FI105554B - Geenimuunnelluista Streptomyces galilaeus-kannoista saatavat hybridiantrasykliinit - Google Patents

Description

105554

Geenimuunnelluista Streptomyces galilaeus -kannoista saatavat hybridiantrasykliinit Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee uusia antrasykliinejä, joita tuotetaan kloonaamalla fuusioituja geenejä mutatoiduissa Streptomyces galilaeus -kannoissa. Saatujen yhdisteiden agly-koniosat ovat muunneltuja aklavinoneja, jolloin muunnokset ovat syntyneet mutanttiin vietyjen geenien vaikutuksesta, ja sokeriosat ovat peräisin isäntäkannasta.

10 Keksinnön tausta

Antrasykliinit, joita pääasiassa Streptomyces-lajit tuottavat sekundaarisina metaboliittei-na, ovat arvokkaita kasvainten vastaisina aineina. Yleisesti ottaen antrasykliinimolekyyli sisältää aglykonirungon ja siihen liittyneenä yhden tai useamman sokeriosan. Aklasino-15 mysiinit ovat ryhmä antrasykliinejä, joiden yhteisenä aglykoniosana on aklavinoni, ja niillä on sokeritähde, kuten rodosamiini (aklasinomysiini T), johon voi peräkkäin olla liittyneenä 2-deoksifukoosi (aklasinomysiini S) ja kolmas sokeri, alun perin rodinoosi. Kolmannen sokeritähteen muunnokset ovat tavallisia. Ensimmäisen aklasinomysiinikom-pleksin, joka koostuu aklasinomysiini A:sta (AcmA), B:stä (AcmB) ja Y:stä (AcmY) ·.’·· 20 eristivät ensimmäisinä S. galilaeuksesta Oki et ai (1975). Myöhemmin aklasinomysiini ’··*·' A, aklarubisiini, kävi läpi kliiniset kokeet syövän kemoterapiakäyttöön. Tutkimusta

• M

'···’ pieniä muunnoksia sisältävien aklasinomysiinien tuottamiseksi on tehty uusien ehdokkai- • * · · den löytämiseksi lääkeaineiden kehittelyä varten. Näiden tutkimusten kuluessa on löy-detty mutatoitujen S. galilaeus -kantojen tuottamia yhdisteitä, joissa on muunnoksia • » · • · » * 25 sokeriosassa (Matsuzawa et ai., 1981).

• ♦ · • * · • · ·

Aklasinomysiinien (Acm), jotka sisältävät aklavinonin ja aminosokerin, rodosamiinin * · · • ^ (Rhn) yleinen kaava on seuraava: · * • · . . 30 ; 9 COOCHj "·" ] 3 OH 14 OH O OH O <p N(CH3)2

R

2 105554 jossa R on H tai sokeritähde, joka on mono- tai disokeriosa.

Antrasykliini R

AcmA dF-CinA

5 AcmB dF-CinB

AcmY dF-Acu

AcmN dF-Rho

AcmM dF-Ami

AcmS dF

10 AcmT (Aklaviini) H

dF on 2-deoksifukoosi, Cin on sineruloosi, Acu on akuloosi, Rho on rodinoosi ja Ami on amisetoosi.

15 Lisäksi aklavinoniglykosideja, joissa ei ole aminosokeritähteitä, on tuotettu mutagenoin-tikäsittelyllä saaduissa S. galilaeus -kannoissa (Matsuzawa et ai., 1981 ja Ylihonko et ai., 1994).

• I I

• · «

Aklasinomysiini A, jota kutsutaan aklarubisiiniksi, on aklasinomysiiniryhmän ainutlaa- 4 4 4 20 tuinen jäsen, jota käytetään syövän kemoterapiässä. Sitä käytetään pääasiassa leukemian hoitoon. Doksorubisiini, daunomysiiniryhmää edustava antrasykliini, on laajimmin » » \V käytetty sytostaattinen antibiootti, joka on aktiivinen useita erilaisia tuumoreita vastaan.

• «· • · ♦

Valitettavasti ikävät sivuvaikutukset, kuten kumulatiivinen kardiotoksisuus saa aikaan dokrorubisiinihoidon keskeyttämisen huolimatta sen tehokkuudesta. Aklarubisiinihoidos- • · · ;*/ 25 sa kardiotoksisuus ei sen sijaan ole yleinen sivuvaikutus. Puuttuva aktiivisuus kiinteitä • · · • ♦ « \ kasvaimia vastaan rajoittaa kuitenkin sen käytön pääasiassa leukemian ja lymfoomien • · · § · ' · hoitoon. Tästä syystä paras mahdollinen antrasykliini syövän hoitoon olisi sellainen, jonka kliininen käyttökelpoisuus on samanlainen kuin doksorubisiinilla, kun taas sivu- • · vaikutukset saisivat mieluummin olla sellaiset kuin aklarubisiinilla, sen vaikutustavan 30 mukaisesti. Syövän kemoterapian tämänhetkinen tila on sellainen, että uusien molekyylien tarve uusien sytostaattisten lääkkeiden kehittämiseksi on edelleen olemassa.

3 105554

Matsuzawa et ai. (1981) kuvaavat aklavinoni-rodosamiini-2-deoksifukoosi-2-deoksi-fukoosin tuoton. Tämä aklasinomysiini on eristetty S. galilaeus -mutanttikannoista 7U-491 ja 7N-1881, jotka ovat peräisin S. galilaeus -kannasta ATCC 31133. Kannat 7U-491 ja 7N-1881 tuottivat myös aklavinoni-Rhn-dF:ää ja lisäksi akiavinoni-dF-dF:ää 5 (MA144 U9) on saatu 7N-1881:n viljelmästä.

Keksinnön yhteenveto

Mutatoimme Streptomyces galilaeus -villityyppikannan (ATCC 31615), jotta mutantti 10 saataisiin tuottamaan muunneltua antrasykliiniä. Saadulle S. galilaeus -mutantille annettiin nimi H075, ja se talletettiin Budapestin sopimuksen mukaisesti 30.6.1997 talletus-laitokseen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg lb, Braunschweig, Saksa, talletusnumerolla DSM 11638. S. galilaeus H075 itse tuottaa aklavinoni-rodosamiini-2-deoksifukoosi-2-deoksifukoosia (H075-la) pääasiallisena 15 tuotteena, ja pienempiä määriä aklavinoni-dF-dF-dF-antrasykliiniä (H075-14), minkä vuoksi se eroaa Matsuzawan et ai. (1981) tuottajakannoista, koska se tuottaa myös uutta yhdistettä, aklavinoni-deoksifukoosi-deoksifukoosi-deoksifukoosia. Tätä mutanttikantaa käytettiin isäntäkantana nogalamysiinin (sno) ja rodomysiinin (rdm) uusien biosyn- • « « '· ’· teesigeenien ilmentämiseksi ja siten uusien hybridiantrasykliinien tuottamiseksi. S.

* · · 20 nogalaterista peräisin olevat jflol-3-geenit saavat aikaan C-9:n etyyliryhmän korvautu- **. misen aklavinonin metyyliryhmällä. S. purpurascensista peräisin olevat rdmB ja -E- • « geenit vastaavat asemien 10 ja vastaavasti 11 hydroksyloitumisesta, ja rrfmC-geenituote dekarboksyloi aglykoniosan aseman 10. Tämä johtaa syövän kemoterapiassa käyttökel- • « · potsiin uusiin yhdisteisiin.

·♦· 25 • · · Tämän keksinnön erityisenä kohteena on siten menetelmä uusien hybridiantrasykliinien * . tuottamiseksi transformoimalla nogalamysiinin (sno) ja/tai rodomysiinin (rdm) biosyn- • · teesigeenit S. galilaeus -kantoihin, edullisesti H075-mutanttiin.

• * 30 Tähän keksintöön sisältyvät yhdisteet, jotka tuotetaan ilmentämällä mainitut geenit S. galilaeus H075:ssä, jotta voidaan muuttaa aklavinonin asemissa 9, 10 ja 11 olevat substituentit.

4 105554

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus S. galilaeus -mutantti H075 (DSM 11638), jota käytetään isäntänä tämän keksinnön mukaisten uusien antrasykliinien tuottamiseksi, on aklavinoniglykosidien ylituottaja.

5 Näiden yhdisteiden yleinen kaava II on O R3 R2

OH O OH O

10 R< R,:

(a) I (b) (c) I

,5 ch,-T^J en, \ N(CH3)2 [ N(CH3)2 [ N(CH3)2

o o OH

^ n,'1^

Γ OH I OH

20 O OH

CHf . — I ..

ΙΛ «o (c) 1

oCOH J J

25 Γ 0H \ OH

ri c"f^ W

9 OH

ä

\ OH OH

jossa kaavassa R, on CH2CH3 tai CH3, R2 = COOCH3, H tai OH ja R3 = OH tai H.

5 105554

Taulukko 1. Kaavan II mukaiset uudet yhdisteet

Aglykoni Substituentit Glykosidi (RJ

H075-2 R-! = CH2CH3 R2 = OH R3 = H a,b,c,d,e 5 H075-3 R, = CH3 R2 = COOCH3 R3 = H a,d,e H075-4 Rt = CH2CH3 R2 = COOCH3 R3 = OH a,b,c,d,e H075-5 R, = CH3 R2 = COOCH3 R3 = OH a,b,c,d,e H075-6 Rl = CH3 R2 = OH R3 = H a,b,c,d,e H075-7 R, = CH3 R2 = H R3 = H a,b,c,d,e 10 H075-8 R, = CH2CH3 R2 = H R3 = H a,b,c,d,e H075-9 Ri = CH2CH3 R2 = H R3 = OH a,b,c,d,e H075-10 R, = CH2CH3 R2 = OH R3 = OH a,d,e H075-11 Rj = CH3 R2 = OH R3 = OH a,b,c,d,e H075-12 R, = CH3 R2 = H R3 = OH a,b,c,d,e 15

Seuraavassa kuvauksessa yhdisteet on nimetty yllä esitetyn kaavan II mukaisesti siten, että yllä lueteltuihin R-ryhmiin perustuville aglykoneille on annettu numero, ja toisaalta pienet kirjaimet viittaavat kaavan II mukaisiin sokeriosiin, a = Rhn-dF-dF; b = Rhn-20 dF; c = Rhn; d = dF-dF-dF; e = dF-dF. (Rhn = rodosamiini, dF = deoksifukoosi).

, S. galilaeus H075:tä isäntänä käyttäen saadut transformoidut kannat tuottavat yhteensä 5 I 14 (sokeriosa) x 11 (aglykonimuunnokset) erilaista antrasykliiniä.

