HRP20010414A2

HRP20010414A2 - METHODS AND COMPOSITIONS FOR RESTORING CONFORMATIONAL STABILITY OF A PROTEIN OF THE p53 FAMILY

Info

Publication number: HRP20010414A2
Application number: HR20010414A
Authority: HR
Inventors: Heather Anne Coffey; Richard Damian Connell; Barbara Ann Foster; Farzan Rastinejad
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 1998-12-02
Filing date: 2001-05-29
Publication date: 2002-06-30
Also published as: TR200101549T2; CA2350597A1; AU1290700A; HK1041644A1; NO20012737L; AP2001002153A0; KR20010086073A; ZA200104210B; US20020048271A1; NO20012737D0; HUP0201215A2; CN1329493A; JP2002531396A; ID29061A; YU35401A; BR9915940A; PL348310A1; OA11722A; EP1137418A2; IL143094A0

Description

Područje izuma

Izum je iz područja tretmana raka. Ovaj izum odnosi se na organske nepeptidne spojeve koji mogu međudjelovati s tumor-supresijskim proteinom p53 porodice i stabilizirati funkcionalnu konformaciju. Izum je osobito primjenjiv u stabiliziranju mutantnog oblika tumor-supresijskog proteina kod pacijenata gdje popravljanje funkcionalnog kapaciteta takvih proteina može olakšati tretman raka. Također se odnosi na postupke pregleda takvih spojeva.

Pozadina izuma

Glavna struktura proteina je određeni slijed aminokiselinskih gradivnih blokova, međusobno povezanih radi tvorbe polipeptidnog/ih lan(a)ca proteina. Ovi polipeptidni lanci su, osim toga, savijeni u trodimenzijsku strukturu. Sada se smatra da više različitih bolesti nastaje zbog konformacijskih perturbacija u trodimenzijskoj strukturi staničnog proteina (vidjeti radi pregleda Thomas i drugi: TIBS 20, 456-459, (1995.); Carrell i drugi: "Lancet", 350, 134-138, (1997.)). Primjerice, Alzheimer-ova bolest je uzrokovana pogrešnim savijanjem i naknadnim nagomilavanjem beta-amiloidnog proteina, što uzrokuje oštećenje stanične funkcije. Slično tome, smatra se da etiološki agensi Creutzfeld-Jacob-ove bolesti, prioni, uzrokuju bolest započinjanjem lančane reakcije prevođenja normalnih prionskih proteina u pogrešno savijene prionske proteine.

Proteini koji poprimaju nenormalne konformacije mogu to činiti ili zbog toga što su sami po sebi osjetljivi na pogrešno savijanje ili zbog toga što imaju mutacije koje termodinamički destabiliziraju mutantni protein u odnosu na protein divljeg tipa. Glavni primjer missens-mutacija koje uzrokuju bolest je tumor-supresijski protein p53.

Divlji tip p53 funkcionira kao transkripcijski regulator za usklađenu kontrolu višestrukih puteva staničnog ciklusa, apoptoze i angiogeneze. Čini se da se svi stanični putevi koji nadgledaju stanične stresove, npr. oštećenje DNA, pogrešno slaganje mitotskog vretena i hipoksiju, usredotočuju prema p53. Gubitak p53 aktivnosti može uzrokovati nekontroliranu proliferaciju pogođenih stanica i tumorski rast. Iako gubitak p53 aktivnosti može ili ne mora, sam po sebi, biti okidač stanične transformacije u stanicu raka, vjerojatnost rasta detetkibilnog raka je veća kod osoba s mutacijama p53. U stvari, mutantni p53 su najčešće genetske aberacije kod pojave raka.

Nedavno su identificirana još dva proteina, p73 i p63, homologna prema p53 (vidjeti radi pregleda Kaelin: "J. Natl. Cancer Inst.", 91, 594-598, (1999.); vidjeti također Yang i drugi: "Molecular Cell", 2(3), 305-16, (1998.); i Yoshikawa i drugi: "Oncogene", 18(22), 3415-21, (1999.)). p51 je označen također kao p40, p51, KET ili p73L. Ne samo što ovi proteini dijele homologiju aminokiselinskog slijeda s p53, već oni također aktiviraju p53 osjetljive promotore i induciraju apoptozu. Osim toga, čini se da geni koji kodiraju ove proteine imaju zajedničkog pretka s p53. Tako je u tehnici prepoznata porodica proteina srodnih p53, sa sličnim funkcijama i sličnih aminokiselinskih sljedova.

p53 je kompleksna makromolekula s tri neovisne funkcionalne domene: N-kraj koji sadrži transkripcijski aktivirajuću domenu (približno aminokiseline 1-43); središnji dio koji kodira DNA vežuću domenu (DNA binding domain, DBD) (približno aminokiseline 100-300); i dio C-kraja koji služi kao oligomerizacijska domena (približno aminokiseline 319-360). Kristalna struktura p53 DBD ukazuje na grubo sferičnu globularnu domenu s visokim sadržajem beta-ploča.

p53 aktivnost je visoko ovisna o sposobnosti proteina da održava svoju funkcionalnu konformaciju. Analiza tumora nastalih od mnogih različitih oblika raka otkriva da je DBD često mutirana. Friedlander i drugi: "J. Biol. Chem.", 271, 25468-25478, (1996.). Unatoč velikom mnoštvu točkastih mutacija unutar p53 DNA vežućih domena kod glavnih oblika raka (Pavletich i drugi: "Genes & Development", 7, 2556-2564, (1993.)), specifični položaji ostataka unutar p53 DBD, poznati kao vruće točke, mutiraju s neobično visokom učestalošću. Mutacije vruće točke često uočene kod ljudskih tumora su donekle slučajno rasute unutar DBD. Nakon izlaganja urei, p53 DBD svih često mutiranih oblika p53 su nestabilnije od DBD divljeg tipa (Bullock i drugi: vidjeti gore). Osim toga, mutantni p53 se često povezuju s proteinima termičkog šoka u stanicama, što navodi na pomisao da su oni manje sposobni održati prirodnu konformaciju (Finlay i drugi: "Molecular and Cellular Biology", 8, 531-39, (1988.)).

Uočeno je da ih međudjelovanja s domenom C-kraja p53 aktiviraju osobine zaustavljanja staničnog ciklusa od strane p53. Specifično, injiciranje u stanice protutijela specifičnog za C-kraj p53 može zaustaviti (Mercer i drugi: "Proc. Nat. Acad. Sci.: USA", 79, 6309-6312, (1982.)). Detaljnija ispitivanja su prikazala da domena C-kraja regulira aktivnost vezanja DBD domene na DNA. Primjerice, Hupp i drugi su uočili da monoklonalno protutijelo Pab 421, koje međudjeluje s ostacima 373-381 p53 domene C-kraja, može pojačavati aktivnosti vezanja na DNA nekih mutantnih oblika p53 (Hupp i drugi: "Nucleic Acids Research", 21, 3167-3174, (1993.)). Tako su se Hupp i kolege usredotočili na protutijela i peptide koji neutraliziraju neovisnu negativnu regulacijsku domenu na C-kraju u pokušaju obnavljanja p53 funkcije (Selivanova i drugi: "Nature Med.", 3, 632-638, (1997.)). Međutim, mutanti na položaju 273 dobiveni ovim postupkom razlikuju se od drugih uobičajenih mutanata time što zadržavaju visoku osnovnu aktivnost vezanja na DNA i pokazuju osobine termodinamičke stabilnosti slične proteinu divljeg tipa (Bullock i drugi: "Proc. Nat. Acad. Sci.: USA", 94, 14338-143421, (1997.)).

Drugi istraživači na ovom polju pokazali su da je razvoj spoja koji se veže na domenu N-kraja mutanta p53 najdjelotvorniji način spašavanja aktivnost p53 divljeg tipa. Primjerice, Friedlander i drugi ispitali su više različitih monoklonalnih protutijela vezanih na definirane epitope na p53 u pogledu sposobnosti promoviranja aktivnosti vezanja na DNA toplinski osjetljivih p53 mutanata. Friedlander i drugi: "J. Biol. Chem.", 271, 25468-25478, (1996.). Dok je Pab 421 protutijelo specifično za C-kraj obnovilo funkciju vezanja na DNA mutantnog p53 na nižim temperaturama, protutijela specifična za N-kraj p53, a osobito monoklonalno protutijelo Pab1801, bila su djelotvornija u promoviranju DNA vežuće aktivnosti kod toplinski osjetljivih mutantnih p53 na povišenim temperaturama. Na temelju ovih spoznaja Friedlander i drugi razmišljali su da bi razvoj male molekule koja oponaša regiju prepoznavanja epitopa 1801 vezanjem na N-kraj mogao olakšati DNA vežuću aktivnost divljeg tipa u mutantu p53. Osobito su Friedlander i drugi prikazali da protutijelo specifično za epitop u središnjom dijelu (DBD domenu) p53 proteina nije imalo utjecaja na DNA vežuću aktivnost. Kao jedno objašnjenje njihovih rezultata, Friedlander i drugi postavili su hipotezu da je konformacija jedne domene unutar proteina stabilizirana upotrebom udaljene domene. Bullock i drugi su prikazali da je promjena u termodinamičkoj stabilnosti kod p53 mutanata u DNA vežućoj domeni koji se često nalaze prilično mala i razmišljali da bi razvoj terapije malom molekulom za p53 kao što su predložili Friedlander i drugi (tj. molekule koje se vežu na N-kraj) mogao biti moguć. Bullock i drugi: vidjeti gore (1997.).

Drugi, globalniji postupci identificiranja antitumorskih spojeva usmjereni su na ispitivanje izravnih, antitumorskih aktivnosti malih molekula temeljenih na stanici (npr. tumorske stanične linije) ili testovima na životinjama. Opisano je više malih molekula s mogućom antitumorskom aktivnošću. Mazerska i drugi: "Anti-Cancer Drug Design", 5, 169-187, (1990.); Su i drugi: "J. Med. Chem.", 38, 3226-3235, (1995.); Nagy i drugi: "Anticancer Research", 16, 1915-1918, (1996.); Wuonola i drugi: "Anticancer Research", 17, 3409-23, (1997.). Mazerska i drugi opisuju niz nitro-9-aminoakridina s nitro grupom vezanom na akridinsku grupu čije se antitumorske osobine pripisuju njihovoj DNA vežućoj sposobnosti i stvaranju kovalentnih veza između lanaca. Su i drugi opisuju niz 9-anilinoakridinskih derivata s različitim položajima anilino i akridinski supstituiranog sustava prstena razvijenih kao inhibitori topoizomeraze II. Nagy i drugi opisuju niz spojeva srodnih fenotiazinu vezanih preko kratke ugljikove poveznice na grupu temeljenu na urei ili ftalimidu. Nagy i drugi pretpostavili su da je antitumorska aktivnost u stanici ove klase spojeva rezultat njihove sposobnosti međudjelovanja s kalcijskim kanalima i kalmodulinom. Wuonola i drugi: vidjeti gore, opisuju fenotiazinske spojeve slične onima koje su opisali Nagy i drugi: vidjeti gore.

Do danas, mala organska nepeptidna molekula koja međudjeluje s proteinom p53 porodice radi obnavljanja ili stabiliziranja aktivnosti divljeg tipa, poput tumor-supresijske aktivnosti, nije opisana. Osim toga, otkriće takvih spojeva je spriječeno nedostatkom visoko propusnog postupka pregleda ili testa.

Bit izuma

Poznavajući važnost identifikacije spojeva koji mogu konformacijski stabilizirati termodinamički nestabilne ili pogrešno savijene proteine povezane s ljudskim bolestima i znajući za nedostatak visoko propusnog sustava testiranja u kome bi se takvi spojevi mogli brzo identificirati, izumitelji su u in vitro i u in vivo testovima ispitali upotrebu izolirane mutantne p53 DNA vežuće domene (DBD) kao modelni sustav za brzo identificiranje tvari koje konformacijski stabiliziraju mutantni p53. Izum se odnosi na brz, pouzdan i točan postupak objektivnog identificiranja spojeva, uključujući farmaceutske pripravke za ljude, koji promoviraju aktivnost divljeg tipa u proteinu iz p53 porodice.

Prema tome, ovaj izum odnosi se na prvu demonstraciju mogućnosti međudjelovanja nepeptidnih organskih spojeva s proteinom iz p53 porodice i promoviranja njegove aktivnosti divljeg tipa. Na ili blizu fizioloških temperatura, ovi aktivni spojevi su promovirali aktivnost divljeg tipa kod p53, ne samo kod niza mutantnih p53 proteina, već također proteina p53 divljeg tipa. Takvi spojevi imaju značajnu primjenu kao farmaceutski pripravci protiv raka. Prema tome, izum se odnosi novi postupak i spojeve upotrebljive u antitumorskoj terapiji kod oblika raka s aktivnošću mutanta ili divljeg tipa proteina iz p53 porodice.

U jednom aspektu, izum se odnosi na postupak promoviranja aktivnosti divljeg tipa kod mutantnog oblika ljudskog proteina iz p53 porodice, gdje je jedna ili više funkcionalnih aktivnosti proteina barem djelomično oštećena zbog nesposobnosti proteina da održava funkcionalnu konformaciju pod fiziološkim uvjetima, gdje postupak obuhvaća faze stupanja u dodir mutantnog proteina s organskim nepeptidnim spojem koji se može vezati na jednu ili više domena u mutantnom proteinu pod fiziološkim uvjetima i stabilizirati funkcionalnu konformaciju i omogućavati stabiliziranom proteinu međudjelovanje s jednom ili više makromolekula koje sudjeluju u aktivnosti divljeg tipa. Ljudski protein iz p53 porodice može biti, primjerice, p53, p63 ili p73. U poželjnim realizacijama, nepeptidni spoj međudjeluje s p53 i, čak poželjnije, s DNA vežućom domenom iz p53.

Izum se također odnosi, u drugom ostvarenju, na postupak tretiranja bolesnog stanja kod ljudskog subjekta povezanog s ekspresijom mutantnog proteina iz p53 porodice s jednom ili više umanjenih aktivnosti divljeg tipa, koji obuhvaća faze primjene na subjektu organskog nepeptidnog spoja koji se može vezati na jednu ili više domena mutantnog proteina pod fiziološkim uvjetima i stabilizirati funkcionalnu konformaciju; i omogućavati stabiliziranom proteinu u pacijentu međudjelovanje s jednom ili više makromolekula koje sudjeluju u aktivnosti divljeg tipa. U još jednoj realizaciji, izum se odnosi na postupak tretiranja raka kod ljudskog subjekta, koji obuhvaća faze: primjene na subjektu organskog nepeptidnog spoja koji se može vezati na jednu ili više domena ljudskog proteina iz p53 porodice pod fiziološkim uvjetima i stabilizirati funkcionalnu konformaciju i omogućavati stabiliziranom proteinu međudjelovanje s jednom ili više makromolekula koje sudjeluju u aktivnosti divljeg tipa proteina.

U jednom aspektu, organski nepeptidni spojevi namijenjeni upotrebi u izumu mogu biti spoj koji sadrži i hidrofobnu grupu (npr. planarni policikl) i kationsku grupu (po mogućnosti amin) vezane zajedno poveznicom specifične duljine.

