意指包含氨基酸或氨基酸链(任选地修饰的、糖基化的等)的任何分子。
术语抗原(或抗原性分子)意指,针对其寻求或获得免疫应答的任何分子例如蛋白质、多肽、肽、脂质、核酸、多糖、表位等,或编码它们的核酸。
在本发明的背景中,片段是来源于或存在于蛋白质(在相同的序列中连续的、彼此相邻的)中的至少5个,优选6个,更优选7个连续氨基酸的部分(或编码这些氨基酸序列的核酸),其可用作抗原,即,可被识别所述蛋白质(其连续包含所述至少5个,优选6个,更优选7个氨基酸)的抗体识别。这样的片段可包含完整蛋白质抗原的至少部分,但优选表位(也称为抗原决定簇),即,被免疫系统/抗体的互补位识别的完整蛋白质抗原的部分。例如,如果抗原包含100个氨基酸,并且氨基酸50-58形成被抗体识别的表位,则抗原的片段优选为包含氨基酸序列50-58的片段。本领域技术人员理解,氨基酸片段可在C末端和/或N末端上侧翼连接其它化合物,例如其它氨基酸,即使这样的氨基酸原来不侧翼连接从其获得片段的抗原中的所述片段。
核苷酸酶是催化核苷酸水解成核苷和磷酸的水解酶。例如,它们将腺苷一磷酸转化成腺苷,和将鸟苷一磷酸转化成鸟苷。5'核苷酸酶从核酸的糖部分的5'末端切除磷酸。取决于它们的底物偏好和亚细胞定位,它们被分类成不同的种类。膜结合5'核苷酸酶显示针对腺苷一磷酸的特异性,并且主要参与预先形成的核苷酸的废物利用,和参与牵涉嘌呤能受体的信号转导级联。已知可溶性5'核苷酸酶全都属于酶的卤代酸脱卤素酶超家族。一个实例是NT5C1A,5'-核苷酸酶,细胞溶质IA(HGNC:17819),有时也称为AMP-特异性5'-NT"、CN-I、CN-IA、CN1、CN1A、"细胞溶质5'核苷酸酶,1A型"、"细胞溶质5'-核苷酸酶IA"、MGC119199或MGC119201,其由具有GenBank ID:AF331801.1的基因编码,并且为具有368个氨基酸的蛋白质。其在骨骼肌中高表达,并且在心脏、脑、肾和胰腺中以中等水平被检测到。其属于5'-核苷酸酶3型家族。另一个实例是NT5C1B,5'-核苷酸酶,细胞溶质IB(HGNC:17818),有时也称为AIRP,自身免疫不育相关蛋白质、细胞溶质5'-核苷酸酶IB或CN-IB,其由具有GenBank ID:AF356185.1的基因编码,并且为具有610AA的蛋白质。其在睾丸、胎盘和胰腺中高表达。其以更低的水平在心脏、肾、肝和肺中被检测到。关于进一步的详细内容,参见http://www.genenames.org/data/hgnc_data.php?match=NT5C1A或http://www.genenames.org/data/hgnc_data.php?match=NT5C1B。
"序列同一性"和"序列相似性"可通过使用全局或局部比对算法(取决于两个序列的长度),进行两个肽或两个核苷酸序列的比对来测定。具有相似长度的序列优选使用全局比对算法(例如Needleman Wunsch)来比对,所述算法将序列在整个长度上最佳地比对,然而长度显著不同的序列优选使用局部比对算法(例如Smith Waterman)来比对。当序列(当使用缺省参数,通过例如程序GAP或BESTFIT最佳地比对时)共有至少一定的最小百分比序列同一性(如下文中定义的)时,则它们可称为“大体上同一的”或“基本上相似的”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法来在它们的整个长度(全长)上比对两个序列,使匹配的数目最大化并且使缺口的数目最小化。全局比对适合用于测定具有相似长度的两个序列的序列同一性。一般地,使用GAP缺省参数,缺口产生罚分=50(核苷酸)/8(蛋白质),和缺口延伸罚分=3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸,使用的缺省评分矩阵是nwsgapdna,对于蛋白质,缺省评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS89,915-919)。序列比对和百分比序列同一性的评分可使用计算机程序例如GCG WisconsinPackage,10.3版(可从Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,CA92121-3752USA获得)或使用开源软件例如EmbossWIN2.10.0版中的程序"needle"(使用全局Needleman Wunsch算法)或"water"(使用局部Smith Waterman算法),使用与上述GAP相同的参数,或使用缺省设置(对于'needle'和对于'water'以及对于蛋白质比对和DNA比对,缺少缺口开放罚分为10.0并且缺省缺口延伸罚分为0.5;缺省评分矩阵是Blossum62(对于蛋白质)和DNAFull(对于DNA))来测定。当序列在整个长度上显著不同时,局部比对,例如使用Smith Waterman算法,是优选的。或者,百分比相似性或同一性可通过使用算法例如FASTA、BLAST等搜索公共数据库来测定。
提及的序列
SEQ ID NO:1:NT5C1A的氨基酸序列
SEQ ID NO:2:NT5C1B的氨基酸序列
发明详述
本发明人现已将5’-核苷酸酶鉴定为IBM的(自身)抗体的靶分子。IBM的组织病理学特征在于,变性和自身免疫性特征,并且本发明人现已发现,44kDa的骨骼肌抗原为IBM的自身抗体的靶。与DM和PM中的抗原的反应性分别为0%和2%。该抗原被鉴定为5’-核苷酸酶(参见下文)并且可用于检测存在于获自患有IBM的受试者的样品中的抗体。此外,所述新型IBM特异性自身抗体还可用作生物标志物来帮助诊断IBM。例如,纯化的(重组)5’核苷酸酶或源自该蛋白质的合成肽现可有利地在诊断测试中用于生物分子相互作用测定,以检测抗-5’-核苷酸酶抗体。
目前,肌炎的几个血清学测试是商购可得的,但这些测试全都不存在IBM特异性标志物。实例是Euroline肌炎印迹测定和肌炎+测试,它们分别由Euroimmun(http://www.euroimmun.com/)和Orgentec(http://www.orgentec.com/)开发。5’-核苷酸酶在这些测试中用作IBM特异性标志物的实施现允许容易且直接地诊断IBM。还可容易地开发和标准化使用5’-核苷酸酶(或来源于其序列的肽)的ELISA测试。
因此,在第一方面,提供了用于鉴定处于发展特发性炎性肌病的风险中的受试者和/或诊断患有特发性炎性肌病的受试者的方法,优选其中所述特发性炎性肌病是包涵体肌炎,所述方法包括步骤:
a)提供所述受试者的测试样品;
b)确定抗5’-核苷酸酶抗体是否存在于所述样品中。
本发明人现已令人惊讶地首次发现,可通过分析抗5’-核苷酸酶(自身)抗体在获自受试者的样品中的存在来诊断患有包涵体肌炎或处于发展所述疾病的风险中的受试者。同时已发现,这些(自身)抗体实际上不存在于获自患有其它特发性炎性肌病(包括皮肌炎和/或多肌炎)或处于发展所述其它特发性炎性肌病的风险中的受试者的样品中。换句话说,本发明可用于评估发展或患有特发性炎性肌病包涵体肌炎的风险,以及评估发展或患有另一种特发性炎性肌病如皮肌炎和/或多肌炎的风险。
在一个方面,本发明涉及用于区分IIM的亚型的方法,所述方法包括步骤:a)提供所述受试者的测试样品;b)确定抗5’-核苷酸酶抗体是否存在于所述样品中。所述抗5’-核苷酸酶抗体的存在表明,患有或发展特发性炎性肌病包涵体肌炎的风险,并且所述抗5’-核苷酸酶抗体的存在表明,不患有或不存在发展特发性炎性肌病如皮肌炎和/或多肌炎的风险。即,当测试样品包含抗5’-核苷酸酶抗体时,受试者可被认为处于发展IBM的风险中或可患有IBM。同时,其表明,受试者不处于发展DM和/或PM的风险中或不患有DM和/或PM。
或者,可将测试样品中的抗5’-核苷酸酶抗体水平与参照样品,例如经诊断未患特发性炎性肌病,例如经诊断未患包涵体肌炎的健康受试者的样品相比较。相较于参照水平,所述样品中所述抗体的升高的水平可表明发展包涵体肌炎的风险或患有包涵体肌炎。相较于参照水平,所述样品中所述抗体的相似或相同水平可表明没有或低的发展包涵体肌炎的风险或未患包涵体肌炎。
本发明方法还可用于肌病优选包涵体肌炎的直接或早期发作检测。
