JP6938372B2 - ヒトｐ５３の直線状エピトープに結合する抗体及びその診断的応用 - Google Patents

Description

本発明は、免疫診断の分野である。

さらに詳細には、本発明は、アルツハイマー病、及び／又は加齢に伴いアルツハイマー病もしくは認知障害を発症する被験者の疾病素質を診断する抗体、キット、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に関する。

ヒトｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）（アミノ酸１０１〜３０６）は、高度な構造的柔軟性により特徴付けられ、３つのシステイン（１７６、２３８及び２４２残基）、並びに１つのヒスチジン（１７９残基）と配位結合した１つのＺｎ^２＋イオンを含む。ヒトｐ５３タンパク質の野生型アイソフォームにおいて、アミノ酸２８２〜２９７の直線状エピトープはマスクされるため、エピトープ特異的抗体による認識に利用できない。

しかしながら、そのＤＢＤドメインの高度な柔軟性のため、ｐ５３タンパク質は複数の立体構造を呈することができ、また、これらの立体構造がその生物学的活性を特徴付ける。

その野生型構造では、ｐ５３はＤＮＡコンセンサス配列に結合することができ、標的遺伝子の発現を転写／抑制することができる。この立体構造において、該タンパク質は、市販の立体構造特異的抗体であるＰＡｂ１６２０により認識されるエピトープを露出する。

ｐ５３の立体構造の変化状態は複数存在し、異なる立体構造変化アイソフォームに相当する。ｐ５３遺伝子における一部の変異は、タンパク質の立体構造変化を引き起こし、これは市販の立体構造特異的抗体が認識することができる立体構造変化アイソフォームに相当する。

さらなる立体構造変化アイソフォームは、酸化及び／又はニトロ化反応など、翻訳後修飾に由来してもよく、タンパク質の野生型３次構造を変化させる。

Ｂｕｉｚｚａ Ｌ．ら（「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３ ａｓ ａｎ ｅａｒｌｙ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ‘ｓ ｄｉｓｅａｓｅ」、ＰｌｏｓＯｎｅ７（１）：ｅ２９７８９）及びＵｂｅｒｔｉ Ｄら（「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ−ｌｉｋｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｓｐｏｒａｄｉｃ Ａｌｚｈｅｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ ２７（２００６）１１９３〜１２０１）は共にアルツハイマー病患者における変異ｐ５３タンパク質の発現を同定している。抗ｐ５３抗体のＰＡｂ２４０を用いて同定しており、これは野生型ｐ５３タンパク質では検出することができないｐ５３タンパク質におけるアミノ酸残基２１３〜２１７の潜在性エピトープに結合する。

Ｂｕｉｚｚａ Ｌ．ら、「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３ ａｓ ａｎ ｅａｒｌｙ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ‘ｓ ｄｉｓｅａｓｅ」、ＰｌｏｓＯｎｅ７（１）：ｅ２９７８９ Ｕｂｅｒｔｉ Ｄら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ−ｌｉｋｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｓｐｏｒａｄｉｃ Ａｌｚｈｅｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ ２７（２００６）１１９３〜１２０１

本発明者は意外にも、アミノ酸２８２〜２９７の直線状エピトープが露出される翻訳後修飾に起因する該タンパク質の立体構造変化アイソフォームを、特異的及び選択的に認識することができることが判明している抗ヒトｐ５３を見出している。

また、本発明者は意外にも、本発明の抗体により認識されるｐ５３タンパク質のアイソフォームが、アルツハイマー病の被験者に特徴的に発現することを観察した。特に、本発明の抗体により認識される立体構造変化アイソフォームは、アルツハイマー病患者の生体試料、特に血液細胞、神経細胞又は他の細胞型の試料、並びに例えば血液、血漿、血清、唾液、尿などの生体液の試料に多量に発現する。

本発明者はさらに、本発明の抗体により認識されるこの立体構造変化アイソフォームは、軽度認知障害（ＭＣＩ）被験者の生体試料にも発現することを観察した。

従って、本発明の抗体は、アルツハイマー病を診断するため、及びアルツハイマー病を発症する軽度認知障害（ＭＣＩ）被験者の疾病素質を決定するための有用な診断及び予後診断用ツールである。

最後に、本発明者は本発明の抗体に陽性のｐ５３タンパク質アイソフォームの発現が、上記研究対象被験者の年齢及び認知障害に統計的に有意に相関することを観察した。

従って、本発明の抗体は、加齢に伴い認知障害を発症する被験者の疾病素質を決定するのに有用である。

従って、本発明の第１の目的は抗ヒトｐ５３抗体であり、ヒトｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に存在する配列ＲＲＴＥＥＥＮＬＲＫＫＧＥＰＨＨ（配列番号１）である、ヒトｐ５３のアミノ酸配列のアミノ酸位２８２〜２９７にわたる直線状エピトープを認識することを特徴とする。