« « « · » • · ♦ 25 Keksintö koskee erityisesti uusia yhdisteitä H075-2a,b,c,d,e, H075-3a,d,e, H075-4a,b,c,d,e, H075-5a,b,c,d,e, H075-6a,b,c,d,e, H075-7a,b,c,d,e, H075-8a,b,c,d,e, • · H075-9a,b,c,d,e, H075-10a,d,e, H075-lla,b,c,d,e, H075-12a,b,c,d,e, kuten yllä taulu- m kossa 1 on esitetty, ja aivan erityisesti uusia yhdisteitä H075-2a, -2b ja -2d; H075-3d; :T: H075-4a; H075-5e; H075-6b ja -6c; H075-8a; H075-10aja H075-llb ja -lie, niin kuin :T: 30 vaatimuksessa 1 on määritelty.

·:··· Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden kanssa samankaltaiset, ennestään tunnetut .·' ; yhdisteet - kaavan II mukaisesti nimettyinä - ovat: H075-la (MA144 UI, Matsuzawa et ai, 1981), • · 35 H075-lb (AcmS, Oki et ai, 1977), H075-lc (Aklaviini, AcmT, Streliz et ai., 1956), 6 105554 H075-le (MA144 U9, Matsuzawa et al., 1981), H075-3b (Auramysiini C, Hoshino et al., 1982), H075-3c (Auramysiini D, Hoshino et al., 1982), H075-10b (Betaklamysiini S, Yoshimoto et al., 1984) ja 5 H075- 10c (Betaklamysiini T, Yoshimoto et al., 1984).

Tämä keksintö tekee mahdolliseksi kaavan II mukaisten yhdisteiden kehittämisen lääkkeiksi. Keksinnön mukaisesti tässä tutkimuksessa käytetyt yhdisteet ovat aktiivisia MES-SA-solulinjaa vastaan verrattuna daunomysiiniin ja aklarubisiiniin. In vivo -aktiivisuus, 10 kun käytettiin P388-leukemiasoluja hiirissä, oli samoin verrannollinen daunomysiinin aktiivisuuteen. Sytostaattisen aktiivisuuden tutkimiseen in vitro käytettyjen kasvainsolu-jen perusteella voidaan odottaa aklasinomysiineihin tai daunomysiineihin verrattavissa olevia ominaisuuksia, riippuen aglykoniosan substituenteista. Tulokset ovat rohkaisevia uusien syövän hoitoon soveltuvien farmaseuttisten aineiden löytymiseksi.

15

Transformoiduilla kannoilla tuotetut yhdisteet ovat kemiallisen rakenteensa vuoksi hyd-rofiilisempia kuin aklarubisiini. Tästä syystä ne muistuttavat fysikaalis-kemial 1 isiIta ominaisuuksiltaan enemmän doksorubisiinia kuin aklarubisiinia. Doksorubisiini vaikuttaa I · · '· '! kasvainsoluihin erilaisella mekanismilla kuin aklarubisiini. Sen on ehdotettu olevan

J « I

20 topoisomeraasi II:n inhibiittori, koska se stabiloi lääke-DNA-entsyymikompleksia DNA- , r | juosteiden kaksoiskierteeksi yhdistymisen estämiseksi. Tämä johtaa solusyklin katkeami- • · . . seen G2-vaiheessa. Aklarubisiinin oletetaan inhiboivan topoisomeraasien vuorovaikutusta • « · • · · DNA:n kanssa, vaikkakaan mekanismia ei tunneta hyvin, ja yhdisteiden on havaittu • · · • · · aiheuttavan solusyklin katkeamisen Gl-vaiheessa. Tämän keksinnön mukaisten hybridi-25 antrasykliinien havaittiin katkaisevan solusyklin Gl-vaiheessa, joka on kromosomien • · replikaatiotapahtuman käynnistymisvaihe, minkä vuoksi sillä on samanlainen vaikutusta- • · · * , pa kuin aklarubisiinilla.

• · • · • Tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voitaisiin tuottaa missä tahansa mikrobisolussa, • · · ’· 30 joka kykenee ilmentämään antrasykliinigeenejä. Streptomyces-fo}\\. ovat edullisia keksin nön tarkoituksiin, ja erityinen suoritusmuoto käsittää geeniteknisesti muokatun S. galila-eus H075:n (DSM 11638) käytön, joka kanta on saatu mutatoimalla villityyppinen S. galilaeus ATCC 31615 NTG:llä (N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiini).

7 105554

Streptomycesissä aklavinonin biosynteesi etenee polyketidireittiä pitkin. Polyketidisyn-taasi (PKS) vastaa polyketidirungon muodostumisesta. Kolme spesifistä geenituotetta, jotka muodostavat minimaalisen PKS:n, kontrolloivat aloitusyksikön, samoin kuin poly-ketidiketjun kokoamisessa käytettyjen pidennysyksiköiden (asetaatti) hyväksymistä.

5 Aglykonibiosynteesin aloitusyksikkö määrää 9-aseman substituentin yllä esitetyssä rakenteessa. Ennestään tiedetään, että propionaattia käytetään aloitusyksikkönä akla-vinonibiosynteesissä, kun R, on etyyliryhmä. Tämä ryhmä voitaisiin muuttaa metyyli-ryhmäksi ilmentämällä minimaalisen PKS:n nogalamysiinigeenit H075:ssä, koska ase-taattia käytetään nogalamysiinin biosynteesireitin aloituksessa (Ylihonko et ai., 1996).

10 Nogalamysiinin minimaalisen PKS:n {sno\-2>) geenit voidaan eristää plasmidista pSY15 (DSM 9436), joka on katkaistu SacI-Sg/IMla, 5,4 kb:n pituisena DNA-jaksona, jolloin saadaan pSY21. Fragmentti kloonataan monikopioplasmidivektoriin, joka replikoituu Streptomyces-laj issa.

15 Aklavinonin 10-asemassa oleva substituentti (ryhmä R2) on karbometoksiryhmä. Tämä ryhmä poistetaan esteraasiaktiivisuudella, edullisesti RdmC:n avulla yhdisteiden H075-7, H075-8, H075-9 ja H075-12 (R2 = H) valmistamiseksi. RdmC saadaan monistamalla rcf/nC-geeniä PCR-tekniikalla (polymeraasiketjureaktio) käyttäen templaattina pJN028:a, * « '· ja viemällä monistettu fragmentti pIJ486:een, jolloin saadaan pRdm52. R2 muutetaan * « « 20 hydroksyyliryhmäksi RdmC:n ja RdmBtn yhteisvaikutuksella, jolloin rdmC:n geenituote • « « vastaa karbometoksiryhmän poistamisesta, kun taas rdmB koodaa hydroksylaasia, ja saa • · . aikaan sen että R2:sta tulee hydroksyyliryhmä. rdmC ja rdmB kloonataan yhdessä, · · jolloin ne saavat aikaan karbometoksiryhmän konversion hydroksyyliryhmäksi.

* · · 9 25 1 l-hydroksyyliryhmä (R3) voidaan lisätä rcfmE-geenituotteen, hydroksylaasin vaikutuk- * t I 9 sella. Geeni rdmE saadaan pJN018:sta ja kloonataan pIJE486:een, jolloin saadaan . pRdm51. Sopivasti fuusioidut geenit kloonattuna ekspressiovektoriin, pIJE486:een,

• I

..... saavat aikaan muunnokset, jotka perustuvat geenituotteiden erillisiin aktiivisuuksiin t · mutanttikannalle H075 ominaisten, tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden johdannais- * · · ’ ; 30 ten tuottamiseksi. Ekspressiorakenteet tehtiin edullisesti S. lividans TK24:ssä, jotta

• I

voitiin tuottaa suuria määriä rekombinanttiplasmideja liitettäväksi S. galilaeus H039:ään, jolla on suurempi transformaatiofrekvenssi kuin muilla käytetyillä S. galilaeus -kannoilla. Plasmidit, joissa oli mainittujen geenien yhdistelmiä, eristetään edelleen H039:stä 8 105554 liitettäväksi S. galilaeus H075:een, yllä esitetyn yleisen kaavan II mukaisten yhdisteiden tuottamiseksi. Asiaankuuluvat plasmidit ja geenit on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2. Geenit, jotka tarvitaan aklavinonin, H075:n tuotteiden aglykoniosan, 5 muuntamiseksi, sno-geenit eristettiin S. nogalaterista (WO 96/10581) ja rdm-geenit S. purpurascensista (WO 92/16629). Yhdisteiden nimet vastaavat yllä esitetyssä kaavassa II ja taulukossa 1 osoitettuja.

10 Yhdiste (Taulukko 1) Plasmidi Geenit

H075-2 pJN028 rdmBC

H075-3 pSY21 sno 1,2,3

H075-4 pRdm51 rdmE

H075-5 pSYRl sno 1,2,3, rdmE

15 H075-6 pSYR3 sno\,2,Z, rdmBC

H075-7 pSYR2 snol,2,3, rdmC

H075-8 pRdm52 rdmC

H075-9 pRdm53 rdmC, E

H075-10 pRdm54 rdmB,C,E

20 H075-11 pSYR4 sno\,2,2, rdmBCE

H075-12 pSYR5 sno\,2,3, rdmC,E

Yleisen kaavan (II) mukaiset antrasykliinit tuotetaan fermentoimalla H075-klooneja, so.

.·, ; kantoja, joissa on taulukossa 2 luetellut plasmidit. Kannat nimettiin seuraavasti: H075- • «· 25 pJN028, H075-pSY21, H075-pSYRl, H075-pSYR2, H075-pSYR3, H075-pSYR4, H075-pSYR5, H075-pRdm51, H075-pRdm52, H075-pRdm53 ja H075-pRdm54. Tuote- • · · *:··· tut antrasykliinit eristetään uuttamalla orgaanisilla liuottimilla, käyttäen edullisesti di- kloorimetaani.-metanoliliuosta. Mielenkiinnon kohteena oleva antrasykliini erotetaan • · :T: seoksesta pylväskromatografialla kahdessa vaiheessa. Puhdistettujen yhdisteiden syto- 30 staattinen aktiivisuus tutkitaan in vitro käyttäen kasvainsoluja, ja leukemiamallissa in • % V ·’ vivo.