优选地,离体地,即对离体测试样品进行根据本发明的方法。所述测试样品可以是获自受试者的任何样品,并且不限于获自受试者的组织或液体。多种样品可用于实践本发明,包括例如血液、血清、血浆、尿、唾液、腹水等。优选地,测试样品是血液样品,这样的样品的非限定性实例是全血样品,但也包括随后处理(例如分级分离)的血液样品。本领域技术人员充分了解获得受试者的测试样品的技术和方法。
在本发明背景中,受试者可以是动物或人类。原则上,任何受试者可使用本发明的方法来诊断。可根据需要,经常地将诊断方法用于该受试者。优选地,受试者是人类,优选40岁或更老的人类。在适当的实施方案中,受试者是被怀疑处于发展特发性炎性肌病的风险中和/或被怀疑患有特发性炎性肌病的受试者,优选其中所述特发性炎性肌病是包涵体肌炎。基于通常与特发性炎性肌病相关的症状(如上文中描述的)的发生,受试者可被怀疑处于发展特发性炎性肌病的风险中。
抗5’-核苷酸酶抗体在测试样品中的存在或水平的测定可通过本领域技术人员可获得的任何适当方法来进行,例如通过使用免疫测定如ELISA、免疫沉淀或细胞筛选,或甚至通过使用抗-抗体(即,抗5’-核苷酸酶抗体的抗体)。
通过使用可定量抗体对抗体抗原的结合的目前的抗体检测技术,可测定所述抗体在获自受试者的样品中的水平或量。
抗体可用作定量蛋白质或其它抗原的量的特异性分析试剂。该技术是酶联免疫吸附测定(ELISA)。在该方法中,将与无色底物反应以产生有色产物的酶共价连接至识别靶抗原的特异性抗体。如果抗原存在于样品中,则抗体-酶复合物将结合抗原,并且抗体-酶复合物的酶组分将催化反应,从而产生有色产物。因此,有色产物的存在表明抗原的存在。此类快速方便的ELISA可检测低于1纳克(10-9g)的蛋白质。可利用多克隆或单克隆抗体进行ELISA,但单克隆抗体的使用产生更可靠的结果。
在检测样品中的抗体的情况下,如在本发明中,可使用间接ELISA。间接ELISA用于通过抗原检测抗体的存在,所述抗原被吸附至固体支持载体,例如小孔的底部。将从受试者获得的并且可能包含抗抗原的抗体的样品添加至抗原包被的小孔并且允许其结合抗原。最后,使针对人抗体的酶联抗体(例如,识别人抗体的山羊抗体)在小孔中反应,并且通过洗涤除去未结合的抗体。随后施用底物。底物的转化表明酶联抗体结合至人抗体,这反过来表明患者具有抗所述抗原的抗体。因此在荧光ELISA的情况下,当具有适当波长的光照射于样品上时,任何抗原/抗体复合物将产生荧光,从而样品中抗体的量可通过荧光信号的强度推断出来。
底物可利用生色底物,虽然更常见地使用荧光底物和化学发光底物,因为它们能够产生更高的灵敏度。
另一个抗体检测法是免疫沉淀(IP)。在IP实验过程中,将测试样品例如血液样品暴露于特定抗原。如果存在待测试的抗体,则其将结合抗原,并且所有其它抗体将保持未结合。如果不存在特定抗体,则没有抗体结合所述抗原。在进行允许抗体-抗原结合的时间后,从样品除去所有抗体连同结合至抗体的任何抗原,并进行分析。
细胞筛选利用包含特定抗原的细胞。用测试样品例如患者的血清样品温育筛选细胞群体,允许来自样品的抗体结合筛选细胞上的抗原。研究者随后可通过就抗体的存在分析筛选细胞,来检测抗体-抗原结合。如果研究者在筛选细胞中发现抗体-抗原复合物,则这表明抗体在患者样品中的存在。
或者,抗体在受试者的样品中的量或存在可使用本领域技术人员已知的任何其它常规技术来测定,包括但不限于毛细管作用、沉淀、浊度计、扩散、凝集反应、电位计、安培计、压电法和倏逝波免疫传感器或本文中引述的方法的任何组合。
还提供了用于监测受试者的包涵体肌炎的进展和/或用于测定受试者对治疗包涵体肌炎的疗法的响应的方法,所述方法包括步骤:
a)在第一时间点提供所述受试者的第一测试样品,和在第二时间点提供所述受试者的第二测试样品;
b)测定所述第一和第二样品中的抗5’-核苷酸酶抗体的水平;
c)将所述第一样品中的抗5’-核苷酸酶抗体的水平与所述第二样品相比较。
还提供这样的方法,其中所述方法还包括d)基于所述第一样品与所述第二样品之间抗5’-核苷酸酶抗体的水平的比较,测定所述受试者的包涵体肌炎的进展和/或对治疗包涵体肌炎的疗法的响应。
优选地,离体地,即对离体测试样品进行根据本发明的方法。所述测试样品可以是获自受试者的任何样品,并且不限于获自受试者的组织或液体。多种样品可用于实践本发明,包括血液、血清、血浆、尿、唾液、腹水等。优选地,测试样品是血液样品,这样的样品的非限定性实例是全血样品,而且还包括随后处理(例如分级分离)的血液样品。
本方法包括步骤:在第一时间点提供来自所述受试者的样品,在第二时间点提供来自所述受试者的第二样品,和测定抗5’-核苷酸酶抗体在两种样品中的水平。通过比较这两个水平,可测定所述受试者的包涵体肌炎的进展。通过测量随时间过去受试者样品中抗体的水平,临床医生能够确定包涵体肌炎是否已进展和/或例如治疗是否成功或有用。
如本文中所用,术语“治疗包涵体肌炎的疗法”是指,预期改善或逆转受试者的包涵体肌炎的任何类型的任何治疗。受试者可以是正响应者,弱响应者或非响应者。如本文中使用的,正响应者是对治疗发生正响应的受试者,即在包涵体肌炎的改善上经历成功的受试者。非响应者是对不响应于治疗或未响应至满意水平的受试者。弱响应者是响应于治疗但未达到正响应者的水平的受试者。
所述第一和第二样品中抗5’-核苷酸酶抗体的相似或相同水平可表明对疗法的适度响应或包涵体肌炎的进展的停止。如果所述第二样品在比所述第一样品更晚的时间点采集,则所述第二样品中所述抗5’-核苷酸酶抗体的水平相较于所述第一样品中所述生物标志物的水平的升高可表明对疗法的负响应或低响应或包涵体肌炎的进展(非响应者)。如果所述第二样品在比所述第一样品更晚的时间点采集,则所述第二样品中所述抗5’-核苷酸酶抗体的水平相较于所述第一样品中所述抗5’-核苷酸酶抗体的水平的降低可表明对疗法的正响应(正响应者)。
在本发明的方法、用途和试剂盒的优选实施方案中,待检测的抗体所针对的5’-核苷酸酶是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB),优选NT5C1A。本领域技术人员理解,抗体,例如存在于获自患有包涵体肌炎的受试者的测试样品中的抗体,除了识别5’-核苷酸酶(优选NT5C1A和/或NT5C1B)外,还可识别所述抗原的某些片段或部分。
或者,在本发明的方法、用途和试剂盒中,待检测的抗体所针对的5’-核苷酸酶包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的、或与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%,更优选至少95%,更优选选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸。本领域技术人员理解,对于本发明,患有包涵体肌炎的受试者中的抗体所针对的根据本发明的5’-核苷酸酶不一定具有与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的氨基酸序列完全相同的氨基酸序列,而是允许氨基酸序列的变异(例如,同种型或同源物)而不背景本发明。同样地,本发明包括这样的实施方案,其中仅患有包涵体肌炎的受试者中的抗体所针对的上述5’-核苷酸酶的片段,例如具有至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个连续氨基酸的片段足以检测存在于所述患者中的抗体。
在一个实施方案中,这样的片段包含至少一个选自下列的5’-核苷酸酶IA的氨基酸区域:
-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸25至50的区域;
-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸221至243的区域;和
–SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸341至368的区域。
已发现,这些区域优先被IBM血清靶向。这些区域可代表主要表位区域。