U poželjnom aspektu, organske nepeptidne spojevi namijenjene upotrebi u izumu bira se iz grupe koju čine:

[image]

gdje, za grupu I,

[image]

R5 je –N–R18R19, gdje

R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, a

R19 je H, (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil ili fenil, gdje spomenuta alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, –CON R18(CH2)pNR20R21, –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21 ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, i

R20i R21 se svaki, neovisno, biraju između:

(a) H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)arila, (C5-C9)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C12)arila, gdje su spomenute grupe izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; ili

(b) NR20R21 uzeti zajedno predstavljaju vodik, morfolin ili 4-(C1-C6)alkilpiperazin;

R6 je

(a) (C1-C6)alkil ili (C2-C8)alkenil, od kojih je svaki izborno supstituiran s jednom ili više fenilna grupa, ili

(b) fenil supstituiran s halo, (C1-C6)alkoksi; i

R7 i R8 su isti, ili različiti, a biraju se između H, nitro, (C1-C6)alkoksi, ili halogen kojeg se bira između fluor, klor i brom;

gdje, za grupu II,

[image]

R9 je (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil, ili fenil, gdje spomenuta alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, –CON R18(CH2)pNR20R21, –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21 ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, a

R20i R21 se svaki, neovisno, biraju između H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)arila, (C5-C9)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C12)arila, gdje spomenute grupe su izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C6)alkil(C5-C9)heteroarila ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila;

gdje, za grupu III,

[image]

R10 je –N–R18R19, gdje

R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, i

R19 je H, (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil ili fenil, gdje spomenuta alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, –CON R18(CH2)pNR20R21, –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21 ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, a

R20i R21 se svaki, neovisno, biraju između:

(a) H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)arila, (C5-C9)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C12)arila, gdje su spomenute grupe izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C6)alkil(C5-C9)heteroarila ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; ili

A i B su isti ili različiti, i svaki predstavlja ugljik ili dušik; i

R11 i R12 su isti, ili različiti, a biraju se između H, nitro, (C1-C6)alkoksi, ili halogena kojeg se bira između fluora, klora i broma;

gdje, za grupu IV,

[image]

R13 je –N–R18R19, gdje

R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, a

R20i R21 se svaki, neovisno, biraju između:

(a) H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C6)alkil(5-C9)heteroarila, (C5-C9)heteroarila, (C6-C10)arila, i (C1-C6)alkil(C6-C10)arila, gdje su spomenute grupe izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C6)alkil(C5-C9)heteroarila ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; ili

A i B su isti ili različiti, i svaki predstavlja ugljik ili dušik; i

R14 i R15 su isti, ili različiti, a biraju se između H, nitro, (C1-C6)alkoksi, ili halogen kojeg se bira između fluor, klor i brom; i

gdje, za grupu V,

[image]

A je ugljik ili dušik;

R16 je –N–R18R19, gdje

R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, i

R20i R21 se svaki, neovisno, biraju između:

(a) H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)arila, (C5-C9)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C10)arila i (C1-C6)alkil(C5-C9)heteroarila, ili gdje su spomenute grupe izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C6)alkil(C5-C9)heteroarila ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; ili

(b) NR20R21 uzeti zajedno predstavljaju vodik, morfolin ili 4-(C1-C6)alkilpiperazin; i

R17 se bira između H, nitro, (C1-C6)alkoksi, ili halogena kojeg se bira između fluor, klor i brom.

Osim toga, mnogi od spojeva upotrebljivih u praksi iz ovog izuma su novi, a opis takvih spojeva definira slijedeći aspekt izuma.

U drugom aspektu se izum također odnosi na postupak dizajniranja daljnjih spojeva koji promoviraju aktivnost divljeg tipa proteina iz p53 porodice. Postupak obuhvaća upotrebu jednog od aktivnih spojeva iz ovog izuma u generiranju hipoteze, identificiranju spoja kandidata koji odgovara hipotezi i određivanju promovira li spoj kandidat aktivnost divljeg tipa proteina iz p53 porodice.

Drugi aspekt izuma je pripravak koji sadrži kompleks proteina p53 porodice i nepeptidnog spoja koji međudjeluje s proteinom i pomaže aktivnost divljeg tipa proteina.

U još jednom aspektu, izum se odnosi na postupak pregleda spojeva koji promoviraju aktivnost divljeg tipa proteina p53 porodice. U poželjnom aspektu, postupak obuhvaća ispitivanje međudjeluju li spojevi s p53 DNA vežućom domenom (DBD) i mjerenje konformacije p53 DBD u prisustvu spoja. Međutim, izum također obuhvaća upotrebu proteina potpune i djelomične duljine iz p53 porodice u takvim postupcima pregleda. U određenoj realizaciji, faze ispitivanja i mjerenja se vrše istovremeno. Spojeve za koje je otkriveno da promoviraju aktivnost divljeg tipa kod mutantnog obliku proteina iz p53 porodice izborno se pregleda in vivo u pogledu njihove sposobnosti zaustavljanja ili supresije tumorskog rasta. Drugi aspekt izuma je postupak otkrića lijeka s pregledom organskih nepeptidnih spojeva u specifičnom međudjelovanju s p53 DBD.

Uspjeh ovog izuma u identificiranju spojeva koji promoviraju aktivnost divljeg tipa u mutantu ili proteinu divljeg tipa iz p53 porodice ukazuje da su postupci iz ovog izuma široko primjenjivi u otkriću lijeka za klasu bolestî koje uzrokuju konformacijski defektni ili nestabilni proteini. Primjeri takvih ciljnih proteina uključuju pp60src, ubikvitin aktivirajući enzim E1, regulator transmembranske vodljivosti kod cistične fibroze, hemoglobin, prionske proteine, serpine, i beta-amiloidni protein.

Kratak opis slika

Slika 1. Modulacija konformacijski ovisnih epitopa na p53 DBD. p53 DBD je imobilizirana u mikrotitarskim jažicama i inkubirana na povišenim temperaturama. ELISA testom određen je postotak epitopa za mAb1620 koji je preostao u zagrijanim jažicama u usporedbi s kontrolnim jažicama držanim na ledu. Slika 1A: inkubirano je 0,5 ng p53 DBD divljeg tipa, a zaostali epitop za mAb1620 je prikazan kao postotak negrijane kontrole. Standardne devijacije su iznosile < 10 %. Slika 1B: 1,25 ng FLAG-markirane p53 DBD imobilizirano je, grijano na 45 °C, a zaostali epitopi za antiFLAG, mAb1620, i mAb240 prikazani su kao postotak negrijane kontrole. Slika 1C: 1,0 ng divljeg tipa i mutantne p53 DBD na položaju 143, koji su dali približno jednake razine epitopa za mAb1620, grijani su na 37 °C, a stabilnost epitopa je praćena kao postotak negrijanih kontrola. Barijere greške su standardna devijacija za 4 replike.

Slika 2. Stabilizacija epitopa 1620 na mutantnoj p53 DBD. Slika 2A: reprezentativni spojevi, označeni kao spoj X, spoj Y i spoj Z, koji su potakli konformacijsku stabilnost p53. Slika 2B: 1 ng p53 DBD divljeg tipa imobilizirana je i grijana na 45°C tijekom 30 minuta, u prisustvu spojeva ili ekvivalentne koncentracije DMSO vehikuluma. Zaostali epitop za mAb1620 je prikazan kao postotak negrijane kontrole. Slika 2C: pripravci divljeg tipa i mutanta p53 DBD, sa skoro jednakim razinama epitopa za mAb1620 (unutar 10 %), imobilizirani su i grijani na 37°C tijekom 30 minuta u prisustvu spoja ili vehikuluma. Zaostali epitop za mAb1620 je prikazan kao postotak negrijanih kontrola. Barijere greške su standardna devijacija za 4 replike.

Slika 3. Modulacija konformacije p53 i transkripcijske aktivnosti u stanicama s mutantnim p53. Slika 3A: H1299 transfektanti koji su eksprimirali mutantni p53 na položaju 173 tretirani su sa 16,5 µg/ml spoja X u kulturi. Stanični lizati su normalizirani s manjim varijacijama ukupnog p53 proteina upotrebom zapadnog bugačenja s metalnom posudom s protutijelom za p53, mAbDO-1, a količina p53 koja je prikazala epitop za mAb1620 određena je ELISA testom. Povećanje frakcije p53 pozitivne na 1620 korigirano je frakcijom p53 pozitivnih na 1620 u netretiranim stanicama. Slika 3B: prilagođeni H1299 transfektanti s luciferaza-reporter-genom (H1299/reporter) ili s reporter-genom i mutantnim p53 na položaju 173 (H1299/reporter + mutantni p53) tretirani su u mikrotitarskim jažicama 16 sati. Inducirana ekspresija luciferaza-reporter-gena, karakteristična za p53 divljeg tipa, korigirana je osnovnom razinom ekspresije u odsustvu spoja. Vrijednosti predstavljaju srednje vrijednosti 4 replike.

Slika 4. Indukcija WAF1 ekspresije u stanicama s mutantnim p53. Saos-2 stanice koje eksprimiraju transficirane mutantne p53 proteine (položaj 173 ili položaj 249) tretirane su u kulturi sa 16,5 µg/ml spoja X tijekom 16 sati. Stanični lizati su normalizirani za ukupni protein i analizirani su zapadnim bugačenjem. Vršni dio bugačenja pretraživan je pomoću mAbDO-1 za ukupni p53, a donji dio istog bugačenja pretraživan je pomoću protutijelom protiv WAF1.

Slika 5. Promoviranje p53 konformacijske stabilnosti i funkcije kod tumora. Miševima s potkožnim tumorima deriviranim iz H1299/reporter + mutantni p53 stanica dana je jedna intraperitonealna injekcija 100 mg/kg spoja X, a lizati duplikata tumora su normalizirani na ukupnu količinu p53 na osnovu denziometrijskog pregleda zapadnih bugačenja s mAbDO-1. Količina p53 koja je prikazala epitop za mAb1620 određena je ELISA testom, a povećanje kod p53 frakcije pozitivne na 1620 korigirano je frakcijom p53 pozitivnog na 1620 u lizatima iz netretiranih tumora. Lizati tumora su također analizirani u pogledu ekspresiju luciferaze radi pristupa pojačanju p53 transkripcijske aktivnosti. Ekspresija luciferaze normalizirana je koncentracijom proteina i uspoređena s lizatima iz netretiranih tumora.

Slika 6. Supresija tumorskog stranog presatka koji eksprimira mutantni p53. Miševi su inokulirani tumorskim stanicama i tretirani intraperitonealnim injekcijama spoja X ili vehikuluma, kao što je navedeno. Spoj je primjenjivan sedam dana jednom dnevno (svaki dan) ili u intervalima od po 12 sati (dvaput dnevno). Miševi tretirani vehikulumom primali su injekcije u intervalima od po 12 sati. Volumen tumora je određen mjerenjem promjera tumora u dvije dimenzije i uprosječen za 5-7 miševa u svakoj grupi. Točkaste crte predstavljaju volumen tumora na početku tretmana.

Detaljan opis izuma

Gubitak funkcije kod tumor-supresorskog produkta p53 gena može uzrokovati nekontroliranu proliferaciju i/ili gubitak apoptoze opažen kod mnogih različitih tipova raka. Čak ako p53 nije mutiran kod stanice raka, promoviranje aktivnosti p53 divljeg tipa kod takve stanice može uzrokovati inhibiciju kanceroznog fenotipa. Izum ukazuje, po prvi put, da organski nepeptidni spojevi mogu međudjelovati s proteinom iz p53 porodice radi stabilizacije funkcionalne konformacije. Prema tome, takvi spojevi imaju značajnu upotrebu kao farmaceutski pripravci u tretmanu svih vrsta raka.

Tako, u jednom aspektu, izum se odnosi na postupak promoviranja aktivnosti divljeg tipa kod mutantnog oblika ljudskog proteina iz p53 porodice, gdje su jedna ili više funkcionalnih aktivnosti proteina barem djelomično oštećene nesposobnošću proteina da održava funkcionalnu konformaciju pod fiziološkim uvjetima, gdje postupak obuhvaća faze stupanja u dodir mutantnog proteina s organskim nepeptidnim spojem koji se može vezati na jednu ili više domena u mutantnom proteinu pod fiziološkim uvjetima i stabiliziranja funkcionalne konformacije i omogućavanja stabiliziranom proteinu međudjelovanje s jednom ili više makromolekula koje sudjeluju u aktivnosti divljeg tipa. Mutantni ljudski protein iz p53 porodice može biti mutantni p53, p63 ili p73 protein. U poželjnim realizacijama, organski, nepeptidni spoj međudjeluje s p53, i čak poželjnije s DNA vežućom domenom iz p53.

Izum se također, u drugoj realizaciji, odnosi na postupak tretiranja bolesnih stanja kod ljudskog subjekta povezanih s ekspresijom mutantnog proteina iz p53 porodice s jednom ili više umanjenih aktivnosti divljeg tipa, koji obuhvaća faze primjene na subjektu organskog nepeptidnog spoja koji se može vezati na jednu ili više domena u mutantnom proteinu pod fiziološkim uvjetima, i stabiliziranja funkcionalne konformacije; i omogućavanja stabiliziranom proteinu u pacijentu međudjelovanje s jednom ili više makromolekula koje sudjeluju u aktivnosti divljeg tipa.

U još jednoj realizaciji, izum se odnosi na postupak tretiranja raka kod ljudskog subjekta koji obuhvaća faze: primjene na subjektu organskog nepeptidnog spoja koji se može vezati s jednom ili više domena iz ljudskog proteina iz p53 porodice pod fiziološkim uvjetima i stabiliziranja funkcionalne konformacije i omogućavanja stabiliziranom proteinu međudjelovanje s jednom ili više makromolekula koje sudjeluju u aktivnosti divljeg tipa proteina. Ljudski protein iz p53 porodice stabiliziran u postupcima iz ovog izuma može biti divljeg tipa ili mutantni protein, primjerice, p53, p63 ili p73.

Iako su proteini iz p53 porodice mutirani u mnoštvu oblika raka, ipak je kod nekih oblika raka ili tipova kanceroznih stanica struktura ili funkcija proteina iz p53 porodice (sam p53 je najviše ispitivan) promijenjena čak iako uključene stanice zadržavaju alel koji kodira divlji tip. Primjerice, vidjeti Kaelin, (1999.), gore, diskusiju o oblicima raka povezanim s virusima, gdje virusni protein obezvrjeđuje p53 protein, ili p53 je inaktiviran ili obezvrijeđen, primjerice, ekspresijom produkta onkogena. Imajući na umu važnost proteina iz p53 porodice u staničnim regulacijskim procesima, bit će jasno da su spojevi iz ovog izuma također upotrebljivi u stabiliziranju funkcionalne konformacije nemutiranih članova p53 porodice pod fiziološkim uvjetima u stanicama gdje je rok trajanja i/ili struktura i/ili aktivnost takvih proteina normalan. Prema tome, spojevi iz ovog izuma su upotrebljivi u tretmanu raka gdje funkcija p53 proteina, i sličnih, nije pod bitnim utjecajem prisustva kanceroznog stanja, a također i u tretmanu tkiva s prekanceroznim stanicama čije se nenormalnosti se još uvijek nisu proširile na nenormalnu funkciju p53 (ili člana p53 porodice), rok trajanja ili strukturu. Osim toga, daljim stabiliziranjem (primjerice, uzrokovanje povećanog roka trajanja) proteina iz p53 porodice kod zdravih stanica u susjedstvu mjesta malignosti, ili koje na drugi način dolaze u dodir s malignim stanicama u tijelu, širenje raka se može kontrolirati. Spojevi iz ovog izuma također su upotrebljivi u ovom pogledu.