図１は、ｐ５３タンパク質配列（配列番号３）を示す。 図２は、ＳＡＤ及びＦＡＤ試料における２Ｄ３Ａ８抗体陽性バンド及びＰＡｂ１６２０陽性バンドの強度比を示す。 図３は、アルツハイマー患者の血液細胞（ＰＢＭＣ）及び血清における２Ｄ３Ａ８陽性ｐ５３アイソフォームの濃度を示す。 図４は、年齢と血液細胞（ＰＢＭＣ）における２Ｄ３Ａ８陽性ｐ５３アイソフォームの濃度の相関を示す。 図５は、ＭＭＳＥ検査で得られた得点と２Ｄ３Ａ８陽性ｐ５３アイソフォームの濃度の相関を示す。

本発明の抗体の調製を以下の実験部分に記載する。

好ましい実施形態において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。

本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を調製する任意の周知の方法により得ることができる。以下の実験部分において、配列がＣＲＴＥＥＥＮＬＲＫＫＧＥＰＨＨ（配列番号２）であり、キャリアとしてウシ血清アルブミンに結合したペプチドからなる抗原を用いた動物（マウス）の免疫処置、及びハイブリドーマ技術による抗体の調製を、実施例に基づき説明する。

上記のように、本発明の抗体物は、アルツハイマー病、及び加齢に伴う認知障害の発症に相関することが示されているヒトｐ５３タンパク質のアイソフォームを特異的に認識する。従って、該抗体は有用な診断及び予後診断用ツールとなる。

アルツハイマー病に特有のｐ５３タンパク質に対する翻訳後修飾により、立体構造が変化したアイソフォームを決定するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法、並びに添付の特許請求の範囲に定義され、本明細書の不可欠な部分を形成する診断及び予後診断方法もまた、本発明の一部である。

添付の特許請求の範囲に定義される免疫診断キットもまた、本発明の一部である。

本発明の方法及びキットを実行するため、周知の各種イムノアッセイを用いることができ、例えば、免疫沈降反応アッセイ、ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡ、免疫蛍光法、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、免疫細胞化学／免疫組織化学などである。

以下の非限定的な実施例を提供し、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲を説明する。

１ａ、免疫処置
健常で異常のない６／８週齢のマウスを免疫処置に用いた。抗体産生用抗原として用いたペプチドは、以下の特徴を有した。
配列：「Ｎ−末端」ＣＲＴＥＥＥＮＬＲＫＫＧＥＰＨＨ「Ｃ末端」（配列番号２）
長さ：１６アミノ酸
分子量：１９６０．９４
純度：９６．４％
形状：凍結乾燥粉末
結合：グルタルアルデヒド法によりＢＳＡと結合

ｐ５３タンパク質配列（配列番号３）を図１に示す。ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を灰色でハイライトし、下線は２Ｄ３Ａ８抗体により認識される直線状エピトープである。

最初の注射は、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）に抗原（５０μｇ）を乳化することにより実施した。動物に、２〜３箇所皮下注射した。フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）に乳化した抗原５０μｇを用い、３週間間隔で追加の注射を実施した。抗体力価をＥＬＩＳＡにより評価する。

ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、マウス５匹の血清における抗体力価を、上述のペプチドを用いた３回目の注射後に評価した。免疫マウスの血液を尾静脈から採取した。分光光度測定値により得られた吸光度値によって、各マウスに存在する抗体力価に関する重要な情報が与えられた。抗体力価が十分に高くなるように、動物にさらに追加の注射を行った。最初の融合のため、抗体力価が最も高いマウスを選択した。

１ｂ、ハイブリドーマの成長
動物の脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞（ＳＰ２／０細胞株）と融合した。融合生成物を、抗原に対してスクリーニングし、抗体産生クローンを選択した。これらのクローンの増殖を継続した。この最初のスクリーニングは、ＥＬＩＳＡ法により行った。陽性クローンを親クローンとし、３回継代培養後凍結した。ＥＬＩＳＡプレート上に抗原コーティングを行い、続いて融合生成物の上清を添加した。免疫動物の血清をＥＬＩＳＡにおける陽性対照として用いた（実施例２）。