在本发明的特别优选的实施方案中,测定抗5’-核苷酸酶抗体的存在和/或水平的步骤通过测定所述抗体与5’-核苷酸酶和/或与所述5’-核苷酸酶的片段之间的相互作用来进行,其中所述片段是来源于所述5’-核苷酸酶的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个连续氨基酸的片段。优选地,用于测定与抗体的相互作用的或用于测定与抗体的相互作用的片段所源自的5’-核苷酸酶是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB)。或者,用于测定与抗体的相互作用的或用于测定与抗体的相互作用的片段所源自的5’-核苷酸酶,包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的、或与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸。
在一个实施方案中,所述片段包含来自5’-核苷酸酶的区域的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个连续氨基酸,所述区域选自:-SEQID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸25至50的区域;-SEQID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸221至243的区域;和,-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸341至368的区域。
如上所述,可利用本领域技术人员已知的检测抗体的任何方法来检测根据本发明的抗5’-核苷酸酶抗体的存在。然而,优选地,样品中的抗体使用特异于所述抗体的抗原或其它具有表位的化合物来检测。因此,在一个实施方案中,5’-核苷酸酶,优选NT5C1A和/或NT5C1B可用于检测针对受试者的5’-核苷酸酶(例如针对受试者的NT5C1A)而引发的抗体在样品中的存在。在另一个实施方案中,所述5’-核苷酸酶优选NT5C1A和/或NT5C1B的片段(即,氨基酸区段,其连续地存在于所述片段所源自或所获自的多肽中)可用于检测针对受试者的5’-核苷酸酶(例如,针对受试者的NT5C1A)引发的抗体的存在。此类片段原则上可以具有任意长度,只要其包含受试者样品中的抗体所针对的表位。优选地,片段包含连续地存在于受试者的5’-核苷酸酶中(例如NT5C1A中)的至少5、6或7个氨基酸。
在适当的实施方案中,片段可包含来自5’-核苷酸酶的区域的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个,例如8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续氨基酸,所述区域选自:-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸25至50的区域;-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸221至243的区域;和,-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸341至368的区域。
本领域技术人员知晓,如何获得可用于在根据本发明的方法中检测抗体的此类片段的方法。例如,可产生例如NT5C1A的具有不同长度和组成的片段,并且测试这些片段与抗5’-核苷酸酶的抗体(存在于获自患有包涵体肌炎的受试者的样品中)的(特异性)结合,将结合作用与获自例如健康受试者和/或患有另一种特发性炎性肌病(包括皮肌炎和/或多肌炎)的受试者的样品的结合作用相比较。结合作用在获自健康受试者和/或患有另一种特发性炎性肌病(包括皮肌炎和/或多肌炎)的受试者的样品中的不存在,和结合作用在获自患有包涵体肌炎的人的相似样品中的存在,以及对于受试者的抗5’-核苷酸酶(例如NT5C1A)抗体的存在测试为阳性,指示可在根据本发明的方法中用于检测所述抗体的片段。
或者,用于测定与抗体的相互作用的、或用于测定与抗体的相互作用的片段所源自的5’-核苷酸酶,包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的、或与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸。事实上,如上所解释的,这些5’-核苷酸酶或氨基酸序列或片段的适合性可由本领域技术人员容易且直接地确定,而无需过度的负担。适当的5’-核苷酸酶片段包括,含有一个或多个上文中引述的主要表位区域的那些片段。
用于检测的5’-核苷酸酶或其片段可合成产生,或通过重组方法产生,或甚至从组织分离而来。本领域技术人员理解,用于检测获自受试者的样品中的抗体的5’-核苷酸酶或其片段还可包含另外的氨基酸序列、标志物部分、标记等,并且可直接或间接地结合或附着至表面、载体、珠粒、磁珠等,只要这不会以使得检测不可靠和/或不可预测的方式干扰根据本发明的抗体的检测。
优选地,用于本发明的所有方面的测试样品是血液样品。还可在用于本发明的方法、用途和试剂盒之前进一步处理血液样品。
在另一个优选实施方案中,提供了根据本发明的方法,其还包括测定抗至少一种抗原的抗体在测试样品中的存在的步骤,所述抗原选自:Mi-2、Ku、PM/Scl-100、PM/Scl-75、SRP、OJ、EJ、PL-12、PL-7、Ro-52、Jo-1、HisRS、ThrRS、AlaRS、GlyRS、IleRS、AsnRS、TyrRS、PheRS、tRNAHis、tRNAAla、Mi-2α、Mi-2β、SRP54、SRP68、SRP72、Tif1-γ、MDA5、SAE1、SAE2、丝氨酸-tRNASec-蛋白质复合物、Ro60、La、U1A、U1C、U1-70k、PMS1、PMS2、Ku70、Ku80、eEF1、核RNP和NXP-2。
上述抗原对于与自身免疫性疾病,特别地特发性炎性肌病相关的领域内的技术人员来说是公知的。所述抗原描述于各种科学出版物中(参见,例如,Mammen AL(2010)Ann N Y Acad Sci1184:134–153和VanDooren等人(2011)Autoimmun Highlights2:5-20)。目前的诊断的一个缺点是,抗这些抗原的抗体在特定疾病中的相对低的流行率。例如,尽管抗Mi-2抗体对于皮肌炎是高度特异性的,但它们可在15%至30%的皮肌炎患者中被发现。抗Ku的抗体在系统性红斑狼疮(SLE)中具有达到10%的流行率,但也在5%至25%的多肌炎/硬皮病重叠综合征的病例中被检测到。因此,超过一种抗体在获自受试者的测试样品中的检测的组合将进一步改善正确病况的诊断和降低误诊的概率,这进而降低错误治疗和护理的概率。
根据本发明的其它方面,提供了5’-核苷酸酶的用途和/或所述5’-核苷酸酶的片段的用途,其中所述片段是源自所述5’-核苷酸酶的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个连续氨基酸的片段,其用于检测存在于获自受试者的测试样品中的抗体。在适当的实施方案中,片段可包含来自5’-核苷酸酶的区域的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个,例如8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续氨基酸,所述区域选自:-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸25至50的区域;-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸221至243的区域;和,-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸341至368的区域。在一个实施方案中,用于测定与抗体的相互作用的5’-核苷酸酶或来源于其的片段是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB)。在另外的或其它实施方案中,用于检测抗体的或用于测定与抗体的相互作用的片段所源自的5’-核苷酸酶包含,SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的或与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸。根据本发明的用途优选用于鉴定处于发展特发性炎性肌病的风险中的受试者和/或诊断患有特发性炎性肌病的受试者,其中特发性炎性肌病选自包涵体肌炎、皮肌炎和/或多肌炎,最优选特发性炎性肌病是包涵体肌炎,和/或监测受试者的包涵体肌炎的进展。在根据本发明的用途中,测试样品优选是血液样品,受试者优选是人受试者。