U skladu s praksom iz ovog izuma, protein iz p53 porodice je definiran kao p53, p63 ili p73 sisavca; i/ili protein s domenom, od kojih svi imaju barem 50 %, poželjnije 80 %, homologije aminokiselinskog slijeda s jednom ili više (1) domena N-kraja nužnom za transkripcijsko aktiviranje, (2) DNA vežućih domena, ili (3) oligomerizacijskih domena p53, p63 ili p73 sisavca, gdje je spomenuta homologija mjerena bilo kojim poznatim algoritmom BLASTP v. 2.0 (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul i drugi: "J. of Molec. Biol.", 215, 403-410, (1990.), "The BLAST Algorithm"; Altschul i drugi: "Nuc. Acids Res.", 25, 3389-3402, (1997.)) i W.U.-BLAST-2.0 (dobiven od Washington, St. Louis, MO, USA), a gdje spomenuti protein pokazuje barem jednu funkciju poznatu u tehnici kao karakterističnu također za p53, p63 ili p73 (npr. primjerice, sposobnost aktiviranja promotora osjetljivih na p53 i induciranje apoptoze; za diskusiju u tehnici poznatih osobina, vidjeti Kaelin: (1999.); Yang i drugi: (1998.); i Yoshikawa i drugi: (1999.), navedeni gore). Za opću raspravu postupka i prednosti BLAST, Smith-Waterman i FASTA algoritama vidjeti Nicholas i drugi: (1998.), "A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods" (www.psc.edu) i tu navedene reference.

Spojevi koji stabiliziraju konformaciju divljeg tipa proteina iz p53 porodice su spojevi koji, kada stupaju u dodir s proteinom iz p53 porodice, promoviraju ili obnavljaju aktivnost divljeg tipa proteina npr. afinitet vezanja na DNA ili kapacitet za međudjelovanje s bilo kojom makromolekulom radi utjecaja na normalnu funkciju proteina iz p53 porodice. Druge aktivnosti divljeg tipa p53 uključuju, ali nisu njima ograničene, aktivnost transkripcijskog aktiviranja (npr. indukcija WAF1), zaustavljanje staničnog ciklusa i započinjanje apoptoze.

U još jednom aspektu, izum uključuje upotrebu spojeva iz ovog izuma u inhibiciji tumorskog rasta i/ili tretiranju raka. Osobita prednost ovog izuma je što se pokazalo da spojevi tako identificirani postupcima iz ovog izuma stabiliziraju aktivnu konformaciju ne samo p53 DBD divljeg tipa i mutantne p53 DBD upotrebljene u pregledu, već također i drugih mutantnih p53 i p53 DBD. Zato, tako identificirani spojevi imaju široku primjenjivost u tretiranju različitih oblika raka.

Ovaj izum se također odnosi na novi način pregleda spojevi koji promoviraju konformaciju divljeg tipa proteina iz p53 porodice i mogu obnoviti aktivnost divljeg tipa u mutantnim proteinima iz p53 porodice. Spojevi identificirani postupcima iz ovog izuma upotrebljivi su u tretiranju bolesti poput raka povezanih s oštećenjima aktivnosti proteina iz p53 porodice.

Postupci iz ovog izuma koji se odnose na pregled spojeva u pogledu međudjelovanja izravno s proteinom iz p53 porodice. Takvi postupci mogu upotrebljavati protein pune duljine iz p53 porodice (mutantni ili divljeg tipa) za potrebe pregleda, ili delecijski derivat koji sadrži barem DBD i izborno domene N-kraja i/ili C-kraja. Međutim, u poželjnom aspektu izuma, u pregledu se može upotrebljavati polipeptidni fragment proteina iz p53 porodice koji čini samo DBD bez netaknute domena N- ili C-kraja. Prema tome, za potrebe ove prijave, podrazumijeva se da termin "DNA vežuća domena" ili "DBD" uključuje upravo DBD iz proteina iz p53 porodice, bez netaknutog N- ili C-kraja (ako nije drugačije navedeno). Takve DBD domene mogu, međutim biti fuzionirane u heterologne polipeptide, ovisno o formatu testa (npr. FLAG-epitop ili glutation-S-transferaza protein). Osim toga, radije nego da samo uklanjaju negativni regulacijski učinak vezanja na DNA, postupci i spojevi iz ovog izuma promoviraju pojačanu konformacijsku stabilnost i divljeg tipa i mutantnog proteina iz p53 porodice.

Prema tome, u jednom aspektu ilustriranom niže pomoću neograničavajućeg radnog primjera, izum se odnosi na postupak pregleda spojeva koji specifično međudjeluju s p53 DBD i mjerenje konformacije p53 DBD u prisustvu testiranog spoja. Izborno, p53 DBD je mutantna p53 DBD. Međutim, p53 DBD divljeg tipa se lakše hiperproducura u velikim količinama. Iako se pregledni test može vršiti u formatu temeljenom na stanici, u pregledu velike propusnosti specifičnom za spojeve čiji je cilj p53 DBD, in vitro osnovni test je najizravniji i najpoželjniji. Spojeve identificirane početnim pregledom u odnosu na p53 DBD može se dalje testirati u pogledu njihovog djelovanja na funkciju netaknutog p53 (uključujući missens-mutacije p53). Spojevi identificirani ovim postupcima također ulaze u opseg izuma.

Za potrebe ovog izuma, testovi za spojevi koji međudjeluju s DNA vežućom domenom proteina iz p53 porodice smišljeni su tako da neotkriveni spojevi su oni sa specifičnim afinitetom prema DBD, a ne prema drugim domenama iz proteina. Primjerice, spoj koji specifično "međudjeluje sa" ili "djeluje na" DBD ne mora se nužno stabilno vezati na DBD (iako može); dovoljno je da spoj ima neki učinak na konformaciju proteina iz p53 porodice u prisustvu spoja. Prema tome, spojeve se može najprije pregledati radi međusobnog reagiranja s DBD, a zatim se može ispitati njihov učinak na konformaciju, ili se ove dvije faze pregleda može izvršiti istovremeno s konformacijskom promjenom u prisustvu spoja također radi detekcije međudjelovanja s DBD.

Termin specifično međudjelovanje u ovoj prijavi se upotrebljava za isključivanje nespecifičnih oblika vezanja, uključujući poznati tip koji se dešava između hidrofobnih spojeva i proteina kroz neselektivna hidrofobna međudjelovanja. Termin specifično međudjelovanje se dalje upotrebljava za razlikovanje osobine spoja iz ovog izuma od spojeva koji utječu na termičku stabilnost proteina s izmjenom kemijskih osobina masovnog otapala. Takve molekule isključene iz opsega ovog aspekta ovog izuma zato uključuju agense termostabiliziranja poput glicerola, trimetilamin-oksida i teške vode. Spojevi koji specifično međudjeluju s proteinom iz p53 porodice imat će učinak u mnogo manjim koncentracijama od takvih masovnih otapala ili nespecifičnih hidrofobnih međudjelovanja. Primjerice, glicerol je djelotvoran na 600 mM. Međutim, učinci spojevi koji specifično međudjeluju s proteinom iz p53 porodice će biti opaženi na koncentracijama spoja manjim od 1 mM, po mogućnosti manjim od 100 µmol, i poželjnije manjim od 10 µmol u in vitro testovima temeljenim na stanici.

U vezi s praksom iz ovog izuma, primijenit će se slijedeće definicije. Termin "alkil", kao što se ovdje upotrebljava, ako nije drugačije navedeno, uključuje zasićene monovalentne ugljikovodične radikale s ravnolančanim, razgranatim ili prstenastim ostacima ili njihove kombinacije. Slično termini "alkenil" i "alkinil" definiraju ugljikovodične radikale s ravnolančanim, razgranatim ili prstenastim ostacima s barem jednom dvostrukom odnosno trostrukom vezom. Takve definicije također se primjenjuju kada alkilna, alkenilna ili alkinilna grupa je prisutna unutar druge grupe, poput alkoksi ili alkilamina. Termin "alkoksi", kao što se ovdje upotrebljava, uključuje O-alkilne grupe gdje "alkil" je definiran gore. Termin "halo", kao što se ovdje upotrebljava, ako nije drugačije navedeno, uključuje fluor, klor, brom ili jod.

Radi pogodnosti opisa, termin (C3-C10) cikloalkil, kada se ovdje upotrebljava, odnosi se i na cikloalkilne i cikloalkenilne grupe, koje imaju nula ili izborno jednu ili više dvostrukih veza, poput ciklopropila, ciklobutila, ciklopentila, ciklopentenila, cikloheksila, cikloheksenila, 1,3-cikloheksadiena, cikloheptila, cikloheptenila, biciklo[3.2.1]oktana, norbornanila i slično. (C3-C10)heterocikloalkil, kada se ovdje upotrebljava, odnosi se na pirolidinil, tetrahidrofuranil, dihidrofuranil, tetrahidropiranil, piranil, tiopiranil, aziridinil, oksiranil, metilendioksil, kromenil, izoksazolidinil, 1,3-oksazolidin-3-il, izotiazolidinil, 1,3-tiazolidin-3-il, 1,2-pirazolidin-2-il, 1,3-pirazolidin-1-il, piperidinil, tiomorfolinil, 1,2-tetrahidrotiazin-2-il, 1,3-tetrahidrotiazin-3-il, tetrahidrotiadiazinil, morfolinil, 1,2-tetrahidrodiazin-2-il, 1,3-tetrahidrodiazin-1-il, tetrahidroazepinil, piperazinil, kromanil itd. Stručnjak će shvatiti da su spomenuti (C3-C10)heterocikloalkilni prstenovi vezani preko ugljika ili sp3 hibridiziranog heteroatoma dušika.

(C5-C9)heteroaril, kada se ovdje upotrebljava, odnosi se na furil, tienil, tiazolil, pirazolil, izotiazolil, oksazolil, izoksazolil, pirolil, triazolil, tetrazolil, imidazolil, 1,3,5-oksadiazolil, 1,2,4-oksadiazolil, 1,2,3-oksadiazolil, 1,3,5-oksadiazolil, 1,3,5-tiadiazolil, 1,2,3-tiadiazolil, 1,2,4-tiadiazolil, piridil, pirimidil, pirazinil, piridazinil, 1,2,4-triazinil, 1,2,3-triazinil, 1,3,5-triazinil, pirazolo[3,4-b]piridinil, kinolinil, pteridinil, purinil, 6,7-dihidro-5H-[1]piridinil, benzo[b]tiofenil, 5,6,7,8-tetrahidro-kinolin-3-il, benzoksazolil, benzotiazolil, benzizotiazolil, benzizoksazolil, benzimidazolil, tianaftenil, izotianaftenil, benzofuranil, izobenzofuranil, izoindolil, indolil, indolizinil, indazolil, izokinolil, kinolil, ftalazinil, kinoksalinil, kinazolinil, benzoksazinil i slično.

Stručnjak će shvatiti da je vezanje (C5-C9)heteroarilne grupe na ostatak strukture općenito bez ograničavanja, što znači, preko atoma ugljika ili sp2 hibridiziranog heteroatoma. Slično, fenil i naftil predstavljaju (C6-C10)aril.

Kada se u crtežu naznači veza, ali nema identifikacije grupe smještene na njenom udaljenom kraju, to se konvencionalno prepoznaje kao metilna grupa. U odsustvu bilo kakve naznake veze, položaj je zauzet s vodikom, ako valencija to omogućuje, kao što se lako podrazumijeva u tehnici. Tako opis, R–O– znači R–O–CH3.

A. Spojevi iz ovog izuma koji promoviraju aktivnost divljeg tipa kod proteina iz p53 porodice

Organski nepeptidni spojevi iz ovog izuma mogu pripadati tipu spoja koji, kada ga se izloži divljem tipu ili mutantnom proteinu iz p53 porodice, promovira aktivnost divljeg tipa proteina. Poželjni spojevi su relativno mali (u usporedbi s tipičnim proteinima od 50 do 150 kDa) organski spojevi. Ovaj izum odnosi se, po prvi put, na spojeve koji nisu peptidi, a preciznije, nisu protutijela, koji još specifično međudjeluju s p53, čime se stabilizira konformacija divljeg tipa iz p53 DBD ili p53 proteina. Nepeptidni organski spojevi osobito su upotrebljivi kao farmaceutski pripravci iz različitih razloga. Primjerice, nepeptidni spojevi su mnogo manje imunogeni od peptida i lakše se apsorbiraju u tijelu preko sluznih ili barijera drugih staničnih slojeva i mogu biti manje labilni.

U jednom aspektu, aktivni spojevi otkriveni postupcima iz ovog izuma mogu se definirati kao spoj s hidrofobnom grupom (npr. planarni policikl) i kationskom grupom (po mogućnosti amin) spojenima zajedno poveznicom specifične duljine. Poželjni su benzimidazol, benzokinolin, fenotiazin i stirilkinazolin u hidrofobnom položaju.

Aktivne kationske grupe su i sekundarni i tercijarni amini, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, dimetilamin, dietil amin, dietanol amin, metil amin, metil piperazin i morfolin. Neki veći amini bili su odgovarajuće aktivni prilikom testiranja u fenotiazinskom hidrofobnom nizu; prema tome, veći amin je poželjan u ovoj situaciji. Pozitivno nabijene grupe u kationskom položaju su aktivne i poželjne (vidjeti tablicu 1, niže).

U odnosu na ovaj aspekt iz ovog izuma, razmak između hidrofobnih i kationskih grupa treba biti barem duljine propila; poveznice kraće od duljine propila bile su bitno nedjelotvornije pod određenim uvjetima iz testa (vidjeti tablicu 2, niže). Zato, poželjne su poveznice duge od približno 3-5 ugljikovih veza (od 5-9 Å, poželjnije 6-8 Å), iako najaktivniji spojevi sadrže poveznice duljine propilne poveznice (oko 6,5 Å). Poveznice veće od duljine butilne poveznice rezultirale su spojevima nedjelotvornijim pod određenim uvjetima testa od odgovarajućih spojeva s poveznicama duljine butilne poveznice (tablica 2). Čak su poželjnije razgranate poveznice koje održavaju pravilan razmak; takve poveznice bile su općenito aktivnije u ovom testu od odgovarajuće nerazgranate poveznice iste duljine, poput onih koji se još drže oko prave duljine poveznice, između 5 i 9 Å (i izborno oko 6,5 Å).

Prema tome, u jednom aspektu, spojevi iz ovog izuma imaju formulu:

F1-L-F2,

a F1 se bira iz grupe koju čine:

[image]

gdje

R1, R2, R3 su isti ili različiti i neovisno se biraju iz grupe koju čine vodik, halogen, metoksi i nitro; L je nerazgranati ili razgranati lanac alkila duljine od 5-9 Å; a F2 je sekundarni ili tercijarni amin.

U drugim aspektima, F2 je dimetil amin, dietil amin, dietanolamin, metil piperazin ili morfolin. Primjerice, F2 može biti amin odabran iz grupe koju čine:

[image]

gdje

R4 je –O–CH2–CH3 ili H.

Niže su iznijete kemijske strukture različitih spojeva iz ovog izuma. Uočeno je da svaki od tih spojeva značajno poboljšava stabilnost konformacijski osjetljivog epitopa prema p53 u barem jednoj mutantnoj p53 DBD, blizu fizioloških temperatura.

