JP2002531396A - ｐ５３ファミリーのタンパク質の配座安定性を回復するための方法及び組成物 - Google Patents

ｐ５３ファミリーのタンパク質の配座安定性を回復するための方法及び組成物

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JP2002531396A JP2000584871A JP2000584871A JP2002531396A JP 2002531396 A JP2002531396 A JP 2002531396A JP 2000584871 A JP2000584871 A JP 2000584871A JP 2000584871 A JP2000584871 A JP 2000584871A JP 2002531396 A JP2002531396 A JP 2002531396A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、癌治療の分野にある。特に、本発明は、その突然変異体タンパク質が他の亘大分子と適正に相互作用する能力を保持し、それによりその野生型の活性を有する全部又は部分を回復させ又は安定化させるように、癌関連調節タンパク質の突然変異及び非突然変異形態と相互作用することができる医薬化合物を提供する。調節タンパク質は、ｐ５３タンパク質ファミリーのメンバー、例えば、ｐ５３、ｐ６３、及びｐ７３を含む。本発明に係る化合物は、癌治療のために有用である。上記の薬理学的化合物をスクリーニングする方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 Ｉ．産業上の利用分野 本発明は、癌治療の分野にある。本発明は、ｐ５３ファミリーの腫瘍サプレッ
サータンパク質と相互作用し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチ
ド化合物を提供する。本発明は、このようなタンパク質の機能的能力を矯正する
ことが癌に対する治療を促進し得る患者における腫瘍サプレッサータンパク質の
突然変異体形態を安定化するために特に適用可能である。このような化合物に関
するスクリーニング方法も提供される。
【０００２】 ＩＩ．発明の背景 本発明の主構造は、一緒に連結されてタンパク質のポリペプチド鎖（単数また
は複数）を形成するアミノ酸構築ブロックの特定の配列である。これらのポリペ
プチド鎖は次に、三次元構造に折り畳まれる。多数の種々の疾患は、細胞タンパ
ク質の三次元構造の配座摂動から起きる、と目下考えられている（再検討のため
には、Thomas et al., 1995, TIBS 20:456-459; Carrell et al., 1997, Lancet
350:134-138参照）。例えば、アルツハイマー病は、β−アミロイドタンパク質
のミスフォールディングおよびその後の凝集により引き起こされて、細胞機能の
損傷をもたらす。同様に、クロイツフェルト−ヤーコブ病に関する病原因子であ
るプリオンは、連鎖反応を開始して、正常プリオンタンパク質をミスフォールド
プリオンタンパク質に転換することにより疾患を引き起こすと考えられる。
【０００３】 異常配座を取り入れるタンパク質は、それらが内在的にミスフォールディング
を受けやすいために、またはそれらが、野生型タンパク質と比較して突然変異体
タンパク質を熱力学的に不安定にする突然変異を有するために、そうし得る。疾
患を引き起こすミスセンス変異の最初の例は、腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５
３である。
【０００４】 野生型ｐ５３は、細胞周期、アポトーシスおよび新脈管形成における多重経路
を協調的に制御するための転写調節因子として機能する。細胞ストレス、例えば
ＤＮＡ損傷、有糸分裂紡錘体ミスアッセンブリーおよび低酸素症を監視する細胞
経路はすべて、ｐ５３に収斂するように見える。ｐ５３の損失は、罹患細胞およ
び腫瘍増殖の非制御化増殖をもたらし得る。ｐ５３活性の損失は、それ自体、癌
性細胞に細胞を形質転換するための引き金であり得るし、そうでないこともある
が、しかし、検出可能な癌は、ｐ５３突然変異を有するヒトにおいてより一般的
であり、そして増殖するようである。実際、ｐ５３の突然変異体は、癌における
最も一般的な遺伝子異常である。
【０００５】 近年、ｐ５３と相同を有する２つの付加的タンパク質、ｐ７３およびｐ６３が
同定された（再検討のためには、Kaelin, 1999, J. Natl. Cancer Inst. 91:594
-598参照；Yang et al., 1998, Molecular Cell 2（3）:305-16;およびYoshikaw
a et al., 1999, Oncogene18（22）:3415-21も参照）。ｐ５１は、ｐ４０、ｐ５
１、ＫＥＴまたはｐ７３Ｌとも呼ばれてきた。これらのタンパク質はｐ５３とア
ミノ酸配列相同を共有するだけでなく、それらはｐ５３応答性プロモーターを活
性化し、アポトーシスを誘導し得る。さらに、これらのタンパク質をコードする
遺伝子は、ｐ５３と先祖が関連があると思われる。したがって、同様の機能およ
び関連アミノ酸配列を有するタンパク質関連ｐ５３の当業界で認識されたファミ
リーが存在する。
【０００６】 ｐ５３は、３つの別々の機能的ドメイン：即ち、転写活性化ドメインを含むＮ
末端（ほぼアミノ酸1〜43）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）をコードする中央
部分（ほぼアミノ酸100〜300）およびオリゴマー形成ドメインとして役立つＣ末
端部分（ほぼアミノ酸319〜360）を有する複合高分子である。ｐ５３ＤＢＤの結
晶構造は、高βシート含量を有するほぼ球面球形のドメインを示す。
【０００７】 ｐ５３活性は、その機能的配座を保持するタンパク質の能力に大いによってい
る。多数の異なる癌由来腫瘍の分析は、ＤＢＤが高頻度に突然変異化されること
を明示する（Friedlander et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:25468-25478）。
主な癌のｐ５３ＤＮＡ結合ドメインないに生じる多数の種々の点突然変異が存在
する（Pavletich et al., 1993, Genes & Development 7, 2556-2564）が、しか
しホットスポットとして知られているｐ５３ＤＢＤ内の特定残基位置は、通常、
高出現率で突然変異化される。ヒト腫瘍に一般的に見出されるホットスポット突
然変異は、ＤＢＤ全体に多少無作為に分散される。尿素に曝露されると、すべて
の高頻度突然変異化形態のｐＤＮＡのｐ５３ＤＢＤは、野生型ＤＢＤより安定性
が低くなる（Bullock et al.上記）。さらに、ｐ５３突然変異体はしばしば、細
胞中の熱ショックタンパク質と会合して、それらがネイティブ配座を保持するこ
とがほとんどできないという推測を導く（Finlay et al., 1988, Molecular and
Cellular Biology 8:531-39）。
【０００８】 ｐ５３のＣ末端ドメインとの相互作用は、ｐ５３の細胞周期停止特性を活性化
することが見出されている。特に、細胞周期進行中細胞中へのＣ末端特異的ｐ５
３抗体の注入は、それらを停止し得る（Mercer et al., 1982,Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 79:6309-6312 ）。さらに詳細な研究は、Ｃ末端ドメインがＤＢＤド
メインのＤＮＡ結合活性を調節することを実証した。例えば、Hupp等は、ｐ５３
Ｃ末端ドメインの残基373〜381と相互作用するモノクローナル抗体Ｐａｂ421が
ｐ５３のある種の突然変異体形態のＤＮＡ結合活性を増強し得ることを見出した
（Hupp et al., 1993, Nucleic Acids Research 21:3167-3174）。したがって、
Huppと同僚等は、ｐ５３機能を回復するための試みにおいて、別々の負の調節ド
メインを中和する抗体およびペプチドに焦点を合わせた（Selivanova et al.,19
97, Nature Med. 3, 632-638）。しかしながら、このアプローチにより回復され
る位置273突然変異は、それらが高基礎ＤＮＡ結合活性を保持し、野生型タンパ
ク質と同様の熱力学的安定性特徴を示す他の一般的突然変異体と異なる（Bulloc
k et al., 1997,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14338-143421）。
【０００９】 当分野のその他の研究者は、突然変異体ｐ５３のＮ末端ドメインを結合する化
合物の開発が、野生型ｐ５３活性を救援するための最も有効な手段であると論じ
ている。例えば、Friedlander等は、感温性ｐ５３突然変異体のＤＮＡ結合活性
を促進する能力に関して、ｐ５３上の限定エピトープと結合した多数の異なるモ
ノクローナル抗体を試験した（Friedlander et al., 1996, J. Biol. Chem. 271
, 25468-25478）。Ｃ末端特異的抗体ＰＡｂ421は低温で突然変異体ｐ５３にＤＮ
Ａ結合機能を回復したが、一方、Ｎ末端特異的ｐ５３抗体、特にモノクローナル
抗体Ｐａｂ1801は、高温での感温性ｐ５３突然変異体のＤＮＡ結合活性の促進に
より有効であった。これらの知見に基づいて、Ｎ末端との結合により1801エピト
ープ認識領域によく似る小分子の開発は、突然変異体ｐ５３中での野生型ＤＮＡ
結合活性を促進する、とFriedlander等は推測した。特に、Friedlander等は、ｐ
５３タンパク質の中心部分（ＤＢＤドメイン）におけるエピトープに特異的な抗
体がＤＮＡ結合活性に影響を及ぼさないことを実証した。それらの結果の説明の
１つとして、タンパク質内の一ドメインの配座が離れたドメインを用いることに
より安定化される、とFriedlander等は仮定した。一般的に生じるｐ５３ＤＮＡ
結合ドメイン突然変異体における熱力学的安定性の変化はかなり小さい、とBull
ock等は実証し、Friedlander等により示唆されたようなｐ５３に関する小分子療
法の開発（即ち、Ｎ末端と結合する分子）は実行可能であると推測した（Bulloc
k et al., 1997、上記）。
【００１０】 抗癌化合物を同定するためのその他のより包括的アプローチは、細胞ベース検
定（例えば、腫瘍細胞株）または動物検定における小分子の直接抗腫瘍活性の検
定に集中した。考え得る抗腫瘍活性を有する多数の小分子が記載されている（Ma
zerska et al., 1990, Anti-Cancer Drug Design 5, 169-187; Su et al., 1995
, J. Med. Chem. 38, 3226-3235; Nagy et al., 1996, Anticancer Research 16
, 1915-1918; Wuonola et al., 1997, Anticancer Research 17, 3409-23）。Ma
zerska等は、その抗腫瘍特性がＤＮＡを結合し、共有的鎖間架橋を生じるそれら
の能力に寄与するアクリジン基と結合したニトロ基を有する一連のニトロ−９−
アミノアクリジンを記載する。Su等は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤として開発
された、置換された種々の位置のアニリノおよびアクリジン環系を有する一連の
９−アニリノアクリジン誘導体を記載する。Nagy等は、短炭素リンカーを介して
尿素またはフタルイミドベースの基に結合される一連のフェノチアジン関連化合
物を記載する。この種類の化合物の抗腫瘍細胞活性は、カルシウムチャンネルお
よびカルモジュリンと反応するそれらの能力に由来する、とNagy等は推測した。
Wuonola等（上記）は、Nagy等（上記）が記載した化合物と同様のフェノチアジ
ン化合物を記載する。
【００１１】 今日まで、腫瘍抑制活性のような野生型活性を回復または安定化するためにｐ
５３ファミリーのタンパク質と相互作用する小有機非ペプチド分子は報告されて
いない。さらに、このような化合物の発見は、高スループットスクリーンまたは
検定の欠如により妨げられてきた。 ＩＩＩ．発明の要約 ヒトの疾患と関連する熱力学的不安定タンパク質またはミスフォールディング
タンパク質を配座的に安定化し得る化合物を同定することの重要性を認識し、こ
のような化合物が迅速に同定される高スループット検定の欠如を認識して、本発
明人は、突然変異体ｐ５３を配座的に安定化する作用物質を迅速に同定するため
のモデル系として、in vitroおよびin vivo検定における単離突然変異体ｐ５３
ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）の使用を研究した。本発明は、ｐ５３ファミリー
のタンパク質中の野生型活性を促進するヒト製剤を含めた化合物を客観的に同定
するための迅速で、信頼性があり且つ正確な方法を提供する。
【００１２】 したがって、本発明は、非ペプチド有機化合物がｐ５３ファミリーのタンパク
質と相互作用し、そしてその野生型活性を促進し得る、という最初の例証を提供
する。生理学的温度またはその付近で、これらの活性化合物は、種々の突然変異
体ｐ５３タンパク質だけでなく、野生型ｐ５３タンパク質においても、ｐ５３の
野生型活性を促進した。このような化合物は、抗癌薬としての重要な用途を有す
る。したがって、本発明は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の突然変異体または
野生型活性による癌の抗腫瘍療法に有用な新規のアプローチおよび化合物を提供
する。
【００１３】 一局面において、本発明は、突然変異体形態のｐ５３ファミリーのヒトタンパ
ク質中の野生型活性を促進する方法であって、生理学的条件下での機能的配座を
保持する前記タンパク質の無能力により前記タンパク質の１つ又はそれ以上の機
能的活性が少なくとも部分的に減損される方法であって、生理学的条件下で突然
変異体タンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合し、そこでの機能的配
座を安定化し得る有機非ペプチド化合物と突然変異体タンパク質を接触させて、
そして安定化タンパク質を野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質
と相互作用させる工程からなる方法を提供する。ｐ５３ファミリーのヒトタンパ
ク質は、例えばｐ５３、ｐ６３またはｐ７３であり得る。好ましい実施態様では
、有機非ペプチド化合物はｐ５３と、さらに好ましくはｐ５３のＤＮＡ結合ドメ
インとさえ相互作用する。
【００１４】 本発明は、別の実施態様では、１つ又はそれ以上の野生型活性低減を示すｐ５
３ファミリーの突然変異体タンパク質の発現に関連した疾患状態に対するヒト被
験者の治療方法であって、生理学的条件下で突然変異体タンパク質中の１つ又は
それ以上のドメインと結合し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチ
ド化合物を被験者に投与して、そして患者中の安定化タンパク質を野生型活性に
関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程を包含する方法も
提供する。さらに別の実施態様では、本発明は、癌に対するヒト被験者の治療方
法であって、生理学的条件下でｐ５３ファミリーのヒトタンパク質中の１つ又は
それ以上のドメインと結合し得る有機非ペプチド化合物を被験者に投与して、そ
こでの機能的配座を安定化し、そして安定化タンパク質をタンパク質の野生型活
性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程を包含する方
法を提供する。
【００１５】 別の局面では、本発明に用いるための有機非ペプチド化合物は、特定長のリン
カーにより一緒に結合される疎水性基（例えば、平面多環式）および陽イオン性
基（好ましくはアミン）の両方を含有する化合物であり得る。 好ましい局面では、本明細書中で用いるための有機非ペプチド化合物は、以下
の：
【００１６】
【化３５】
【００１７】 からなる群から選択されるが、この場合、Ｉ基：
【００１８】
【化３６】
【００１９】 に関しては、 Ｒ5は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19 （ここで、Ｒ18はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2 ）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍ
は０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アル
キルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロ
アリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又は
それ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アル
キル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシ
クロアルキルまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に
置換される）から選択されるか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、 Ｒ6は、 （ａ）各々任意に１つ又はそれ以上のフェニル基により置換される（Ｃ1〜
Ｃ6）アルキルまたは（Ｃ2〜Ｃ8）アルケニル、 （ｂ）ハロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシにより置換されるフェニル であり、 Ｒ7およびＲ8は同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコ
キシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンであり、 ＩＩ基：
【００２０】
【化３７】
【００２１】 に関しては、 Ｒ9は−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニル
（ここで、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ
、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−
（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−
（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０
〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル
である）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）
アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル
、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキ
ル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、
アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ
、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル）または（Ｃ1〜Ｃ 6 ）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択される）
であり、 ＩＩＩ基：
【００２２】
【化３８】
【００２３】 に関しては、 Ｒ10は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフ
ェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2 ）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍ
は０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アル
キルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロ
アリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又は
それ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アル
キル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシ
クロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1
〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択され
るか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、 ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そし
て Ｒ11およびＲ12は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
ルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから
選択され、 ＩＶ基：
【００２４】
【化３９】
【００２５】 に関しては、 Ｒ13は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフ
ェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2） p −（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは
０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキ
ルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロア
リール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ 6 ）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ
、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
ルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜
Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜
Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、 ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そし
て Ｒ14およびＲ15は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
ルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから
選択され、 Ｖ基：
【００２６】
【化４０】
【００２７】 に関しては、 Ａは炭素または窒素であり、 Ｒ16は、−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたは
フェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2） p −（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは
０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキ
ルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロ
アリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）ア
ルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ
、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
ルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜
Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜
Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、そして Ｒ17は、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロま
たはブロモから選択されるハロゲンから選択される。
【００２８】 さらに、本発明の実施に有用な多数の化合物はそれ自体新規であり、このよう
な化合物についてのその場合の説明は、本発明のさらなる局面を定義する。 本発明は、別の局面で、ｐ５３ファミリーの野生型活性を促進するさらに別の
化合物の設計方法も提供する。本方法は、仮定を説明するために本発明の活性化
合物の１つを用いて、仮定に適合する候補化合物を同定し、そして候補化合物が
ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性を促進するか否かを確定することを
必然的に伴う。
【００２９】 本発明の別の局面は、ｐ５３ファミリーのタンパク質とそのタンパク質と相互
作用し、そのタンパク質の野生型活性を促進する非ペプチド化合物との複合体を
包含する組成物である。 さらに別の局面では、本発明は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性
を促進する化合物に関するスクリーニング方法を提供する。好ましい局面では、
本方法は、ｐ５３ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用する化合物に関して
検定し、本化合物の存在下でｐ５３ＤＢＤの配座を測定することを包含する。し
かしながら、本発明は、スクリーニングのこのような方法におけるｐ５３ファミ
リーの全長および部分タンパク質の使用も意図する。特定の実施態様では、検定
および測定工程は、同時に実施される。ｐ５３ファミリーの突然変異体形態のタ
ンパク質中の野生型活性を促進することが発見された化合物は、任意に、腫瘍増
殖を停止または抑制するそれらの能力に関してin vivoでスクリーニングされる
。本発明の別の局面は、ｐ５３ＤＢＤとの特異的相互作用に関して有機非ペプチ
ド化合物をスクリーニングすることによる薬剤発見方法である。
【００３０】 ｐ５３ファミリーの突然変異体または野生型タンパク質中での野生型活性を促
進する化合物の同定での本発明の成功は、本発明の方法が、配座的欠陥または不
安定タンパク質により誘導される種類の疾患のための薬剤発見に広範に適用可能
であることを実証する。このようなタンパク質標的の例としては、ｐｐ６０src
、ユビキチン活性化酵素Ｅ１、嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス調節因子、ヘ
モグロビン、プリオンタンパク質、セルピンおよびβ−アミロイドタンパク質が
挙げられる。
【００３１】 Ｖ．発明の詳細な説明 腫瘍サプレッサー遺伝子生成物ｐ５３における機能損失は、多数の異なる種類
の癌において観察される非制御化増殖および／またはアポトーシスの損失を引き
起こし得る。ｐ５３が癌細胞中で突然変異化されない場合でも、このような細胞
中での野生型ｐ５３活性促進は、癌性表現型を抑制し得る。本発明は、有機非ペ
プチド化合物がｐ５３ファミリーのタンパク質と相互作用して、そこでの機能的
配座を安定化し得る、ということを初めて実証する。したがって、このような化
合物は、すべての種類の癌の治療のための製剤としての重要な用途を有する。
【００３２】 したがって、一局面において、本発明は、突然変異体形態のｐ５３ファミリー
のヒトタンパク質における野生型活性の促進方法であって、生理学的条件下での
機能的配座を保持するタンパク質の無能力によりタンパク質の１つ又はそれ以上
の機能的活性が少なくとも部分的に減損される方法であって、生理学的条件下で
突然変異体タンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合し、そこでの機能
的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物と突然変異体タンパク質を接触させ
て、そして安定化タンパク質を野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子
物質と相互作用させる工程からなる方法を提供する。ｐ５３ファミリーの突然変
異体ヒトタンパク質は、突然変異体ｐ５３、ｐ６３およびｐ７３タンパク質であ
り得る。好ましい実施態様では、有機非ペプチド化合物は、ｐ５３と、さらに好
ましくはｐ５３のＤＮＡ結合ドメインと相互作用する。
【００３３】 本発明は、別の実施態様では、１つ又はそれ以上の野生型活性低減を示すｐ５
３ファミリーの突然変異体タンパク質の発現に関連した疾患状態に対するヒト被
験者の治療方法であって、生理学的条件下で突然変異体タンパク質中の１つ又は
それ以上のドメインと結合して、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプ
チド化合物を被験者に投与し、そして患者中の安定化タンパク質を野生型活性に
関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程を包含する方法も
提供する。
【００３４】 さらに別の実施態様では、本発明は、癌に対するヒト被験者の治療方法であっ
て、生理学的条件下でｐ５３ファミリーのヒトタンパク質中の１つ又はそれ以上
のドメインと結合し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物
を被験者に投与して、そして安定化タンパク質をタンパク質の野生型活性に関与
する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程を包含する方法を提供
する。本発明の方法で安定化されるｐ５３ファミリーのヒトタンパク質は、野生
型または突然変異体タンパク質、例えばｐ５３、ｐ６３またはｐ７３であり得る
。
【００３５】 ｐ５３ファミリーのタンパク質は種々の癌中で突然変異体であるが、しかしそ
れでもいくつかの癌または癌細胞型では、ｐ５３（ｐ５３それ自体が最も多数の
試験を受けている）ファミリーのタンパク質の構造または機能は、関与細胞が野
生型コード対立遺伝子を保持する場合でも、変更される。例えば、ウイルスタン
パク質がｐ５３タンパク質を分解するか、あるいはｐ５３が、例えば癌遺伝子の
発現生成物により不活性化されるかまたは分解されるウイルス関連癌の考察に関
しては、Kaelin（1999）を参照していただきたい。細胞調節工程におけるｐ５３
ファミリーのタンパク質の重要性が示された場合、このようなタンパク質の寿命
および／または構造および／または活性が正常である細胞中で生理学的条件下で
、本発明の化合物が非突然変異体ｐ５３ファミリー成員の機能的配座を安定化す
るのにも有用である、ということは明らかである。したがって、本発明の化合物
は、ｐ５３タンパク質および同様の物質の機能が眼精状態の存在により実質的に
影響を及ぼされない癌の治療において、ならびにその異常が未だ異常ｐ５３（ま
たはｐ５３ファミリー成員）の機能、寿命または構造に検出可能的に拡がってい
ない前癌細胞を発現する組織の治療においても有用である。さらに、悪性疾患の
部位に隣接するか、そうでなければ身体中の悪性細胞と接触するようになる健常
細胞中のｐ５３ファミリーのタンパク質をさらに安定化する（例えば、寿命を増
大させる）ことにより、癌の拡張が制御され得る。本発明の化合物は、この点で
も有用である。
【００３６】 本発明の実施によれば、ｐ５３ファミリーのタンパク質は、哺乳類ｐ５３、ｐ
６３またはｐ７３、および／または１つ又はそれ以上の（１）転写活性化に必要
とされるＮ末端ドメイン、（２）ＤＮＡ結合ドメイン、または（３）哺乳類ｐ５
３、ｐ６３またはｐ７３のオリゴマー形成ドメインと少なくとも50％、さらに好
ましくは80％のアミノ酸配列相同をすべてが有するドメインを保有するタンパク
質と定義され、この場合、前記の相同は、認可アルゴリズムBLASTP v.2.0（www.
ncbi.nlm.nih.gov）（Altschul et al., 1990, J. of Molec. Biol., 215:403-4
10, "The BLAST Algorithm"; Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25:338
9-3402）およびW.U.-BLAST-2.0（Washington University, St. Louis, MO, USA
から利用可能）のいずれかにより測定され、そして前記のタンパク質は、ｐ５３
、ｐ６３またはｐ７３の特性を示していると当業界で認識される少なくとも１つ
の機能（例えば、ｐ５３応答性プロモーターを活性化し、アポトーシスを誘導す
る能力。当業界認知特性に関しては、前記で引用したKaelin, 1999; Yang et al
., 1998;およびYoshikawa et al., 1999参照）を立証する。BLAST, Smith-Water
manおよびFASTAアルゴリズムの手法および利点についての一般的考察に関しては
、Nicholas et al., 1998, "A Tutorial on Searching Sequence Databases and
Sequence Scoring Methods"（www.psc.edu）およびそこに引用された参考文献
を参照されたい。
【００３７】 ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型配座を安定化する化合物は、ｐ５３フ
ァミリーのタンパク質との接触時に、タンパク質の野生型活性、例えばＤＮＡ結