在本发明的最后方面,提供了试剂盒。根据本发明的试剂盒包括,用于检测存在于从受试者采集的测试样品中的抗5’-核苷酸酶抗体的工具,优选地其中5’-核苷酸酶是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB),或包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸或与SEQ ID NO:1和/或SEQ IDNO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的5’-核苷酸酶。在一个实施方案中,5’-核苷酸酶可包含来自下述区域的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个,例如8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续氨基酸,所述区域选自:-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸25至50的区域;-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸221至243的区域;和,-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸341至368的区域。
根据本发明的试剂盒优选用于鉴定处于发展特发性炎性肌病的风险中的受试者和/或诊断患有特发性炎性肌病的受试者,优选其中特发性炎性肌病选自包涵体肌炎、皮肌炎和/或多肌炎,最优选特发性炎性肌病是包涵体肌炎,和/或用于监测受试者的包涵体肌炎的进展。
在一个实施方案中,根据本发明的试剂盒包括作为检测抗5’-核苷酸酶抗体的工具的5’-核苷酸酶,优选其中5’-核苷酸酶是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB),或包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸或与SEQID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的5’-核苷酸酶,或所述5’-核苷酸酶或所述氨基酸序列的片段,其中所述片段是来源于所述5’-核苷酸酶的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个连续氨基酸的片段。在适当的实施方案中,片段可包含来自5’-核苷酸酶的区域的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个,例如8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续氨基酸,所述区域选自:-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸25至50的区域;-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸221至243的区域;和,-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸341至368的区域。关于适当的序列、片段等的细节已在上文中进行了描述,并且在本领域技术人员的知识范围内。5’-核苷酸酶的所述片段可任选地包含至多367个,例如365、360、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9或8个氨基酸。
根据本发明的试剂盒可以是这样的试剂盒,其中将用于检测抗5’-核苷酸酶抗体的所述5’-核苷酸酶和/或片段附着至媒介物,所述媒介物优选选自适合用于体外免疫测定,优选免疫印迹的膜、珠粒、磁珠、载体、蛋白质-接头、表面。抗原或表位的附着是本领域技术人员已知的。
试剂盒还可包括,用于检测抗5’-核苷酸酶抗体的结合的测定,优选地,测定选自分子相互作用测定、ELISA、免疫印迹、微阵列、免疫沉淀、免疫扩散、对流免疫电泳、线性印迹测定或多重分析技术。在本发明的背景中,“包括测定”可表示,试剂盒包括进行特定方案所需的所有必需工具,试剂盒包括进行特定方案的书面说明书,和/或仅包括进行特定方案所需的部分必需工具,但例如不包括特定材料(包括测试样品)的必需装置。上述技术对于本领域技术人员来说是已知的,并且已综述于例如Van Dooren等人(2011)Autoimmun Highlights2:5-20中。
Van Dooren公开,在数年中已开发了许多具有不同方法学差异的多重测定。多重测定能够针对多种自身抗体特异性同时筛选单个血液或其它生物液体样品。这样,可产生患者特异性自身抗体特征谱。一种类型的多重测定是基于固体表面的自身抗原微阵列,所述微阵列在固体表面上预定的位置中包含固定的蛋白质或其它生物分子。固定的抗原与血清样品中的分子例如(标记的)抗体之间的相互作用可通过基于荧光的方法来检测。第二类型是所谓的可寻址珠粒自身抗原微阵列。将单独的目标抗原化学偶联至不同颜色的珠粒。随后,可在包含珠粒混合物的微量滴定孔中分析血清或其它生物液体。一个激光测量特定抗原偶联的珠粒的颜色,而第二激光测定结合至珠粒的荧光色素偶联的第二抗体的存在和量。如同描述的自身抗原微阵列技术,多重测定在减小的样品体积、增强的灵敏性、自动化和增加的可测试的样品数目方面具有优于常规技术的有利方面。
线性-印迹测定或所谓的线性免疫测定(LIA)基于将纯化的抗原点在蛋白质结合膜上而无需凝胶电泳的免疫印迹法。天然抗原的费力纯化法被高度纯化的重组抗原或合成肽的更加可重现的生产替代。这些发展促成了商购可得的线性-印迹的增加的灵敏性和特异性。不同制造商的几种LIA最近已在临床上得以验证,结果显示LIA正成为有时用于诊断实验室的更加昂贵和复杂的技术的适当替代技术。
在另一个或其它实施方案中,由于上文中已论述的原因,试剂盒包括至少一种选自下述的抗原:Mi-2、Ku、PM/Scl-100、PM/Scl-75、SRP、OJ、EJ、PL-12、PL-7、Ro-52、Jo-1、HisRS、ThrRS、AlaRS、GlyRS、IleRS、AsnRS、TyrRS、PheRS、tRNAHis、tRNAAla、Mi-2α、Mi-2β、SRP54、SRP68、SRP72、Tif1-γ、MDA5、SAE1、SAE2、丝氨酸-tRNASec-蛋白质复合物、Ro60、La、U1A、U1C、U1-70k、PMS1、PMS2、Ku70、Ku80、eEF1、核RNP和NXP-2。本领域技术人员将理解,所述抗原还可以是片段(如上文中对于5’-核苷酸酶所论述的),来源于或获自针对其引发待检测的抗体(例如在从其获得样品的受试者中)的蛋白质。用于本发明试剂盒的抗原是任何蛋白质(其片段),其可用于以一定的特异性水平检测抗所述蛋白质的抗体。
本说明书中引述的所有专利和参考资料通过引用整体并入本文。
很清楚,上述描述用于举例说明本发明的一些实施方案,并且不限定本发明的保护范围。基于这些公开内容,更多的实施方案对于本领域技术人员来说是很显然的,它们在本发明的精神和保护范围内并且是现有技术和本专利的公开内容的明显组合。
本领域技术人员理解,本文中公开和描述的所有实施方案和参数选择可进一步组合成本发明的其他实施方案。同样地,本领域技术人员理解,可将第一实施方案、方面或参数选择的某些元素或技术特征与第二实施方案、方面或参数选择的某些元素或技术特征组合,而不背离本公开内容和发明的范围。例如,如果在第一实施方案中提及将5’-核苷酸酶用于检测包涵体肌炎的进展的方法中,并且在第二实施方案中提及5’-核苷酸酶优选是NT5C1A,则公开了NT5C1A在用于检测包涵体肌炎的进展的方法中的用途。