1. Akridini

[image]

2. Kinazolini

[image]

3. Fenotiazoli

[image]

U skladu s ovdje opisanim općim principima konstrukcija, poželjne su slijedeće grupe spojeva u praksi iz ovog izuma:

[image]

gdje, za grupu I,

[image]

R5 je –N–R18R19, gdje

R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, i

R19 je H, (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil ili fenil, gdje spomenuta alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, –CONR18(CH2)pNR20R21, –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21 ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, a

R20i R21 se svaki, neovisno, biraju između:

(a) (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)arila, (C5-C9)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C12)arila, gdje su spomenute grupe izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; ili

R6 je

(b) fenil supstituiran s halo, (C1-C6)alkoksi; i

gdje, za grupu II,

[image]

R9 je (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil, ili fenil, gdje spomenuta alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, –CON R18(CH2)pNR20R21, –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21 ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil; a

R20i R21 se svaki, neovisno, biraju između H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)arila, (C5-C9)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C12)arila, gdje su spomenute grupe izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C6)alkil(C5-C9)heteroarila ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila;

gdje, za grupu III,

[image]

R10 je –N–R18R19, gdje

R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, a

R20i R21 se svaki, neovisno, biraju između:

A i B su isti ili različiti, i svaki predstavlja ugljik ili dušik; a

R11 i R12 su isti, ili različiti, a biraju se između H, nitro, (C1-C6)alkoksi, ili halogen kojeg se bira između fluor, klor i brom;

gdje, za grupu IV,

[image]

R13 je –N–R18R19, gdje

R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, i

R20i R21 se svaki, neovisno, biraju između:

A i B su isti ili različiti, i svaki predstavlja ugljik ili dušik; a

R14 i R15 su isti, ili različiti, a biraju se između H, nitro, (C1-C6)alkoksi, ili halogen kojeg se bira između fluora, klora i broma; a

gdje, za grupu V,

[image]

A je ugljik ili dušik;

R16 je –N–R18R19, gdje

R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, i

R20i R21 se svaki, neovisno, biraju između:

(a) H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)arila, (C5-C9)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C10)arila i (C1-C6)alkil(C5-C9)heteroarila, gdje su spomenute grupe izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C6)alkil(C5-C9)heteroarila ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; ili

(b) NR20R21 uzeti zajedno predstavljaju vodik, morfolin ili 4-(C1-C6)alkilpiperazin; a

R17 se bira između H, nitro, (C1-C6)alkoksi, ili halogen, kojeg se bira između fluora, klora i broma.

Osobito poželjni spojevi iz ovog izuma uključuju slijedećih jedanaest spojeva:

[image]

(1-Benzil-piperidin-4-il)-(3-fenotiazin-10-il-propil)-amin

[image]

[2-(4-Klor-fenil)-etil]-(3-fenotiazin-10-il-propil)-amin

[image]

(3-Fenotiazin-10-il-propil)-tiokroman-4-il-amin

[image]

[1-Metil-3-(2,6,6-trimetil-cikloheks-2-enil)-alil]-(3-fenotiazin-10-il-propil)-amin

[image]

(7-Etoksi-1,2,3,4-tetrahidro-naftalen-2-il)-(3-fenotiazin-10-il-propil)-amin

[image]

N'-(9-Fluor-benzo[c]akridin-7-il)-N,N-dimetil-propan-1,3-diamin

[image]

N'-Akridin-9-il-N,N-dimetil-propan-1,3-diamin

[image]

2-{4-[4-(Benzo[g]kinolin-4-ilamino)-fenil]-piperazin-1-il}-etanol

[image]

N4-{2-[2-(4-Brom-fenil)-vinil]-7-klor-kinazolin-4-il}-N',N'-dietil-pentan-1,4diamin

[image]

N-Benzo[g]kinolin-5-il-N'-cikloheksil-propan-1,3-diamin

[image]

2-[(2-Hidroksi-etil)-(3-{2-[2-(4-metoksi-fenil)-vinil]-kinazolin-4-ilamino}-propil)amino]-etanol.

Organske nepeptidne spojeve iz ovog izuma može se sintetizirati konvencionalnih tehnikama.

Spojevi iz ovog izuma i u upotrebi u postupcima iz ovog izuma također uključuju predlijekove spojeva koji promoviraju aktivnost divljeg tipa proteina iz p53 porodice. Predlijekovi su spojevi koji se prilikom primjene na sisavcu subjektu (osobito čovjeku) prevode u značajnim i djelotvornim količinama u aktivnu molekulu.

Spojevi iz ovog izuma mogu biti u obliku slobodnih kiselina, slobodnih alkalija ili njihovih farmaceutski djelotvornih solî. Takve soli mogu se lako dobiti reakcijom spoja s prikladnom kiselinom. Takve kiseline uključuju, kao primjer i bez ograničenja na njih, neorganske kiseline poput hologenovodične kiseline (klorovodična, bromovodična itd.), sumporne kiseline, dušične kiseline, fosforne kiseline itd.; i organske kiseline poput octene kiseline, propanske kiseline, 2-oksoproponske kiseline, propandonske kiseline, butandonske kiseline itd. Isto tako, sol se može prevesti u oblik slobodne alkalije reakcijom s alkalijom.

B. Terapijske krajnje točke i doziranja

Spojevi identificirani postupcima iz ovog izuma su upotrebljivi u tretmanu bolesti povezanih s konformacijski nestabilnim ili pogrešno savijenim proteinima. Bolesti povezane s konformacijski nestabilnim ili pogrešno savijenim proteinima su poznate i uključuju cističnu fibrozu (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR (regulator transmembranske vodljivosti kod cistične fibroze)), Marfan-ov sindrom (fibrilin), amiotrofnu lateralnu sklerozu (superoksid dismutaza), skorbut (kolagen), bolest javorno sirupaste mokraće (alfa-keto kiselinsko dehidrogenazni kompleks), nepotpunu osteogenezu (tip I prokolagen pro-alfa), Creutzfeldt-Jacob-ovu bolest (prion), Alzheimer-ovu bolest (beta-amiloid), porodičnu amiloidozu (lizozim), očne mrene (kristalini), porodičnu hiperkolekterolemiju (LDL receptor (low density lipoprotein receptor, receptor lipoproteina niske gustoće)), nedostatak α1-antitripsina, Tay-Sachs-ovu bolest (beta-heksozaminidaza), retinitis pigmentozu (rodopsin) i leprešonizam (inzulinski receptor). Naravno, ovdje opisani postupci i spojevi osobito su upotrebljivi u tretmanu raka, a osobito su upotrebljivi u tretmanu oblika raka povezanih s mutantnim p53 genima.

Stručnjak će primijetiti da bi, iz medicinske perspektive prakse ili pacijenta, bilo poželjno praktično bilo kakvo ublažavanje ili sprječavanje neželjenog simptoma povezanog s bolesnim stanjem, a osobito kod kanceroznog stanja (npr. bol, osjetljivost, gubitak težine, i slično). Osim toga, u vezi s kanceroznim stanjem, poželjno je bilo kakvo smanjenje mase ili brzine rasta tumora, kao i poboljšanje histopatološke slike tumora. Tako, za potrebe ove prijave, ovdje upotrebljeni termini "tretman", "terapijska upotreba" ili "medicinska upotreba" odnosit će se na bilo koju i na svaku upotrebu zahtjevanih pripravaka koji liječe bolesno stanje ili simptome, ili na drugi način sprječavaju, ometaju, usporavaju ili poništavaju napredovanje bolesti ili drugih neželjenih simptoma na bilo koji takav način.

Djelotvorno doziranje i protokol tretmana mogu se odrediti konvencionalnim sredstvima, polazeći od male doze kod laboratorijskih životinja, a zatim povećavanjem doziranja uz praćenje učinaka i isto tako sustavno variranje režima doziranja. Studije životinja, po mogućnosti studije sisavaca, često se upotrebljavaju u određivanju maksimalno tolerirane doze, ili MTD, bioaktivnog agensa po kilogramu težine. Stručnjaci redovito ekstrapoliraju doze radi djelotvornosti i izbjegavanja otrovnosti kod drugih vrsta, uključujući ljude.

Prije određivanja djelotvornosti studija na ljudima, faza I kliničkih studija kod normalnih subjekata pomaže utvrđivanje sigurnih doza. Klinički liječnik mora uzeti u razmatranje brojne činitelje kada se određuje optimalno doziranje za dani subjekt. Najvažniji je otrovnost i poluživot odabranog produkta heterolognog gena. Dodatni činitelji uključuju veličinu pacijenta, starost pacijenta, opće stanje pacijenta, određenu tretiranu kanceroznu bolest, težinu bolesti, prisustvo drugih lijekova u pacijentu, in vivo aktivnost genskog produkta i slično. Probna doziranja bi se moglo odabrati nakon razmatranja rezultata studija na životinjama kao i kliničke literature.

Kao što je niže prikazano stvarnom radnom realizacijom, doza od 200 mg/kg/dan bila je visoko djelotvorna u inhibiciji i/ili smanjivanju tumorskog rasta kod životinjskog modela raka kod čovjeka. Na temelju ovog rezultata, tipična doza za ljude spoja X u tretmanu raka iznosi od 0,1-10 g/dan, ubrizgana i.v. ili izravno u masu tkiva ili primijenjena oralno, ovisno o stanju pacijenta. Za spoj s različitom razinom djelotvornosti i/ili otrovnosti, ove vrijednosti mogle bi se naravno odgovarajuće promijeniti. Osim toga, doze se može uzeti u dva ili više inkremenata dnevno.

Spojeve za upotrebu u postupcima iz ovog izuma može se također formulirati kao implantacijski uređaj za sporo oslobađanje, za prošireno ili održano unošenje. Primjeri takvih formulacija održanog oslobađanja uključuju kompozite od biokompatibilnih polimera, npr. poli(mliječna kiselina), poli(mliječna-ko-glikolna kiselina), metilceluloza, hijaluronska kiselina, kolagen, i slično. Struktura, odabir i upotreba razgradivih polimera u oslobađanju vehikuluma lijeka prikazani su u nekoliko publikacija, uključujući, A. Domb i drugi: "Polymers for Advanced Technologies", 3, 279-292, (1992.). Dodatno vođenje u selekciji i upotrebi polimera u farmaceutskim formulacijama može se naći u radu M. Chasin i R. Langer (eds.): "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems", Vol. 45 of "Drugs and the Pharmaceutical Sciences", M. Dekker, New York, (1990.) i US patentu br. 5.573.528 autorstva Aebischer i drugi (izdat 12. studenog (1996.)).

Osobito gdje se razmatra upotrebu in vivo, različite biokemijske komponente iz ovog izuma su po mogućnosti visoke čistoće i bitno su slobodne od potencijalno štetnih nečistoća (npr. barem za National Food (NF) stupanj, općenito barem analitički stupanj, a poželjno barem farmaceutski stupanj). Do stupnja gdje se dani spoj mora sintetizirati prije upotrebe, takva sinteza ili naknadno pročišćavanje će po mogućnosti rezultirati produktom bitno slobodnim od bilo kojih potencijalno toksičnih agensa, koje se moglo upotrebljavati za vrijeme postupaka sinteze ili pročišćavanja.

Radi upotrebe u tretiranju kanceroznog stanja subjekta, ovaj izum se također odnosi u jednom od svojih aspekata na komplet ili pakiranje u obliku sterilno napunjene bočice ili ampule, koju čine spoj koji je dokazano djelotvoran u postupcima iz ovog izuma. U jednoj realizaciji, komplet sadrži spoj iz ovog izuma, npr. spoj Y, spoj X ili spoj Z, kao formulaciju spremnu za primjenu, u jedinici doze ili u višedoznim količinama, gdje pakiranje uključuje oznaku s uputstvom za upotrebu njegovog sadržaja u tretmanu raka. Alternativno, i u skladu s drugom realizacijom izuma, pakiranje uključuje sterilno napunjenu bočicu ili ampulu koju čini takav spoj.

C. Postupci otkrića lijeka

Svaka ili sve faze u pregledu spojeva koji međudjeluju s proteinom iz p53 porodice, a osobito p53 DBD, i/ili njihov učinak na aktivnost divljeg tipa su prikladni u visoko propusnim testovima za spojeve kandidate. Visoko propusni pregledi su dobro poznati u tehnici i mogu se vršiti u bilo kom broju formata. Primjerice, ELISA, tehnologija blizinske scintilacije, testovi kompetitivnog vezanja i testovi vezanja uz izmještanje su upotrebljivi formati. Laboratorijska automatizacija, uključujući tehnologiju robotike, može mnogo skratiti vrijeme potrebno za pregled velikog broja spojeva i tržišno je dostupna od strane, primjerice tvrtki Tecan, Scitec, Rosys, Mitsubishi, CRS Robotics, Fanuk, i Beckman-Coulter Sagitan, da se spomene nekoliko njih. Nakon identificiranja spoja kandidata (ili zajedno s njihovom identifikacijom), mogu se izvršiti sekundarni pregledi za određivanje staničnih i/ili in vivo učinaka spojeva na aktivnost proteina iz p53 porodice.

1. Proteini iz p53 porodice kao cilj postupaka i pripravaka iz ovog izuma

p53 je sveprisutan u svim eukariotskim organizmima. Prema tome, p53 proteini i p53 DBD u upotrebi u postupcima i pripravcima iz ovog izuma mogu doći iz, ili se dobiti iz, bilo koje eukariotske stanice uključujući gljive (npr. Saccharomyces cerevisae), kukce (npr. Drosophila) i sisavce (npr. miš i/ili čovjek), iako su poželjni ljudski p53 proteini. Identificirani su još neki homolozi p53 iz sisavaca, srodne strukture i funkcije, osobito p63 i p73; takvi proteini iz p53 porodice, primjerice njihove odgovarajuće DBD, može se također upotrebljavati u postupcima i pripravcima iz ovog izuma. Osim toga, proteine iz p53 porodice (kao što je ovdje definirano), ali ih još treba otkriti, može se također upotrebljavati u postupcima i pripravcima iz ovog izuma.

Kao što je napomenuto gore, p53 protein sadrži barem tri različite domene: domenu za aktiviranje transkripcije smještenu na amino kraju; središnju DBD; i oligomerizacijsku domenu na karboksilnom kraju. Osim toga, na karboksilnom kraju proteina nalazi se i domena za negativnu regulaciju. Većina p53 missens-mutacija povezanih s oblicima raka kod ljudi dešava se u DBD. Postupci i spojevi iz ovog izuma usmjereni su na stabiliziranje konformacije kod bilo kojih takvih missens-mutacija. Osobito poželjni ciljevi su mutantni p53 koji sadrže jednu ili više tzv. "vrućih točaka" mutacija u preostalim položajima 175, 245, 248, 249, 273 i 282 (svi preostali položaji dani su u odnosu na ljudski p53 slijed; analogni položaj ostatka kod p53 proteina iz drugih organizama može se lako odrediti usporedbom homologije s ljudskim slijedom). Druge uobičajene mutacije u p53 pojavljuju se na 132, 135, 138, 141, 143, 146, 151, 152, 154, 157, 158, 159, 163, 173, 179, 186, 194, 196, 213, 220, 237, 238, 241, 242, 258, 266, 272, 278, 281, 285 i 286; to su također ciljevi ovog izuma. Osim toga, izum niže ilustriraju radni primjeri koji prikazuju konformacijsku stabilizaciju slijedećih mutantnih p53 proteina: 143A, 173A, 175S, 241D, 249S i 273H.