• · * • · · • · · *:··; Seuraavassa kuvataan keksinnön yksityiskohtaiset suoritustavat esittämällä esimerkkeinä "··: (i) S. galilaeus -villityypin (ATCC 31615) mutagenointi, (ii) plasmidien rakentaminen * 35 muunnoksien aikaansaamiseksi aglykonissa, (Hi) plasmidien liittäminen S. galilaeus :·· H075:een H075-kloonien valmistamiseksi, (iv) H075-kloonien tuottamien yhdisteiden eristäminen ja mainittujen, kloonattujen geenien aikaansaamia muunnoksia edustavien 9 105554 yhdisteiden puhdistus- ja identifiointimenetelmien suoritus ja (v) sytotoksisen aktiivisuuden mittaus.

Piirustusten lyhyt kuvaus 5

Kuva 1 Yhdisteen H075-4a ‘H-NMR-spektri.

Kuva 2 Yhdisteen H075-4a I3C-NMR-spektri.

10 Kuva 3 Yhdisteen H075-4a aktiivisuus MES-SA-solulinjaa vastaan. KOKEELLINEN OSA

Käytetyt materiaalit 15

Bakteerikannat:

Streptomyces galilaeus ATCC 31615 tuottaa aklasinomysiinejä. Kantaa käytettiin tässä villityyppinä NTG-mutageneesiä varten.

• f • · · • « * • · « 20 Streptomyces galilaeus H039 (WO 96/10581) tuottaa aklavinoniglykosideja. Sitä käyte-tään tässä välikantana, koska sillä on suurempi transformaatiofrekvenssi kuin H075:llä.

• · · t · « · • · · • · ·

Streptomyces lividans TK24 (WO 96/10581) ei tuota antrasykliinejä. Se on restrik- *·* * tiomuunnoksista vapaa kanta, jota käytetään kloonauksessa ensisijaisena isäntänä.

25 • ·

Plasmidit: • * · <t‘ . Promoottori ermE (Bibb et ai., 1985), joka tekee mahdolliseksi alavirtaan kloonattujen • · ..... geenien konstitutiivisen ilmentymisen, insertoitiin pIJ486:n ja pIJ487:n monikloonaus- * i .· e kohtaan (MCS, multiple cloning site) (Ward et ai., 1986; plasmidit saatiin Prof. Hop- • · # * «· ’ * 30 woodilta, John Innes Centre, Iso-Britannia), jotka vektorit ovat yleisesti käytettyjä • t Är^pto/nyces-kloonausvektoreita, jolloin saatiin plasmidit pIJE486 ja pIJE487.

10 105554

Plasmidi pSY15 sisältyy S. lividans -kantaan DSM 9436, joka plasmidi sisältää nogala-mysiinin kromoforin S. nogalaterista peräisin olevat geenit vektorissa pIJ486. Yksityiskohtainen kuvaus pSY15:stä on annettu WO-julkaisussa nro 96/10581.

5 pSY21 saatiin alakloonaamalla 3,5 kb Sacl-BglU DNA-fragmentti pSY15:stä pIJ486:een (Ylihonko et ai., 1996).

EB3 on plasmidi, joka sisältää Rdm6:n (WO 92/16629) 6 kb £coRI-5awHI-fragmentin liitettynä pIJ486:een. Insertti sisältää 11-hydroksylaasin, 10-demetylaasin, 10-hydroksy-10 laasin ja aminometylaasin {rdmD) geenit ja syklaasin (rdmA) epätäydellisen geenin. Kaksi viimemainittua geeniä, rdmD ja rdmA eivät osallistu aklavinonin muunnoksiin.

pJN028 on ekspressiorakenne geenejä rdmB,C,D varten. 2,8 kb 5/yI-fragmentti kloonattiin pIJE487:ään (Niemi ja Mäntsälä, 1995).

15 pJN018 on plasmidi, joka sisältää EB3:n 2,7 kb P/?wMI-Bö/nHI-fragmentin kloonattuna pIJ487:ään. Ligatoinnissa käytettiin tasaisia päitä. Insertti sisältää täydellisen 11-hyd-roksylaasigeenin (Niemi ja Mäntsälä, 1995).

I I · ;;; 20 Ravintoalustat ja-liuokset • · « • ψ NTG (N-metyyli-N’-nitro-N-nitrosoguanidiini) (SIGMA) « · · • · • ·· • · · · ·

Tiostreptoni (SIGMA) varastoliuos 50 j*g/ml DMSO:ta 25 • · · w • ’f’. TSB (Tryptoni-soijaliemi) «

Litraa kohti: Oxoidin Tryptone-Soya Broth -jauhetta 30 g.

• * • * ISP4 Bacto-ISP-alusta 4, Difco; 37 g/1.

30 • ·

El Litraa kohti: Glukoosia 20 g, tärkkelystä 20 g, Farmamedia 5 g, hiivauutetta 2,5 g, Κ2ΗΡ04·3Η20 1,3 g, MgS04«7H20 1 g, NaCl 3 g, CaC03 3 g. Vesijohtovettä lisätään 1 litran tilavuuteen ja pH säädetään 7,4:ään.

11 105554

Esimerkki 1. S. galilaeus ATCC 31615:n mutagenointi ja mutanttikannan karakterisointi

Mutagenointia varten S. galilaeus -kantaa ATCC 31615 viljeltiin 50 ml:ssa TSB-alustaa 5 250 ml:n Erlenmeyer-kolvissa. Kaikissa mutagenointi in käytetyissä kolveissa oli pohjas sa jousi rihmaston hajottamiseksi viljelyn aikana. Kannan viljelyä jatkettiin kaksi päivää 30 °C:ssa ravistelijassa nopeudella 330 rpm. 1 ml viljelmää ympättiin edelleen seuraa-vaan pulloon, joka sisälsi 50 ml TSB:tä ja viljelyä jatkettiin yhden päivän ajan (30 °C, 330 rpm). Tämän nuoremman viljelmän pH säädettiin arvoon 8,5 2%:isella NaOH:lla, 10 ja 800 //g/ml NTG:tä lisättiin ja annettiin vaikuttaa soluihin 20 minuuttia 37°C:ssa. Kannan mutagenoitu viljelmä jaettiin kahteen putkeen ja sentrifugoitiin, 300 rpm, 10 minuuttia. Yhdistettyjä pellettejä käytettiin ympättäessä 50 ml TSB-alustaa. Kun oli viljelty yhden päivän ajan 30 °C:ssa, 330 rpm, koko viljelmä sentrifugoitiin ja suspen-doitiin TSB-alustaan. Solususpension tiitteri määritettiin maljaamalla sopivia laimennok-15 siä, esimerkiksi 1:10 ISP4-maljoille. Mutagenoitujen viljelmien pesäkkeitä verrattiin villityypin pesäkkeisiin ja sellaiset, joissa oli villityypistä eroavia piirteitä, valittiin jatkokarakterisointiin.

• m • · · *· 'ί Yksi mutanteista nimettiin H075:ksi. Se oli erilainen kuin villityyppinen S. galilaeus * · · '··’1 20 ATCC 31615, koska se kasvoi syvän keltaisena agar-maljalla. Mitään muita villityypistä • « eroavia piirteitä ei havaittu.

• * · 1 • 1 · Γ.! Valittuja mutantteja viljeltiin 60 mlrssa El-alustaa neljän päivän ajan (28 °C, 330 rpm).

• · · 250 μ\ 1 M fosfaattipuskuria lisättiin 250 //Iraan El-viljelmää ja pelletti erotettiin super- .·;· 25 natantista sentrifugoimalla. Pelletti uutettiin 500 //1:11a tolueeni-metanolia (1:1) raviste- • · · lemalla 1 h ajan huoneenlämmössä. Orgaaninen faasi erotettiin vedestä lisäämällä 250 μ\ • · . fosfaattipuskuria ja sentrifugoimalla. 10 μ\ näyte orgaanisesta faasista aplikoitiin TLC- »•IM i · levylle (ohutlevykromatografia)(Kieselgel 60, Merck) ja ajettiin tolueeni-etyyliasetaatti- - t· metanoli-muurahaishapolla (50:50:15:3). Mainitun mutanttikannan viljelmästä saatu pää- '· 30 yhdiste antoi Rf-arvon 0,016, kun taas villityypin pääyhdisteet antoivat Rf-arvot 0,11, 0,13 ja 0,23, osoittaen sen, että ne olivat aklasinomysiini A, Y, ja vastaavasti B. Akla-vinoniglykosidien kokonaismäärä verrattuna hydrolysoiduista fraktioista saadun aklavino-nin määrään oli ainakin viisi kertaa niin suuri kuin villityypin tuottama.

12 105554

Esimerkki 2. Plasmidien rakentaminen aklavinonimuunnosten aikaansaamiseksi, ja plasmidien transformointi H075:een 2.1. Yleiset menetelmät 5

Aklavinonin, so. H075-tuotteiden aglykonin, muunnoksista vastaavat plasmidit on lueteltu taulukossa 2. Geenien lähteinä käytetyt plasmidit on kuvattu yllä kappaleessa Käytetyt materiaalit. Plasmidit eristettiin asiaankuuluvista S. lividans TK24 -kannoista, ja geenifuusiot suoritettiin käyttäen sopivia restriktiokohtia. Pilkonnat suoritettiin käyttäen 10 MBI Fermentasin restriktioentsyymejä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tasaisten päiden yhdistämistä varten insertti ja sopivalla restriktioentsyymillä pilkottu vektori käsiteltiin Klenow-polymeraasilla (Promega Corp. Madison, WI) nukleotidien läsnäollessa, ko-hesiivisten päiden täyttämiseksi käyttäen valmistajan suosittelemia olosuhteita. Vektorit käsiteltiin CIAPillä (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, vasikan suolen alkalinen 15 fosfataasi, Promega) fosfaattien poistamiseksi 5'-päästä vektorimolekyyiin sisäisen sulkeutumisen estämiseksi. Ligaatiot suoritettiin T4 DNA-ligaasilla (Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

^ f « '· '1 2.2 Plasmidikonstruktiot • · · 20 « i « : ; pRdmSl: Aklavinonin hydroksylaatiosta vastaava geeni asemassa 11 (rdmE) oli peräisin IIM| • « , , pJN018:sta. Plasmidi pJN018 katkaistiin öamHI-restriktioentsyymillä ja yhdistettiin *· * * pIJE486:n öamHI-kohtaan. ermE:n promoottorin kanssa samansuuntainen orientaatio *** · tarkistettiin käyttäen Xhohä, jolloin saatiin 2,2 kb:n ja 7 kb:n fragmentit.

··· 25 • · » • · « pRdm52 tehtiin monistamalla EB3:sta saatu 900 bp:n DNA-fragmentti PCR-tekniikalla.