下列非限定性实施例举例说明本发明的不同实施方案。除非在实施例中另外声明,否则按照Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press以及Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY;或Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology,CurrentProtocols,USA.Standard materials的第1和2卷中描述的标准方案来进行所有重组DNA技术。
实施例
实施例1:包涵体肌炎的生物标志物:抗-Mup44,IBM-特异性自身
抗体
此处我们描述了,将44kDa的骨骼肌抗原(Mup44)鉴定为IBM的自身抗体的靶。Mup44被27%的IBM患者血清识别。在皮肌炎和多肌炎中与Mup44的反应性分别为0%和2%。该新型的IBM特异性自身抗体和抗原可用作生物标志物,帮助IBM的诊断。针对该抗原的自身抗体显示对于IBM是高度特异性的,这表明其是IBM的新型生物标志物。
方法
血清样品
将来自由Abdo等人(Abdo WF,Acta neuropathologica.2009;118:429-431)描述的一组良好表征的炎性肌病患者(31个IBM,47个PM和24个DM患者)的血清样品用于本研究。为了进行确认,分析来自IBM患者(Badrising UA,Annals of neurology.2002;51:369-372)的血清样品的单独队列以及获自Sanquin Blood Supply Foundation(Nijmegen,TheNetherlands)的健康个体的血清。
肌肉提取和细胞裂解物
将获自整形外科的人健康腘绳肌在液氮中冷冻并且于-80℃贮存。利用微型细胞研磨器(Braun Biotech International,Melsungen,Germany)将小片的冷冻肌肉组织粉末化,重悬浮于10倍体积的RIPA缓冲液(50mMTris-Cl,pH7.4,150mM NaCl,1%NP-40,0.5%DOC,0.1%SDS,10mMDTT,0.5mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Mannheim,Germany))中,在4℃超声处理,以21,000g离心15分钟。将上清液用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),随后进行蛋白质印迹分析。
按照标准方法培养人Jurkat T-淋巴细胞和小鼠C2C12成肌细胞,通过在裂解缓冲液中(50mM Hepes-KOH,pH7.4,100mM KCl,10mM MgCl2,0.05%NP-40,0.5mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物)中进行超声处理随后以21,000g进行离心来裂解细胞。
蛋白质印迹分析
使用全宽凝胶通过12%SDS-PAGE分离人肌肉提取物、Jurkat或C2C12细胞裂解物,将其印迹在硝酸纤维素膜上。将膜切成3-4mm宽的条带,用5%的于PBS-0.1%Tween-20(PBS-T)中的奶粉进行封闭,用人患者血清(于5%牛奶-PBS-T中以1:1000进行稀释)温育。使用山羊-抗-人-IRDye800标记的二抗(Rockland,Gilbertsville,USA)显现结合的抗体,用Odyssey系统(LI-COR Biosciences,Lincoln,USA)进行扫描。
结果
人骨骼肌提取物中的Mup44的鉴定
为了鉴定骨骼肌组织中的自身抗体的靶,通过SDS-PAGE分离健康人腘绳肌提取物,将其印迹至硝酸纤维素上,用来自IBM患者的血清温育。几种多肽被这些患者血清中的抗体识别。虽然不同的血清与不同的肌肉抗原反应,但一种主要多肽显示被几种IBM血清共同地检测到。9种IBM血清中有4种与该多肽(其具有约44kDa的分子量)反应。
有趣地,与其它检测到的抗原不同,该44kDa多肽是骨骼肌特异性的。其在来自培养的细胞系例如人Jurkat和HeLa细胞的提取物中和分化的小鼠C2C12肌管中都未被检测到。然而,其在小鼠骨骼肌提取物中以及健康和IBM-影响的骨骼肌样品中都被检测到。使用相邻印迹条带的免疫印迹确认,由不同IBM患者血清检测到的44kDa抗原在SDS-PAGE凝胶中显示完全相同的电泳迁移率,从而显示,这些血清识别共同的抗原性蛋白质(在下文中命名为Mup44(44kDa的肌肉蛋白质))。
肌炎血清中抗-Mup44自身抗体与IBM的关联性
为了研究抗-Mup44抗体是IBM血清特异性的,还是也发现于具有其它炎性肌病的患者的血清中,如上所述,通过免疫印迹分析来自24个DM患者和47个PM患者的血清。如表1中显示的,该队列中的29%的IBM血清包含针对Mup44的自身抗体。虽然DM和PM血清与肌肉提取物中的几种抗原性蛋白质反应(数据未显示),但DM血清都未显示与Mup44的反应性并且仅有一个PM血清显示与Mup44的反应性(表1)。
在独立的IBM血清队列中确认了针对Mup44的自身抗体在IBM血清中的相对高的频率,其中25%的血清与Mup44反应。32个健康个体的血清都未包含抗-Mup44自身抗体(表1)。总之,以27%的灵敏性和99%的特异性在IBM患者血清中检测到抗-Mup44。
表1.抗-Mup44自身抗体的流行率
a肌炎血清队列(Abdo WF,Acta neuropathologica.2009;118:429-431);
bIBM血清队列2(Badrising UA,Annals of neurology.2002;51:369-372)
c健康个体的血清
讨论
44kDa肌肉自身抗原(命名为Mup44)被27%的分析的IBM血清识别,而其几乎不与或不与其它肌炎和健康对照血清反应。以99%的特异性检测到抗-Mup44自身抗体。当与肌炎的其它自身抗体反应性相比较时,IBM血清的抗-Mup44反应性的频率相对较高。其类似于被最频繁检测到的MSA抗-Jo-1(见于20%-30%的PM和DM患者中)的频率。通常情况下,使用培养的细胞系例如HeLa细胞来进行自身免疫性疾病的自身抗原的鉴定。然而,由于Mup44在该细胞系中的表达明显不存在,针对该蛋白质的患者抗体到目前为止仍然逃避检测。因此,抗-Mup44代表可区分IBM与其它炎性肌病的基于抗体的IBM生物标志物。鉴于基于肌肉活组织检查的组织学分析难以区分PM与IBM,这是特别有用的。我们发现,抗-Mup44自身抗体的存在是IBM的新型生物标志物。
实施例2:将Mup44鉴定为5’-核苷酸酶IA
为了揭示Mup44的分子身份,通过免疫亲和层析,使用从IBM患者血清分离的抗体从健康骨骼肌提取物中分离该蛋白质。分离的蛋白质的SDS-PAGE和染色显示,具有预期分子量的多肽仅存在于利用来自IBM患者的抗体(而非利用来自对照的抗体)获得的材料中。该多肽的身份通过经凝胶内消化获得的胰蛋白酶消化的肽的质谱(MS)分析来确定。
方法
通过与250μl蛋白A-琼脂糖珠粒(50%浆料;Kem-en-Tec,Denmark)一起温育,从250μl的2个IBM患者的血清样品和健康人血清的混合物中分离IgG。随后,通过0.2M硼酸钠缓冲液,pH9.0中的双功能交联剂庚二酰亚胺酸二甲酯二盐酸盐(Sigma Aldrich)将IgG共价偶联至蛋白A-珠粒。用乙醇胺和PBS洗涤抗体偶联的珠粒,将其于4℃贮存直至将来使用。
将获自整形外科的人健康腘绳肌在液氮中冷冻并且于-80℃贮存。用微型细胞研磨器(Braun Biotech International,Melsungen,Germany)将小片冷冻的肌肉组织磨成粉。将所得的材料重悬浮于10倍体积的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl,pH7.4,150mM NaCl,1%Nonidet P-40(NP-40),0.5%脱氧胆酸钠,0.1%SDS,10mM二硫苏糖醇,0.5mM苯甲磺酰基氟化物(PMSF)和完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Mannheim,Germany))中,于4℃超声处理,以21,000g离心15分钟。将上清液,人肌肉裂解物于-80℃贮存直至用于免疫亲和层析。