Oblici raka povezani s missens-mutacijama u p53 proteinima, osobito u DBD iz p53 proteina, uključuju ali se na njih ne ograničuju, kolorektalni karcinom, karcinom mokraćnog mjehura, hepatocelularni karcinom, karcinom jajnika, karcinom pluća, karcinom grudi, karcinom ljuskastih stanica na glavi i vratu, karcinom jednjaka, karcinom štitnjače i neurogenske tumore poput astrocitoma, ganglioblastoma i neuroblastoma. Gore navedene oblike raka i druge može se tretirati postupcima i spojevima iz ovog izuma.

p53 DBD približno čine aminokiselinski ostaci 100-300. Pokazalo se da je jezgra, otporna na proteolizu, koju čine ostaci 102-292, dovoljna za vezanje na DNA, a kristalna struktura p53 DBD je riješena za ostatke 94-312 (Cho i drugi: "Science", 265, 346, (1994.); Friend: "Science", 265, 334, (1994.)). Prema tome, prilikom upotrebe u postupcima iz ovog izuma, N-kraj p53 DBD domene može početi od ostatka 50 do ostatka 110, po mogućnosti počinje negdje između ostataka 94 i 102. C-kraj p53 DBD može završavati na ostatku 286 do ostatka 340, a po mogućnosti se završava između ostataka 292 i 312.

"Termodinamički destabilizirani mutanti p53" su mutanti koji ne zadržavaju jednu ili više funkcionalnih osobina p53 npr. vezanje na DNA pod fiziološkim uvjetima (npr. oko 37 °C), ali ponovo poprimaju takvu/e funkciju/e na sniženim temperaturama, ili pod drugim uvjetima. Primjerice, svi od često susretanih mutanata zadržavaju kapacitet vezanja na DNA in vitro na niskoj temperaturi (Friedlander i drugi: (1996.), vidjeti gore).

2. Formati testova

a. Formati testa vezanja

Princip upotrebljenih testova za identificiranje spojeva koji se jednostavno vežu na DBD proteina iz p53 porodice uključuje pripravljanje reakcijske smjese DBD proteina i testiranog spoja pod uvjetima i u vremenu dovoljnom da se omogući međudjelovanje i vezanje dvije komponente, čime se tvori kompleks kojeg se može ukloniti i/ili detektirati u reakcijskoj smjesi. Upotrebljene vrste DBD mogu varirati ovisno o cilju preglednog testa. Primjerice, gdje se traže spojevi koji međudjeluju s određenim domenom vezanja, može se upotrebljavati protein iz p53 porodice potpune duljine koji sadrži tu vezujuću domenu, sama DBD, ili fuzijski protein koji sadrži DBD fuzioniranu s proteinom ili polipeptidom koji pruža prednosti u testnom sustavu (npr. označavanje, izdvajanje rezultirajućeg kompleksa itd.). Peptidi derivirani iz DBD namijenjeni upotrebi u ovoj tehnici moraju sadržavati barem 6 uzastopno poredanih aminokiselina, po mogućnosti 10 uzastopno poredanih aminokiselina, poželjnije 20 uzastopno poredanih aminokiselina, još poželjnije 30 ili čak 50 uzastopnih aminokiselina, ili više, deriviranih iz DBD.

Pregledne testove može se vršiti na mnoštvo načina. Primjerice, jedan postupak vršenja takvog testa mogao bi uključiti sidrenje DBD proteina, polipeptida, peptida ili fuzijskog proteina ili testirane tvari na krutu fazu i detektiranje kompleksa DBD/testirani spoj usidrenog na krutu fazu na kraju reakcije. U jednoj realizaciji takvog postupka, DBD reaktant može se usidriti na krutu površinu, a testirani spoj, koji nije usidren, može se označiti, ili izravno ili neizravno. Bilo koje mnoštvo prikladnih sustava označavanja može se upotrebljavati uključujući, ali bez ograničavanja na, radioizotope poput 125I i 32P, sustave enzimskog označavanja koji daju kolorimetrijski signal kojeg se može detektirati ili svjetlost prilikom izlaganja supstratu, i fluorescentne markere. U drugoj realizaciji postupka, DBD protein usidren na krutu fazu kompleksira se s markiranim protutijelom. Zatim se testirani spoj može testirati u pogledu njegove sposobnosti raskidanja kompleksa DBD/protutijelo.

U praksi, mikrotitarske ploče se može konvencionalno upotrebljavati kao krutu fazu. Usidrenu komponentu se može imobilizirati nekovalentnim ili kovalentnim vezanjem. Nekovalentno vezanje može se vršiti jednostavnim prekrivanjem krute površine otopinom proteina i sušenjem. Alternativno, za sidrenje proteina na krutu površinu može se upotrebljavati imobilizirano protutijelo, po mogućnosti monoklonalno protutijelo, specifično za protein kojeg treba imobilizirati. Površine se može unaprijed pripremiti i uskladištiti.

Za provedbu testa, neimobilizirana komponenta se dodaje na prevučenu površinu koja sadrži usidrenu komponentu. Nakon dovršenja reakcije, nereagirane komponente se uklanja (npr. ispiranjem) pod takvim uvjetima da bilo koji formirani kompleksi ostaju imobilizirani na krutoj površini. Detekcija kompleksa usidrenih na krutu površinu može se vršiti na više načina. Kada je ranije neimobilizirana komponenta prethodno markirana, detekcija markera imobiliziranog na površini označuje tvorbu kompleksa. Kada ranije neimobilizirana komponenta nije prethodno markirana, može se upotrebljavati neizravni marker za detekciju kompleksa usidrenih na površinu; npr. upotrebom protutijela specifičnog za prethodno neimobiliziranu komponentu (protutijelo se, osim toga, može izravno markirati označenim anti-Ig protutijelom).

U drugim realizacijama, vezanje se može detektirati bez upotrebe izravnog ili neizravnog markera. Primjerice, može se testirati biofizičko svojstvo koje se mijenja prilikom vezanja. Sustav s krutim nosačem osobito pogodan za takav pregled je BIAcore 2000TM sustav, tržišno dostupan od strane BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ). Instrument BIAcoreTM (http://www.biacore.com) upotrebljava optički fenomen površinske rezonance plazmona (surface plasmon resonance, SPR) u praćenju biospecifičnih međudjelovanja u realnom vremenu. SPR učinak je, u biti, nestajuće električno polje koje je pod utjecajem lokalnih promjena u indeksu loma na granici metal-tekućina. Senzorski čip načinjen od sendviča od zlatnog filma između stakla i karboksimetil dekstranske matrice na koju je kemijski vezan ligand ili protein koje treba testirati. Ovaj senzorski čip postavljen je na fluidičko punjenje koje tvori protočne ćelije kroz koje se može ubrizgati spojeve analite. Međudjelovanja ligand-analit na senzorskom čipu detektiraju se kao promjene kuta reflektiranog snopa polarizirane svjetlosti s površine čipa. Vezanje bilo kakve mase na čip djeluje na SPR u sloju zlato/dekstran. Ova promjena u električnom polju u sloju zlata međudjeluje s reflektiranim snopom svjetlosti i mijenja kut refleksije proporcionalno količini vezane mase. Reflektiranu svjetlost se detektira na nizu dioda i prevede u signal vezanja izražen kao jedinice odgovora (response units, RU). Kao što je odgovor izravno proporcionalan vezanoj masi, moguće je mjerenje kinetičke i ravnotežne konstante međudjelovanja protein-protein.

Alternativno, reakcija se može vršiti u tekućoj fazi, reakcijske produkti izdvojiti od nereagiranih komponenata, a komplekse se detektira.

b. Postupci mjerenja konformacija proteina iz p53 porodice

Konformacija proteina iz p53 može se mjeriti na bilo koji od više različitih načina. Primjerice, protutijela se može upotrebljavati za sondiranje konformacije p53 DBD. U poželjnim postupcima iz ovog izuma upotrebljavaju se monoklonalna protutijela specifična za aktivne (npr. vezanje DNA) ili inaktivne (termodinamički destabilizirane ili pogrešno savijene ili nesavijene) konformacije p53 i/ili p53 DBD. Primjerice, maAb1620 koji prepoznaje epitop na p53 DBD usko je povezan s aktivnošću tumor-supresorskog proteina p53. Ball i drugi: "EMBO J.", 3, 1485-1491, (1984.); Gamble i drugi: "Virology", 162, 452-458, (1998.). Tako mAb 1620 se neće vezati na p53 DBD, kada ista poprimi inaktivnu konformaciju. Suprotno tome, epitop kojeg prepoznaje mAb 240 je izložen kada je p53 inaktivan mutiranjem ili je p53 divljeg tipa denaturiran (Bartek i drugi: "Oncogene", 5, 893-899, (1990.); Stephen i drugi: "J. Mol. Biol.", 225, 577-83, (1992.)). U postupcima iz ovog izuma može se također upotrebljavati druga monoklonalna protutijela, poznata ili koja još treba otkriti, specifična prema konformacijama. Takva protutijela su upotrebljiva zbog toga što ih se može lako prilagoditi za preglede visoke propusnosti. Postupci dobivanja protutijela, uključujući monoklonalna protutijela, dobro su poznati u tehnici.

Drugi načini mjerenja konformacija proteina iz p53 porodice poput p53 ili p53 DBD su, ali nisu time ograničeni, apsorpcija boja, spektroskopski (npr. cirkularni dikroizam, NMR), kromatografija s izdvajanjem veličine, ultracentrifugiranje, specifično vezanje DNA (npr. na fiziološkim temperaturama, nasuprot nižim temperaturama) i specifično vezanje proteina (npr. SV40 veliki T antigen veže se samo na aktivnu konformaciju divljeg tipa, a ne na inaktivnu konformacija).

Kao što je napomenuto gore, mnoge od često sretanih mutacija p53 ne mogu se vezati na DNA na fiziološkim temperaturama, ali će vezati DNA na nižim temperaturama. Zato, jedan aspekt mjerenja konformacija proteina iz p53 porodice u prisustvu testiranih spojeva je ovisnost o temperaturi. Po mogućnosti, konformaciju se mjeri na fiziološkim temperaturama (oko 38 °C); pogodni raspon je između 20°C i 50 °C, a poželjnije između 35°C i 42 °C. Konformacija ciljnog proteina može se također mjeriti tijekom vremena, od nekoliko minuta do nekoliko sati ili više. Kada se u pregledu upotrebljava p 53 protein ili p53 DBD, grijanje se općenito provodi dulje i na višim temperaturama, nego kada se upotrebljava mutantna p53 DBD. Stručnjak može lako odrediti pogodnu temperaturu upotrebom ovako dobivene informacije.

Osim toga, istovremeno se može ispitivati i vezanje spoja i bilo kakva promjena konformacije proteina iz p53 porodice. U takvom testu, promjena konformacije proteina iz p53 porodice u prisustvu testiranog spoja smatra se pogotkom. Niže navedeni pregledi visoke propusnosti za testiranje spojeva ilustrirani su neograničavajućim primjerima koji međudjeluju s p53 DBD radi izazivanja konformacijske promjene. Ovim pregledima visoke propusnosti moglo se identificirati klasu spojeva namijenjenih upotrebi u postupcima iz ovog izuma. Na temperaturama blizu fizioloških, ovi spojevi su povećali stabilnost konformacijski osjetljivog epitopa za mAb1620 na divljem tipu i nizu mutantnih p53 proteina. Niske mikromolarne koncentracije spoja prolazno su povećale konformacijsku stabilnost epitopa u živim stanicama i omogućile su da mutantni p53 aktivira transkripciju. Kao što je potpunije niže opisano, organski nepeptidni spoj je prilikom primjene na miševima s tumorima s mutantnim p53 modulirao konformaciju i funkciju p53 i značajno inhibira rast stranog presataka ljudskog tumora s prirodno mutiranim p53.

c. Testovi temeljeni na stanici i temeljeni na životinji

Jednom kada su spojevi kandidati identificirani u primarnom pregledu, kao što je gore opisano, testovi temeljeni na stanici i temeljeni na životinji općenito se mogu vršiti za određivanje djelovanja spoja kandidata u ovim sustavima. Početni testovi mogu uključivati stanične linije koje derivirane iz tumora s mutantnim genom koji kodira protein iz p53 porodice, ili stanične linije manipulirane tako da eksprimiraju mutantni protein iz p53 porodice. Ispitan je učinak spoja kandidata na bilo koju (ili sve) aktivnost/i divljeg tipa proteina iz p53 porodice. Primjerice, indukcija WAF1 u prisustvu spoja kandidata označuje da spoj održava funkciju mutantnog p53 promoviranjem osobina specifičnog vezanja na DNA, a ne svojstva nespecifičnog vezanja. Može se ispitati bilo koji gen kojeg na dolje ili na gore regulira p53 ili drugi članovi p53 porodice. Druge aktivnosti proteina iz porodice p53 uključuju supresiju rasta i apoptozu. Supresija rasta se lako procjenjuje u stanicama kulture tkiva pod mikroskopom ili testom formiranja kolonije. Apoptozu se može vizualizirati TUNEL-bojanjem ili propidij jodidnim bojanjem i protočnom citometrijom.

Osim toga, modele temeljene na životinjama može se upotrebljavati u pregledu i otrovnosti i djelotvornosti spoja kandidata. Primjerice, tumore s mutantnim p53 može se inducirati u životinjskom modelu, a spojeve kandidate se primjeni na životinji. Procjenjuje se otrovnost i tumorski rast ili povlačenje. Niže je iznijet radni primjer takvog pregleda.

3. Izvori spojeva za pregledanje

Spojevi koje se može pregledati u skladu s ovim izumom uključuju, ali nisu njima ograničeni, male organske molekule koje mogu ući u stanicu utjecati na aktivnost proteina iz p53 porodice. Više biblioteka spojeva su tržišno dostupne od strane tvrtki poput Pharmacopeia, Arqule, Enzymed, Sigma, Aldrich, Maybridge, Trega i PanLabs, da se spomene samo nekoliko izvora. Za spojeve koji međudjeluju s p53 DBD može se također pregledati biblioteke poznatih spojeva, uključujući prirodne produkte ili sintetičke kemikalije i biološki aktivne materijale, uključujući proteine. Međutim, poželjni spojevi nisu proteini ili peptidi (npr. niz od 3 ili više aminokiselina vezanih peptidnim vezama). Protutijela su peptidi koji su imunoglobulini ili imunoglobulinski fragmenti za vezanje antigena; poželjni spojevi također nisu protutijela. Niže su opisane specifične klase i primjeri spojeva namijenjenih upotrebi u postupcima iz ovog izuma.

Jednom kada se identificira spoj koji promovira aktivnost divljeg tipa proteina iz p53 porodice, u osmišljavanju djelotvornijih varijanti spoja može se upotrebljavati tehnike molekulskog modeliranja. Primjeri sustava molekulskog modeliranja su CHARM (Polygen Corporation, Waltham, MA) i (QUANTA programs Molecular Simulations Inc., San Diego, CA). CHARM izvršava funkcije minimalizacije energije i molekulske dinamike. QUANTA izvršava konstrukciju, grafičko modeliranje i analizu molekulske strukture. QUANTA omogućuje konstrukciju međudjelovanja, modificiranje, vizualiziranje i analizu međusobnog ponašanja molekula.