. Monistettujen alueiden viereiset nukleotidisekvenssit olivat seuraavat: 5’-ACATGTCC- * G A ACGC ATCGTGCCG-3 ’ and 5’-AGCAGCGGGCGGGAGAGACGATG-3’. Mo- MK » f · ,· t nistetun alueen päihin lisättiin BaniHl- ja X6oI-restriktiokohdat ja fragmentti kloonattiin

• « I

1 · · ' l 30 pIJE487:ään määritetyssä orientaatiossa.

I I I I · * « - 13 105554 pRdm53: pJN018 pilkottiin fiamHFIlä ja 2,8 kb fragmentin päät tasattiin. Fragmentti kloonattiin tasapäiseksi tehtyyn pRdm52:een (///«dlll-kohtaan, joka oli käsitelty Klenow-entsyymillä).

5 pRdm54: EB3:sta erotettiin 6 kb DNA-fragmentti katkaisemalla Bg/IF.lla ja fragmentti kloonattiin pIJE486:n Bö/nHI-kohtaan. M/wI-kohtaa käytettiin geenien orientaation määrittämiseksi niiden ilmentämiseksi e/vnE-promoottorin alaisena.

pSYRl: Aklavinonin 9-ja 11-asemien muunnoksista vastaava plasmidi konstruoitiin 10 alakloonaamalla pJN018:sta pSY21:een DNA-fragmentti, jossa oli 11-hydroksylaasin geeni. pJN018 katkaistiin fcoREllä ja //mdIII:lla ja 5'-päät tasoitettiin Klenow-polyme-raasilla. 2,9 kb fragmentti yhdistettiin pSY21:n tasaiseksi tehtyyn Y&öl-kohtaan. Kloonatun fragmentin orientaatio ei ollut kriittinen, koska rdmE:n ilmentymistä ohjasi sen oma promoottori.

15 pSYR2: 1,2 kb DNA-fragmentti katkaistiin plasmidista pRdm52 EcoRI-Z/rndlil-entsyy-rneillä. Fragmentti kloonattiin pSY21:een tasapäisenä.

,·. : pSYR3: 3 kb £coRI-/7/«dIII-fragmentti kloonattiin pSY21:een tasapääligaatiolla.

20 • « φ ( ( i pSYR4: pRdm54 katkaistiin S^/II:lla ja erwE-promoottorin sisältävä 6,4 kb fragmentti · · ligoitiin pSY21:een, joka oli katkaistu Xbahllä ja tehtiin tasapäiseksi Klenow-polyme-: raasilla.

• 9 • 99 9 9 9 •99 9 25 pSYR5: 3 kb fragmentti pRdm53:sta kloonattiin pSY21:n tasapäiseksi tehtyyn Xba\- 9 9 9 V · kohtaan.

• · · t · I • · · 9 "**: 2.3 Transformointimenetelmät t • · 30 Ligaatioseokset vietiin S. lividans TK24:ään protoplastitransformaatiolla ja plasmidi • 9 :··: tarkistettiin ’miniprep'-menetelmällä (Hopwood et ai., 1985). Joissakin plasmideissa tarkistettiin sopivia restriktiokohtia käyttäen, että orientaatio oli alavirtaan m?tE-pro-moottorista.

M 105554

Oikeat plasmidikonstruktiot eristettiin TK24:stä ja vietiin S. galilaeus -kantaan H039. S. galilaeus -kantojen protoplastitransfomaatiossa käytetty tekniikka on kuvattu WO-jul-kaisussa n:o 96/10581. H039:ssä monistetut plasmidit vietiin sitten S. galilaeus H075:een, jotta saataisiin aikaan karakterististen antrasykliinien muunnosreaktiot. Saatiin 5 11 transformoitua kantaa, so. nH075-kloonia", ja niille annettiin nimet H075-pJN028, H075-pSY21, H075-pSYRl, H075-pSYR2, H075-pSYR3, H075-pSYR4, H075-pSYR5, H075-pRdm51, H075-pRdm52, H075-pRdm53, H075-pRdm54.

Esimerkki 3. S. galilaeus -klooneihin kerääntyvien yhdisteiden tuottaminen, eris-10 tys ja puhdistus 3.1. Antrasykliinituoton viljelyolosuhteet

Kaksi 250 ml erlenmeyer-kolvia, joissa oli 60 ml El-alustaa täydennettynä tiostreptonilla 15 (10 ^g/ml) ympättiin H075-kloonien maljaviljelmällä. Neljän-viiden päivän kuluttua kolveja käytettiin ympättäessä Biostat-fermentori, jossa oli 13 litraa El-alustaa tiostreptonilla (10 /xg/ml) täydennettynä, ja fermentointia jatkettiin neljä-kuusi päivää (330 rpm, 30 °C, ilmastusnopeus 13 1/min).

« < < 1 < * I I < : 20 3.2 Antrasykliinien eristäminen ja puhdistus • · I · I » · • I • · «

Fermentointiliemen (13 I) pH säädettiin arvoon 7,0 IM fosfaattipuskurilla rihmaston • · ίρϊ#: erottamiseksi liemestä sentrifugoimalla. Rihmasto uutettiin kaksi kertaa metanolilla (2x1 • · « · 1). Metanoliuutteet yhdistettiin supernatanttiin ja seos uutettiin kaksi kertaa dikloorime- 25 taani/metanolilla (3:1) pH:ssa 7,5. Yhdistetyt orgaaniset faasit konsentroitiin tyhjiössä ja • · · V : viskoosi jäännös liuotettiin kloroformi:etikkahappoon (99:1) ja syötettiin piihappo- • · 1 · *·1 1 "flash"-pylvääseen (5 cm). Pylväs eluoitiin metanolin kasvavalla lineaarisella gradientil-

Ia. Puhtaat fraktiot yhdistettiin, neutraloitiin fosfaattipuskurilla, pH 7,0, ja pestiin kaksi « kertaa vedellä. Liuottimet poistettiin kiertohaihduttimessa. Jäännös liuotettiin etyy-30 liasetaattiin ja saostettiin heksaanilla. Pohjaan laskeutunut kiinteä aine kuivattiin tyhjiös-sä.

15 105554 3.3 Uusien yhdisteiden rakenne

Puhtaiden antrasykliinien rakenteet määritettiin NMR-spektreistä kerättyjen tietojen perusteella. NMR-tietojen signaalit on esitetty taulukoissa 3-6. Kuvissa 1 ja 2 on esitetty 5 H075-4a:n lH-NMR-ja 3C-NMR-spektrit. Saatuja signaaleja verrattiin H075:n tuotteen, aklavinoni-Rhn-dF-dF:n signaaleihin, ja uusien yhdisteiden rakenne pääteltiin eroavaisuuksien perusteella.

Antrasykliinien rakenteet pääteltiin taulukoissa 3-6 esitettyjen NMR-tietojen perusteella.

* I * « · • · • · · * · • · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · « • · · 1 * · · · 16 105554

Taulukko 3. Tämän keksinnön mukaisten, aminosokeriosan sisältävien yhdisteiden kemialliset 13C-siirtymät. Spektrit ajettiin DMSO:ssa, CHCI3:ssa tai asetonissa. Sisäisenä referenssinä käytettiin TMS:ää.

Asema H075- H075- H075- H075- H075- H075- H075- H075- H075- _ la _8a__2b__2a__4a__1 Ib 6b__6c__10a 1 120.9 120.0 119.2 120.1 119.5 118.8 119.2 119.6 118.8 2 137.3 137.1 136.7 137.2 136.9 136.4 136.7 136.9 136.6 3 124.7 124.6 124.0 124.7 124.7 124.0 124.0 124.2 124.1 4 162.5 162.4 161.7 162.4 162.5 161.8 161.7 162.1 157.3 4a 115.7 115.8 115.3 115.9 116.0 115.4 115.3 115.1 115.2 5 192.6 192.6 192.0 192.6 190.6 189.8 192.0 192.4 189.6 5a 114.6 Π3.6 113.6 113.6 111.4 111.1 113.6 114.1 110.4 6 162.1 161.9 161.1 161.8 157.0 157.2 161.1 161.4 156.3 6a 133.4 130.9 130.1 136.1 138.9 130.1 133.3 139.3 7 71.0 70.4 70.3 70.8 70.6 69.5 70.3 70.9 69.9 8 34.2 34.3 38.6 35.9 34.3 34.1 38.5 37.2 32.2 9 71.6 70.1 71.3 70.9 71.0 70.0 71.3 71.5 71.4 10 57.1 42.9 73.8 65.4 67.8 73.8 73.9 70.2 10a 142.6 146.0 148.9 149.4 135.5 134.6 148.9 148.3 135 15 171.3 - - - 171.3 - 16 52.5 - - - 52.5 - - - 11 120.1 121.4 119.8 156.9 156.3 119.8 120.9 161.7 11a 132.8 132.4 131.9 111.1 110.5 131.9 132.5 110.9 12 181.3 181.6 180.6 185.9 185.2 180.6 181.0 185.1 12.a 131.4 133.5 133.0 133.3 132.8 133.0 130.1 132.6 13 32.1 35.1 22.7 33.5 25.3 22.7 23.6 28.8 14 6.7 7.4 - 6.7 6.10 'I;;' Γ 99.3 101.1 99.9 100.6 101.7 100.6 99.9 100.2 100.8 T 29.2 29.2 28.6 29.2 28.6 28.6 28.1 29.8 3' 61.4 61.5 60.9 61.6 60.9 60.9 59.4 61.0 Υ- 43.2 43.2 42.7 43.0 43.2 42.5 42.7 41.6 42.8 :.V: NMe2 4' 74.0 74.1 73.3 74.2 73.4 73.3 65.7 73.4 ’·’ * 5' 67.2 68.2 67.6 68.5 67.8 67.6 66.1 64.8 6' 16.8 17.9 16.5 17.6 17.8 17.2 17.4 16.7 17.2 1" 100.8 99.3 98.6 98.8 99.4 98.6 98.6 99.8 2" 33.7 37.4 32.2 33.0 32.2 32.3 31.8 v”: 3" 65.4 65.6 64.9 65.7 64.9 64.9 64.8 4" 83.8 83.8 65.9 83.6 70.6 65.9 81.2 5" 68.3 66.8 70.6 66.9 66.5 70.6 67.7 6" 17.0 17.0 17.4 16.8 17.0 16.2 16.5 16.6 1"' 101.6 100.8 98.5 100.8 98.7 2"' 33.0 33.0 32.4 33.5 I 3"' 66.8 65.4 65.5 64.7 4" 70.6 71.0 71.1 5"' 65.6 67.2 67.3 66.4 6"' 17.8 16.8 16.9 16.7 16.5 17 105554

Taulukko 4. Tämän keksinnön mukaisten aminoglykosidien kemialliset 1 H-siirtymät. Spektrit ajettiin DMSOtssa, CHCl3:ssa tai asetonissa. Sisäisenä referenssinä käytettiin TMS:ää.