用250μl的于RIPA缓冲液中的蛋白A-琼脂糖珠粒(50%浆料)温育包含10mg蛋白质的肌肉裂解物,以从肌肉裂解物中除去内源性IgG。随后,将50μl抗体偶联的珠粒添加至预清洁的肌肉裂解物,于4℃温育16小时。用RIPA缓冲液洗涤抗体偶联的珠粒5次,通过在SDS-样品缓冲液(2%SDS,5%β-巯基乙醇,10%甘油,0.01%溴酚蓝,125mMTris-HCl,pH6.8)中煮沸释放结合的蛋白质。通过12%SDS-PAGE分离结合的蛋白质,通过胶体考马斯亮蓝染色显示蛋白质。
从凝胶切取包含对应于Mup44的位置的蛋白质条带的凝胶切片,并且在还原和烷基化后,用胰蛋白酶进行凝胶内消化。将消化的样品装载在stagetips上以进行脱盐和浓缩,并将其洗脱在20μl的终体积中,其5μl用于分析(利用Nijmegen Proteomics Facility(NPF)的nanoLCLTQ FT Ultra MS仪)。简而言之,通过反相(RP)nano-HPLC层析分离肽混合物,随后进行纳米电喷雾电离(nano-electrospray ionization)。通过LTQ FT Ultra MS质谱仪分析肽离子。
借助于搜索程序Mascot(http://www.matrixscience.com/search_form_select.html)从数据中提取肽和蛋白质鉴定数据。在该情况下,将利用智人分类学的RefSeq33数据库与添加的序列标签一起使用。将可能的污染物添加至该数据库(例如,人角蛋白、胰蛋白酶和LysC)。在搜索时允许下列修饰:半胱氨酸的脲基甲基化(carbamidomethylation)(固定的)、甲硫氨酸的氧化(可变的)和N末端的乙酰化(可变的)。
通过下列来验证蛋白质身份:基于独特鉴定的肽序列的数目通过软件分类蛋白质鉴定数据,将共有相同组的肽的蛋白质聚类,并且基于下列标准验证蛋白质:具有1个肽的蛋白质必须具有肽评分:>49;具有超过1个肽的蛋白质必须具有肽评分:>29。
结果
切取的对应于Mup44的条带的LC-MS/MS结果的分析显示,Mup44对应于5’-核苷酸酶IA(NP_115915.1)。5’-核苷酸酶IA(其是LC-MS/MS结果列表中评分最高的蛋白质)的emPAI评分(Exponentially ModifiedProtein Abundance Index;http://www.matrixscience.com/help/quant_empai_help.html)对于两种IBM样品和对照抗体样品分别为5.4、9和0.9,这与观察到的蛋白质条带的强度一致。因为仅对于5’-核苷酸酶IA获得这些高emPAI评分,并且其它鉴定的蛋白质都没有显示相似的IBM与对照样品之间的区别,因此,这些结果证明,被IBM患者抗体靶向的44kDa蛋白质是细胞溶质5’-核苷酸酶IA。重要地,已知该蛋白质以相对高的水平在骨骼肌组织中表达。
实施例3:被IBM血清靶向的5’-核苷酸酶IA的主要表位区域的鉴定
为了获得对优先被IBM血清靶向的5’-核苷酸酶IA的区域的更多的认识,产生包含覆盖5’-核苷酸酶IA的整个氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的一组重叠合成肽的微阵列,并且用抗-Mup44-阳性血清进行探测。总共合成90个具有11个氨基酸重叠的15聚体肽,将其以一式三份点在载玻片的表面上。这些微阵列购自JPT Peptide Technologies(Berlin,Germany)。每一个载玻片包含3个相同的肽阵列。通过在室温下用MTBST(5%的于TBS,0.05%Tween-20中的脱脂干奶粉)温育1小时来封闭载玻片。随后,用300μl的于MTBST中稀释100倍的患者血清在37℃于湿盒中温育载玻片2小时。在用MTBST洗涤5次后,在搅拌的条件下,用Alexa Fluor-568-标记的山羊-抗-人二抗(A21090,Molecular Probes)在30℃温育阵列1小时。在用MTBST洗涤5次和用水洗涤5次后,使载玻片干燥,通过PerkinElmer ProScanArray微阵列扫描仪来显现结合的抗体。使用Quantity One软件(Bio-Rad)定量信号。
用含抗-Mup44自身抗体的IBM血清温育9张载玻片,用正常健康对照血清温育2张载玻片。鉴定了3个主要表位区域。这些表位区域之一(紧邻N末端)包含氨基酸残基25-50。一些血清还显示与包含N末端24个氨基酸的部分的肽的微弱的反应性。第二个自身反应性区域紧邻C末端(a.a.341-368)。第三个表位区域更靠近中央(a.a.221-243)。对照血清不与阵列上的任一种5’-核苷酸酶IA肽反应。这些数据表明,5’-核苷酸酶IA包含至少3个不连续的自身表位。
Claims (28)
1.一种用于鉴定处于发展特发性炎性肌病的风险中的受试者和/或诊断患有特发性炎性肌病的受试者的方法,优选其中所述特发性炎性肌病是包涵体肌炎,所述方法包括步骤:
a)提供所述受试者的测试样品;
b)测定抗5’-核苷酸酶抗体是否存在于所述样品中。
2.权利要求1的方法,其中所述受试者是被怀疑处于发展特发性炎性肌病的风险中的受试者和/或被怀疑患有特发性炎性肌病的受试者,优选其中所述特发性炎性肌病是包涵体肌炎。
3.一种用于区分患有特发性炎性肌病的受试者的特发性炎性肌病的亚型的方法,其中所述特发性炎性肌病是皮肌炎或多肌炎或包涵体肌炎,所述方法包括步骤:
a)提供所述受试者的测试样品;
b)确定抗5’-核苷酸酶抗体是否存在于所述样品中。
4.权利要求3的方法,其中抗5’-核苷酸酶抗体在所述样品中的存在指示包涵体肌炎的诊断,并且抗5’-核苷酸酶抗体在所述样品中的不存在指示皮肌炎或多肌炎的诊断。
5.一种方法,其用于监测受试者的包涵体肌炎的进展和/或用于测定受试者对治疗包涵体肌炎的疗法的响应,所述方法包括步骤:
a)在第一时间点提供所述受试者的第一测试样品,和在第二时间点提供所述受试者的第二测试样品;
b)测定所述第一和第二样品中的抗5’-核苷酸酶抗体的水平;
c)将所述第一样品中的抗5’-核苷酸酶抗体的水平与所述第二样品相比较。
6.前述权利要求的任一项的方法,其中所述5’-核苷酸酶是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB),优选地是NT5C1A。
7.前述权利要求的任一项的方法,其中所述5’-核苷酸酶包含SEQID NO:1和/或SEQ ID NO:2的、或与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸。
8.前述权利要求的任一项的方法,其中测定抗5’-核苷酸酶抗体的存在和/或水平的步骤是通过测定所述抗体与5’-核苷酸酶和/或与所述5’-核苷酸酶的片段之间的相互作用来进行的,其中所述片段是来源于所述5’-核苷酸酶的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个连续氨基酸的片段。
9.前述权利要求的任一项的方法,其中用于测定与抗体的相互作用的、或用于测定与抗体的相互作用的片段所源自的5’-核苷酸酶是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB)。
10.权利要求6-7的任一项的方法,其中用于测定与抗体的相互作用的、或用于测定与抗体的相互作用的片段所源自的5’-核苷酸酶,包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的、或与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸。