合親和性または任意の高分子物質と相互作用する能力を促進または回復してｐ５
３ファミリーのタンパク質の正常機能を実行する化合物である。ｐ５３のその他
の野生型活性としては、転写活性化活性（例えば、ＷＡＦ１誘導）、細胞周期停
止およびアポトーシス誘発が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】 さらに別の局面において、本発明は、腫瘍増殖を抑制しおよび／または癌を治
療するための本発明の化合物の使用を含む。本発明の特有の利点は、本明細書中
の方法を用いてそのように同定された化合物が、スクリーンに用いられる野生型
ｐ５３ＤＢＤおよび突然変異体ＤＢＤだけでなく、他の突然変異体ｐ５３および
ｐ５３ＤＢＤの活性配座も安定化することが示されていることである。したがっ
て、そのように同定された化合物は、種々の癌の治療に際して、広範な適用可能
性を有する。
【００３９】 本発明は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型配座を促進し、ｐ５３ファ
ミリーの突然変異体タンパク質に対して野生型活性を回復し得る化合物に関する
スクリーニングの新規の方法も提供する。本発明の方法を用いて同定される化合
物は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の活性の欠陥と関連する癌のような疾患を
治療するのに有用である。
【００４０】 本発明の方法は、ｐ５３ファミリーのタンパク質と直接接触するものに関して
化合物をスクリーニングすることを含む。このような方法は、スクリーニング目
的のためのｐ５３ファミリー（突然変異体または野生型）の全長タンパク質、あ
るいは少なくともＤＢＤを、そして任意にＮ末端および／またはＣ末端ドメイン
を含有する欠失誘導体を用い得る。しかしながら、本発明の好ましい局面では、
スクリーンは、無傷ＮまたはＣ末端ドメインを伴わずにＤＢＤのみを含有するｐ
５３ファミリーのタンパク質のポリペプチド断片を使用する。したがって、本出
願のために、「ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＤＢＤ」という用語は（別記しな
い限り）、無傷ＮまたはＣ末端を伴わずにただｐ５３ファミリーのタンパク質の
ＤＢＤを含むものと理解される。しかしながら、このようなＤＢＤドメインは、
検定フォーマットによって異種ポリペプチドと融合され得る（例えば、ＦＬＡＧ
エピトープまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質）。したが
って、ＤＮＡ結合に及ぼす負の調節作用を単に除去するというよりむしろ、本発
明の方法および化合物は、ｐ５３ファミリーの野生型および突然変異体タンパク
質の両方の配座安定性の増強を促進する。
【００４１】 したがって、非限定的実行例により以下に説明される一局面において、本発明
は、ｐ５３ＤＢＤと特異的に相互作用する化合物に関してスクリーニングし、そ
して被験化合物の存在下でｐ５３ＤＢＤの配座を測定する方法を提供する。任意
に、ｐ５３ＤＢＤは、突然変異体ｐ５３ＤＢＤである。しかしながら、野生型ｐ
５３ＤＢＤは、大量に過剰生成するのがより容易である。スクリーニング検定は
細胞ベースのフォーマットで実施され得るが、しかしｐ５３ＤＢＤを標的にする
化合物に特異的な高スループットスクリーンに関しては、in vitroベースの検定
が最も直接的で且つ望ましい。ｐ５３ＤＢＤに対する初期スクリーンで同定され
た化合物は、無傷ｐ５３（ｐ５３ミスセンス突然変異体を含む）の機能に及ぼす
それらの作用に関してさらに検査され得る。これらの方法を用いて同定される化
合物も、本発明の範囲内である。
【００４２】 本発明の目的で、ｐ５３ファミリーのタンパク質のＤＮＡ結合ドメインと相互
作用する化合物に関する検定は、包含されない化合物がＤＢＤを特異的に標的と
し、タンパク質の他のドメインを標的としないものであるよう意図される。例え
ば、ＤＢＤと特異的に「相互作用する」かまたはそれに「作用を及ぼす」化合物
は、必ずしもＤＢＤと安定的に結合しないという必要はない（しかし、それもあ
り得る）。化合物の存在下でｐ５３ファミリーのタンパク質の配座に及ぼす何ら
かの作用を化合物が有することで十分である。したがって、化合物は、ＤＢＤと
の相互作用に関して先ずスクリーニングされ、次に、配座に及ぼすそれらの作用
に関して検定されるか、あるいはこれら２つのスクリーニング工程は、ＤＢＤと
の相互作用も検出するために、化合物の存在下で配座的変化を用いることにより
同時に実施され得る。
【００４３】 特異的相互作用という用語は、本出願においては、非選択的疎水性相互作用に
より疎水性化合物とタンパク質との間に起こることが知られている種類のものを
含めた非特異的形態の結合を排除するために用いられる。特異的相互作用という
用語はさらに、バルク溶媒の化学特性を変えることによりタンパク質熱安定性に
影響を及ぼす化合物と穂亜反応化合物の特性を区別するために用いられる。した
がって、本発明のこの局面の範囲から除外されるこのような分子としては、熱安
定化剤、例えばグリセロール、トリメチルアミン−オキシドおよび重水素水が挙
げられる。ｐ５３ファミリーのタンパク質と特異的に相互作用する化合物は、こ
のようなバルク溶媒または非特異的疎水性相互作用より非常に低い濃度で作用を
示す。例えば、グリセロールは、600 mMで有効である。しかしながら、ｐ５３フ
ァミリーのタンパク質と特異的に相互作用する化合物の作用は、in vitroまたは
細胞ベース検定において、1 mMより低い、好ましくは100μMより低い、さらに好
ましくは10μMより低い化合物の濃度で観察される。
【００４４】 本発明の実施に関連して、以下の定義が一般的に適用する。「アルキル」とい
う用語は、本明細書中で用いられる場合、別記しない限り、直鎖、分枝鎖または
環状部分あるいはそれらの組合せを有する飽和一価炭化水素基を含む。同様に、
「アルケニル」および「アルキニル」という用語は、それぞれ少なくとも１つの
二重結合または少なくとも１つの三重結合が存在する直鎖、分枝鎖または環状部
分を有する炭化水素基を定義する。このような定義は、アルキル、アルケニルま
たはアルキニル基が別の基、例えばアルコキシまたはアルキルアミン内に存在す
る場合にも適用する。「アルコキシ」という用語は、本明細書中で用いられる場
合、「アルキル」が前記と同様であるＯ−アルキル基を含む。「ハロ」という用
語は、本明細書中で用いる場合、別記しない限り、フルオロ、クロロ、ブロモま
たはヨードを含む。
【００４５】 説明の便宜上、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルという用語は、本明細書中で用
いる場合、ゼロまたは任意に１つ又はそれ以上の二重結合を有するシクロアルキ
ルおよびシクロアルケニル基の両方を、例えばシクロプロピル、シクロブチル、
シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、１，
３−シクロヘキサジエン、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、ビシクロ［３．
２．１］オクタン、ノルボルナニル等を指す。（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアル
キルは、本明細書中で用いる場合、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒ
ドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、チオピラニル、アジリジニル
、オキシラニル、メチレンジオキシル、クロメニル、イソキサゾリジニル、１，
３−オキサゾリジン−３−イル、イソチアゾリジニル、１，３−チアゾリジン−
３−イル、１，２−ピラゾリジン−２−イル、１，３−ピラゾリジン−１−イル
、ピペリジニル、チオモルホリニル、１，２−テトラヒドロチアジン−２−イル
、１，３−テトラヒドロチアジン−３−イル、テトラヒドロチアジアジニル、モ
ルホリニル、１，２−テトラヒドロジアジン−２−イル、１，３−テトラヒドロ
ジアジン−１−イル、テトラヒドロアゼピニル、ピペラジニル、クロマニル等を
指す。前記の（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル環の結合は、炭素またはｓｐ3 混成化窒素異種原子を介してである、と当業者は理解する。
【００４６】 （Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールは、本明細書中で用いる場合、フリル、チエニル
、チアゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、
ピロリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、１，３，５−オキサジ
アゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１
，３，５−チアジアゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジ
アゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、１，２，４−ト
リアジニル、１，２，３−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル、ピラゾロ
［３，４−ｂ］ピリジニル、シンノリニル、プテリジニル、プリニル、６，７−
ジヒドロ−５Ｈ−［１］ピリンジニル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル、５，６，７
，８−テトラヒドロ−キノリン−３−イル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾ
リル、ベンズイソチアゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンズイミダゾリル、チ
アナフテニル、イソチアナフテニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、イ
ソインドリル、インドリル、インドリジニル、インダゾリル、イソキノリル、キ
ノリル、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、ベンズオキサジニル等
を指す。（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール基の構造の残りの部分との結合は一般的に
炭素原子またはｓｐ2混成異種原子によるが、これらに限定されない、と当業者
は理解する。同様に、フェニルおよびナフチルは、（Ｃ6〜Ｃ10）アリールの代
表的なものである。
【００４７】 図面において、一結合が図示されているが、しかしその遠位端に置かれる基に
関しては同定が成されていない場合、慣用的に認識されているように、メチル基
が意図される。図示されている任意の結合の非存在下では、原子価が許す場合に
は、当業界で容易に理解されるように、その位置は水素により占められる。した
がって、Ｒ−Ｏ−の記述は、Ｒ−Ｏ−ＣＨ3を意味する。
【００４８】 Ａ．ｐ５３ファミリーのタンパク質中の野生型活性を促進する本発明の化合物 本発明の有機非ペプチド化合物は、ｐ５３ファミリーの野生型または突然変異
体タンパク質に曝露されると、そのタンパク質の野生型活性を促進するあらゆる
種類の化合物であり得る。好ましい化合物は、相対的に小型の（50〜150 kDの典
型的タンパク質と比較した場合）有機化合物である。本発明は、ペプチドでない
、そして特に抗体でない、さらにｐ５３と特異的に反応せず、それによりｐ５３
ＤＢＤまたはｐ５３タンパク質の野生型配座を安定化するような化合物を初めて
提供する。ペプチドでない有機化合物は、種々の理由のために、製剤として特に
有用である。例えば、非ペプチド化合物は、ペプチドより非常に低免疫原性であ
り、粘膜またはその他の細胞層バリアにより身体中により容易に吸収され、低不
安定性であり得る。
【００４９】 一局面では、本発明の方法により発見された活性化合物は、特定長のリンカー
により一緒に結合される疎水性基（例えば平面多環式）および陽イオン性基（好
ましくはアミン）の両方を含有する化合物と定義され得る。疎水性位置における
ベンズイミダゾール、ベンゾキノリン、フェノチアジンおよびスチリルキナゾリ
ンが好ましい。
【００５０】 活性陽イオン性基は、第二級および第三級アミンの両方であり、その例として
は、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、メチルアミン、メ
チルピペラジンおよびモルホリンが挙げられるが、これらに限定されない。ある
種の大型アミンは、フェノチアジン疎水性シリーズで試験される場合、相対的に
より活性であった。したがって、この状況では、大型アミンが好ましい。陽イオ
ン性位置の正荷電基は活性であり、好ましい（下記の表１参照）。
【００５１】 本発明のこの局面に関しては、疎水性基および陽イオン性基間の間隔は、少な
くともプロピル長であるべきである。プロピル長より短いリンカーは、特殊検定
条件下では、実質的に低有効性であった（下記の表２参照）。したがって、約3
〜5炭素結合の長さを有するリンカーが好ましい（5〜9オングストローム、さら
に好ましくは6〜8オングストローム）が、しかし、プロピルリンカーの長さ（約
6.5オングストローム）を有するリンカーを含有する化合物が最も活性である。
ブチルリンカーの長さより長いリンカーは、ブチルリンカーの長さを有するリン
カーを含有する対応する化合物より、特殊検定条件下では低有効性であった（表
２）。さらに好ましいのは、的確な距離を保持する分枝鎖リンカーである。この
ようなリンカーは一般に、本検定では、5〜9オングストローム（そして最適には
約6.5オングストローム）の正しいリンカー長を依然として保持する限り、対応
する線状リンカーより活性であった。
【００５２】 したがって、一局面において、本発明の化合物は式： Ｆ1−Ｌ−Ｆ2 を有し、Ｆ1は以下の：
【００５３】
【化４１】
【００５４】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一であるかまたは異なり、そして別々に、水素、ハ
ロゲン、メトキシおよびニトロから成る群から選択される） から成る群から選択され、Ｌは、5〜9オングストロームの長さを有する直鎖また
は分枝鎖アルキルであり、そしてＦ2は第二級または第三級アミンである。別の
局面では、Ｆ2は、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、メ
チルピペラジンまたはモルホリンである。例えば、Ｆ2は、以下の：
【００５５】
【化４２】
【００５６】 （式中、Ｒ4は−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3またはＨである） から成る群から選択されるアミンであり得る。 以下で提示されるのは、本発明の種々の化合物に関する化学構造である。これ
らの化合物の各々は、ほぼ生理学的温度で少なくとも１つの突然変異体ｐ５３Ｄ
ＢＤにおけるｐ５３に対する配座感受性エピトープの安定性を有意に増強するこ
とが見出された。
【００５７】 １．アクリジン
【００５８】
【化４３】
【００５９】
【化４４】
【００６０】 ２．キナゾリン
【００６１】
【化４５】
【００６２】 ３．フェノチアゾール
【００６３】
【化４６】
【００６４】
【化４７】
【００６５】
【化４８】
【００６６】 本明細書中に記載された一般設計原則によれば、本発明の実施に置いては以下
の群：
【００６７】
【化４９】
【００６８】 の化合物が好ましく、この場合、 Ｉ基：
【００６９】
【化５０】
【００７０】 に関しては、 Ｒ5は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19 （ここで、Ｒ18はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
ェニルであって、前記のアルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒ
ドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20 Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（Ｃ
Ｈ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり
、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）
アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロ
アリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又は
それ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アル
キル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシ
クロアルキルまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に
置換される）から選択されるか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、 Ｒ6は、 （ａ）各々任意に１つ又はそれ以上のフェニル基により置換される（Ｃ1〜
Ｃ6）アルキルまたは（Ｃ2〜Ｃ8）アルケニル、 （ｂ）ハロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシにより置換されるフェニル であり、 Ｒ7およびＲ8は同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコ
キシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンであり、 ＩＩ基：
【００７１】
【化５１】
【００７２】 に関しては、 Ｒ9は−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニル
（ここで、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ
、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−
（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−
（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０
〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル
である）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）
アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル
、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキ
ル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、
アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ
、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル）または（Ｃ1〜Ｃ 6 ）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択される）
であり、 ＩＩＩ基：
【００７３】
【化５２】
【００７４】 に関しては、 Ｒ10は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフ
ェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2 ）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍ
は０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アル
キルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロ
アリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又は
それ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アル
キル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシ
クロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1
〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択され
るか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、 ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そし
て Ｒ11およびＲ12は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
ルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから
選択され、 ＩＶ基：
【００７５】
【化５３】
【００７６】 に関しては、 Ｒ13は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフ
ェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2） p −（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは
０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキ
ルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロア
リール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ 6 ）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ
、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
ルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜
Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜
Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、 ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そし
て Ｒ14およびＲ15は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
ルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから
選択され、 Ｖ基：
【００７７】
【化５４】
【００７８】 に関しては、 Ａは炭素または窒素であり、 Ｒ16は、−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたは
フェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2） p −（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは
０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキ
ルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロ
アリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）ア
ルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ
、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
ルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜
Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜
Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、そして Ｒ17は、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロま
たはブロモから選択されるハロゲンから選択される。
【００７９】 本発明の特に好ましい化合物としては、以下の１１個の化合物が挙げられる：
【００８０】
【化５５】
【００８１】 （１−ベンジル−ピペリジン−４−イル）−（３−フェノチアジン−１０−イル
−プロピル）−アミン、
【００８２】
【化５６】
【００８３】 ［２−（４−クロロ−フェニル）−エチル］−（３−フェノチアジン−１０−イ
ル−プロピル）−アミン、
【００８４】
【化５７】
【００８５】 （３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−チオクロマン−４−イル−ア
ミン、
【００８６】
【化５８】
【００８７】 ［１−メチル−３−（２，６，６−トリメチル−クロロヘキス−２−エニル）−
アリル］−（３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、
【００８８】
【化５９】
【００８９】 （７−エトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−（
３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、
【００９０】
【化６０】
【００９１】 Ｎ’−（９−フルオロ−ベンゾ［ｃ］アクリジン−７−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−プロパン−１，３−ジアミン、
【００９２】
【化６１】
【００９３】 Ｎ’−アクリジン−９−イル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１，３−ジアミン
、
【００９４】
【化６２】
【００９５】 ２−｛４−［４−（ベンゾ［ｇ］キノリン−４−イルアミノ）−フェニル］−ピ
ペラジン−１−イル｝−エタノール、
【００９６】
【化６３】
【００９７】 Ｎ4−｛２−［２−（４−ブロモ−フェニル）−ビニル］−７−クロロ−キナゾ
リン−４−イル｝−Ｎ1，Ｎ1−ジエチル−ペンタン−１，４−ジアミン、
【００９８】
【化６４】
【００９９】 Ｎ−ベンゾ［ｇ］キノリン−５−イル−Ｎ‘−クロロヘキシル−プロパン−１，
３−ジアミン、
【０１００】
【化６５】
【０１０１】 ２−［（２−ヒドロキシ−エチル）−（３−｛２−［２−（４−メトキシ−フェ
ニル）−ビニル］−キナゾリン−４−イルアミノ｝−プロピル）−アミノ］−エ
タノール。 本発明の有機非ペプチド化合物は、慣用的技法を用いて合成され得る。 本発明の、そして本発明の方法に用いるための化合物は、ｐ５３ファミリーの
タンパク質の野生型活性を促進する化合物のプロドラッグも含む。プロドラッグ
は、被験動物（特にヒト）に投与した場合に、有意且つ有効量で、活性分子に転
換される化合物である。
【０１０２】 本発明の化合物は、遊離酸、遊離塩基または製薬的に有効なそれらの塩の形態
であり得る。このような塩は、適切な酸で化合物を処理することにより容易に調
製され得る。このような酸としては、例えば無機酸、例えばhydroholic酸（塩酸
、hydrobiomic等）、硫酸、硝酸、リン酸等、および有機酸、例えば酢酸、プロ
パン酸、２−オキソプロパン酸、プロパン二酸、ブタンに酸等が挙げられるが、
これらに限定されない。逆に、塩は、アルカリで処理することにより、遊離塩基
形態に転換され得る。
【０１０３】 Ｂ．治療的終点および投薬量 本発明の方法により同定される化合物は、配座的不安定またはミスフォールド
化タンパク質と関連した疾患の治療に有用である。配座的不安定またはミスフォ
ールド化タンパク質に関連した疾患が知られており、それらの例としては、嚢胞
性繊維症（ＣＦＴＲ）、マルファン症候群（フィブリン）、筋萎縮性側索硬化症
（スーパーオキシドジスムターゼ）、壊血病（コラーゲン）、カエデシロップ尿
病（α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体）、骨形成不全（Ｉ型プロコラ―ゲンプ
ロアルファ）、クロイツフェルト−ヤーコブ病（プリオン）、アルツハイマー病
（β−アミロイド）、家族性アミロイドーシス（リゾチーム）、白内障（クリス
タリン）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体）、アルファ１−抗トリ
プシン欠損症、テイ−サックス病（β−ヘキソサミニダーゼ）、色素性網膜炎（
ロドプシン）および妖精症（インスリン受容体）が挙げられる。もちろん、本明
細書中に記載した方法および化合物は、癌の治療に特に有用であり、そして突然
変異体ｐ５３遺伝子に関連した癌の治療に特に有用である。
【０１０４】 開業医または患者の見解から、疾患状態、特に癌性状態に関連した望ましくな
い症状（例えば、疼痛、感受性、体重減少等）の事実上あらゆる軽減または防止
が望ましい、と当業者は理解する。さらに、癌性状態に関しては、腫瘍塊または
増殖のあらゆる低減が、腫瘍の組織病理学的病像の改善と同様に、望ましい。し
たがって、本出願の目的のために、「治療」、「療法的使用」または「医学的使
用」という用語は、本明細書中で用いる場合、疾患状態または症状を改善するか
、あるいはそうでなければ、どんな方法でも、疾患またはその他の望ましくない
症状の進行を防止し、妨害し、遅延しまたは逆転する特許請求組成物のあらゆる
およびすべての使用を指す。
【０１０５】 有効投薬および治療プロトコールは、慣用的手段により確定され、実験室動物
において低用量で開始し、その後、効力を監視しながら投薬量を増大して、その
上で投薬レジメンを体系的に変更し得る。動物試験、好ましくは哺乳類試験は、
一般に、体重１kg当たりの生物活性物質の最大耐容用量またはＭＴＤを決定する
ために用いられる。当業者は、効力に関して用量を定期的に推定して、ヒトを含
めた他の種に対する毒性を回避する。
【０１０６】 効力についてのヒト試験が着手される前に、正常被験者における段階Ｉ臨床試
験は安全用量を確立するのに役立つ。所定の被験者に関する最適投薬量を決定す
る場合、臨床医により多数の因子が考慮され得る。これらの中でも第一は、選定
異種遺伝子生成物の毒性および半減期である。さらに別の因子としては、患者の
サイズ、患者の年齢、患者の全身状態、治療中の特定の癌性疾患、疾患の重症度
、患者中のその他の薬剤の存在、遺伝子生成物のin vivo活性等が挙げられる。
試験投薬量は、動物試験の結果および臨床文献を考察後に選定される。
【０１０７】 実際の作業実施態様により以下に示されているように、ヒト癌の動物モデルに
おける腫瘍増殖を阻害し、および／または後退させるためには、200 mg/kg/日の
用量が非常に有効であった。この結果に基づいて、癌の治療のための化合物Ｘの
典型的ヒト用量は、被験者の状態によって、静注により、または腫瘍塊に直接的
に注入されるか、あるいは経口的に投与される0.1〜10 g／日である。異なるレ
ベルの効力および／または毒性を有する化合物に関しては、これらの値は、もち
ろん、それに応じて変更される。さらに、用量は、１日当たり２回またはそれ以
上の増分で投与され得る。
【０１０８】 本発明の方法に用いるための化合物は、長期および持続性投与のために徐放性
移植装置としても処方され得る。このような持放性処方物の例としては、生物適
合性ポリマーの複合材料、例えばポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−共−グリコール酸
）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン等が挙げられる。薬剤送達ビ
ヒクル中の分解可能ポリマーの構造、選択および使用は、いくつかの出版物、例
えばA. Domb et al., Polymers for Advanced Technologies 3:279-292（1992）
で検討されている。製剤処方物中のポリマーの選択および使用におけるさらに別
の指針は、M. ChasinとLanger（編集）による教科書“Biodegradable Polymers
as Drug Delivery Systems,”Vol. 45 of "Drugs and the Pharmaceutical Scie
nces," M. Dekker, New York, 1990および米国特許第5,573,528号（Aebischer等
、1996年11月12日発行）に見出される。
【０１０９】 特に、in vivo使用が意図される場合には、本発明の種々の生化学的構成成分
は、好ましくは高純度を有し、潜在的有害夾雑物（例えば、少なくともNational
Food（ＮＦ）等級、一般的には少なくとも分析等級、好ましくは少なくとも製
剤等級）を実質的に含有しない。合成またはその後の精製が、好ましくは、合成
または精製操作中に用いられ得た可能性のあるいかなる毒性物質も実質的に含有
しない生成物を生じる程度まで、所定の化合物は使用前に合成されねばならない
。
【０１１０】 被験者における癌性状態の治療に用いるために、本発明は、その一局面におい
て、本発明の方法に有効であることが示された化合物を含有するキットまたはパ
ッケージも、滅菌充填バイアルまたはアンプルの形態で提供する。一実施態様で
は、キットは、単位用量または多数回用量で、即投与型処方物として、本発明の
化合物、例えば化合物Ｙ、化合物Ｘまたは化合物Ｚを含有し、この場合、パッケ
ージは、癌の治療のためのその内容物の使用説明書を一緒に含入する。あるいは