Asema H075- H075- H075- H075- H075- H075- H075- H075- H075- __la__8a__2b__2a__4a__1 Ib 6b__6c__10a 1 7.81, 7.75, 7.72, 7.81, 7.67, 7.72, 7.72, 7.73, 7.77, 1H, IH, IH, 1H, 1H, 1H, IH, IH, 1H, dd, dd, 7.5, dd, dd, dd, dd, dd, dd, 7.5, 7.5, 1.6 7.5, 7.5, 7.6, 7.4, 7.5, 7.6, .

1.1 1.1 1.6 1.1 1.0 1.6 1.2 1.7 2 7.68, 7.61, 7.68, 7.83, 7.56, 7.61, 7.68, 7.61, 7.73, IH, IH, IH, IH, IH, IH, IH, IH, IH, dd, dd, dd, dd, dd, dd, dd, dd, dd, 8.4, 8.4, 8.8, 8.0, 8.4, 8.4, 8.1, 8.4, 7.9, 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.6 7.4 7.5 7.6 3 7.29, 7.22, 7.26, 7.35, 7.15, 7.19, 7.26, 7.21, 7.27, IH, IH, IH, IH, IH, IH, IH, IH, IH, dd, dd, dd, dd, dd, dd, dd, dd, dd, 8.4, 8.4, 8.1, 8.0, 8.4, 8.4, 8.1, 8.4, 7.9, 1.1 1.1 1.6 1.6 1.1 1.0 1.6 1.2 1.7 4-OH 12.02, 12.00, 11.95, - 11.90, - 11.95, - IH, IH, s IH, IH, IH, brs brs brs brs 6-OH 12.66, 12.57, 12.60, - 13.32, - 12.60, - IH, IH, s IH. IH, IH, . , brs brs brs brs 7 5.26, 5.16, 5.00, 5.09, 5.14, 5.01, 5.00, 5.02, 5.01, : IH, IH, IH, IH, IH, IH, IH, IH, IH, dd, dd, dd, dd, dd, dd, dd, dd, dd, 4.3, 4.2, 6.0, 4.7, 4.0, 4.2, 6.0, 5.5, 4.1, 1.8 2.2 5.0 3.9 1.9 1.8 5.0 4.0 3.2 . 8A 2.51, 2.28, 2.35, 2.30, 2.13, 2.22, 2.36, 2.32, 2.15, IH, IH, IH, IH, m IH, IH, IH, IH, IH, m :*·*; dd, ddd, dd, dd, dd, dd, dd, 14.8, 14.5, 14.1, 15.1, 14.9, 14.1, 14.5, 5.2 4.2, 6.0 4.1 4.2 6.0 5.5 ;*;*·; 1.6 8B 2.30, 2.16, 2.05, 2.30, 2.26, 1.99, 2.05, 2.03, 2.15, V ; IH, IH, IH. IH, m IH, IH, IH, IH, IH.m brd, 14.5, dd. dd, dd, dd, dd, 14.8 2.2 14.1, 15.1, 14.9, 14.1, 14.5, . ·:··· 5.0 1.9 1.8 5.0 4.0 9-OH 4.57, IH, s 10A IH, 3.03, 4.50, 4.56, 4.56, 4.64, 4.50, 4.44, 4.79, ' * 4.11, s IH, IH, s IH, s IH, s IH, s lH,s IH.s lH,s dd, 18.2, 1.6 JOB - 2.77, IH, d.

18 105554

Taulukko 4. jatkuu 18.2 esteri 3.69, - - - 3.63, - OMe 3H, s 3H, s II 7.67, 7.54, 7.90, 7.88, - - 7.90, 7.90, 1H, s 1H, s 1H, s 1H, s lH.s lH,s 11-OH - 12.73, - 1H, brs 13A 1.74, 1.57, 1.20, 1.76, 1.76, 1.35, 1.20, 1.23, 1.75, 1H, 2H, m 3H, s 1H, m 1H, 3H, s 3H, s 3H, s 1H, m 14.6, dq, 7.4 14.1, 7.3 13B 1.50, - - 1.54, 1.38, - - - 1.75, lH,dq, 1H, m 1H, 1H, m 14.6, dq, 7.4 14.1, 7.3 14 1.09, 0.98, - 1.04, 1.06, - - - 1.09, 3H,t, 3H, t, 3H, t, 3H, t, 3H, t, 7.4 7.5 7.4 7.3 7.4 1' 5.50, 5.43, 5.43, 5.45, 5.44, 5.38, 5.43, 5.41, 5.46, 1H, d, 1H, d. 1H, d, 1H, d, 1H, d, 1H, d, 1H, d, 1H, d, lH,d, 3.2 3.4 2.0 2.9 2.8 2.5 3.1 3.0 2' 2.10 1.75, 1.85, 1.88, 1.88, 1.80, 1.83, 1.73, 1.80, 2H, ja 1H, m 2H, m 2H, m 2H, m 2H, m 2H, m 2H, m 2H, m ; 1.80 ’ cm :/./. 3' 2.09, 2.08, 2.16, 2.13, 2.07, 2.04, 2.16, 2.23, 2.16, 1H, 1H, 1H, m 1H, m 1H, m 1H, 1H, m 1H, m 1H, m dd, dd, ddd, 12.0, 12.0, 12.9, 4.5 4.5 5.4, • · · 10 3'- 2.16, 2.16, 2.19, 2.18, 2.11, 2.08, 2.19, 2.17, 2.19, NMc2 6H, s 6H, s 6H, s 6H, s 6H, s 6H, s 6H, s 6H, s 6H, s 4' 3.72, 3.70, 3.73, 3.81, 3.68, 3.65, 3.73, 3.61, 3.79, :T: 1H, 1H, s 1H, s 1H, s 1H, s 1H, s 1H, s 1H, s IH, s . ·: , brs 5' 3.99, 3.98, 3.98, 4.04, 3.97, 3.95, 3.98, 3.97, 4.01, lH,q, 1H, q. IH.q, 1H, q, 1H, q, IH,q, lH,q, 1H, IH.q, 6.6 6.5 6.6 6.2 6.6 6.7 6.6 dq, 6.6 "··: 6.7, 0.8 :.’·ί 6' 1.27, 1.21, 1.26, 1.27, 1.20, 1.19, 1.26, 1.29, 1.29, 3H,d, 3H,d, 1H, d, 3H, d, 3H, d, 3H, d, 3H, d, 3H, d, 3H, d, 6.6 6.5 6.6 6.2 6.6 6.7 6.6 6.7 6.6 1" 5.01, 4.98, 4.96, 4.99, 4.95, 4.90, 4.97. - 5.01, 1H, d, 1H, d, 1H, d, lH,d, 1H, d, IH.d. lH,d, lH,d, 19 105554

Taulukko 4. jatkuu 3.0 3.7 2.2 2.7 2.6 2.2 2.9 2" 2.05 1.75, 1.85, 1.88, 2,0, 1.80, 1.87, - 1.80, 2H,ja 2H, m 2H, m 2H, m 2H, m 2H, m 2H, m 2H, m 1.76 cm 3" 4.13, 4.06, 3.98, 3.99, 4.03, 3.94, 3.97, - 4.03, 1H, m 1H, m 1H, m 1H, s 1H, m 1H, m 1H, 1H, m ddd, 10.3, 6.8, 3.0 4" 3.55, 3.49, 3.52, 3.60, 3.49, 3.47, 3.52, - 3.58, 1H, 1H, s 1H, s 1H, s 1H, s 1H, s 1H, s 1H, m brs 5" 4.52, 4.42, 4.42, 4.50, 4.45, 4.34, 4.42, - 4.49, 1H, q, 1H, q, 1H, q, 1H, q, 1H, q, lH,q, 1H, q, 1H, 6.4 6.8 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 dq.

6.6, 0.7 6" 1.16, 1.08, 1.15, 1.12, 1.08, 1.08, 1.15, - 1.14, 3H,d, 3H, d, 3H,d, 3H, d, 3H, d, 3H, d, 3H,d, 3H, d, 6.4 6.8 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.6 14.96, 4.89, - 4.91, 4.88, - - - 4.93, 1H, d, 1H, d, IH.d, 1H, d, IH.d, 3.3 3.5 3.2 3.0 2.9 : 2"' 2.02 1.75, - 1.88, 1.90, - - - 1.80, • 2H,ja 2H, m 2H, m 2H, m 2H, m : 1.93 I 4 4 cm 3"' 4.13, 4.08, - 3.99, 4.04, - - - 4.03, 1H, m 1H, m 1H, m IH, 1H, m ddd, '·*·’ 11.6, • •f ’ V ; 4.8, 2.1 4"' 3.68, 3.62, - 3.57, 3.60, - - - 3.61, O : 1H, 1H, d, 1H, s 1H, d, IH, s brs 3.6 2.1 5'" 4.19, 4.12, - 4.20, 4.11, - - - 4.20, lH,q, IH, q, IH, IH, q, IH.

. 6.7 7.2 dq, 6.6 dq, 6.5, 6.6, 1.1 0.8 \'-i 6"' 1.30, 1.23, - 1.19, 1.22, - - - 1.23, 3H,d, 3H,d, 3H, d, IH, d, 3H, d, 6.7 7.2 6.5 6.6 6.6 20 105554

Taulukko 5, Kemialliset 13C-siirtymät niille antrasykliineille, joilta puuttuu amino-sokeriosa. Spektrien ajamiseen käytettiin CHCl3:a. Sisäisenä referenssinä käytettiin TMS:ää.

Asema | H075-3d | H075-lld | H075-lle | 1 120,9 119,2 120,8 2 137,3 136,8 137,2 3 124,7 124,4 124,6 4 162,5 162,3 162,4 4a 115,7 115,8 115,6 5 192,6 190,4 192,5 5a 114,6 111,6 114,5 6 162,0 157,6 162,0 6a 130,8 133,2 131,0 7 70,6 70,4 70,9 8 36,6 34,6 34,1 9 69,7 70,3 70,7 10 57,9 67,0 57,0 10a 142,3 139,3 142,5 11 120,1 156,6 120,0 11a 132,8 111,0 132,8 12 181,1 185,8 181,1 12a 133,4 134,8 133,4 13 27,2 25,6 31,9 14 - - 6,5 15 171,3 - 171,1 16 52,5 - 52,3 1' 101,8 101,6 102,0 2' 34,0 33,8 34,0 3' 65,4 65,0 67,5 .!!!: 4' 82,8 81,8 82,6 ; ‘ 5' 67,8 66,9 65,1 :!0 6' 17,0 16,8 16,9 1" 100,9 100,5 100,9 2" 34,2 32,6 33,7 3" 65,2 65,0 67,8 4" 82,7 70,6 82,6 5'' 67,4 67,3 65,3 ’ 6" 17,7 16,6 16,8 Γ" 100,8 - 100,8 2 "' 32,7 - 32,6 Ύ" 65,1 - 67,3 : 4"' 70,9 - 71,4 5'" 67,4 - 65,0 ""ί 6'" 17,7 - 16,7 21 105554

Taulukko 6. Kemialliset ‘H-siirtymät antrasykliineille, joilta puuttuu aminosokeri-osa. Spektrien ajamiseen käytettiin CHCl3:a. Sisäisenä referenssinä käytettiin TMS:ää.