抗体力価が最も高いマウスの脾臓細胞、及びマウスの骨髄腫細胞を融合後、ＥＬＩＳＡアッセイを行い、融合生成物を評価した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに抗原のコーティングを行い、各クローン上清の段階希釈を各ウェルに添加して、分光光度測定値によりこれらの抗体産生を評価した。４５０ｎｍの光学密度（ＯＤ４５０ｎｍ）が最も高いクローンを２４ウェルプレートに移し、増殖後、ＥＬＩＳＡアッセイを繰り返し、抗体産生が最も高いクローンを６ウェルプレートに移し、増殖し、再度ＥＬＩＳＡにより試験した。培養フラスコに移したクローンにもこの手順を繰り返した。これらの連続するアッセイにより最も優れたクローンを同定し、最後にＥＬＩＳＡ、限界希釈法により試験し、陽性クローンが実際の抗体反応を示したことを確認した。

有効な抗体を、ＯＤ４５０ｎｍ値が最も高い、従って抗体力価が最も高いクローンの上清から精製した。この抗体を略して「クローン２Ｄ３Ａ８」とする。

散発性及び家族性アルツハイマー病並びにＭＣＩ患者における、２Ｄ３Ａ８抗体により認識されるｐ５３タンパク質の立体構造変化アイソフォームの発現に関する研究
散発性アルツハイマー（ＳＡＤ）及び家族性アルツハイマー（ＦＡＤ）と診断された患者の不死化Ｂリンパ球において、タンパク質の野生型アイソフォーム（ＰＡｂ１６２０）及び立体構造変化アイソフォーム（２Ｄ３Ａ８）を認識する２つの立体構造特異的抗体を用い、ｐ５３の立体構造状態を免疫沈降法により評価した。その後、ポリクローナル抗ｐ５３抗体（ＣＭ１）を用いたウェスタンブロットにより、免疫沈降物を可視化した。実験データを、同じ試料の２Ｄ３Ａ８抗体陽性バンド及びＰＡｂ１６２０陽性バンドの強度比として表した。

ＳＡＤ及びＦＡＤ試料において、２Ｄ３Ａ８／１６２０比は、痴呆のない対照患者のリンパ球と比較して、有意に高かった（図２）。

従って、２Ｄ３Ａ８抗体は、散発性（ＳＡＤ）及び家族性（ＦＡＤ）アルツハイマー患者の不死化リンパ球に特徴的に発現するｐ５３の立体構造変化アイソフォームを識別することができる。

アルツハイマーと診断された患者、及びＭＣＩと診断された軽度認知障害被験者の鮮血の試料において、２Ｄ３Ａ８抗体により認識されるｐ５３の立体構造変化アイソフォーム（２Ｄ３Ａ８陽性ｐ５３）をＥＬＩＳＡにより評価した。また、同齢の健常で痴呆のない被験者も評価した。

２Ｄ３Ａ８陽性ｐ５３は、同じ患者又は被験者の血液細胞（ＰＢＭＣ）及び血清の両方で検出された。２Ｄ３Ａ８抗体は、アルツハイマー患者を高い特異性で認識することができる。興味深いことに、軽度認知障害被験者においては、２Ｄ３Ａ８陽性ｐ５３の血清濃度が、対照被験者に存在するタンパク質アイソフォーム濃度よりも統計的に高い。アルツハイマー患者のＰＢＭＣ及び血清において、２Ｄ３Ａ８陽性ｐ５３アイソフォームは、対照と比較して、統計的に増加した（図３）。

２Ｄ３Ａ８陽性ｐ５３アイソフォームは、年齢に相関する。

加齢に伴い、血液細胞（ＰＢＭＣ）における２Ｄ３Ａ８陽性ｐ５３の発現は、統計的に有意に増加する（図４）。

さらに、２Ｄ３Ａ８陽性ｐ５３の発現は、周知の神経心理学的検査であるＭＭＳＥにより測定される認知状態に相関する。ＭＭＳＥ検査で得られた得点の減少に伴い、２Ｄ３Ａ８陽性ｐ５３アイソフォームは増加する。すなわち、認知障害の進行に伴い増加する（図５）。

Claims (10)