、そして本発明の別の実施態様によれば、パッケージは、このような化合物を含
有する滅菌充填バイアルまたはアンプルを提供する。
【０１１１】 Ｃ．ドラッグ・デリバリー方法 ｐ５３ファミリーのタンパク質、特にｐ５３ＤＢＤと相互作用するか、および
／またはその野生型活性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする場合の工程
の各々またはすべては、候補化合物に関する高スループット検定を受けることが
できる。高スループットスクリーンは当業界で周知であり、多数のフォーマット
のいずれかで実施され得る。例えば、ＥＬＩＳＨ、シンチレーション近接技法、
競合的結合測定法および置換結合検定は有用なフォーマットである。ロボット工
学技術を含めた実験室自動操作は、多数の化合物をスクリーニングするのに必要
な時間を大幅に低減し、例えば、数社の名前を挙げると、Tecan、Scitec、Rosys
、Mitsubishi、CRS Robotics、FanukおよびBeckman-Coulter Sagianから市販さ
れている。候補化合物が同定された後（またはそれらの同定と同時に）、二次ス
クリーニングが実施されて、ｐ５３ファミリーのタンパク質の活性に及ぼす化合
物の細胞および／またはin vivo作用を確定し得る。
【０１１２】 １．本発明の方法および組成物により標的化されるｐ５３ファミリーのタンパ
ク質 ｐ５３は、すべての真核生物に遍在性である。したがって、本発明の方法およ
び組成物中に用いるためのｐ５３タンパク質およびｐ５３ＤＢＤは、真菌（例え
ば、ビール酵母菌）、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）および哺乳類（例えば
、マウスおよび／またはヒト）を含めたあらゆる真核生物細胞からであるか、ま
たはそれに由来し得るが、しかしヒトｐ５３タンパク質が好ましい。構造および
機能が関連したｐ５３の付加的哺乳類相同体、特にｐ６３およびｐ７３が同定さ
れている。ｐ５３ファミリーのこのようなタンパク質、ならびに例えばそれらの
それぞれのＤＢＤも、本発明の方法および組成物に用いられ得る。さらに、未だ
発見されていないｐ５３ファミリーのタンパク質（本明細書中で定義されたよう
な）も、本発明の方法および組成物に用いられ得る。
【０１１３】 前記のように、ｐ５３タンパク質は、少なくとも３つの異なるドメイン、即ち
アミノ末端に位置する転写活性化ドメイン、中心ＤＢＤおよびカルボキシル末端
のオリゴマー形成ドメインを含有する。さらに、負の調節ドメインは、タンパク
質のカルボキシル末端に出現する。ヒト癌と関連するｐ５３ミスセンス突然変異
のほとんどが、ＤＢＤに生じる。本発明の方法および化合物は、このようなミス
センス突然変異のいずれかの配座の安定化に向けられる。特に好ましい標的は、
残基位置175、245、248、249、273および282（全残基位置はヒトｐ５３配列に関
して示されている。他の生物体からのｐ５３タンパク質中の同様の残基位置は、
ヒト配列との相同アラインメントにより容易に確定され得る）での突然変異に関
する１つ又はそれ以上のいわゆる「ホットスポット」を含有する突然変異体ｐ５
３である。ｐ５３におけるその他の一般的突然変異は、132、135、138、141、14
3、146、151、152、154、157、158、159、163、173、176、179、186、194、196
、213、220、237、238、241、242、258、266、272、278、280、281、285および2
86で起こる。これらも本発明に対する標的である。さらに、以下の突然変異体ｐ
５３タンパク質：143A、173A、175S、241D、249Sおよび273Hの配座安定性を示す
作業実例により、本発明を以下で説明する。
【０１１４】 ｐ５３タンパク質における、特にｐ５３タンパク質のＤＢＤにおけるミスセン
ス突然変異に関連した癌としては、結腸直腸癌、膀胱癌、肝細胞癌、卵巣癌、肺
癌、乳癌、頭部および頸部の扁平上皮癌、食道癌、甲状腺癌および神経原性腫瘍
、例えば星状細胞腫、神経節芽細胞腫および神経芽細胞腫が挙げられるが、これ
らに限定されない。前記の癌およびその他の癌は、本発明の方法および化合物に
より治療可能である。
【０１１５】 ｐ５３ＤＢＤは、ほぼアミノ酸残基100〜300に存在する。残基102〜292のタン
パク質分解耐性コアはＤＮＡ結合に十分であることが示されており、ｐ５３ＤＢ
Ｄ結晶構造は、残基94〜312に関して解明されている（Cho et al., 1994, Scien
ce 265, 346; Friend, 1994, Science 265, 334）。したがって、本発明の方法
に用いるために、ｐ５３ＤＢＤドメインのＮ末端は残基50から開始して残基110
までであり、好ましくは94〜102間のどこかで開始する。ｐ５３ＤＢＤのＣ末端
は、残基286〜残基340で終結し、好ましくは残基292〜312で終結し得る。
【０１１６】 「ｐ５３の熱力学的不安定化突然変異体」は、生理学的温度（即ち約37℃）で
のＤＮＡ結合のようなｐ５３の１つ又はそれ以上の機能を保持しないが、低温で
、または他の条件下でこのような機能（単数または複数）を回復する突然変異体
である。例えば、一般的遭遇突然変異体はすべて、低温でin vitroでＤＮＡを結
合する能力を保持する（Friedlander et al., 1996、上記）。
【０１１７】 ２．検定フォーマット ａ．結合検定フォーマット ｐ５３ファミリーのタンパク質のＤＢＤに簡単に結合する化合物を同定するた
めに用いられる検定の原理は、２つの化合物を相互作用させ、結合させるための
条件下で、それに十分な時間、ＤＢＤタンパク質と被験化合物の反応混合物を調
製し、したがって、反応混合物中で除去され、および／または検出され得る複合
体を生成することを包含する。用いられるＤＢＤ種は、スクリーニング検定の目
的によって変わり得る。例えば、特定の結合ドメインと相互作用する化合物が探
索される場合、その結合ドメインを含有するｐ５３ファミリーの全長タンパク質
、ＤＢＤそれ自体、あるいは検定系（ラベリング、結果的に生じる複合体の単離
等）に利点をもたらすタンパク質またはペプチドと融合したＤＢＤを含有する融
合タンパク質が利用され得る。本技法に用いるためのＤＢＤ由来のペプチドは、
ＤＢＤの少なくとも６連続アミノ酸、好ましくは10連続アミノ酸、さらに好まし
くは20連続アミノ酸、さらに好ましくは30または50でさえある連続アミノ酸また
はそれ以上のアミノ酸を包含すべきである。
【０１１８】 スクリーニング検定は、種々の方法で実行され得る。例えば、このような検定
を実行するための一方法は、ＤＢＤタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは
融合タンパク質あるいは被験物質を固相上に固着し、そして反応終了時に、固相
上に固着されたＤＢＤ／被験化合物複合体を検出することを包含する。このよう
な方法の一実施態様では、ＤＢＤ反応体は固体表面に固着され、そして固着され
ていない被験化合物が直接または間接的に標識され得る。種々の適切な標識系の
いずれかが用いられ得る。それらの例としては、放射性同位元素、例えば125Ｉ
および32Ｐ、ある物質および蛍光標識に曝露された場合に検出可能な比色定量シ
グナルまたは光を生じる酵素標識系が挙げられるが、これらに限定されない。本
方法の別の実施態様では、固相上に固着されたＤＢＤタンパク質が標識化抗体と
複合体を形成する。その後、ＤＢＤ／抗体複合体の会合を崩壊させるその能力に
関して、被験化合物が検定され得る。
【０１１９】 実際問題として、微小滴定プレートは、固相として便利に利用され得る。固着
構成成分は、非共有または共有結合により固定され得る。非共有結合は、タンパ
ク質の溶液で固体表面を単に被覆し、乾燥することにより成し遂げられ得る。あ
るいは、固定化抗体、好ましくは固定されるタンパク質に特異的なモノクローナ
ル抗体が、固体表面にタンパク質を固着するために用いられ得る。表面は、予め
調製され、保存され得る。
【０１２０】 検定を実行するために、固着構成成分を含有する被覆表面に非固定化構成成分
が付加される。反応完了後、生成されたあらゆる複合体が固体表面に固定された
ままであるような条件下で、未反応構成成分が除去される（例えば洗浄により）
。固体表面に固着された複合体の検出は、多数の方法により成し遂げられ得る。
予備非固定化構成成分が前標識化される場合、表面に固定された標識の検出は、
複合体が生成されたことを示す。予備非固定化構成成分が前標識化されない場合
には、表面に固着された複合体を検出するために、例えば予備非固定化構成成分
に特異的な標識化抗体を用いて、間接標識が用いられ得る（抗体は次に、標識化
抗Ｉｇ抗体で直接的に標識されるか、または間接的に標識され得る）。
【０１２１】 他の実施態様では、結合は、直接または間接標識を使用せずに検出され得る。
例えば、結合が起きた場合に変わる生物物理学的特性が検定され得る。このよう
なスクリーニングに特に有益である固体支持体系は、ＢＩＡｃｏｒｅ2000系（BI
Acore, Inc., Piscataway, NJから市販）である。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）計器
（http://www.biacore.com）は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象を
用いて、実時間での生物特異的相互作用を監視する。ＳＰＲ効果は、本質的には
、金属−液体界面での屈折率の局所的変化に影響される無限小電場である。セン
サーチップは、ガラスと検定される配位子またはタンパク質が化学的に連結され
るカルボキシメチルデキストランマトリックスとの間の金フィルムのサンドイッ
チ状物から作製される。このセンサーチップは、分析物化合物がそれを通して注
入され得るフローセルを形成する流体素子工学カートリッジ上に取り付けられる
。センサーチップ上での配位子−分析物相互作用は、チップ表面から反射される
偏光光線の角度の変化として検出される。チップとの任意の塊の結合は、金／デ
キストラン層中のＳＰＲに影響を及ぼす。金層中の電場のこの変化は反射光線と
相互作用して、結合した塊の量に比例して反射の角度を変える。反射光は、ダイ
オードアレイ上で検出されて、応答単位（ＲＵ）として表される結合シグナルに
翻訳される。応答は結合された塊に直接比例するので、タンパク質−タンパク質
相互作用に関する速度論的および平衡定数が測定され得る。
【０１２２】 あるいは、反応は液相で実行され、反応生成物が未反応構成成分から分離され
、複合体が検出される。 ｂ．ｐ５３ファミリーのタンパク質の配座の測定方法 ｐ５３のタンパク質の配座は、多数の異なる方法のいずれかで測定され得る。
例えば、抗体は、ｐ５３ＤＢＤの配座をプローブするために用いられ得る。本発
明の好ましい方法は、ｐ５３および／またはｐ５３ＤＢＤの活性（例えば、ＤＮ
Ａ結合）または不活性（熱力学的不安定化、あるいはミスフォールド化またはア
ンフォールド化）配座に特異的であるモノクローナル抗体を用いる。例えば、ｐ
５３ＤＢＤ上のエピトープを認識するｍＡｂ1620は、ｐ５３タンパク質の腫瘍サ
プレッサー活性と密接に関連する（Ball et al., 1984, EMBO J. 3:1485-1491;
Gamble et al., 1988, Virology 162:452-458）。したがって、ｍＡｂ1620は、
それが不活性配座をとる場合には、ｐ５３ＤＢＤを結合しない。逆に、ｍＡｂ16
20により認識されるエピトープは、ｐ５３が突然変異により不活性化されるかま
たは野生型ｐ５３が変性される場合に、露呈される（Bartek et al., 1990, Onc
ogene 5, 893-899; Stephen et al., 1992, J. Mol. Biol. 225, 577-83）。配
座特異的であることが知られているかまたはいずれは発見されるその他のモノク
ローナル抗体も、本発明の方法に用いられ得る。このような抗体は、高スループ
ットスクリーンに容易に採用され得るために、有用である。モノクローナル抗体
を含めた抗体の製造方法は、当業界で周知である。
【０１２３】 ｐ５３またはｐ５３ＤＢＤのようなｐ５３ファミリーのタンパク質の配座の他
の測定方法としては、染料の吸収、分光分析的（例えば、円二色性、ＮＭＲ）、
サイズ排除クロマトグラフィー、超遠心分離、特異的ＤＮＡ結合（例えば、低温
と対照したものとして生理学的温度での）、および特異的タンパク質結合（例え
ば、ＳＶ40大型Ｔ抗原は、野生型活性配座とのみ結合し、不活性配座と結合しな
い）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】 前記のように、一般的に遭遇するｐ５３突然変異の多くは生理学的温度でＤＮ
Ａを結合できないが、しかし低温でＤＮＡを結合する。したがって、被験化合物
の存在下でのｐ５３ファミリーのタンパク質の配座を測定する一局面は、温度依
存性である。好ましくは、配座は、生理学的温度（約38℃）で測定される。適切
な範囲は20℃〜50℃、さらに好ましくは35℃〜42℃である。標的タンパク質の配
座はさらに、2〜3分から数時間までまたはそれ以上の時間に亘って測定され得る
。野生型ｐ５３タンパク質またはｐ５３ＤＢＤがスクリーニングに用いられる場
合、加熱は一般に、突然変異体ｐ５３ＤＢＤが用いられる場合よりも長時間且つ
高温で実施される。本明細書中で提供された情報を用いて、当業者は適切な温度
を容易に決定し得る。
【０１２５】 さらに、化合物の結合と、ｐ５３ファミリーのタンパク質の配座のあらゆる変
化とを同時に検定し得る。このような検定では、被験化合物の存在下でのｐ５３
ファミリーのタンパク質の配座の変化は、一ヒットとして点数をつけられる。ｐ
５３ＤＢＤと相互作用して配座変化を引き起こす化合物に関して検定する高スル
ープットスクリーニングは下記の例により説明されるが、それらに限定されない
。これらの高スループットスクリーニングは、本発明の方法に用いるためのある
種類の化合物を同定し得た。ほぼ生理学的温度で、これらの化合物は野生型およ
び種々の突然変異体ｐ５３タンパク質上のｍＡｂ1620に対する配座感受性エピト
ープの安定性を増強した。低μｍｏｌ濃度の化合物は、生存細胞内のエピトープ
の配座安定性を一時的に増強し、突然変異体ｐ５３が転写を活性化するのを可能
にした。下記でさらに詳しく記載されるように、有機非ペプチド化合物は、突然
変異体ｐ５３を有する腫瘍を保有するマウスに投与された場合、ｐ５３配座およ
び機能を変調し、天然突然変異化ｐ５３を有するヒト腫瘍異種移植片の増殖を有
意に阻害した。
【０１２６】 ｃ．細胞ベースおよび動物ベースの検定 前記の一次スクリーン（単数または複数）を用いて候補化合物が同定されると
、これらの系における候補化合物の作用を確定するために、細胞ベースおよび動
物ベースの検定が一般に実行される。初期検定は、ｐ５３ファミリーのタンパク
質をコードする突然変異体遺伝子を有する腫瘍由来の細胞株、またはｐ５３ファ
ミリーの突然変異体タンパク質を発現するよう操作された細胞株を包含し得る。
ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性のいずれか（またはすべて）に及ぼ
す候補化合物の作用が査定される。例えば、候補化合物の存在下でのＷＡＦ１の
誘導は、無差別的結合特性というよりむしろ特異的ＤＮＡ結合特性を促進するこ
とにより、化合物は突然変異体ｐ５３中に機能を保存することを示す。ｐ５３ま
たはｐ５３ファミリーのその他の成員により上向き調節されるかまたは下向き調
節された任意の遺伝子が検査され得る。ｐ５３ファミリーのタンパク質のその他
の活性としては、増殖抑制およびアポトーシスが挙げられる。増殖抑制は、顕微
鏡的にまたはコロニー形成検定により、組織培養細胞で容易に査定される。アポ
トーシスは、ＴＵＮＥＬ染色またはpropidium iodide染色およびフローサイトメ
トリーにより可視化され得る。
【０１２７】 さらに、動物ベースのモデルは、候補化合物の毒性および有効性の両方に関し
てスクリーニングするために用いられ得る。例えば、突然変異体ｐ５３を有する
腫瘍がある動物モデルで誘導され、候補化合物が動物に投与される。毒性および
腫瘍増殖または後退が査定される。このようなスクリーニングの作業例を以下に
提示する。
【０１２８】 ３．スクリーニングのための化合物の供給源 本発明にしたがってスクリーニングされ得る化合物としては、細胞中に入って
、ｐ５３ファミリーのタンパク質の活性に影響を及ぼし得る小型有機分子が挙げ
られるが、これらに限定されない。2〜3の供給元の名前を挙げると、例えばPhar
macia、Arqule、Enzymed、Sigma、Aldrich、Maybridge、TregaおよびPanLabsと
いった会社から、多数の化合物ライブラリーが市販されている。ｐ５３ＤＢＤと
相互作用する化合物に関して、天然物質または合成化学物質を含めた既知の化合
物、ならびにタンパク質を含めた生物学的活性物質のライブラリーもスクリーニ
ングし得る。しかしながら、好ましい化合物は、タンパク質またはペプチド（即
ち、ペプチド結合により連結される３個またはそれ以上の一続きのアミノ酸）で
ない。抗体は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの断片を結合する抗原であ
るペプチドである。好ましい化合物は、抗体でもない。本発明の方法に用いるた