Asema . I H075-3d 1 H075-lle | H075-5e | H075-2d [ 1 7.70, 1H, 7.83, IH.dd, 7.81.1H,dd, 7.74, 1H, dd, 7.6, 1.1 7.6,1.3 7.5,1.0 dd, 7.5, 1.0 2 7.58, 1H, 7.78, lH.dd, 7.64, IH.dd, 7.62, 1H, dd 8.4,7.6 8.1,7.6 8.4,7.5 dd, 8.3, 7.5 3 7.20, 1H, 7.33, IH.dd, 7.25, lH.dd, 7.23, 1H, dd, 8.4, 1.1 8.1,1.3 8.4,1.0 dd, 8.3, 1.0 4-OH 11.88, 1H, - 12.80, lH,s 11.98, 1H, s s 6-OH 12.60, 1 H, - 13.42, 1H, s 12.56, 1H, s s 7 5.16, 1H, 4.96, IH.dd, 5.15, 1H,4.2, 4.99, 1H, dd, 4.4,3.1 1.6 d,4.0 8A 2.54, 1H, 2.23, IH.dd 2.28, 1H, 2.20, 1H, dd, 15.0, 15.0,4.2 dd, 14.5, 4.4 4.0 8B 2.11, 1H, 1.99, IH, dd, 2.12, 1H, 2.04, IH, dd, 15.0, 15.0, 1.6 d, 14.5 3.1 9-OH 4.40, 1 H, s - 10A 4.02, IH, s 4.60, IH, s 4.20, IH, s 4.47, IH, s

.'·.· 10B

, .·[ esteri 3.64,3H, s - 3.66,3H, s OMe 1! 7.55, IH, s - - 7.88, IH, s : Π-OH - - 12.08, IH, s ;/ 13A 1.31,3H, s 1.35,3H, s 1.35,3H, s 1.50, IH, 13B - - 1.70, IH, • · · • m 14 - 0.96, 3H.

t, 7.5 :·* * 1' 5.42, lH,d, 5.36, IH, d, 5.44, IH, d, 5.38, IH, :T: 3.5 3.6 3.5 d, 3.0 . 2'a 1.71, IH, 1.88, IH, 1.88, IH, 1.94, IH, ”*: ddd, 12.6, ddd, 12.6, ddd, 13.2, m 10.2,3.8 12.3,3.6 12.9,3.5 2'c 1.83, IH, 1.78, IH.dd, 1.98, IH.dd, 1.94, IH, : dd, 12.6, 12.3,5.0 12.9,5.2 m 5.1 3' 3.70, IH, m 3.73, IH, m 3.70, IH, m 4.05, IH, m 4' 3.50, IH, s 3.65, IH, s 3.65, IH, s 3.46, IH, s 5' 4.08, IH,q, 4.14, IH, q, 4.11, lH.q, 4.03, IH, 6-2 6.5 6.3 q, 6.6 6' 1.22,3H,d, 1.22,3H,d, 1.23,3H,d, 1.22, 3H, 22 105554

Taulukko 6. jatkuu 6.2 6.5 6.3 d, 6.6 I" 4.88, lH,d, 4.89, lH,d, 4.90, lH,d, 4.88, 1H, 3.8 3.2 3.4 d, 3.1 2"a 1.90, 1H, m 1.77, 1H, 1.71, 1H, 1.94, 1H, ddd, 12.8, ddd, 12.8, m 12.3,3.3 12.1,3.4 2"e 1.90, 1H, m 1.67, IH.dd, 1.86, 1H, 1.94, IH, 12.3,4.7 12.5,5.0 m 3" 4.07, IH, m 3.93, 1H, m 4.10, 1H, m 4.05, 1H, m 4" 3.54, IH, s 3.48, IH, s 3.52, IH, s 3.51,111, s 5" 4.12, lH,q, 4.19, IH, q, 4.11, IH. q, 4.14, IH, 6.5 6.5 6.6 q, 6.4 6" 1.20,3H,d, 1.12,3H,d, 1.21,3H,d, 1.20, 3H, 6.5 6.5 6.6 d, 6.4 1"' 4.88, lH,d, - - 4.88, IH, 3.0 d, 2.8 2"' 1.88, IH, m -. - 1.94,111, m 3"' 4.07, IH, m - - 4.05, IH, ; m ' / 4'" 3.60, IH, d, - - 3.54, IH, s ;..V' 2.7 ;··*. 5"' 4.03, lH,q, - - 4.04, IH, 6.4 q, 6.5 6"' 1.14,3H,d, - - 1.13, 3H, 6.4 d, 6.5 * · · • · « ·· • · · • · * • M • · · • I « « ··« • * · • « β « • · « « 9 • « * « · * • · t * 9 23 105554

Yksittäiset muutokset molekyylissä nähtiin muutoksina NMR-spektreissä (Taulukot 3, 4, 5 ja 6) seuraavasti:

Muutokset aglykoniosassa: 5 R9: Metyyli asemassa R9 antoi kolmen vedyn singletin kohdassa 1,20 - 1,35 ppm, kun taas etyylisivuketju antoi kytkeytyneen multipletin kohdassa 1,3 - 1,8 ppm ja tripletin kohdassa 1 ppm.

R10: Substituentin R10 poistuminen asemasta R10 nähdään C-15:n ja C-16:n puuttuvina 10 signaaleina hiilispektreissä ja metoksiryhmästä johtuvana puuttuvana singlettinä. Dekar-boksyloidut yhdisteet (H075-7, 8, 9 ja 12) antavat kaksoisdubletin ja CH2-ryhmästä johtuvan dubletin, kun taas hydroksyloidut yhdisteet (H075-2, 6, 10 ja II) antavat 1-vedyn singletin kohdassa 4,5 - 4,8 ppm.

15 Rn: Aseman 11 hydroksylaatio nähdään H-ll:n puuttuvana signaalina.

Muutokset sokeriosassa:

Neutraaliglykosidit tunnistetaan puuttuvasta singletistä 6 H:ssa, joka on peräisin C5 :n N(CH3)2-ryhmästä.

: 20 f I • « . .·. Mono- ja disakkarideja verrattiin trisakkaridistä saatuihin spektreihin ja niillä havaittiin I I | olevan ensimmäisenä sokerina joko rodosamiini tai deoksifukoosi, ja kaikissa tapauksissa ·;·· toisen sokerin havaittiin olevan deoksifukoosi samoin kuin disakkarideissa.

• · • · * · · • · : : ; 25 Yhdisteet H075-8a, 2b, 2a, 3d, 4a, 11b, 5e, 2d, lie, 6b, 6c ja 10a tunnistettiin näillä kriteereillä kaavan II mukaisiksi yhdisteiksi.

• « · • · t • · · ··· • · · • · · • · ' i « * < « I · • 9 24 105554

Esimerkki 4. Sytotoksiset aktiivisuudet in vitro.

4.1 Uusien yhdisteiden IN VITRO -seulonta 5 4.1.1 Soluviljelmät

Uusien antrasykliinien sytotoksisuus testattiin in vitro kahdella solulinjalla: ihmisen kohdun sarkoomasolulinjoilla MES-SA (CRL-1976; American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, USA) ja MES-SA/Dx5 (CRL-1977; ATCC, Rockville, Maryland, USA). MES-SA/Dx5 on kehitetty kasvattamalla MES-SA-soluja doksorubi-10 siinin kasvavissa konsentraatioissa (Harker and Sikic, 1985). Valittu variantti on 100-kertaisesti resistentti doksorubisiinille ja osoittaa myös merkittävää ristiresistenssiä useisiin muihin sytotoksisiin lääkkeisiin nähden (monilääkeresistenssi, multi drug resistance, MDR).

15 Yksikerrosviljelmiä kasvatettiin McCoy'n 5A-alustassa, jossa oli L-glutamiinia (Gibco BRL), täydennettynä 10%:isella FBS:llä (Foetal Bovine Serum, naudan sikiöseerumi,

Gibco BRL). Antibiootteja ei lisätty. Koska resistenssi on stabiili ainakin 20 tuoren- nuksen ajan, MES-SA/Dx5-soIuja kasvatettiin ilman antrasykliiniselektiota (Harker ja

Sikic, 1985). Soluja pidettiin 37 °C:ssa 5 %:ssa C02:a ja siitä tehtiin jatkoviljelmä 3-5 ;'.t: 20 päivän välein.

• « « · · »· · 4.1.2 Sytotoksisuusniääritykset • · · ·:·*: Sytotoksisuustestit suoritettiin 96-kaivoisilla mikrotiitterilevyillä (steriilit valkoiset levyt, • · •*.v joissa kirkas pohja, Corning Costar Corporation, Cambridge, Mass. USA). Antrasyk- «·« V 25 liinit pipetoitiin levyille 10 /xl:ssa etanolia, kontrollimaljoilla käytettiin puhdasta etanolia.

Positiivisina kontrolleina käytettiin daunorubisiinia ja aklarubisiinia. Kun etanoli oli • · · • · · *·* ' haihtunut, solut ympättiin levyille 100 jxl:ssa sopivaa alustaa. Ympättyjen solujen määrä • 9 9 '* * kaivoa kohti oli 2500 MES-SA-soluilla, 3000 MES-SA/Dx5-soluiIla, 3000 LL/2-soluiIla, « "'·* 2000 B16-F0-ja B16-F1 -soluilla, 2000 KLN-205-soluilla ja 8000 MLTC-l-soluilla.

* 30 Solujen ATP-sisältö mitattiin sen jälkeen, kun soluja oli inkuboitu kolme päivää 37 °C:ssa 5 %:ssa C02:a.