Primjerice, jednom kada se identificira spoj koji promovira aktivnost divljeg tipa proteina iz p53 porodice, spoj može se upotrebljavati za generiranje hipoteze. Kao što će detaljnije biti iznijeto niže, poželjna hipoteza je da planarna policiklička hidrofobna grupa polarnog amina bude udaljena oko 5 (pet) do 9 (devet) Å, poželjnije 6 (šest) do 8 (osam) Å. Takva hipoteza može se generirati od bilo kog spoja iz ovog izuma pomoću programa Catalyst (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA). Osim toga, Catalyst može upotrebljavati hipotezu u traženju pogodne baze podataka, Cambridge small molecule database (Cambridge, Engleska) isto kao druge spomenute baze podataka, vidjeti gore, za identificiranje dodatnih primjera spojeva iz ovog izuma.

Spojeve iz ovog izuma može se dalje upotrebljavati u dizajniraju djelotvornijih varijanti pomoću paketa za modeliranje npr. Ludi, Insight II, C2-Minimizer i Affinity (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA). Osobito pogodan paket za modeliranje je MacroModel (Columbia University, NY, NY).

Spojeve iz ovog izuma može se dalje upotrebljavati kao osnovu za razvijanje racionalne kombinacijske biblioteke. Takvu biblioteku može se također pretraživati za djelotvornije spojeve. Kao što priroda kombinacijske biblioteke ovisi o činiteljima poput određenog spoja odabranog između poželjnih spojeva iz ovog izuma radi formiranja osnove biblioteke i želja za stvaranje biblioteke pomoću smole, prepoznat će se da spojevi iz ovog izuma daju potrebne podatke pogodne za programe kombinacijskog dizajna poput C2-QSAR (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA).

Izum je dalje opisan slijedećim primjerima ponuđenim kao način ilustriranja, a ne kao ograničenje.

VI. Primjer 1: p53 DBD test termostabiliziranja

Razvijen je test visoke propusnosti upotrebom divljeg tipa p53 DBD. Farmakološki spojevi su pregledani testom, a spojevi koji su stabilizirali aktivnu konformaciju DBD smatrani su pogocima.

A. Materijali i postupci

Test termostabiliziranja. Rekombinantna DBD (ostaci 94-312) iz proteina divljeg tipa, mutantnog proteina odnosno FLAG-markirane p53 DBD dobivena je kao što je opisano (Pavletich i drugi: "Genes and Dev.", 7, 2556-2564, (1993.); Bullock i drugi: (1997.), vidjeti gore.). Upotrebljeni mutantni proteini bili su 143A, 173A, 175S, 249S i 273H. Testirano je više niskomolekulskih organskih spojeva. Stokovi spojeva otope se u DMSO na 10 mg/ml i razrijede prije upotrebe. Proteini (0,25-1,0 ng/jažica) razrijede se u puferu koji sadrži 25 mM HEPES, pH 6,8, 150 mM KCl, 10 mM ditiotreitol i vežu se u 50 µl na Reacti-Bind mikrotitarske ploče (Pierce), tijekom 35 minuta na ledu. Jažice se ispere s 25 mM HEPES, pH 6,8, 150 mM KCl, doda se spoj ili razrijeđeni DMSO vehikulum, a ploče se inkubira na označenim temperaturama. Inkubacija se završi stavljanjem jažica na led; ELISA testove provede se uz držanje ploča na ledu kako bi se izbjegle daljnje promjene epitopa. Jažice se blokiraju tijekom 1 sata hladnim 5 % obranim mlijekom (Difco) u HEPES/KCl puferu, prije dodavanja primarnih protutijela. Monoklonalna protutijela mAb1620, mAb240 (Calbiochem) i antiFLAG M2 protutijelo (Eastman Kodak Company) se razrijede na 1:100-1:250 u HEPES/KCl i dodaju na 100 µl/jažica tijekom 30 minuta. Ploče se isperu 2 × hladnim HEPES/KCl puferom i inkubiraju s peroksidazom iz hrena (horse radish peroxidase, HRP) konjugiranom s protumišjim IgG (Boehringer) tijekom daljnjih 30 minuta. HPR signal je razvijen pomoću TMB razvijača (Pierce), a optička gustoća signala očitana je na BioRad setu čitača mikroploče na 450 nm.

B. Rezultati

Konformacija p53 DBD je termolabilna. Epitop kojeg prepoznaje mAb1620 ovisi o konformaciji, a njegovo prisustvo na p53 usko je povezano s tumor-supresijskom aktivnošću proteina (Ball i drugi: (1984.), vidjeti gore; Gamble i Milner: (1988.), vidjeti gore). Suprotno tome, epitop kojeg prepoznaje mAb240 je linearni epitop, koji je izložen kada je p53 inaktiviran mutacijom ili kada je p53 divljeg tipa denaturiran (Bartek i drugi:, (1990.) "Oncogene", 5, 893-899; Stephen i Lane: "J. Mol. Biol.", 225, 577-583, (1992.)). Rekombinantna ljudska p53 DBD (ostaci 94-312), kada se podvrgava tranziciji iz aktivne u inaktivne konformacije in vitro, postupno gubi epitop 1620 dok akumulira epitop 240. Pročišćena p53 DBD imobilizirana na mikrotitarskim pločama grijana je na temperaturama blizu fizioloških i sondirana s mAb1620 u ELISA formatu. Epitop 1620 se izgubi na temperaturi i na vremenski ovisan način (slika 1A). Gubitak epitopa 1620 specifično se odnosi na gubitak konformacije, dok je FLAG epitop koji je bio vezan za DBD ostao potpuno stabilan (slika 1B). Osim toga, gubitak epitopa 1620 desio se zajedno s pojačanim pojavljivanjem epitopa 240, uz uvjet da gubitak 1620 odražava konformacijsku promjenu p53 DBD, a ne gubitak imobiliziranog proteina.

Poluživot epitopa 1620 na p53 DBD divljeg tipa bio je približno 25 minuta na 23°C i progresivno se smanjivao na višim temperaturama na manje od 5 minuta na 45°C (slika 1A). Paralelno tome, kapacitet vezanja p53 DBD na DNA u testovima pomicanja gela smanjen je nakon grijanja u otopini (podaci nisu prikazani). Poluživot epitopa 1620 na p53 DBD divljeg tipa bio je približno 2 × dulji od onog na mutantnoj DBD na položaju 143 na 37°C (slika 1C). Ovo saznanje je u skladu s ranijim izvještajima o smanjenoj termodinamičkoj stabilnosti pojedinih drugih mutantnih p53 proteina i prikazuje da se epitop 1620 može upotrebljavati za praćenje konformacije p53 DBD (Bullock i drugi: (1997.), vidjeti gore).

Spojevi stabiliziraju konformaciju p53. ELISA test upotrebljen je za identificiranje spojevi koji stabiliziraju aktivnu konformacija p53 i omogućuju bolje održavanje funkcije divljeg tipa kod mutantnih proteina. Nekoliko spojeva suprimiralo je gubitak epitopa za mAb1620 na fiziološkoj temperaturi (za primjere vidjeti sliku 2A). Relativna potentnost spojeva utvrđena je titracijskim eksperimentima određivanjem koncentracije potrebne za stabliziranje 50 % epitopa za mAb1620. Aktivni spojevi stabilizirali su epitop na dozno ovisan način (slika 2B). Otapalo DMSO i nekoliko analoga aktivnih spojeva nisu mogli stabilizirati (slika 2B, vidjeti tablice 1 i 2). Spojevi su također stabilizirali p53 divljeg tipa potpune duljine, kao što je bilo za DBD iz nekoliko mutantnih p53 proteina (podaci nisu prikazani, slika 2C). U prisustvu spoja, mutantni proteini bili su stabilni poput proteina divljeg tipa u odsustvu spoja.

Dok su spojevi štitili epitop za mAb1620, nisu spasili p53 koji je već izgubio epitop. Primjerice, nije bilo povećanja kod mAb1620 reaktivnosti kada je p53 DBD grijan prije dodavanja spoja Y. Iako je brzina gubitka epitopa reducirana prisutnim spojem, produljeno grijanje je rezultiralo u konačnim gubitkom 1620-pozitivne konformacije. Osim toga, spoj očito nije ireverzibilno vezan na p53 jer dodavanje i ispiranje spoja Y prije inkubiranja na 37°C nije spriječilo gubitak epitopa (podaci nisu prikazani). Ova saznanja su u skladu s modelom gdje međudjelovanje p53 DBD sa spojem omogućuje proteinu da stabilnije održi funkcionalnu konformaciju, kao što je prepoznato s mAb1620.

Struktura aktivnih spojeva. Svi identificirani aktivni spojevi poveznicom specifične duljine drže zajedno hidrofobnu grupu (planarni policikl) i kationsku grupu (često amin). Benzimidazol, benzokinolin, fenotiazin, i stirilkinazolin u hidrofobnom (R1) položaju bili su aktivni dok male promjene u ovim grupama i jednostavne bicikličke ili monocikličke grupe nisu bile aktivne pod uvjetima određenim testom (tablica 1). U ovom testu spojevi su prozvani "aktivnima" ako je razlika između dva odgovarajuća para bila više no 10 × (vidjeti tablicu 1) od količine spoja potrebne za stabiliziranje 50 % epitopa za mAb1620. Prema tome, treba imati na umu da spojevi prozvani inaktivnima u ovom testu nisu bili apsolutno inaktivni, nego samo relativno inaktivni. Prema tome, aktivne kationske (R2) grupe uključivale su dimetilamin, dietil amin, dietanol amin, metil amin, metil piperazin i morfolin (tablica 1). Neki veći amini bili su odgovarajuće aktivniji kada su testirani u fenotiazinskom nizu. Negativno nabijene ili nenabijene grupe poput karboksilne ili benzenske grupe u R2 položaju bile su inaktivne, kao što je definirano u ovom testu (tablica 1). Razmak između grupe R1 i R2 bio je također važan za aktivnost spoja u ovom testu, jer su poveznice kraće od duljine propila smanjile aktivnost spaja (tablica 2). Butilne poveznice bili su neznatno manje potentne od propilne poveznice, dok su dulje poveznice opažene kod spojeva s manjom aktivnošću u ovom testu (tablica 2 i podaci nisu prikazani). Razgranate poveznice koje zadržavaju pravilan razmak općenito su bile aktivnije od odgovarajućih ravnolančanih poveznica.

Ova opća opažanja ne ograničavaju opseg izuma, ali se mogu upotrebljavati u praksi izuma za dizajniranje slijedećih molekula.

Tablica 1: Ovisnost aktivnosti o strukturnim karakteristikama spoja

[image] [image] * Aktivan i inaktivan označuje > 10 × od razlike potentnosti odgovarajućeg para spojeva. Relativna potentnost bila je određena količinom spoja potrebnom za stabiliziranje 50 % epitopa za mAb1620 u titracijskom eksperimentu. ;Tablica 2: Ovisnost aktivnosti o razmaku između grupe R1 i R2 ;[image] [image] ;* Koncentracija spoja potrebna za očuvanje 50 % epitopa za mAb1620 na 0,5 ng iz p53 DBD grijane na 45°C tijekom 30 minuta.

C. Rasprava

Rezultati prikazuju dokaz principa za novu strategiju obnavljanja funkcije mutantnog p53 i razvoj antitumorskih lijekova. Ovaj primjer opisuje otkriće prve porodice spojevi koji mogu djelovati na izdvojenu DBD radi promoviranja konformacijske stabilnosti.

VII. Primjer 2: Određivanje p53 konformacija u stanicama i tumorima

U ovom primjeru i primjerima koji slijede, pokazalo se da spojevi prototipovi funkcioniraju u niskim mikromolarnim koncentracijama u moduliranju mutantnog p53 u živim stanicama i u tumorima te da suprimiraju rast tumora s prirodno mutiranim p53.

A. Materijali i postupci

Kultura stanica. Sve stanične linije dobivene su od ATCC i rasle su u preporučenom mediju s 10 % telećim fetalnim serumom (Gibco BRL).

Određivanje konformacije p53. Približno 1 × 107 H1299/Reporter + mutantni p53 stanica tretirano je preko noći, isprano 3 × hladnom Tris puferiranom fiziološkom otopinom i lizirano u 1,5 ml hipotoničnog pufera za liziranje (20 mM HEPES, pH 7,4, 10 mM NaCl, 20 % glicerola, 0,2 mM EDTA, 0,1 % Triton-X 100, 10 mM ditiotreitola s inhibitorima proteaza). Stanice se istaloži u mikrofugalnim epruvetama na 2000 o/min tijekom 5 minuta na 4 °C, a nuklearne ekstrakte se dobije resuspendiranjem taloga u istom puferu s 0,5M NaCl. Uzorke tumora se homogenizira u Dounce homogenizatoru pomoću 3 volumena gore navedenog pufera s 0,5 M NaCl. Lizate se pročisti centrifugiranjem na 10.000 o/min kroz 10 minuta na 4 °C. Nuklearne ekstrakte se normalizira prema razini p53 kvantificiranoj iz zapadnog bugačenja mAbDO-1 protutijelom, a p53 se prikupi u jažicama Maxisorp F96 ploča (Nunc) prevučenim preko noći na 4°C s mAbDO-1 na 1 µg/ml u 0,05 M karbonatnom puferu, pH 9,6. Jažice se ispere hladnim PBS, blokira tijekom 3 sata na 4°C 4 % obranim mlijekom u PBS, te se ispituje pomoću mAb1620 protutijela konjugiranog s HRP u obranom mlijeku. Inkubacija protutijela se vrši kroz 1 sat na ledu, nakon čega se jažice ispere 3 × u PBS s 0,05 % Tween 20, a TMB supstrat se upotrijebi za razvijanje signala. Standardna krivulja se odredi pomoću lizata H1299/Reporter + mutantni p53 stanica kod pomaknute temperature (32 °C), koje su u velikim količinama eksprimirale 1620-pozitivni p53. Kvantifikacija uzoraka bila je unutar linearnog segmenta standardne krivulje i korigirana je za ukupni p53 u svakom uzorku, isto kao za 1620-pozitivnu p53 frakciju u netretiranim lizatima.

B. Rezultati

Stabilizacija konformacije u stanicama. Sposobnost spojeva da stabiliziraju 1620-pozitivnu konformaciju staničnog p53 testirana je na živim stanicama koje isključivo eksprimiraju p53. H1299 stanice, koje ne eksprimiraju p53, transficirane su mutantnim p53 (položaj 173) deriviranim iz tumora, a konformacijski neosjetljivo protutijelo protiv p53 (mAbDO-1) je upotrijebljeno u zapadnom bugačenju u odabiru klona koji eksprimira velike količine mutantnog proteina. U ekstraktima iz transfektanta detektirane su niske razine stabilnog stanja p53 koje su prikazale epitop za mAb1620, potvrđujući da mala frakcija mutantnog p53 može održati aktivnu konformaciju (Chen i drugi: "Oncogene", 8, 2159-2166, (1993.)). Niske mikromolarne koncentracije spoja X povećale su frakciju stabilnog stanja 1620 pozitivnog p53 u stanicama za približno 5 × (slika 3A). Vršne razine obogaćivanja epitopa dostignute su 4-6 sati nakon tretmana. Ukupna količina p53 nije se promijenila prilikom mjerenja reaktivnosti s mAbDO-1 protiv konformacijske neosjetljivog epitopa smještenog na amino kraju proteina.