1. 配列がＲＲＴＥＥＥＮＬＲＫＫＧＥＰＨＨ（配列番号１）であり、且つ、アルツハイマー病患者、アルツハイマー病を発症する疾病素質を有する軽度認知障害患者、又は加齢に伴い認知障害を発症する疾病素質を有する患者に特徴的なｐ５３タンパク質の立体構造変化アイソフォームで露出するヒトｐ５３の直線状エピトープに、特異的に結合することを特徴とする抗ヒトｐ５３抗体であって、
   （ｉ）ウシ血清アルブミンと結合させた、配列がＣＲＴＥＥＥＮＬＲＫＫＧＥＰＨＨ（配列番号２）である前記ヒトｐ５３タンパク質のペプチドを含む免疫原を用い、非ヒト動物に免疫処置する工程；と
   （ｉｉ）免疫処置で得られた前記抗体を単離する工程と、
   により調製される、抗ヒトｐ５３抗体。
2. モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
3. 配列がＲＲＴＥＥＥＮＬＲＫＫＧＥＰＨＨ（配列番号１）であり、且つ、アルツハイマー病患者、アルツハイマー病を発症する疾病素質を有する軽度認知障害患者、又は加齢に伴い認知障害を発症する疾病素質を有する患者に特徴的なｐ５３タンパク質の立体構造変化アイソフォームで露出するヒトｐ５３の直線状エピトープに、特異的に結合することを特徴とする抗ヒトｐ５３抗体を調製する方法であって、
   （ｉ）ウシ血清アルブミンと結合させた、配列がＣＲＴＥＥＥＮＬＲＫＫＧＥＰＨＨ（配列番号２）である前記ヒトｐ５３タンパク質のペプチドを含む免疫原を用い、非ヒト動物に免疫処置する工程；と
   （ｉｉ）免疫処置で得られた前記抗体を単離する工程と、
   により特徴付けられる方法。
4. 少なくとも請求項１又は２に記載の抗体、及び前記抗体のヒトｐ５３タンパク質への結合を検出する手段を含む、イムノアッセイキット。
5. 前記野生型ヒトｐ５３タンパク質に対する翻訳後修飾により、立体構造的に変化した試料中の前記ヒトｐ５３タンパク質のアイソフォームを検出するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、前記試料が請求項１又は２に記載の少なくとも１つの抗体と接触すること、前記ヒトｐ５３タンパク質及び前記抗体の免疫複合体の形成が、前記試料において検出されることを特徴とする方法。
6. 被験者におけるアルツハイマー病を診断するためのｉｎ ｖｉｔｒｏキットであって、
   少なくとも請求項１又は２に記載の抗体、及び前記抗体のヒトｐ５３タンパク質への結合を検出する手段を含み、
   前記診断は、
   （ｉ）前記被験者の生体試料を、請求項１又は２に記載の少なくとも１つの抗ヒトｐ５３抗体と、前記ヒトｐ５３タンパク質及び前記少なくとも１つの抗体の免疫複合体の形成に適当な条件下で接触させる工程；と
   （ｉｉ）前記ヒトｐ５３タンパク質及び前記少なくとも１つの抗体の免疫複合体の形成を検出する工程と、により特徴付けられ、
   前記免疫複合体の形成はアルツハイマー病を示す、キット。
7. 軽度認知障害である被験者のアルツハイマー病を発症する疾病素質を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏキットあって、少なくとも請求項１又は２に記載の抗体、及び前記抗体のヒトｐ５３タンパク質への結合を検出する手段を含み、
   前記決定は、
   （ｉ）前記被験者の生体試料を、請求項１又は２に記載の少なくとも１つの抗ヒトｐ５３抗体と、前記ヒトｐ５３タンパク質及び前記少なくとも１つの抗体の免疫複合体の形成に適当な条件下で接触させる工程；と
   （ｉｉ）前記ヒトｐ５３タンパク質及び前記少なくとも１つの抗体の免疫複合体の形成を検出する工程と、により特徴付けられ
   前記免疫複合体の形成はアルツハイマー病を発症する疾病素質を示す、キット。
8. 加齢に伴い認知機能不良となる被験者の疾病素質を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏキットであって、少なくとも請求項１又は２に記載の抗体、及び前記抗体のヒトｐ５３タンパク質への結合を検出する手段を含み、
   前記決定は、
   （ｉ）前記被験者の生体試料を、請求項１又は２に記載の少なくとも１つの抗ヒトｐ５３抗体と、前記ヒトｐ５３タンパク質及び前記少なくとも１つの抗体の免疫複合体の形成に適当な条件下で接触させる工程；と
   （ｉｉ）前記ヒトｐ５３タンパク質及び前記少なくとも１つの抗体の免疫複合体の形成を検出する工程と、により特徴付けられ、
   前記免疫複合体の形成は加齢に伴い認知機能不良となる疾病素質を示す、キット。
9. 前記生体試料が、血液、血漿、血清、唾液、尿、神経細胞又は血液細胞である、請求項５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
10. 前記検出が、免疫沈降反応技術、イムノアッセイ、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、又は免疫細胞化学／免疫組織化学技術により実施される、請求項５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。

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