11.权利要求8-10的任一项的方法,其中所述片段包含来自5’-核苷酸酶的区域的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个连续氨基酸,所述区域选自:-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸25至50的区域;-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸221至243的区域;和,-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸341至368的区域。
12.前述权利要求的任一项的方法,其中所述测试样品是血液样品。
13.前述权利要求的任一项的方法,其中所述受试者是人受试者。
14.前述权利要求的任一项的方法,其还包括测定抗至少一种抗原的抗体在测试样品中的存在的步骤,所述抗原选自Mi-2、Ku、PM/Scl-100、PM/Scl-75、SRP、OJ、EJ、PL-12、PL-7、Ro-52、Jo-1、HisRS、ThrRS、AlaRS、GlyRS、IleRS、AsnRS、TyrRS、PheRS、tRNAHis、tRNAAla、Mi-2α、Mi-2β、SRP54、SRP68、SRP72、Tif1-γ、MDA5、SAE1、SAE2、丝氨酸-tRNASec-蛋白质复合物、Ro60、La、U1A、U1C、U1-70k、PMS1、PMS2、Ku70、Ku80、eEF1、核RNP和NXP-2。
15.5’-核苷酸酶和/或所述5’-核苷酸酶的片段用于检测存在于获自受试者的测试样品中的抗体的用途,其中所述片段是来源于所述5’-核苷酸酶的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个连续氨基酸的片段。
16.权利要求15的用途,其中用于测定与抗体的相互作用的5’-核苷酸酶或源自其的片段是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB)。
17.权利要求15-16的任一项的用途,其中用于检测抗体的或用于测定与抗体的相互作用的片段所源自的5’-核苷酸酶包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的、或与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸。
18.权利要求15-17的任一项的用途,其中所述片段包含来自5’-核苷酸酶的区域的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个连续氨基酸,所述区域选自:-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸25至50的区域;-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸221至243的区域;和,-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸341至368的区域。
19.权利要求15-18的任一项的用途,其用于鉴定处于发展特发性炎性肌病的风险中的受试者和/或诊断患有特发性炎性肌病的受试者,其中特发性炎性肌病选自包涵体肌炎、皮肌炎和/或多肌炎,最优选特发性炎性肌病是包涵体肌炎,和/或监测受试者的包涵体肌炎的进展。
20.权利要求15-19的任一项的用途,其中所述测试样品是血液样品。
21.权利要求15-20的任一项的用途,其中所述受试者是人受试者。
22.一种试剂盒,其包括用于检测存在于获自受试者的测试样品中的抗5’-核苷酸酶抗体的工具,优选其中5’-核苷酸酶是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB),或包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸或与SEQID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的5’-核苷酸酶。
23.权利要求22的试剂盒,其用于鉴定处于发展特发性炎性肌病的风险中的受试者和/或诊断患有特发性炎性肌病的受试者,优选其中特发性炎性肌病选自包涵体肌炎、皮肌炎和/或多肌炎,最优选特发性炎性肌病是包涵体肌炎,和/或用于监测受试者的包涵体肌炎的进展。
24.权利要求22-23的任一项的试剂盒,其中试剂盒包括作为检测抗5’-核苷酸酶抗体的工具的5’-核苷酸酶,优选其中5’-核苷酸酶是NT5C1A(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IA)或NT5C1B(人5’-核苷酸酶,细胞溶质IB),或包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的至少30个、40个、50个、100个、200个、300个、优选至少350个、最优选全部连续氨基酸或与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少90%、更优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%同一性的氨基酸序列的5’-核苷酸酶,或所述5’-核苷酸酶或所述氨基酸序列的片段,其中所述片段是来源于所述5’-核苷酸酶的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个连续氨基酸的片段。
25.权利要求22-24的任一项的试剂盒,其中所述片段包含来自5’-核苷酸酶的区域的至少5个,优选至少6个,更优选至少7个连续氨基酸,所述区域选自:-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸25至50的区域;-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸221至243的区域;和,-SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90%,更优选至少95%,更优选至少98%,最优选至少99%同一性的氨基酸序列的氨基酸341至368的区域。
26.权利要求24-25的任一项的试剂盒,其中将检测抗5’-核苷酸酶抗体的所述5’-核苷酸酶和/或片段固定至媒介物,所述媒介物优选选自适合用于体外免疫测定,优选免疫印迹的膜、珠粒、磁珠、载体、蛋白质-接头。
27.权利要求22-26的任一项的试剂盒,其还包括用于检测抗5’-核苷酸酶抗体的结合的测定,优选所述测定选自分子相互作用测定、ELISA、免疫印迹、微阵列、免疫沉淀、免疫扩散、对流免疫电泳、线性印迹测定或多重分析技术。
28.权利要求22-27的任一项的试剂盒,其中试剂盒包括至少一种选自Mi-2、Ku、PM/Scl-100、PM/Scl-75、SRP、OJ、EJ、PL-12、PL-7、Ro-52、Jo-1、HisRS、ThrRS、AlaRS、GlyRS、IleRS、AsnRS、TyrRS、PheRS、tRNAHis、tRNAAla、Mi-2α、Mi-2β、SRP54、SRP68、SRP72、Tif1-γ、MDA5、SAE1、SAE2、丝氨酸-tRNASec-蛋白质复合物、Ro60、La、U1A、U1C、U1-70k、PMS1、PMS2、Ku70、Ku80、eEF1、核RNP和NXP-2的抗原。
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Cited By (4)
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---|---|---|---|---|
CN108603885A (zh) * | 2015-11-17 | 2018-09-28 | 科罗拉多大学评议会公司 | 诊断或评估哺乳动物中的疾病或紊乱的新型多重分析 |
CN110554202A (zh) * | 2019-10-14 | 2019-12-10 | 南京鼓楼医院 | 趋化因子ccl8在制备皮肌炎病情及预后评估试剂中的应用 |