C. Rasprava

Rezultati prikazuju da konformacijski stabilizirajući spojevi identificirani postupcima iz ovog izuma mogu stabilizirati aktivnu konformaciju p53 u živim stanicama. Spojevi koji obnavljaju mutantni p53 u tumorima mogu imati za cilj ili ukupnu nefunkcionalnu količinu p53 ili frakciju p53 koja prikazuje epitop za mAb1620. Čini se da je ključni cilj za ovdje opisane spojeve novo sintetiziran mutantni p53, koji još zadržava aktivnu konformaciju. Spojevi su, odista, pojačali stabilnost epitopa 1620, ali nisu mogli obnoviti izgubljen epitop 1620 prije grijanja in vitro. Spojevi koji pojačavaju stabilnost aktivne konformacije na novo sintetiziranom p53 mogli bi omogućiti nakupljanje razina stabilnog stanja funkcionalnog p53 na vremenski ovisan način. Opaženo kašnjenje od četiri dana za postizanje maksimalnog pojačanja epitopa 1620 u stanicama u skladu je s ovom hipotezom (slika 3A).

VIII. Primjer 3: Obnavljanje funkcije p53

A. Materijali i postupci

Testovi transaktiviranja. Stanice su transficirane ekspresijskim plazmidima koji kodiraju mutantne p53 proteine (173A, 249S) i neomicin-selektivnim markerom, pomoću DOTAP-a, kationski lipidnog transfekcijskog reagensa (Boechringer Mannheim) ili kalcij fosfata. Stanice su također transficirane plazmidom koji kodira marker higromicinske otpornosti i p53 reporter gen koji se sastojao od četiri replike p53 vežuća slijeda koji odgovaraju p53 vežućem slijedu u promotorskoj regiji gena za timidin kinazu Herpes Simplex virusa (baze 26-58, GenBank pristupni br. S57428 za timidin kinazu, koja počinje slijedom GCCTTGCCT, a završava slijedom TGCCTTTTC) ugrađene uzvodno od SV40 osnovnog promotora koji aktivira gen za luciferazu. Odgovarajući par stanica dobiven je transfekcijom klona stanica reporter-konstruktom s dodatnim konstruktom za eksprimiranje mutantnog 53. Transficirani klonovi odabrani su za rast u mediju s higromicinom ili G418, prema pogodnosti. Jednostruki slojevi stanica u pločama za kulture tkiva s 96 jažica (Costar) tretirani su spojem, a luciferazna aktivnost određena je testom prevođenja supstrata (Promega) i kvantificirana Dyntech microplate luminometrom.

Eksprimiranje WAF1 i p53. Kultivirane stanice tretirane su tijekom 21 sata, isprane 3 × hladnom Tris puferiranom fiziološkom otopinom, sastrugane, i prevedene u talog na 10.000 o/min tijekom 30 sekundi prije resuspendiranja u 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 % NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 50 µg/ml aprotinina, 1 mg/ml Pefabloc (Boehringer Mannheim). Koncentracije proteina određene su Bradford-ovim reagensom (BioRad), a 5 odnosno 10 µg staničnog lizata prelito je u 8-16 % gradijentne poliakrilamid/SDS gelove (Novex). Proteini su prenijeti na Immobilon P membranu (Millipore) u Towbin-ovom puferu (Towbin i drugi: "Proc. Nat. Acad. Sci.: USA", 76, 4350, (1979.)) s 20 % metanolom. Membrane su podijeljene između 32,5 i 47,5 kDa markera molekulske težine i blokirane tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi u SuperBlock (Pierce) s 3 % obranim mlijekom. Donja polovina mrlje ispitana je na ekspresiju WAF1 monoklonalnim protutijelom iz klona EA10 (Calbiochem WAF1 Ab-1), a gornja polovina mrlje ispitana je na ekspresiju ukupnog p53 pomoću mAbDO-1 (Calbiochem p53 Ab-6). Mrlje su isprane tijekom 1 sata u 3 količine Tris puferirane fiziološke otopine s 0,1 % Tween 20, prije dodavanja sekundarnog protutijela, HRP-konjugiranog protumišjeg IgG. Pruge su vizualizirane pomoću Renaissance ECL (DuPont) i izlaganjem Hyperfilm ECL (Amersham Life Science).

B. Rezultati

Obnavljanje funkcije p53 u stanicama. U određivanju bi li stabilizacija konformacije p53 mogla rezultirati boljim održavanjem funkcija divljeg tipa, ispitali smo aktivnost slijedno specifične transkripcijske aktivnosti p53. Stanice H1299 transficirane su p53-inducibilnim luciferaza-reporter-genom, a stabilni klon (H1299/Reporter) sekundarno je transficiran mutantnim p53 radi dobivanja odgovarajućeg klona koji je eksprimirao i reporter-gen i mutantni p73 na položaju 173 (H1299/Reporter + mutantni p53). Spojevi su pojačali transkripcijsku aktivnost mutantnog p53, što je mjereno indukcijom reporter-gena (slika 3B). Niske razine transkripcijske aktivnosti opažene su u H1299/Reporter stanicama, što može biti zbog prisustva p53 homologa, p73 (podaci nisu prikazani). Iako još nismo utvrdili mogu li ovi spojevi pojačati aktivnost p73, obiman p53 ovisan porast indukcije reporter-gena ukazuje da je p53 osnovni cilj u ovim stanicama. p53 ovisno aktiviranje reporter-gena koje se desilo unutar relativno malog raspona koncentracija, s obzirom da je djelotvornost spojeva u višim dozama ograničeno odvajanjem stanica. Pojačanje transkripcijske aktivnosti dostiže vršnu vrijednost 12-16 sati nakon tretmana (podaci nisu prikazani). Ovo opažanje je u skladu s ekspresijom reporter gena koja je sekundarni događaj nakon stabilizacije funkcionalne konformacije p53, što se desilo 4-6 sati nakon tretmana.

Spoj Y bio je superioran naspram spoja X u testovima indukcije reporter-gena. Ovo može doprinijeti sekundarnom učinku spoja Y, što uključuje oštećenje DNA i uzrokuje povišene razine proteina p53 (slika 3B). Spoj Y, ali ne i spoj X, povisio je ukupnu razinu proteina p53 u koncentracijama nužnim za staničnu aktivnost. Kako bi se osiguralo da oštećenje DNA nije jedino odgovorno za indukciju p53-reporter-gena spojem Y, testirali smo učinke DNA oštećujućeg agensa adriamicina. Adriamicin nije inducirao reporter-gen unutar širokog opsega koncentracija (0,4-40 µg/ml), unatoč tome što može inducirati akumulaciju mutantnog p53 u stanicama (podaci nisu prikazani). Ovi rezultati prikazuju da konformacijska stabilizacija, ali ne i akumulacija mutantnog p53, može promovirati specifičnu transkripcijsku aktivnost. Osobito, spoj X, koje ne podiže razinu stabilnog stanja ukupnog p53 proteina, čini se da obnavlja transkripcijsku funkciju p53 jedinstveno stabilizirajući konformaciju.

Spoj X je regulirao na gore WAF1, produkt staničnog gena osjetljivog na p53, u prisustvu mutantnog p53. Saos-2 stanice iz osteosarkoma, koje ne eksprimiraju p53, transficirane su ekspresijskim vektorima za mutantni p53, a izolirani su klonovi koji eksprimiraju jedan od dva mutanta (položaj 173 ili položaj 249). Klonovi koji eksprimiraju donje osnovne razine WAF1, u usporedbi s roditeljskim Saos-2 stanicama, vjerojatno odražavaju naš izbor brže rastućih klonova. Ove stanice tretirane su spojem X tijekom 16 sati, a lizati koji predstavljaju jednake količine proteina analizirani su zapadnim bugačenjem za p53 i WAF1. Stanice koje su eksprimirale jedan od dva mutantna p53 proteina, ali ne roditeljske Saos-2 stanice, povećale su razine eksprimiranja WAF1 nakon tretmana (slika 4). Ukupna količina proteina p53 u ovim lizatima u osnovi je nepromijenjena. Adriamicin nije inducirao ekspresiju WAF1 u Saos-2 stanicama s mutantnim p53, iako nije pojačao ekspresiju WAF1 u U2OS stanicama koje eksprimiraju p53 divljeg tipa (podaci nisu prikazani).

C. Rasprava

Ovdje opisani način djelovanja konformacijski stabilizirajućih agensa jasno se razlikuje od opaženog za tradicionalne citotoksične antineoplastike. Citotoksični agensi koje se upotrebljava u kemoterapiji raka općenito su nedjelotvorni u stanicama s mutantnim p53 (Lowe i drugi: "Nature", 362, 847-849, (1993.); O’Connor i drugi: "Cancer Res.", 57, 4285-4300, (1997.)). DNA oštećujući agens, adriamicin, odista nije obnovio transkripcijsku aktivnost kod mutantnog p53 u našim testovima. Za citotoksične spojeve također je karakteristična značajna indukcijska ukupnog p53 proteina u normalnim i tumorskim stanicama. Spoj X nije inducirao razine ukupnog p53 proteina u stanicama ili u tumorima. Kako je indukcija p53 osjetljiva mjera oštećenja DNA u stanici, nije vjerojatno da spoj X može oštetiti DNA u djelotvornim koncentracijama. Uzeta zajedno, naša saznanja ukazuju da se stabilizacija 1620-pozitivne konformacije i funkcionalno obnavljanje aktivnosti kod mutantnog p53 može desiti mehanizmom neovisnim o oštećenju DNA.

Pojedine linije dokaza isključuju nespecifični učinak na stabilizaciju proteina. Glicerol, nespecifični inhibitor denaturiranja proteina koji funkcionira izmiještanjem vode i stvaranjem hidrofobnijeg mikrookoliša oko molekule proteina, može obnoviti nuklearnu lokalizaciju mišjeg mutantnog p53 u stanicama, u koncentraciji od 600 mM (Brown i drugi: "J. Clin. Invest.", 99, 1432-1444, (1997.)). Spoj X je bio aktivan u koncentraciji od 0,03 mM u ovom testu, što ukazuje na uključivanje preciznijeg međudjelovanja koja uključuju specifične kontakte između spoja i p53 (podaci nisu prikazani). Osim toga, opažanje da spoj X može utjecati na konformaciju p53 u prisustvu velikog viška drugih proteina u kulturi i in vivo (vidjeti niže) u skladu je sa selektivnim prepoznavanjem p53. Osim toga, priroda međudjelovanja spoja i p53 ne mora uključivati čvrsto vezanje na nativnu strukturu proteina. Jako međudjelovanje s malom frakcijom molekula proteina koji su u prijelaznom stanju može funkcionirati tako da blokira daljnje odstupanje od aktivne konformacije ili olakšava povratak nativne konformacije.

IX. Primjer 4: Test tumorskog rasta

A. Materijali i postupci

Test tumorskog rasta. Kultivirane stanice isprane su PBS-om i 1 × 106 A375S2 ili je 5 × 106 DLD1 stanica inokulirano u 90 % Matrigel (Becton Dickinson) unilateralno u desnu slabinu ženki NU/NU-nuBR miševa od 20 grama (Charles River Laboratories). Spoj je primijenjen intraperitonealno u fiziološkoj otopini s 0,1 % Pluronic P-105 (BASF). Promjer tumora mjeren je u dvije dimenzije šestarom za mjerenje šupljina i preveden je u volumen tumora (Euhus i drugi: "J. Surg. Oncol.", 31, 229-234, (1986.)).

B. Rezultati

Modulacija p53 in vivo. Spoj X je povisio razinu stabilnog stanja frakcije p53 koja prikazuje epitop za mAb1620 kod tumora s mutiranim p53. Spoj je primijenjen intraperitonealno u koncentraciji od 100 mg/kg na miševima koji nose potkožne tumore derivirane iz ubrizganih H1299/Reporter + mutantni p53 stanica. Životinje su žrtvovane nakon jedne doze spoja, a tumorski lizati su analizirani na ukupnu i 1620-pozitivnu ekspresiju p53. Ukupne razine p53 bili su nepromijenjene, kao što je mjereno u zapadnom bugačenju pomoću mAbDO-1. Lizati su normalizirani za varijacije tumora u ukupnom sadržaju p53 i testirani su ELISA testom na eksprimiranje epitopa za mAb1620. Količina epitopa je porasla unutar 3-5 sati nakon tretmana (slika 5). Vremenski tijek odgovora in vivo bio je sličan onom za kultivirane stanice (slika 3A).

Kako bi se procijenilo funkcionalno obnavljanje mutanta p53 in vivo, ispitivali smo eksprimiranje luciferaza-reporter-gena u tumorima iz tretiranih i netretiranih životinja. Maksimalna 4,5 × indukcija reporter-gena opažena je 8 sati nakon doziranja (slika 5). Vremensko kašnjenje između konformacijskih i funkcionalnih odgovora može odražavati vrijeme nužno za translaciju luciferaznog transkripta i nakupljanje proteina. Vršna koncentracija spoja u plazmi kod miševa bila je približno 10 µg/ml, što je manje nego što bi moglo biti nužno za maksimalnu indukciju reporter-gena u stanicama (podaci nisu prikazani). Stoga, niže razine indukcije reporter-gena u tumorima, u usporedbi s kultiviranim stanicama, mogu biti uzrokovane suboptimalnim izlaganjem.

C. Rasprava

Rezultati prikazuju da konformacijski stabilizirajući spojevi mogu obnoviti više slučajno izabranih mutanata. Prema tome, postupci i spojevi iz ovog izuma su široko primjenjivi kod različitim mutantih p53. Primjerice, mutacija položaja 241 u DLD-1 stanicama, koja pogađa manje važno mjesto za kontakt s DNA, može se funkcionalno nadopuniti stabilizacijskom aktivnošću spoja X. Stoga, nakon stabilizacije aktivne konformacije može se obnoviti veliko mnoštvo mutacija p53, uključujući neke na mjestima za kontakt s DNA.

Spoj X pokazao je terapijsku selektivnost in vivo usprkos stabilizaciji konformacije i divljeg tipa i mutantnog p53 in vitro. Spoj se odista pokazao sigurnim, a smrtnost nije zabilježena prilikom doziranja miševima u koncentraciji od 200 mg/kg (100 mg/kg dvaput dnevno) tijekom 14 uzastopnih dana (podaci nisu prikazani). Selektivnost može biti uzrokovana vrlo niskim razinama stabilnog stanja p53 u normalnim stanicama, u usporedbi s vrlo visokim razinama kod tumorskih stanica (Lassus i drugi: "EMBO J.", 15, 4566-4573, (1996.)). Također, tumorski specifični stresovi poput oštećenja DNA i uskraćivanja kisika i hrane mogu preferencijalno navesti tumorske stanice na apoptotske učinke p53 (Chen i drugi:, (1996.) "Genes and Dev.", 10, 2438-2451). Ako je tako, moglo bi biti moguće postići sinergistički antitumorske učinke kombiniranjem p53 stabilizirajućih spojeva sa zračenjem i genotoksičkim lijekovima.

Prethodno napisana specifikacija je dovoljna da stručnjaku omogući primjenu izuma u praksi. Različite modifikacije gore opisanog sredstva za vršenje izuma, očite stručnjaku iz molekularne biologije, medicine ili srodnog područja odista kane biti unutar opsega slijedećih patentnih zahtjeva.

Claims

1. Postupak promoviranja aktivnosti divljeg tipa kod mutantnog oblika ljudskog proteina iz porodice proteina p53, kod kojeg jedna ili više funkcionalnih aktivnosti navedenog proteina su barem djelomice oslabljene nemogućnošću navedenog proteina da očuva funkcionalnu konformaciju pod fiziološkim uvjetima, naznačen time što ga čine ovi koraci: (a) stupanje u dodir navedenog mutantnog proteina s organskim nepeptidnim spojem, koji se može vezati na jednu ili više domena navedenog mutantnog proteina pod fiziološkim uvjetima i stabiliziranje funkcionalne konformacije, i (b) dopuštanje navedenom stabiliziranom proteinu međudjelovanje s jednom ili više makromolekula koje sudjeluju u navedenoj aktivnosti divljeg tipa.

2. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time što navedeni protein se bira iz grupe koju čine: p53, p63 i p73.

3. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time što navedeni protein je p53.

4. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time što navedeni organski nepeptidni spoj se bira iz grupe koju čine: [image] , gdje, za grupu I [image] , R5 je –N–R18R19, gdje R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, i R19 je H, (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil, ili fenil, naznačen time što navedena alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, –CON R18(CH2)pNR20R21, –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, i R20i R21 se svaki, neovisno bira između: (a) (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)aril, (C5-C9)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C12)arila, gdje navedene grupe su izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C10)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, ili (C1-C6)alkila (C6-C10)arila; ili (b) NR20R21 uzeti zajedno predstavljaju vodik, morfolin ili 4-(C1-C6)alkilpiperizin; R6 je (a) (C1-C6)alkil ili (C2-C8)alkenil, svaki izborno supstituiran s jednom ili više fenilnih grupa, ili (b) fenil supstituiran s halo, (C1-C6)alkoksi; i R7 i R8 su istovjetni ili različiti, a bira ih se između H, nitro, (C1-C6)alkoksi, ili halogen, kojeg se bira između fluora, klor i brom; gdje, za grupu II [image] , R9 je (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil, ili fenil, gdje navedena alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, –CON R18(CH2)pNR20R21–(CH2)pNR20R21–(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n-NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, i R20i R21 se svaki neovisno bira između H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)arila, (C5-C9)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C12)arila, gdje navedene grupe su izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C6)alkil(C1-C6)heteroarila, ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; gdje, za grupu III [image] , R10 je –N–R18R19, gdje R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, i R19 je H, (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil, ili fenil, gdje navedena alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, –CON R18(CH2)pNR20R21–(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n-NR20R21 ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n-NR20R21(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, i R20i R se svaki neovisno bira između: (a) H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)arila, (C5-C9)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C12)arila, gdje navedene grupe su izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C10)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C6)alkil(C5-C9)heteroarila, ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; ili (b) NR20R21 uzeti zajedno predstavljaju vodik, morfolin, ili 4-(C1-C6)alkilpiperizin; A i B su istovjetni ili različiti, a svaki od njih predstavlja ugljik ili dušik; i R11 i R12 su istovjetni ili različiti, a bira ih se između H, nitro, (C1-C6)alkoksi ili halogena, kojeg se bira između fluora, klora i broma; gdje, za grupu IV [image] , R13 je –N–R18R19, gdje R18 is H, (C1-C6)alkil, ili fenil, i R19 je H, (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil, ili fenil, gdje navedena alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, –CON R18(CH2)pNR20R21–(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21 ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, i R20i R21se svaki neovisno bira između: (a) H, (C1-C12)alkil, (C3-C12)cikloalkil, (C3-C10)heterocikloalkil, (C1-C10)alkil(C5-C9)heteroaril, (C5-C9)heteroaril, (C6-C10)aril, i (C1-C6)alkil(C6-C10)aril, gdje navedene grupe su izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C10)alkil(C5-C9)heteroarila i (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; ili (b) NR20R21uzeti zajedno predstavljaju vodik, morfolin, ili 4-(C1-C6)alkilpiperizin; A i B su istovjetni ili različiti, a svaki od njih predstavlja ugljik ili dušik; i R14 i R15 su istovjetni ili različiti, a bira ih se između H, nitro, (C1-C6)alkoksi, ili halogena, kojeg se bira između fluora klora i broma; i gdje, za grupu V [image] , A je ugljik ili dušik; R16 je –N–R18R19, gdje R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, i R19 je H, (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil, ili fenil, gdje navedena alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, –CON R18(CH2)pNR20R21, –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, i R20i R21 se svaki neovisno bira između: (a) H, (C1-C12)alkil, (C3-C12)cikloalkil, (C3-C10)heterocikloalkil, (C6-C10)aril, (C1-C6)heteroaril, (C1-C6)alkil(C6-C10)aril i (C1-C6)alkil(C1-C6)heteroaril, ili, gdje navedene grupe su izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetilom, (C1-C6)alkilom, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkilom, (C1-C6)alkil(C5-C9)heteroarilom, ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arilom; ili (b) NR20R21uzeti zajedno predstavljaju vodik, morfolin, ili 4-(C1-C6)alkilpiperizin; i R17 se bira između H, nitro, (C1-C6)alkoksi ili halogena, kojeg se bira između fluora, klora i broma.

5. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time što navedeni organski nepeptidni spoj se veže na DNA vežuću domenu, ostatke 94-312 ljudskog proteina p53.

6. Postupak prema zahtjevu 5, naznačen time što DNA vežuća domena navedenog proteina p53 sadrži missens-mutaciju aminokoiselinskog položaja i bira se iz grupe koju čine ostaci 143, 173, 175, 241 i 249.

7. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time što koraci (a) i (b) se provode istodobno.

8. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time što koraci (a) i (b) se provode jedan za drugim.

9. Postupak tretiranja bolesnog stajna ljudskog subjekta povezanog s pojavom mutantnog proteina iz porodice proteina p53, gdje je oslabljena jedna ili više aktivnosti divljeg tipa, naznačen time što ga čine ovi koraci: (a) primjena na navedenom subjektu organskog nepeptidnog spoja koji se može vezati na jednu ili više domena navedenog mutantnog proteina pod fiziološkim uvjetima i stabiliziranje funkcionalne konformacije, i (b) omogućavanje navedenom stabiliziranom proteinu u navedenom pacijentu međudjelovanje s jednom ili više makromolekula koje sudjeluju u navedenoj aktivnosti divljeg tipa.

10. Postupak prema zahtjevu 9, naznačen time što navedeni protein se bira iz grupe koju čine: p53, p63 i p73.

11. Postupak prema zahtjevu 10, naznačen time što navedeni protein je p53.

12. Postupak prema zahtjevu 10, naznačen time što navedeni organski nepeptidni spoj se veže na DNA vežuću domenu, ostatke 94-312 ljudskog proteina p53.

13. Postupak prema zahtjevu 12, naznačen time što DNA vežuća domena navedenog proteina p53 sadrži missens-mutaciju aminokoiselinskog položaja, kojeg se bira iz grupe koju čine ostaci 143,173,175,241 i 249.

14. Postupak prema zahtjevu 9, naznačen time što koraci (a) i (b) se provode istodobno.

15. Postupak prema zahtjevu 9, naznačen time što koraci (a) i (b) se provode jedan za drugim.

16. Postupak prema zahtjevu 10, naznačen time što navedeno bolesno stanje je rak.

17. Postupak tretiranja raka kod ljudskog subjekta naznačen time što ga čine ovi koraci: (a) primjena na navedenom subjektu organskog nepeptidnog spoja koji se može vezati na jednu ili više domena ljudskog proteina iz porodice proteina p53 pod fiziološkim uvjetima, i stabiliziranje funkcionalne konformacije, i (b) dopuštanje navedenom stabiliziranom proteinu međudjelovanje s jednom ili više makromolekula koje sudjeluju u aktivnosti divljeg tipa navedenog proteina.

18. Postupak prema zahtjevu 17, naznačen time što navedeni protein se bira iz grupe koju čine: p53, p63, i p73.

19. Postupak prema zahtjevu 17, naznačen time što navedeni protein je p53.

20. Postupak prema zahtjevu 17, naznačen time što navedeni organski nepeptidni spoj se bira iz grupe koju čine: [image] , gdje, za grupu I [image] , R5 je –N–R18R19, gdje R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, i R19 je H, (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil ili fenil, gdje navedena alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, –CON R18(CH2)pNR20R21–(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21 ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, i R20i R21 se svaki neovisno bira između: (a) H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)arila, (C5-C9)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C12)arila, gdje navedene grupe su izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C10)alkil(C3-C10)heterocikloalkila ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; ili (b) NR20R21 uzeti zajedno predstavljaju vodik, morfolin, ili 4-(C1-C6)alkilpiperizin; R6 je (a) (C1-C6)alkil ili (C2-C8)alkenil, svaki izborno supstituiran s jednom ili više fenilnih grupa, ili (b) fenil supstituiran s halo, (C1-C6)alkoksi; i R7 i R8 su istovjetni ili različiti, a bira ih se između H, nitro, (C1-C6)alkoksi ili halogena, kojeg se bira između fluora, klora i broma; gdje, za grupu II [image] , R9 je (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil, ili fenil, gdje navedena alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, –CON R18(CH2)pNR20R21–(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21 ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, i R20i R21 se svaki neovisno bira između H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)arila, (C1-C6)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C12)arila, gdje navedene grupe su izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C6)alkil(C1-C6)heteroarila, ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; gdje, za grupu III [image] , R18 je –N–R18R19, gdje Rl8 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, i R19 je H, (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil, ili fenil, gdje navedena alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkil, –CON R18(CH2)pNR20R21–(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, i R20i R21se svaki neovisno bira između: (a) H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)arila, (C1-C6)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C12)arila, gdje navedene grupe su izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C10)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C6)alkil(C1-C6)heteroarila ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; ili (b) NR20R21 uzeti zajedno predstavljaju vodik, morfolin, ili 4-(C1-C6)alkilpiperizin; A i B su istovjetni ili različiti, a svaki od njih predstavlja ugljik ili dušik; i R11 i R12 su istovjetni ili različiti, a bira ih se između H, nitro, (C1-C6)alkoksi ili halogena, kojeg se bira između fluora, klora i broma; gdje, za grupu IV [image] , R13 je –N–R18R19, gdje R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, i R19 je H, (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil, ili fenil, gdje navedena alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, –CON R18(CH2)pNR20R21–(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21 ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, i R20i R21se svaki neovisno bira između: (a) H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C10)alkil(C1-C6)heteroarila, (C1-C6)heteroarila, (C6-C10)arila i (C1-C6)alkil(C6-C10)arila, gdje navedene grupe su izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C10)alkil(C1-C6)heteroarila i (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; ili (b) NR20R21 uzeti zajedno predstavljaju vodik, morfolin, ili 4- (C1-C6)alkilpiperizin; A i B su istovjetni ili različiti, a svaki od njih predstavlja ugljik ili dušik; i R14 i R15 su istovjetni ili različiti, a bira ih se između H, nitro, (C1-C6)alkoksi ili halogena, kojeg se bira između fluora, klora i broma; i gdje, za grupu V [image] , A je ugljik ili dušik; R16 je –N–R18R19, gdje R18 je H, (C1-C6)alkil, ili fenil, i R19 je H, (C1-C6)alkil, (C3-C10)cikloalkil, ili fenil, gdje navedena alkilna, cikloalkilna ili fenilna grupa je izborno supstituirana s hidroksi, (C3-C8)cikloheteroalkilom, -CON R18(CH2)pNR20R21–(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21 ili –(CH2)p–(CHR22)m–(CH2)n–NR20R21, gdje p je 0-5, m je 0-5, n je 0-5, R22 je hidroksi ili (C1-C6)alkil, i R20i R21se svaki neovisno bira između: (a) H, (C1-C12)alkila, (C3-C12)cikloalkila, (C3-C10)heterocikloalkila, (C6-C10)arila, (C5-C9)heteroarila, (C1-C6)alkil(C6-C10)arila i (C1-C6)alkil(C5-C9)heteroarila, ili gdje navedene grupe su izborno supstituirane s jednim ili više hidroksi, halo, amino, trifluormetila, (C1-C6)alkila, (C1-C6)alkoksi, (C1-C6)alkil(C3-C10)heterocikloalkila, (C1-C6)alkil(C5-C9)heteroarila ili (C1-C6)alkil(C6-C10)arila; ili (b) NR20R21uzeti zajedno predstavljaju vodik, morfolin, ili 4-(C1-C6)alkilpiperizin; i R17 se bira između H, nitro, (C1-C6)alkoksi ili halogena, kojeg se bira između fluora, klora i broma.

21. Postupak prema zahtjevu 17, naznačen time što navedeni organski nepeptidni spoj se veže na DNA vežuću domenu, ostatke 94-312 ljudskog proteina p53.

22. Postupak prema zahtjevu 17, naznačen time što protein iz porodice proteina p53, koji je cilj navedenog organskog nepeptidnog spoja, je divljeg tipa.

23. Postupak prema zahtjevu 17, naznačen time što protein iz porodice proteina p53 koji je cilj navedenog organskog nepeptidnog spoja je mutant kojeg kodira alelska varijanta.

24. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time što navedeni organski nepeptidni spoj se bira iz grupe koju čine: [image] (1-Benzil-piperidin-4-il)-(3-fenotiazin-10-il-propil)-amin [image] [2-(4-Klor-fenil)-etil]-(3-fenotiazin-10-il-propil)-amin [image] (3-Fenotiazin-10-il-propil)-tiokroman-4-il-amin [image] [1-Metil-3-(2,6,6-trimetil-cikloheks-2-enil)-alil]-(3-fenotiazin-10-il-propil)-amin [image] (7-Etoksi-1,2,3,4-tetrahidro-naftalen-2-il)-(3-fenotiazin-10-il-propil)-amin [image] N'-(9-Fluor-benzo[c]akridin-7-il)-N,N-dimetil-propan-1,3-diamin [image] N'-Akridin-9-il-N,N-dimetil-propan-1,3-diamin [image] 2-{4-[4-(Benzo[g]kinolin-4-ilamino)-fenil]-piperazin-1-il}-etanol [image] N4-{2-[2-(4-Brom-fenil)-vinil]-7-klor-kinazolin-4-il}-N',N'-dietil-pentane-1,4diamin [image] N-Benzo[g]kinolin-5-il-N'-cikloheksil-propan-1,3-diamin [image] 2-[(2-Hidroksi-etil)-(3-{2-[2-(4-metoksi-fenil)-vinil]-kinazolin-4-ilamino}-propil)amino]-etanol.

25. Postupak prema zahtjevu 17, naznačen time što navedeni organski nepeptidni spoj se bira iz grupe koju čine: [image] (1-Benzil-piperidin-4-il)-(3-fenotiazin-10-il-propil)-amin [image] [2-(4-Klor-fenil)-etil]-(3-fenotiazin-10-il-propil)-amin [image] (3-Fenotiazin-10-il-propil)-tiokroman-4-il-amin [image] [1-Metil-3-(2,6,6-trimetil-cikloheks-2-enil)-alil]-(3-fenotiazin-10-il-propil)-amin [image] (7-Etoksi-1,2,3,4-tetrahidro-naftalen-2-il)-(3-fenotiazin-10-il-propil)-amin [image] N'-(9-Fluor-benzo[c]akridin-7-il)-N,N-dimetil-propan-1,3-diamin [image] N'-Akridin-9-il-N,N-dimetil-propan-1,3-diamin [image] 2-{4-[4-(Benzo[g]kinolin-4-ilamino)-fenil]-piperazin-1-il}-etanol [image] N4-{2-[2-(4-Brom-fenil)-vinil]-7-klor-kinazolin-4-il}-N1,N1-dietil-pentane-1,4-diamin [image] N-Benzo[g]kinolin-5-il-N'-cikloheksil-propan-1,3-diamin [image] 2-[(2-Hidroksi-etil)-(3-{2-[2-(4-metoksi-fenil)-vinil]-kinazolin-4-ilamino}-propil)amino]-etanol.