25 105554 4.1.3 ATP:n luminesenssimääritys

Kasvualusta poistettiin kääntämällä levyt ylösalaisin, ja kaivoihin lisättiin 200 μ\ ATP:n uuttoreagenssia, Somalyzea. Levyjä inkuboitiin sitten 30 minuuttia huoneenlämmössä. ATP-määritys suoritettiin Luminoskan-luminometrillä (Labsystems Oy, Helsinki, Suomi) 5 22 °C:ssa. Kaivoihin lisättiin 20 μ\ ATP:n mittausreagenssia, joka sisälsi lusiferiinia, ja lusiferaasi jaettiin kaivoihin, ja kutakin kaivoa mitattiin integraalisesti 10 s ajan 2 s viiveellä. Kaikki käytetyt reagenssit toimitti Bio-Orbit Oy, Turku, Suomi.

Suoria luminometrituloksia (suhteellisina valoyksiköinä, relative light units, RLU) 10 käytettiin laskettaessa sytotoksista vaikutusta. Tämä valosignaali on suoraan verrannollinen ATP:n määrään laajalla alueella (määritettynä Bio-Orbitin ATP-standardilla, tietoja ei esitetty). Toisaalta ATP:n määrä on suoraan verrannollinen elävien solujen määrään (Kangas et ai., 1984). Tulokset on esitetty prosentteina käsittelemättömien solujen kontrolliarvosta. ICJ0-arvo (lääkeainekonsentraatio, joka johti ATP-signaaliin, joka oli 15 50 % käsittelemättömän kontrollin signaalista) arvioitiin graafisesti kontrollin %-määräs- tä verrattuna lääkeainekonsentraation arvoon suoralla.

« I * 1 ·

• t I < I

1 · (

<11 I I I

I I I | • • « • · • · ·

1 I

• · M» • · · • 1 ·

Ml • f · • · · • · · • · · * 1 · a • 1 « • a ta aa f 26 105554 4.1.4 Uusien antrasykliinien in vitro -aktiivisuudet

Taulukko 7. Antrasykliinien EDjo-arvot (nM) MES-SA- ja MES-SA/Dx5 kohdun sarkoomasoluissa in vitro (> 10 000 = ED^tä ei saavutettu suurimmalla käytetyllä 5 konsentraatiolla, 10'5M). Kolmea ensimmäistä yhdistettä, aklarubisiini, daunorubisiini ja H075-tuote (Akv-Rhn-dF-dF) käytettiin kontrolleina.

Yhdiste MES-SA MES-SA/Dx5 ED50 (nM) EDjo (nM) 10 Aklarubisiini 2 12

Daunorubisiini 8 220

Akv-Rhn-dF-dF = 6 540 H075-la 15 H075-4a 1 50 H075-10a 30 1 300 H075-1 Ib 60 3 500 H075-8a 130 > 10 000 H075-6b 200 > 10 000 20 H075-2b 400 > 10 000 H075-1 le 800 > 10 000 H075-2a 3200 > 10 000 H075-6c 4200 > 10 000 H075-5e 5200 > 10 000 25 H075-2d > 10 000 > 10 000 H075-3d > 10 000 > 10 000 • «

Taulukon 7 mukaan H075-4a:lIa on mahdollista aktiivisuutta tutkittuja ihmisen solu- linjoja vastaan. Sen aktiivisuus on samanlainen kuin aklarubisiinin. Kaikilla yhdisteillä, · . 30 joilla on aminosokeri (a,b,c) oli aktiivisuutta MES-SA:aa vastaan. Edelleen, antrasyklii- • · ♦ nillä, jolla oli disakkaridi dF-dF (e), oli kohtalainen aktiivisuus MES-SA:aa vastaan.

• ♦ t 4.2 Lisäkokeita H075-4a:lla • · · • · « • · · • · · 35 4.2.1 In vitro -aktiivisuudet hiiren solulinjoja vastaan

• I

H075-4a:ta testattiin myös useilla hiiren soluiinjoilla in vitro (kaikki ostettiin ATCC:ltä, • ·

Rockville, Maryland, USA): Levvis-keuhkokarsinooma (LL/2)(CRL-1642), B16-F0- · · melanooma (CRL-6322), B16-F1-melanooma (CRL-6323), KLN-205-keuhkojen suomu- 27 105554 solukarsinooma (CRL-1453) ja MLTC-l-leydig-solukasvain (CRL-2065) käyttäen referensseinä daunomysiiniä, akiarubisiinia ja H075-la:ta (MA 144U1).

Kaikki solut kasvoivat yksisolukerroksina ja niitä viljeltiin 37 °C:ssa, 5 %:ssa C02:a 5 ATCC:n kullekin solulinjalle antamien vakio-ohjeiden mukaisesti: LL/2 Dulbeccon muunnetussa Eaglen alustassa, jossa oli 4,5 g/1 glukoosia ja 10 % FCS:ää, B16-F0 ja B16-F1 MEM:ssä (Eagle) Earlen BSS:ssä, jossa oli ei-välttämättömiä aminohappoja ja 10 % FCS:ää, KLN-205 MEM:ssä (Eagle) Earlen BSS:ssä, jossa oli ei-välttämättömiä aminohappoja ja 10 % FCS:ää, MLTC-1 RPMI 1640:ssä, jossa oli 25 mM HEPES:iä ja 10 10 % FBS:ää. Kaikki alustat hankittiin Gibco BRL:ltä, seerumi oli Gibcon BRL naudan siköseerumia.

Sytotoksisuusmääritykset ja ATP-seuranta suoritettiin samalla tavalla kuin on kuvattu ihmisen solulinjoille.

15

Taulukko 8. H075-4a:n ja referenssiyhdisteiden ED50-arvot (nM) hiiren erilaisille solulinjoille in vitro.

20 Yhdiste B16-F0 B16-F1 KLN- LL/2 MLTC- SK-N-

205 1 MC

I ' "1 “1 “ “ ““—““—“— “1 — - H075-4a 2 2 5 8 60 9 : Aklarubisiini 3 4 12 5 70 9

Daunorubisiini 20 8 90 15 900 3

Akv-Rhn-dF-dF 14 12 90 38 600 30 :··: 25 • · : Kuten taulukosta 8 voidaan päätellä, yhdiste H075-4a on aktiivinen useita testattuja • · · · solulinjoja vastaan. Aktiivisuudet ovat samanlaiset kuin aklarubisiinilla.

28 105554 5 ml suspensiota, jossa oli noin 50 000 solua /ml. Virtaussytometrianalyysi suoritettiin alkuperäiselle solususpensiolle ja lääkkeiden kanssa ja ilman niitä suoritetun yhden, kaksi ja kolme päivää kestäneen inkuboinnin jälkeen.

5 Solut valmistettiin virtaussytometristä DNA-analyysiä varten Vindelovin et ai (1985) esittämän menetelmän mukaisesti. Analyysi suoritettiin Epics XL virtaussytometrillä (Coulter Corporation, Miami, Fla). Näytteet valaistiin 15 mV argon-ionilaserilla (488 nm) ja propidiumjodidin fluoresenssi detektoitiin 620 nm "band pass"-suodattimen läpi. Kunkin näytteen solujen lukumäärä laskettiin erikseen lisäämällä sisäinen kalibrointiaine 10 (50 μΐ liuosta, joka sisälsi 1 x 10® Fluoresbrite-helmiä/ml) 50 μΙ.-aan solususpensiota.

Virtaussytometritutkimuksien perusteella voitiin määrittää tutkittujen solujen solusyklin vaihe. Vaiheessa G1 tapahtuu RNA-ja proteiinisynteesi, mutta ei replikaatiota. Siirtymä vaiheesta G1 vaiheeseen S tarkoittaa replikaation aloitusta, ja vaihe kestää siihen saakka 15 kun kaikki DNA on replikoitunut. Ajanjakso vaiheesta S mitoosiin (M) on vaihe G2. Hybridiantrasykliini H075-4a katkaisi solusyklin vaiheessa Gl, samoin kuin aklarubisii-ni, mikä osoittaa, että tämä yhdiste esti replikaation aloituksen.

Taulukko 9. Virtaussytometritulokset 24h inkubaation jälkeen antrasykliinien kanssa , , 20 tai ilman niitä. Solumäärä oli alussa 46 000 solua / ml. Solujen prosenttiosuudet solu- syklin eri vaiheiden alussa on myös esitetty.

» € I

f » < • « 4 • I ( * f __ _

Konsentraa- Soluja Gl (%) G2 (%) S + M

tio (1000/ml) (%) • · _______— ______ _____ ______ ___ — ·1·1 25 kontrolli Oh 46 32 12 56 kontrolli 24h 152 28 15 57 * H075-4a lxlO'8M 88 40 12 48 3,3xl0sM 67 45 19 36 30 ’·1 1 Aklarubisiini 1 x 10'8M 101 43 14 43 3,3xlO s M 78 47 29 24 * ·

Daunorubisiini lxlO'8M 66 11 38 51 3,3 x 10'8 M '23 6 66 27 :M 35 29 105554

Esimerkki 5. Sytotoksinen aktiivisuus in vivo: Ieukemiamalli.

P388-leukemiaa pidettiin yllä naaraspuolisissa DBA/2JBom-hiirissä (M & B A/S, Ry, Tanska) sarjalla vatsaontelon sisäisiä (i.p.) transplantaatioita. Eläimet pidettiin Turun 5 yliopiston koe-eläinkeskuksessa. Eläinyksikön hoito perustuu ja sitä seurataan seuraavien ohjeiden mukaisesti: "European Convention for the protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes, European Treaty Series No. 123 (EU No. 609/86), Official Journal of European Communities No. L 358, Strasbourg 24th November 1986", ja "Suomen laki, Asetus n:o 1360/90, Helsinki 21.12.1990: 10 Asetus kokeellisiin ja muihin tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien selkärankaisten eläinten suojelemiseksi tehdyn eurooppalaisen yleissopimuksen voimaansaattamisesta. Suomen säädöskokoelma."

In vivo -kokeet aloitettiin injektoimalla hiiriin 106 P388-solua suspendoituna Dulbeccon 15 fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen i.p. päivänä 0. Käytettiin kolmen hiiren ryhmiä. Lääkkeet annostettiin i.p. päivänä 1 kunkin hiiren ruumiinpainon perusteella. Kontrolliryhmä sai kantoainetta (10%:ista etanolia Dulbeccon fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa). Eläinten eloonjäämisajat merkittiin muistiin ja ne on esitetty taulukossa 10. Näiden tietojen perusteella tämän keksinnön mukaisilla yhdisteillä on lisääntynyt aktiivi-;·. ί 20 suus verrattuna daunomysiinin aktiivisuuteen.