めの化合物の特定の種類および例を以下に説明する。
【０１２９】 ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性を促進する化合物が同定されれば
、分子モデリング技法を用いて、より有効な化合物の変異体を設計し得る。分子
モデリング系の例は、ＣＨＡＲＭ（Polygen Corporation, Waltham, MA）および
ＱＵＡＮＴＡプログラム（Molecular Simulations Inc., San Diego, CA）であ
る。ＣＨＡＲＭはエネルギー最小化および分子動力学機能を実施する。ＱＵＡＮ
ＴＡは、相互の分子の行動の相互作用構築、修飾、可視化および分析を可能にす
る。
【０１３０】 例えば、ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性を促進する化合物が同定
されれば、その化合物を用いて、仮説を立て得る。以下でさらに詳述するように
、好ましい仮説は、平面多環式疎水性基は、極性アミンから約5〜9オングストロ
ーム、さらに好ましくは6〜8オングストロームの間隔を置いたというものである
。このような仮説は、プログラムCatalyst（Molecular Simulations Inc., San
Diego, CA）を用いて、本発明の化合物のいずれかからもたらされ得る。さらに
、Catalystは、その仮説を用いて、所有権データベース、Cambridge小型分子デ
ータベース（Cambridge, England）、ならびに上記のその他のデータベースを検
索して、本発明の化合物のさらに別の例を同定し得る。
【０１３１】 本発明の化合物は、Ludi、Insight II、C2-Minimizer and Affinity（Molecul
ar Simulations Inc., San Diego, CA）のようなモデリングパッケージを用いて
より有効な変異体を設計するためにさらに用いられ得る。特に好ましいモデリン
グパッケージは、MacroModel（Columbia University, NY, NY）である。 本発明の化合物はさらに、理論的組合せライブラリーを開発するための基礎と
して用いられ得る。組合せライブラリーの性質はライブラリーの基礎を形成する
ために本発明の好ましい化合物から選定される特定の化合物、および樹脂を用い
てライブラリーを合成したいという要求のような因子によっているが、しかし、
本発明の化合物はＣ2−ＱＳＡＲ（Molecular Simulations Inc., San Diego, CA
）のような組合せ設計プログラムに適した必要なデータを提供する、と認識され
る。
【０１３２】 本発明を説明してきたが、以下の実施例により本発明をさらに説明する。本発
明はこれらに限定されない。 ＶＩ．実施例１：ｐ５３ＤＢＤ熱安定化検定 野生型ｐ５３ＤＢＤを用いた高スループット検定を開発した。本検定を用いて
薬理学的化合物をスクリーニングし、ＤＢＤの活性配座を安定化するそれらの化
合物をヒットとして点数をつけた。
【０１３３】 Ａ．材料および方法 熱安定化検定． 野生型および突然変異体ｐ５３タンパク質からの組換えＤＢ
Ｄ（残基94〜312）およびＦＬＡＧ−タグ化ｐ５３ＤＢＤを記載通りに調製した
（Pavletich et al., 1993, Genes and Dev. 7, 2556-2564; Bullock et al., 1
997、上記）。用いた突然変異体タンパク質は、143A、173A、175S、249Sおよび2
73Hであった。多数の小型分子有機化合物を試験した。化合物ストックを10 mg/m
lでＤＭＳＯ中に溶解し、使用前に稀釈した。25 mMＨＥＰＥＳ、ｐＨ6.8、150 m
MＫＣｌ、10 mMジチオトレイトールを含有する緩衝液中に、タンパク質（0.25〜
1.0 ng／ウエル）を稀釈し、氷上で35分間、50 ul中でReacti-Bind微小滴定プレ
ート（Pierce）にくっつけた。ウエルを25 mMＨＥＰＥＳ、ｐＨ6.8、150 mMＫＣ
ｌですすぎ、化合物または稀釈ＤＭＳＯビヒクルを付加し、プレートを指定温度
でインキュベートした。氷上にウエルを置くことによりインキュベーションを終
結させた。エピトープがそれ以上変化しないようにするために、氷上にプレート
を保持しながら、ＥＬＩＳＡ検定を実施した。第一抗体の付加前に、ＨＥＰＥＳ
／ＫＣｌ緩衝液中の冷5％スキムミルク（Difco）でウエルを１時間遮断した。モ
ノクローナル抗体ｍＡｂ1620、ｍＡｂ240（Calbiochem）および抗−ＦＬＡＧ
Ｍ２抗体（Eastman Kodak Company）をＨＥＰＥＳ／ＫＣｌ中で1:100〜1:250で
稀釈し、100 ul／ウエルで30分間付加した。プレートを冷ＨＥＰＥＳ／ＫＣｌ緩
衝液で２回すすぎ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−共役抗マ
ウスＩｇＧ（Boehringer Mannheim）とともにさらに30分間インキュベートした
。ＴＭＢ展開剤（Pierce）を用いてＨＲＰシグナルを発現させ、シグナルの光学
密度を、450 nmに設定したBioRadマイクロプレート読取器で読み取った。
【０１３４】 Ｂ．結果 ｐ５３ＤＢＤの配座は熱不安定性である． ｍＡｂ1620により認識されるエピ
トープは配座依存性であり、ｐ５３上のその存在はタンパク質の腫瘍サプレッサ
ー活性と密接に関連する（Ball et al., 1984,上記; Gamble and Milner,1988、
上記）。逆に、ｍＡｂ240により認識されるエピトープは、ｐ５３が突然変異に
より不活性化されるかまたは野生型ｐ５３が変性される場合に、露呈される線状
エピトープである（Bartek et al., 1990, Oncogene 5, 893-899; Stephen et a
l., 1992, J. Mol. Biol. 225, 577-583）。組換えヒトｐ５３ＤＢＤ（残基94〜
312）はin vitroで活性配座から不活性配座への遷移を経て、240エピトープを蓄
積しながら1620エピトープを次第に失う。微小滴定プレート上に固定された精製
ｐ５３ＤＢＤを生理学適温度近くに加熱して、ＥＬＩＳＡフォーマットでｍＡｂ
1620を用いてプローブした。1620エピトープは、温度および時間依存性方式で損
失された（図１Ａ）。1620エピトープの損失は、ＤＢＤに結合されたＦＬＡＧエ
ピトープが依然として十分に安定であるために、配座の損失に特異的に関連した
（図１Ｂ）。さらに、1620エピトープの損失は240エピトープの出現増強と共同
して起こったが、これは1620エピトープの損失がｐ５３ＤＢＤの配座的変化を反
映し、固定化タンパク質の損失はそうではないことを確実にする。
【０１３５】 野生型ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの半減期は23℃で約35分であって、高
温では漸増的に減少し、45℃では5分未満になった（図１Ａ）。平行して、ゲル
シフト検定におけるｐ５３ＤＢＤのＤＮＡ結合能力は、溶液中で加熱時に低減さ
れた（データは示されていない）。野生型ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの半
減期は、37℃で位置143突然変異体ＤＢＤの場合の約２倍であった（図１Ｃ）。
この知見は、いくつかのその他の突然変異体ｐ５３タンパク質に関する熱力学的
安定性低減についての以前の報告と一致し、1620エピトープがｐ５３ＤＢＤの配
座をモニタリングするために利用され得ることを確定する（Bullock et al., 19
97、上記）。
【０１３６】 化合物はｐ５３配座を安定化する． ＥＬＩＳＡ検定を用いて、活性ｐ５３配
座を安定化し、突然変異体タンパク質に野生型機能をより良好に保持させる化合
物を同定した。いくつかの化合物は、生理学的温度でのｍＡｂ1620に対するエピ
トープの損失を抑制した（例えば、図２Ａ参照）。ｍＡｂ1620に対するエピトー
プの50％を安定化するのに必要な濃度を測定することにより、滴定実験において
、化合物の相対能力を確定した。活性化合物は、用量依存的方法でエピトープを
安定化した（図２Ｂ）。ＤＭＳＯ溶媒および活性化合物のいくつかの類似体は、
安定化することができなかった（図２Ｂ。表１および２参照）。いくつかの突然
変異体ｐ５３タンパク質からのＤＢＤと同様に、全長野生型ｐ５３も安定化され
た（データは示されていない。図２Ｃ）。化合物の存在下では、突然変異体タン
パク質は、化合物の非存在下での野生型タンパク質と同様に安定であった。
【０１３７】 化合物はｍＡｂ1620に対するエピトープを保存したが、しかしそれらは、エピ
トープをすでに失っていたｐ５３を救援しなかった。例えば、化合物Ｙの付加前
にｐ５３ＤＢＤを加熱した場合、ｍＡｂ1620反応性の増大は認められなかった。
エピトープ損失速度は存在する化合物に伴って低減されたが、しかし長期加熱は
1620−陽性配座の結果的損失を引き起こした。さらに、37℃でのインキュベーシ
ョン前の化合物Ｙの付加および洗い落としたがってエピトープの損失を妨げなか
ったために、化合物はｐ５３と非可逆的に結合するとは思われなかった（データ
は示されていない）。これらの知見は、ｐ５３ＤＢＤと化合物との相互作用がタ
ンパク質に、ｍＡｂ1620により認識されるような機能的配座をより安定的に保持
させるモデルと一致する。
【０１３８】 活性化合物の構造． 同定された活性化合物はすべて、特定長のリンカーによ
り疎水性基（平面多環式）および陽イオン性基（しばしばアミン）と一緒に結合
する。疎水性（Ｒ１）位置のベンズイミダゾール、ベンゾキノリン、フェノチア
ジンおよびスチリルキナゾリンは活性であったが、一方、これらの基および単一
二環式または一環式基における微妙な変化は試験した特殊条件下では活性でなか
った（表１）。ｍＡｂ1620に対するエピトープの50％を安定化するのに必要な量
の化合物の２つの適合対（表１参照）間に10倍より大きい差が認められた場合に
、化合物は、この検定において「活性」であると称された。したがって、本検定
により不活性と称された化合物は絶対的に不活性であるというわけではなく、相
対的に不活性であるだけであることに留意すべきである。したがって、活性陽イ
オン性（Ｒ２）基としては、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールア
ミン、メチルアミン、メチルピペラジンおよびモルホリンが挙げられた（表１）
。ある種の大型アミンは、フェノチアジンシリーズで試験した場合、相対的によ
り活性であった。Ｒ２位置の負荷電または非荷電基、例えばカルボキシルまたは
ベンゼン基は、本検定で明示したように、不活性であった（表１）。Ｒ１および
Ｒ２基間の間隔も、プロピル長より短いリンカーが相対的化合物活性を低減する
場合、本検定における化合物活性にとって重要であった（下記の表２参照）。ブ
チルリンカーはプロピルリンカーよりわずかに低効力であったが、一方、本検定
において低活性を示した化合物ではより長いリンカーが観察された（表２。デー
タは示されていない）。的確な距離を保持する分枝鎖リンカーは一般に、対応す
る線状リンカーより活性であった。これらの一般的観察は本発明の範囲を限定し
ないが、しかし、さらなる分子を設計するための本発明の実施に用いられ得る。
【０１３９】
【表１】
【０１４０】 滴定実験において、ｍＡｂ1620に対するエピトープの50％を安定化するのに必
要な化合物の量により、相対的効力を確定した。
【０１４１】
【表２】
【０１４２】 Ｃ．考察 結果は、突然変異体ｐ５３機能の回復、ならびに抗癌療法の開発のための新規
の戦略のための原理の証拠を実証する。本実施例は、単離ＤＢＤに作用してその
配座安定性を促進し得る化合物の第一ファミリーの発見を報告する。 ＶＩＩ．実施例２：細胞および腫瘍中のｐ５３配座の確定 本実施例および以下の実施例では、低μモル濃度で機能して生きた細胞中およ
び腫瘍中の突然変異体ｐ５３を変調し、天然突然変異化ｐ５３を有する腫瘍の増
殖を抑制する原型化合物を示す。
【０１４３】 Ａ．材料および方法 細胞培養． ＡＴＣＣから全細胞株を入手し、10％ウシ胎仔血清（Gibco BRL
）を含有する推奨培地中で増殖させた。 ｐ５３配座の確定． 約1 x 10Ｈ1299／レポーター+突然変異体ｐ５３細胞を
一夜処理し、冷トリス緩衝化食塩水で3回すすぎ、1.5 mlの低張溶解緩衝液（20
mMＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.4、10 mMＮａＣｌ、20％グリセロール、0.2 mMＥＤＴＡ、
0.1％トリトン−Ｘ100、10 mMジチオトレイトール、プロテアーゼ阻害剤含有）
中で溶解した。2000 rpmで、4℃で5分間、細胞を微小遠心管中でペレット化し、
0.5 MＮａＣｌを含有する同一緩衝液中にペレットを再懸濁することにより核抽
出物を調製した。0.5 MＮａＣｌを含有する前記の緩衝液３容積を用いて、Dounc
eホモジナイザー中で腫瘍試料を均質化した。10,000 rpmで4℃で10分間の遠心分
離により、溶解物を透明にした。ｍＡｂＤＯ−１抗体を用いてウエスタンブロッ
トから定量されるようなｐ５３含量に関して、核抽出物を標準化し、0.05 Mの炭
酸塩緩衝液、ｐＨ9.6中に1 ug/mlでのｍＡｂＤＯ−１で4℃で一夜被覆されてい
たMaxiSorp F96プレート（Nunc）のウエル上にｐ５３を捕獲した。冷ＰＢＳでウ
エルを洗浄し、ＰＢＳ中の4％スキムミルクを用いて4℃で3時間、遮断し、スキ
ムミルク中のＨＲＰ−共役化ｍＡｂ1620抗体を用いてプローブした。抗体インキ
ュベーションは氷上で１時間であって、その後、0.05％トゥイーン20を含有する
ＰＢＳ中でウエルを3回洗浄し、ＴＭＢ基質を用いてシグナルを発現させた。大
量の1620−陽性ｐ５３を発現した温度シフト化（32℃）Ｈ1299／レポーター+突
然変異体ｐ５３細胞からの溶解物を用いて、標準曲線を確立した。試料の定量は
標準曲線の線状範囲内であり、各試料中の総ｐ５３に関して、ならびに未処理溶
解物中の1620−陽性ｐ５３分画に関して補正した。
【０１４４】 Ｂ．結果 細胞中の配座の安定化． 細胞性ｐ５３の1620−陽性配座を安定化する化合物
の能力を、専ら突然変異体ｐ５３を発現する生きた細胞を用いて試験した。ｐ５
３を有さないＨ1299細胞を腫瘍由来突然変異体ｐ５３（位置173）を用いてトラ
ンスフェクトし、非配座感受性ｐ５３抗体（ｍＡｂＤＯ−１）をウエスタンブロ
ットに用いて、十分量の突然変異体タンパク質を発現するクローンを選択した。
ｍＡｂ1620に対するエピトープを表示する低定常状態レベルのｐ５３をトランス
フェクタントからの抽出物中に検出して、突然変異体ｐ５３の小分画が活性配座
を保持し得ることを確証した（Chen et al., 1993, Oncogene 8, 2159-2166）。
低μモル濃度の化合物Ｘは、細胞中の1620陽性ｐ５３の定常状態分画を約５倍増
大した（図３Ａ）。処置後4〜6時間で、最大レベルのエピトープ濃縮を達成した
。タンパク質のアミノ末端に位置する非配座感受性エピトープに対して向けられ
るｍＡｂＤＯ−１との反応性により測定した場合、ｐ５３の総量は変わらなかっ
た。
【０１４５】 Ｃ．考察 結果は、本発明の方法により同定された配座安定化化合物が生きた細胞中のｐ
５３の活性配座を安定化し得ることを示す。腫瘍中の突然変異体ｐ５３を回復す
る化合物は、全非機能的ｐ５３プールまたはｍＡｂ1620に対するエピトープを表
示するｐ５３のサブセットを標的にし得る。本明細書中に記載した化合物に関す
る重要な標的は、活性配座を依然として保持する新規合成突然変異体ｐ５３であ
ると思われる。実際、化合物は1620エピトープの存続を増強したが、しかしin v
itro予備加熱のために損失された1620エピトープを回復することはできなかった
。新規合成ｐ５３における活性配座の安定性を増強する化合物は、時間依存的方
法で機能的ｐ５３の定常状態レベルの蓄積を可能にし得る。細胞中の最大1620エ
ピトープ増強の達成に関して観察された４時間遅延は、この仮説と一致する（図
３Ａ）。
【０１４６】 ＶＩＩＩ．実施例３：ｐ５３機能の回復 Ａ．材料と方法 トランス活性化検定． ＤＯＴＡＰ陽イオン性脂質トランスフェクション試薬
（Boehringer Mannheim）またはリン酸カルシウムを用いて突然変異体ｐ５３タ
ンパク質（173A、249S）をコードする発現プラスミドおよびネオマイシン選択性
マーカーで細胞をトランスフェクトした。ヒグロマイシン耐性マーカーをコード
するプラスミド、およびルシフェラーゼ遺伝子を誘導するＳＶ40基本プロモータ
ーの上流に置かれる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（GenBank寄
託番号S57428チミジンキナーゼの塩基番号26〜58。これは配列GCCTTGCCTで開始
して、配列TGCCTTTTCで終結する）のプロモーター領域におけるｐ５３結合配列
の４つのコピーから成るｐ５３レポーター遺伝子でも、細胞をトランスフェクト
した。突然変異体ｐ５３発現のための付加的構築物を有するレポーター構築物で
細胞のクローンをトランスフェクトすることにより、適合細胞対を調製した。適
宜、ヒグロマイシンまたはＧ418を含有する培地中での増殖に関して、トランス
フェクト化クローンを選択した。96ウエル組織培養プレート（Costar）中の単層
細胞を化合物で処理し、基質転換検定（Promega）を用いてルシフェラーゼ活性