CN114350820A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-04-15 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种与猪胴体性状相关的分子标记及其应用 |
CN116298305A (zh) * | 2023-01-03 | 2023-06-23 | 郑州大学 | 一种抗nt5c1a自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012154933A1 (en) | 2011-05-10 | 2012-11-15 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Detecting inclusion body myositis |
WO2015023626A1 (en) * | 2013-08-13 | 2015-02-19 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Sensitive diagnostic assay for inclusion body myositis |
CN104422763B (zh) * | 2013-08-23 | 2017-03-22 | 中日友好医院 | 抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途和试剂盒 |
WO2016080887A1 (en) * | 2014-11-17 | 2016-05-26 | Biocistronix Ab | Novel autoantigen in idiopathic inflammatory myopathies |
EP3293520B1 (en) | 2016-09-09 | 2019-11-06 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG | A method for the production of an polypeptide |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002004613A2 (en) * | 2000-07-07 | 2002-01-17 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Isolated polynucleotides encoding human 5'-nucleotide cn-ia and cn-ib, isolated proteins encoded by the same, and methods utilizing the same |
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Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1992004472A1 (en) * | 1990-09-07 | 1992-03-19 | Oklahoma Medical Research Foundation | Antigens associated with polymyositis and with dermatomyositis |
US20040072190A1 (en) * | 2001-09-28 | 2004-04-15 | Henry Yue | Hydrolases |
DE602005005454T2 (de) | 2005-04-25 | 2009-04-30 | Sahltech I Göteborg AB | Behandlung von Einschlusskörper-Myositis |
WO2012154933A1 (en) * | 2011-05-10 | 2012-11-15 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Detecting inclusion body myositis |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002004613A2 (en) * | 2000-07-07 | 2002-01-17 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Isolated polynucleotides encoding human 5'-nucleotide cn-ia and cn-ib, isolated proteins encoded by the same, and methods utilizing the same |
CN101522910A (zh) * | 2006-06-12 | 2009-09-02 | 佐拉生物科学有限公司 | 肌病的诊断方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
J VAN DER PAS ET AL: "Diagnostic value of MHC class I staining in idiopathic inflammatory myopathies", 《JOURNAL OF NEUROLOGY,NEUROSURGERY & PSYCHIATRY》, vol. 75, 30 December 2004 (2004-12-30), XP 055020585 * |
MOHAMMAD SLAJEGHEH ET AL: "Autoantibodies against a 43 KDa Muscle Protein in Inclusion Body Myositis", 《PLOS ONE》, 1 January 2011 (2011-01-01) * |
THOMAS E. LLOYD ET AL: "Cytosolic 5"-Nucleotidase 1A as Target of Cirulating Autoantibodies in Autoimmune Diseases", 《ARTHRITIS CARE & RESEARCH》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108603885A (zh) * | 2015-11-17 | 2018-09-28 | 科罗拉多大学评议会公司 | 诊断或评估哺乳动物中的疾病或紊乱的新型多重分析 |
CN110554202A (zh) * | 2019-10-14 | 2019-12-10 | 南京鼓楼医院 | 趋化因子ccl8在制备皮肌炎病情及预后评估试剂中的应用 |
CN114350820A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-04-15 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种与猪胴体性状相关的分子标记及其应用 |
CN114350820B (zh) * | 2022-01-20 | 2023-10-20 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种与猪胴体性状相关的分子标记及其应用 |
CN116298305A (zh) * | 2023-01-03 | 2023-06-23 | 郑州大学 | 一种抗nt5c1a自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒 |
CN116298305B (zh) * | 2023-01-03 | 2024-05-28 | 郑州大学 | 一种抗nt5c1a自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒 |
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