« I

• f I

• · 4

• · I

• « I

• · • I « · « • · • · • · · · f • · • tf • · · • · · • I· • · · * · · ··· • · · • · · • · « « · • · « • «t « · 1 · 30 105554

Taulukko 10. Eloonjäämisaikojen mediaani hiirillä, jotka oli käsitelty daunorubi-siinilla tai H075-4a:lla.

5 Ryhmä Käsittely Eloonjäämispäivien mediaani (alue) 1. Kontrolli 10% etanoli i.p. 12 (12-13) 2. daunorubisiini (4 mg/kg 14 (14-16) i.p.) 10 3. H075-4a (6 mg/kg i.p.) 15 (15-16) 4. H075-4a (4 mg/kg i.p.) 15(13-15) 5. H075-4a (2 mg/kg i.p.) 14 (13-16) 6. H075-4a (1 mg/kg i.p.) 14 (13-15) 15 7. H075-llb (16 mg/kg i.p.) 16(15-19) 8. H075-1 Ib (8 mg/kg i.p.) 14(13-15) 9. H075-1 Ib (4 mg/kg i.p.) 13(12-13) 20 10. H075-10a (16 mg/kg i.p.) 14(14-15) 11. H075-10a ( 8 mg/kg i.p.) 14(13-15) 12. H075-10a ( 4 mg/kg i.p.) 15(14-17) 25

Talletetut mikro-organismit: Seuraava mikro-organismi talletettiin Budapestin sopi-. , muksen mukaisesti DSMZ-talletuslaitokseen (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Saksa)

< I i ( I I

I 4 t l r i , < I · 30 Mikro-organismi Talletusnumero Talletuspäivä • * • · · • · · • ·

Streptomyces galilaeus H075 DSM 11638 30.06.1997 • · · • · · • · · · · ·

• « I

I I

« f • « « · « • · « « « 3i 105554

Viitejulkaisut

Bibb, M.J., Janssen, G.R. ja Ward, J.M. (1985). Cloning and analysis of the promoter region of the erythromycin resistance gene (ermE) of Streptomyces erythraeus. Gene 38, 215-226.

Harker W.G. ja Sikic B.I. (1985). Multidrug (pleiotropic) resistance in doxorubicin-selected variants of the human sarcoma cell line MES-SA. Cancer Research 45, 4091-4096.

Hopwood, D.A., Bibb, M.J., Chater, K.F., Kieser, T., Bruton, C.J., Kieser, H.M., Lydiate, D.J., Smith, C.P., Ward, J.M. ja Schrempf, H. (1985). Genetic manipulations of Streptomyces: a laboratory manual. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom.

Hoshino, T., Tazoe, M., Nomura, S. ja Fujiwara A. (1982). New anthracycline antibiotics, auramycins and sulfurmycins. II. Isolation and characterization of 10 minor components. J. Antibiot. 35, 1271-1279.

Kangas L., Grönroos M. ja Nieminen A.-L. (1984). Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343.

Matsuzawa, Y., Yoshimoto, A., Shibanioto, N., Tobe, H., Oki, T., Naganawa, H., Takeuchi, T., ja Umezawa, H. (1981). New anthracycline metabolites from mutant strains of Streptomyces galilaeus MA144-M1. II Structure of 2-hydroxyaklavinone and new aklavinone glycosides. J Antibiot 34, 959-964.

Niemi, J. ja Mäntsälä, P. (1995). Nucleotide sequences and expression of genes from , , Streptomyces purpurascens that cause the production of new anthracyclines in

Streptomyces galilaeus. J Bacteriol 177, 2942-2945 • I «

Oki, T., Matsuzawa, Y., Yoshimoto, A., Numata, K., Kitani ura, I., Hori, S., '··' Takamatsu, A., Umezawa, H., Ishizuka, M., Naganawa, H., Suda, H., Ilamada,

*;’*ί M. ja Takeuchi, T. (1975). New antitumor antibiotics, aclacinomycins A and B. J

Antibiot 28, 830-834 • · • · · I « t *.· * Oki, T., Shibanioto, N., Matsuzawa, Y., Ogasawara, T., Yoshimoto, A., Kitamu- ra, I., Inui, T., Naganawa, H., Takeuchi, T. ja Umezawa, H. (1977). Production of .·;· nineteen anthracyclic compounds by Streptomyces galilaeus MA144-M1. J Antibiot 30, 683-687.

• · · ♦ * · • · 9 • ' . Streliz, F., Flon, H., Weiss, U, ja Asheshov, I.N (1956). Aklavin, an antibiotic subs- : tance with antiphage activity. J. Bacteriol. 72, 90-93.

Vindelov, L.L., Christensen, I.J. ja Nissen, N.I.'(1985). A detergent-trypsin method for the preparation of nuclei for flow cytometric DNA analysis. Cytometry 6, 348-356.

< 4 32 105554

Ward, J.M., Janssen, G.R., Kieser, T., Bibb, M.J., Buttner, M.J. ja Bibb, M.J. (1986). Construction and characterization of a series of multicopy promoter-probe plasmid vectors for Streptomyces using the aminoglycoside phosphotransferase from Tn5 as indicator. Mol Gen Genet 203, 468-478

Ylihonko K., Hakala J., Niemi J., Lundell J. ja Mäntsälä P.

(1994). Isolation and characterization of aclacinomycin A-non-producing Streptomyces galilaeus (ATCC 31615) mutants. Microbiol. 140 1359-1365.

Ylihonko K., Tuikkanen J., Jussila S., Cong L., Mäntsälä P. (1996). A gene cluster involved in nogalamycin biosynthesis from Streptomyces nogalater: sequence analysis and complementation of early blocked mutations of anthracycline pathway. Mol Gen Genetic.

Yoshimoto, A., Matsuzawa, Y., Ishikura, T., Sawa, T., Takeuchi, T ja Umezawa, H. (1984). New anthracycline derivatives from betaclamycin A. J. Antibiot. 920-922.

* · I I i % « I ( • » < < ( I » ( « '

I

« < ( • • · • · * · · • · · • · • · t

• · I

• · »

V

M« : : : • · · I · I • · · « « «« i · < « ·

I I ( * I

' r I * I

Min t <

Claims (8)

33 105554 Patenttivaatim ukset

1. Syövän hoidossa käyttökelpoiset antrasykliiniyhdisteet, joilla on kaava II, OH O OH (p FU 10 jossa kaavassa Rj on CH2CHj, R2 on COOCH3, R3 on OH ja R4 on Rhn-dF-dF (= H075-4a), tai R, on CH3, R2 on OH, R3 on OH ja R4 on Rhn-dF, (= H075-1 Ib), tai Rj on CH2CH3, R2 on H, R3 on H ja R4 on Rhn-dF-dF (= H075-8a), tai 15 R, on CH3, R2 on OH, R3 on H ja R4 on Rhn-dF, (= H075-6b), tai Rj on CH2CH3, R2 on OH, R3 on H ja R4 on Rhn-dF (= H075-2b), tai R, on CH3, R2 on OH, R3 on OH ja R4 on dF-dF, (= H075-1 le), tai R, on CH2CH3, R2 on OH, R3 on H ja R4 on Rhn-dF-dF (= H075-2a), tai R, on CH3, R2 on OH, R3 on H ja R4 on Rhn, (= H075-6c), tai 20 R] on CH3, R2 on COOCH3, R3 on OH ja R4 on dF-dF (= H075-5e), tai R, on CH2CH3, R2 on OH, R3 on H ja R4 on dF-dF-dF (= H075-2d), tai R! on CH3, R2 on COOCH3, R3 on H ja R4 on dF-dF-dF (= H075-3d), tai • I R, on CH2CH3, R2 on OH, R3 on OH ja R4 on Rhn-dF-dF (= H075-10a). • · • · • · · • · ·

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset antrasykliiniyhdisteet, joissa • « · R, on CH2CH3, R2 on COOCH3, R3 on OH ja R4 on Rhn-dF-dF (= H075-4a), tai Ri on CH3, R2 on OH, R3 on OH ja R4 on Rhn-dF, (= H075-1 Ib), tai · R, on CH2CH3, R2 on OH, R3 on OH ja R4 on Rhn-dF-dF (= H075-10a). e e • i i 1 t 34 105554

3. Yhdisteen aklavinoni-Rhn-dF-dF johdannaiset, joilla on kaava III 5 O R3 r2 OH O OH O io n^7 I N(CH3)2 o c-,^7 I OH OH 20 f c I ”’l jossa kaavassa I1! on CH3 tai CH2CH3, R2 on H tai OH, ja R3 on H tai OH. • · • · • · · • t ·

4. Menetelmä hybridiantrasykliinien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että • · · Streptomyces galilaeus -isäntään H075 siirretään nogalamysiinin ja/tai rodomy-siinin biosynteesigeenit, jotka saavat aikaan muutoksen ainakin yhdessä aklavinonirun- • · · gon asemista 9, 10 ja 11, ' . viljellään saatuja kantoja olosuhteissa, jotka mahdollistavat mainittujen geenien • « ><<<; 30 ilmentymisen, ja • I f· < otetaan talteen syntyneet hybridiantrasykliinit. « « t < Il « · 35 105554

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä kaavan II mukaisen yhdisteen valmistamiseksi V i3 Rz OH O OH (j) K jossa kaavassa R, on CH2CH3 tai CH3, R2 on COOCH3) H tai OH, R3 on OH tai H ja 10 R4 on Rhn-dF-dF, Rhn-dF, Rhn, dF-dF-dF, tai dF-dF, jossa Rhn on rodosamiini ja dF on deoksliukoosi.

6. Menetelmä kaavan II mukaisten antrasykliinien valmistamiseksi

15. R3 r2 OH O OH O R. 20 ' "· jossa kaavassa R! on CH2CH3, R2 on COOCH3, R3 on H ja R4 on Rhn-dF-dF, Rhn-dF, Rhn, dF-dF-dF, tai dF-dF, jossa Rhn on rodosamiini ja dF on deoksifukoosi, tunnettu siitä, että viljellään kantaa Streptomyces galilaeus H075 (DSM 11638) olosuhteissa, MIU . . jotka mahdollistavat antrasykliinien tuoton, ja otetaan talteen syntyneet antrasykliinit. • 1 · 25 lii • · I

7. Streptomyces galilaeus H075 (DSM 11638). Il • · · III

8. Streptomyces galilaeus -kanta H075, jossa on ainakin yksi geeniyhdistelmä, joka on kloonattu plasmidiin pSY21, pJN028, pSYRl, pSYR2, pSYR3, pSYR4, pSYR5, iiti. 30 pRdm51, pRdm52, pRdm53 tai pRdm54, joiden rakenne on esitetty esimerkissä 2. * · « * tl • I • • t 36 105554