を測定し、Dynatechマイクロプレートルミノメーターで定量した。
【０１４７】 ＷＡＦ１およびｐ５３発現． 培養細胞を21時間処理し、冷トリス緩衝化食塩
水で3回すすぎ、掻き取って、10,000 rpmで30秒間ペレット化した後、50 mMＨＥ
ＰＥＳ、ｐＨ7.5、0.1％ＮＰ−40、250 mMＮａＣｌ、5 mMＥＤＴＡ、50 mMＮａ
Ｆ、1 mMＤＴＴ、50 ug/mlアプロチニン、1 mg/mlPefabloc（Boehringer Mannhe
im）中にそれらを再懸濁した。Bradford試薬（BioRad）を用いてタンパク質濃度
を確定し、5または10 ugの細胞溶解物を8〜16％勾配ポリアクリルアミド／ＳＤ
Ｓゲル（Novex）上に載せた。20％メタノールを含有するTowbin緩衝液（Towbin
et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350）中のImmobilon P膜（Mi
llipore）上に、タンパク質を移した。32.547.5 kDa分子量マーカー間で膜を二
分して、SuperBlock（Pierce）＋3％スキムミルク中で、室温で１時間遮断した
。モノクローナル抗体クローンＥＡ10（CalbiochemＷＡＦ１ Ａｂ−１）を用い
てＷＡＦ１発現に関してブロットの底半分をプローブし、ｍＡｂＤＯ−１（Calb
iochemｐ５３Ａｂ−６）を用いて全ｐ５３発現に関してブロットの上半分をプロ
ーブした。0.1％トゥイーン20を含有するトリス緩衝化食塩水を３回取り換えて
ブロットを１時間洗浄した後、第二抗体ＨＲＰ共役抗マウスＩｇＧを付加した。
ルネッサンスＥＣＬ（DuPont）を用いて帯域を可視化し、ハイパーフィルムＥＣ
Ｌ（Amersham Life Science）に曝露した。
【０１４８】 Ｂ．結果 細胞中のｐ５３機能の回復． ｐ５３配座の安定化が野生型機能の良好な保持
を生じたか否かを確定するために、ｐ５３の配列特異的転写活性を調べた。Ｈ12
99細胞をｐ５３誘導性ルシフェラーゼレポーター遺伝子でトランスフェクトし、
安定クローン（Ｈ1299／レポーター）を突然変異体ｐ５３で補佐的にトランスフ
ェクトして、レポーター遺伝子と位置173突然変異体ｐ５３の両方を発現する適
合クローン（Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３）を得た。レポーター遺伝
子誘導により測定した場合、化合物は、突然変異体ｐ５３の転写活性を増強した
（図３Ｂ）。Ｈ1299／レポーター細胞中で低レベルの転写活性化が観察されたが
、これは、ｐ５３相同体であるｐ７３の存在によると思われる（データは示され
ていない）。これらの化合物がｐ７３活性を増強し得るか否かを我々は未だ確定
していないが、しかしレポーター遺伝子誘導における広範なｐ５３依存性増大は
、ｐ５３がこれらの細胞中での第一標的であることを示唆する。高用量での化合
物の有効性は細胞剥離により制限されたので、レポーター遺伝子のｐ５３依存性
活性化は相対的に小濃度範囲で起きた。転写活性の増強は、処理後12〜16時間で
ピークを生じた（データは示されていない）。この観察は、処理後4〜6時間目に
起きた機能的ｐ５３配座の安定化御の派生的事象として生じるレポーター遺伝子
発現と一致する。
【０１４９】 化合物Ｙは、レポーター遺伝子誘導検定においては、化合物Ｘより優れていた
。これは、ＤＮＡ損傷を包含して、ｐ５３タンパク質のレベル上昇をもたらす化
合物Ｙの二次作用によるものと思われる（図３Ｂ）。化合物Ｙは、細胞活性に必
要な濃度で全ｐ５３タンパク質レベルを増強したが、化合物Ｘは増強しなかった
。ＤＮＡ損傷が単に化合物Ｙによるｐ５３レポーター遺伝子誘導に寄与するだけ
ではないことを保証するために、ＤＮＡ損傷剤アドリアマイシンの作用を試験し
た。アドリアマイシンは、細胞中での突然変異体ｐ５３蓄積を誘導するその能力
にもかかわらず、広範囲の濃度（0.4〜40 ug/ml）内でレポーター遺伝子を誘導
しなかった（データは示されていない）。これらの結果は、突然変異体ｐ５３の
蓄積ではなく、配座安定化が、特異的転写活性を促進し得る、ということを実証
する。特に、全ｐ５３タンパク質の定常状態レベルを上げない化合物Ｘは、配座
安定化により独自にｐ５３転写機能を回復すると思われる。
【０１５０】 化合物Ｘは、突然変異体ｐ５３の存在下で、ｐ５３応答性細胞遺伝子生成物で
あるＷＡＦ１を上向き調節した。ｐ５３を発現しないSaos-2骨肉腫細胞を突然変
異体ｐ５３発現ベクターでトランスフェクトして、２つの突然変異体（位置173
または位置249）のいずれかを発現するクローンを単離した。クローンは、親Sao
s-2細胞と比較した場合、より低い基本レベルのＷＡＦ１を発現したが、これは
、迅速増殖クローンを我々が選択したことを反映するものと思われる。これらの
細胞を化合物Ｘで16時間処理し、等量のタンパク質を示す溶解物を、ｐ５３およ
びＷＡＦ１に関してウエスタンブロットで分析した。２つの突然変異体ｐ５３タ
ンパク質のいずれかを発現した細胞は、処理時にＷＡＦ１の発現レベルの上昇を
示したが、親Saos-2細胞は示さなかった（図４）。これらの溶解物中のｐ５３タ
ンパク質の総量は、本質的には変わらなかった。アドリアマイシンは突然変異体
ｐ５３を有するSaos-2細胞中でのＷＡＦ−１発現を誘導しなかったが、しかし野
生型ｐ５３を発現するU2OS細胞中でのＷＡＦ−１発現を上昇させた（データは示
されていない）。
【０１５１】 Ｃ．考察 本明細書中に記載した配座安定化剤の作用様式は、伝統的細胞傷害性抗新生物
剤に関して観察されたものとは明らかに異なる。癌の化学療法に用いられる細胞
障害剤は一般に、突然変異体ｐ５３を有する細胞では無効である（Lowe et al.,
1993, Nature 362, 847-849; O'Connor et al., 1997, Cancer Res. 57, 4285-
4300）。実際、ＤＮＡ損傷剤であるアドリアマイシンは、我々の検定において、
転写活性に関して突然変異体ｐ５３を回復しなかった。細胞傷害性化合物は、正
常および腫瘍細胞中での総ｐ５３タンパク質の顕著な誘導によっても検証される
。化合物Ｘは細胞中または腫瘍中の総ｐ５３タンパク質レベルを誘導しなかった
。ｐ５３誘導は細胞ＤＮＡ損傷の高感度測定であるので、化合物Ｘが有効濃度で
ＤＮＡを損傷し得るとは思われない。合わせて考えると、我々の知見は、1620陽
性配座の安定化および突然変異体ｐ５３活性の機能的回復がＤＮＡ損傷非依存性
メカニズムにより起こり得る、ということを示す。
【０１５２】 数通りの証拠が、タンパク質安定化に及ぼす非特異的作用を排除する。水を置
換し、タンパク質分子周囲のより疎水性の微小環境を作ることにより機能するタ
ンパク質変性の非特異的阻害剤であるグリセロールは、600 mMの濃度で細胞中の
突然変異体マウスｐ５３の核局在化を回復し得る（Brown et al., 1997, J. Cli
n. Invest. 99, 1432-1444）。化合物Ｘは、本検定においては0.03 mMで活性で
あったが、これは、化合物とｐ５３との間の特異的接触を包含する非常に緻密な
相互作用を示唆する（データは示されていない）。さらに、化合物Ｘが培養中お
よびin vivoで非常に過剰量の他のタンパク質の存在下でｐ５３配座に影響を及
ぼし得るという観察（下記参照）は、ｐ５３の選択的認識と一致する。さらに、
ｐ５３との化合物相互作用の性質は、ネイティブタンパク質構造との密接な結合
を包含しない。遷移状態のタンパク質分子の小サブセットとの強い相互作用は、
活性配座からの逸脱を遮断するか、またはネイティブ配座への方向転換を促進す
るよう機能し得る。
【０１５３】 ＩＸ．実施例４：腫瘍増殖検定 Ａ．材料と方法 腫瘍増殖検定． 培養細胞をＰＢＳですすぎ、1 x 106Ａ375.S2または5 x 106 ＤＬＤ１細胞を90％Matrigel（Becton Dickinson）中で、20 gの雌ＮＵ／ＮＵ−
ｎｕＢＲマウス（Charles River Laboratories）の片方の右脇腹に接種した。0.
1％プルロニックＰ−105（BASF）を含有する生理食塩溶液中で、化合物Ｘを腹腔
内投与した。カリパスを用いて腫瘍直径を二次元で測定し、腫瘍容積に変換した
（Euhus et al., 1986, J. Surg. Oncol. 31, 229-234）。
【０１５４】 Ｂ．結果 in vivoでのｐ５３の変調． 化合物Ｘは、突然変異化ｐ５３を有する腫瘍中
のｍＡｂ1620に対するエピトープを表示するｐ５３分画の定常状態レベルを増強
した。注入Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３細胞由来の皮下腫瘍を保有す
るマウスに、化合物を100 mg/Kgで腹腔内投与した。化合物の１回投与後に動物
を屠殺し、総および1620-陽性ｐ５３発現に関して、腫瘍溶解物を分析した。総
ｐ５３レベルは、ｍＡｂＤＯ−１を用いたウエスタンブロットで測定した場合、
変化がなかった。総ｐ５３含量の小変動に対して溶解物を標準化して、ｍＡｂ16
20に対するエピトープの発現に関してＥＬＩＳＡ検定で試験した。エピトープは
、処理後3〜5時間内に増大された（図５）。in vivo応答の時間経過は、培養細
胞の場合と同様であった（図３Ａ）。
【０１５５】 in vivo突然変異体ｐ５３の機能的回復を評価するために、処置および未処置
動物からの腫瘍中のルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を我々は査定した。
投薬後8時間目に、最大4.5倍のレポーター遺伝子誘導が観察された（図５）。配
座的および機能的応答間のタイムラグは、ルシフェラーゼ転写体の翻訳およびタ
ンパク質の蓄積にようする時間を反映し得る。マウスにおける化合物のピーク血
漿濃度は10 ug/mlであったが、これは細胞中のレポーター遺伝子の最大誘導に必
要なものより低かった（データは示されていない）。したがって、培養細胞と比
較して、腫瘍中のより低レベルのレポーター遺伝子誘導は、次善の曝露によると
思われる。
【０１５６】 Ｃ．考察 結果は、配座安定化化合物が多数の無作為選定突然変異体を機能的に回復し得
る、ということを示す。したがって、本発明の方法および化合物は、異なるｐ５
３突然変異体に広範に適用可能である。例えば、小ＤＮＡ接触部位に影響を及ぼ
すＤＬＤ−１細胞中の位置241突然変異は、化合物Ｘの安定化活性により機能的
に補足され得る。したがって、ＤＮＡ接触部位のいくつかを含めた非常に多数の
ｐ５３突然変異体は、活性配座の安定化時に回復され得る。
【０１５７】 化合物Ｘは、in vitroで野生型および突然変異体ｐ５３の両方の配座を安定化
するにもかかわらず、in vivoで治療的選択性を実証した。実際、本化合物は安
全であると思われたし、マウスに200 mg/kg／日（100 mg/kg／１日２回）で14連
続日投与した場合に、脂肪は観察されなかった（データは示されていない）。選
択性は、腫瘍細胞中での非常に高いレベルと比較した場合の、正常細胞中のｐ５
３の非常に低い定常状態レベルによるものと思われる（Lassus et al., 1996, E
MBO J. 15, 4566-4573）。さらに、腫瘍特異的ストレス、例えばＤＮＡ病変およ
び酸素または栄養素欠乏は、ｐ５３のアポトーシス作用に対して腫瘍細胞を優先
的に導き得る（Chen et al., 1996, Genes and Dev. 10, 2438-2451）。そのよ
うな場合、ｐ５３安定化化合物を放射線または遺伝子傷害性療法と組合せること
により、共働的抗腫瘍作用を成し遂げ得る。
【０１５８】 前記の明細書は、当業者が本発明を実施し得るに十分である。実際、分子生物
学、医学または関連分野の当業者に明らかである本発明の実行のための前記の手
段の種々の修正は、以下の特許請求の範囲内であるよう意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 ｐ５３ＤＢＤ上の配座依存性エピトープの変調 ｐ５３ＤＢＤを微小滴定ウエル中で固定し、高温でインキュベートした。ＥＬ
ＩＳＡ検定は、氷上に保持された対照ウエルと比較した場合の、加熱ウエル中に
残存するｍＡｂ1620に対するエピトープのパーセントを確定した。0.5 ngの野生
型ｐ５３ＤＢＤをインキュベートした。ｍＡｂ1620に対する残存エピトープは、
非加熱対照のパーセントとして示される。標準偏差は<10％であった。
【図１Ｂ】 ｐ５３ＤＢＤ上の配座依存性エピトープの変調 ｐ５３ＤＢＤを微小滴定ウエル中で固定し、高温でインキュベートした。ＥＬ
ＩＳＡ検定は、氷上に保持された対照ウエルと比較した場合の、加熱ウエル中に
残存するｍＡｂ1620に対するエピトープのパーセントを確定した。1.25 ngのＦ
ＬＡＧタグ化ｐ５３ＤＢＤを固定し、45℃で加熱して、抗ＦＬＡＧ、ｍＡｂ1620
およびｍＡｂ240に対する残存エピトープを非加熱対照のパーセントとして示し
た。
【図１Ｃ】 ｐ５３ＤＢＤ上の配座依存性エピトープの変調 ｐ５３ＤＢＤを微小滴定ウエル中で固定し、高温でインキュベートした。ＥＬ
ＩＳＡ検定は、氷上に保持された対照ウエルと比較した場合の、加熱ウエル中に
残存するｍＡｂ1620に対するエピトープのパーセントを確定した。ｍＡｂ1620に
対するほぼ等レベルのエピトープを示した1.0 ngの野生型および位置143突然変
異体ｐ５３ＤＢＤを37℃で加熱し、エピトープの安定性を非加熱対照のパーセン
トとして監視した。誤差バーは、４つの反復実験に関する標準偏差である。
【図２Ａ】 突然変異体ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの安定化 ｐ５３の配座安定性を促進する化合物Ｘ、化合物Ｙおよび化合物Ｚと呼ばれる
代表的化合物。
【図２Ｂ】 突然変異体ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの安定化 1 ngの野生型ｐ５３ＤＢＤを固定し、化合物または等価濃度のＤＭＳＯビヒク
ルの存在下で45℃で30分間加熱した。ｍＡｂ1620に対する残存エピトープは、非
加熱対照のパーセントとして示される。
【図２Ｃ】 突然変異体ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの安定化 ｍＡｂ1620に対するほぼ同レベルのエピトープを有する野生型および突然変異
体ｐ５３ＤＢＤ調製物を固定し、化合物またはビヒクルの存在下で37℃で30分間
加熱した。ｍＡｂ1620に対する残存エピトープは、非加熱対照のパーセントとし
て示される。誤差バーは、４つの反復実験に関する標準偏差である。
【図３Ａ】 突然変異体ｐ５３を有する細胞中のｐ５３配座および転写活性の変調 位置173突然変異体ｐ５３を発現したＨ1299トランスフェクタントを培養中で1
6.5 ug/mlの化合物Ｘで処理した。panｐ５３抗体、ｍＡｂＤＯ−１を用いたウエ
スタンブロットを用いて、全ｐ５３タンパク質中の小変異に関して、細胞溶解物
を標準化し、ｍＡｂ1620に対するエピトープを示すｐ５３の量をＥＬＩＳＡ検定
で確定した。1620陽性ｐ５３分画における増大を、未処理細胞中の1620陽性ｐ５
３の分画に対して補正した。
【図３Ｂ】 突然変異体ｐ５３を有する細胞中のｐ５３配座および転写活性の変調 Ｈ1299トランスフェクタントをルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｈ1299／レ
ポーター）とまたはレポーター遺伝子と適合させて、位置173突然変異体ｐ５３
（Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３）を微小滴定ウエル中で16時間処理し
た。野生型ｐ５３機能を示すルシフェラーゼレポーター遺伝子の誘導化発現を、
化合物の非存在下での基礎レベルの発現に対して補正した。値は、４つの反復実
験の平均を表す。
【図４】 突然変異体ｐ５３を有する細胞中のＷＡＦ１発現の誘導 トランスフェクト化突然変異体ｐ５３タンパク質（位置173または位置249）を
発現するＳａｏｓ−２細胞を、16.5 ug/mlの化合物Ｘを含有する培養中で16時間
処理した。細胞溶解物を全タンパク質に関して標準化し、ウエスタンブロットで
分析した。ブロットの上部を全ｐ５３に関してｍＡｂＤＯ−１でプローブし、同
一ブロットの底部をＷＡＦ１に向けられる抗体でプローブした。
【図５】 腫瘍におけるｐ５３配座安定性および機能の促進 Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３細胞由来の皮下腫瘍を保有するマウス
に、化合物Ｘの100 mg/kg腹腔内注射を１回施して、ｍＡｂＤＯ−１を用いたウ
エスタンブロットの濃度計走査を基礎にして、全ｐ５３含量に関して二つの腫瘍
溶解物を標準化した。ｍＡｂ1620に対するエピトープを示すｐ５３の量をＥＬＩ
ＳＡ検定で確定し、1620陽性ｐ５３分画における増大を、非処置腫瘍からの溶解
物中の1620陽性ｐ５３の分画に対して補正した。ｐ５３転写活性の増強を査定す
るために、ルシフェラーゼ発現に関しても腫瘍溶解物を分析した。タンパク質濃
度に関してルシフェラーゼ発現を標準化し、非処置腫瘍からの溶解物と比較した
。
【図６】 突然変異化ｐ５３を発現する腫瘍異種移植片の抑制 マウスに腫瘍細胞を接種し、指示されたような化合物Ｘまたはビヒクルの腹腔
内注射により処置した。化合物を、１日１回（q.d.）または12時間間隔（b.i.d.
）で7日間投与した。ビヒクル処置マウスには、12時間間隔で注射を施した。二
次元での腫瘍直径測定により腫瘍容積を確定し、各群の5〜7匹に関して平均を出
した。点線は、処置を開始した場合の初期腫瘍容積を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 3/06 ４Ｃ０８６ 7/04 7/04 ４Ｈ０４５ 21/04 21/04 25/00 25/00 25/28 25/28 27/02 27/02 27/12 27/12 35/00 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ // Ｃ０７Ｄ 219/12 Ｃ０７Ｄ 219/12 221/08 221/08 221/18 221/18 239/94 239/94 279/26 279/26 417/12 417/12 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 コネル，リチャード ダミアン アメリカ合衆国，コネチカット 06340， グロトン，イースタン ポイント ロー ド，セントラル リサーチ ディビジョ ン，ファイザー インク (72)発明者 フォスター，バーバラ アン アメリカ合衆国，コネチカット 06340， グロトン，イースタン ポイント ロー ド，セントラル リサーチ ディビジョ ン，ファイザー インク (72)発明者 ラスティンジャド，ファーザン アメリカ合衆国，コネチカット 06340， グロトン，イースタン ポイント ロー ド，セントラル リサーチ ディビジョ ン，ファイザー インク Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 FA01 HA17 4C034 BD11 CJ06 4C036 AA02 AA14 AA20 4C063 AA01 BB09 CC64 CC95 DD10 DD64 EE01 4C084 AA13 AA14 AA17 NA14 ZA021 ZA161 ZA331 ZA531 ZA811 ZA961 ZB261 ZC331 ZC351 ZC411 ZC412 4C086 AA01 AA02 BC27 BC46 BC50 BC89 GA04 GA07 GA10 GA12 MA01 MA04 NA14 ZA02 ZA16 ZA33 ZA53 ZA81 ZA96 ZB26 ZC33 ZC35 ZC41 4H045 AA30 CA40 EA28 【要約の続き】

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 突然変異体形態のｐ５３ファミリーのヒトタンパク質におけ
    る野生型活性の促進方法であって、生理学的条件下での機能的配座を保持する前
    記タンパク質の無能力により前記タンパク質の１つ又はそれ以上の機能的活性が
    少なくとも部分的に減損される方法であって、以下の： （ａ）生理学的条件下で前記突然変異体タンパク質中の１つ又はそれ以上のド
    メインと結合し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物と前
    記突然変異体タンパク質を接触させて、そして （ｂ）前記安定化タンパク質を野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分
    子物質と相互作用させる 工程からなる方法。
  2. 【請求項２】 前記タンパク質が、ｐ５３、ｐ６３およびｐ７３から成る群
    から選択される請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 前記タンパク質がｐ５３である請求項２の方法。
  4. 【請求項４】 前記有機非ペプチド化合物が以下の： 【化１】 からなる群から選択される請求項１の方法であって、Ｉ基： 【化２】 に関しては、 Ｒ5は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19 （ここで、Ｒ18はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
    ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
    ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2 ）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍ
    は０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アル
    キルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロ
    アリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又は
    それ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アル
    キル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシ
    クロアルキルまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に
    置換される）から選択されるか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、 Ｒ6は、 （ａ）各々任意に１つ又はそれ以上のフェニル基により置換される（Ｃ1〜
    Ｃ6）アルキルまたは（Ｃ2〜Ｃ8）アルケニル、 （ｂ）ハロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシにより置換されるフェニル であり、 Ｒ7およびＲ8は同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコ
    キシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンであり、 ＩＩ基： 【化３】 に関しては、 Ｒ9は−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニル
    （ここで、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ
    、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−
    （ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−
    （ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０
    〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル
    である）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）
    アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル
    、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキ
    ル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、
    アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ
    、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル）または（Ｃ1〜Ｃ 6 ）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択される）
    であり、 ＩＩＩ基： 【化４】 に関しては、 Ｒ10は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフ
    ェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
    ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
    ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2 ）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍ
    は０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アル
    キルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロ
    アリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又は
    それ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アル
    キル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシ
    クロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1
    〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択され
    るか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、 ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そし
    て Ｒ11およびＲ12は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
    ルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから
    選択され、 ＩＶ基： 【化５】 に関しては、 Ｒ13は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフ
    ェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
    ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
    ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2） p −（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは
    ０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキ
    ルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロア
    リール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ 6 ）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ
    、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
    ルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜
    Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜
    Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、 ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そし
    て Ｒ14およびＲ15は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
    ルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから
    選択され、 Ｖ基： 【化６】 に関しては、 Ａは炭素または窒素であり、 Ｒ16は、−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたは
    フェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
    ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
    ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2） p −（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは
    ０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキ
    ルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロ
    アリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）ア
    ルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ
    、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
    ルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜
    Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜
    Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、そして Ｒ17は、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロま
    たはブロモから選択されるハロゲンから選択される方法。
  5. 【請求項５】 前記有機非ペプチド化合物がヒトｐ５３タンパク質のＤＮＡ
    結合ドメイン残基94〜312と結合する請求項１の方法。
  6. 【請求項６】 前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが残基143、173
    、175、241および249から成る群から選択されるアミノ酸位置にミスセンス突然
    変異を包含する請求項５の方法。
  7. 【請求項７】 工程（ａ）および（ｂ）が同時に実施される請求項１の方法
    。
  8. 【請求項８】 工程（ａ）および（ｂ）が引き続いて実施される請求項１の
    方法。
  9. 【請求項９】 １つ又はそれ以上の野生型活性低減を示すｐ５３ファミリー
    の突然変異体タンパク質の所有に関連した疾患状態に対するヒト被験者の治療方
    法であって、以下の： （ａ）生理学的条件下で前記突然変異体タンパク質中の１つ又はそれ以上のド
    メインと結合し得る有機非ペプチド化合物を前記被験者に投与して、そこでの機
    能的配座を安定化し、そして （ｂ）前記患者中の前記安定化タンパク質を前記野生型活性に関与する１つ又
    はそれ以上の高分子物質と相互作用させる 工程を包含する方法。
  10. 【請求項１０】 前記タンパク質がｐ５３、ｐ６３およびｐ７３から成る群
    から選択される請求項９の方法。
  11. 【請求項１１】 前記タンパク質がｐ５３である請求項１０の方法。
  12. 【請求項１２】 前記有機非ペプチド化合物がヒトｐ５３タンパク質のＤＮ
    Ａ結合ドメイン残基94〜312と結合する請求項１０の方法。
  13. 【請求項１３】 前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが残基143、1
    73、175、241および249から成る群から選択されるアミノ酸位置にミスセンス突
    然変異を包含する請求項１２の方法。
  14. 【請求項１４】 工程（ａ）および（ｂ）が同時に実施される請求項９の方
    法。
  15. 【請求項１５】 工程（ａ）および（ｂ）が引き続いて実施される請求項９
    の方法。
  16. 【請求項１６】 前記疾患状態が癌である請求項１０の方法。
  17. 【請求項１７】 癌に対するヒト被験者の治療方法であって、以下の： （ａ）生理学的条件下でｐ５３ファミリーのヒトタンパク質中の１つ又はそれ
    以上のドメインと結合し得る有機非ペプチド化合物を前記被験者に投与して、そ
    こでの機能的配座を安定化し、そして （ｂ）前記安定化タンパク質を前記タンパク質の野生型活性に関与する１つ又
    はそれ以上の高分子物質と相互作用させる 工程を包含する方法。
  18. 【請求項１８】 前記タンパク質がｐ５３、ｐ６３およびｐ７３から成る群
    から選択される請求項１７の方法。
  19. 【請求項１９】 前記タンパク質がｐ５３である請求項１７の方法。
  20. 【請求項２０】 前記有機非ペプチド化合物が以下の： 【化７】 からなる群から選択される請求項１７の方法であって、Ｉ基： 【化８】 に関しては、 Ｒ5は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19 （ここで、Ｒ18はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
    ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
    ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2） p −（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは
    ０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキ
    ルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロ
    アリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又は
    それ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アル
    キル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシ
    クロアルキルまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に
    置換される）から選択されるか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示し、 Ｒ6は、 （ａ）各々任意に１つ又はそれ以上のフェニル基により置換される（Ｃ1〜
    Ｃ6）アルキルまたは（Ｃ2〜Ｃ8）アルケニル、 （ｂ）ハロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシにより置換されるフェニル であり、 Ｒ7およびＲ8は同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコ
    キシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンであり、 ＩＩ基： 【化９】 に関しては、 Ｒ9は−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニル
    （ここで、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ
    、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−
    （ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2）p−（
    ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜
    ５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルで
    ある）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）ア
    ルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、
    （Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル
    （Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、ア
    ミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、
    （Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル）、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
    ルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）
    アリールにより任意に置換される）から選択される）であり、 ＩＩＩ基： 【化１０】 に関しては、 Ｒ10は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフ
    ェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
    ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
    ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2） p −（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは
    ０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキ
    ルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロ
    アリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又は
    それ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アル
    キル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシ
    クロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1
    〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択され
    るか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、 ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そし
    て Ｒ11およびＲ12は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
    ルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから
    選択され、 ＩＶ基： 【化１１】 に関しては、 Ｒ13は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフ
    ェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
    ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
    ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2） p −（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは
    ０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキ
    ルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロア
    リール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ 6 ）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ
    、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
    ルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜
    Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜
    Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、 ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そし
    て Ｒ14およびＲ15は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
    ルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから
    選択され、 Ｖ基： 【化１２】 に関しては、 Ａは炭素または窒素であり、 Ｒ16は、−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたは
    フェニルであり、そして Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフ
    ェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒド
    ロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ 21 、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2） p −（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは
    ０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキ
    ルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の： （ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ 3 〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロ
    アリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）ア
    ルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ
    、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）ア
    ルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜
    Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜
    Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは （ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6 ）アルキルピペラジンを示す）であり、そして Ｒ17は、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロま
    たはブロモから選択されるハロゲンから選択される方法。
  21. 【請求項２１】 前記有機非ペプチド化合物がヒトｐ５３タンパク質のＤＮ
    Ａ結合ドメイン、残基94〜312と結合する請求項１７の方法。
  22. 【請求項２２】 前記有機非ペプチド化合物によりターゲッティングされる
    ｐ５３ファミリーのタンパク質が野生型である請求項１７の方法。
  23. 【請求項２３】 前記有機非ペプチド化合物によりターゲッティングされる
    ｐ５３ファミリーのタンパク質が対立遺伝子変異体によりコードされる突然変異
    体である請求項１７の方法。
  24. 【請求項２４】 前記有機非ペプチド化合物が以下のものから成る群から選
    択される請求項１の方法： 【化１３】 （１−ベンジル−ピペリジン−４−イル）−（３−フェノチアジン−１０−イル
    −プロピル）−アミン、 【化１４】 ［２−（４−クロロ−フェニル）−エチル］−（３−フェノチアジン−１０−イ
    ル−プロピル）−アミン、 【化１５】 （３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−チオクロマン−４−イル−ア
    ミン、 【化１６】 ［１−メチル−３−（２，６，６−トリメチル−クロロヘキス−２−エニル）−
    アリル］−（３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、 【化１７】 （７−エトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−（
    ３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、 【化１８】 Ｎ’−（９−フルオロ−ベンゾ［ｃ］アクリジン−７−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチ
    ル−プロパン−１，３−ジアミン、 【化１９】 Ｎ’−アクリジン−９−イル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１，３−ジアミン
    、 【化２０】 ２−｛４−［４−（ベンゾ［ｇ］キノリン−４−イルアミノ）−フェニル］−ピ
    ペラジン−１−イル｝−エタノール、 【化２１】 Ｎ4−｛２−［２−（４−ブロモ−フェニル）−ビニル］−７−クロロ−キナゾ
    リン−４−イル｝−Ｎ1，Ｎ1−ジエチル−ペンタン−１，４−ジアミン、 【化２２】 Ｎ−ベンゾ［ｇ］キノリン−５−イル−Ｎ‘−クロロヘキシル−プロパン−１，
    ３−ジアミン、 【化２３】 ２−［（２−ヒドロキシ−エチル）−（３−｛２−［２−（４−メトキシ−フェ
    ニル）−ビニル］−キナゾリン−４−イルアミノ｝−プロピル）−アミノ］−エ
    タノール。
  25. 【請求項２５】 前記有機非ペプチド化合物が以下のものから成る群から選
    択される請求項１７の方法： 【化２４】 （１−ベンジル−ピペリジン−４−イル）−（３−フェノチアジン−１０−イル
    −プロピル）−アミン、 【化２５】 ［２−（４−クロロ−フェニル）−エチル］−（３−フェノチアジン−１０−イ
    ル−プロピル）−アミン、 【化２６】 （３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−チオクロマン−４−イル−ア
    ミン、 【化２７】 ［１−メチル−３−（２，６，６−トリメチル−クロロヘキス−２−エニル）−
    アリル］−（３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、 【化２８】 （７−エトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−（
    ３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、 【化２９】 Ｎ’−（９−フルオロ−ベンゾ［ｃ］アクリジン−７−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチ
    ル−プロパン−１，３−ジアミン、 【化３０】 Ｎ’−アクリジン−９−イル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１，３−ジアミン
    、 【化３１】 ２−｛４−［４−（ベンゾ［ｇ］キノリン−４−イルアミノ）−フェニル］−ピ
    ペラジン−１−イル｝−エタノール、 【化３２】 Ｎ4−｛２−［２−（４−ブロモ−フェニル）−ビニル］−７−クロロ−キナゾ
    リン−４−イル｝−Ｎ1，Ｎ1−ジエチル−ペンタン−１，４−ジアミン、 【化３３】 Ｎ−ベンゾ［ｇ］キノリン−５−イル−Ｎ’−クロロヘキシル−プロパン−１，
    ３−ジアミン、 【化３４】 ２−［（２−ヒドロキシ−エチル）−（３−｛２−［２−（４−メトキシ−フェ
    ニル）−ビニル］−キナゾリン−４−イルアミノ｝−プロピル）−アミノ］−エ
    タノール。
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