JP2002514399A - 遺伝子工学処理したストレプトマイセス・ガリレウス株由来のハイブリッドアントラサイクリン - Google Patents
遺伝子工学処理したストレプトマイセス・ガリレウス株由来のハイブリッドアントラサイクリンInfo
- Publication number
- JP2002514399A JP2002514399A JP2000548348A JP2000548348A JP2002514399A JP 2002514399 A JP2002514399 A JP 2002514399A JP 2000548348 A JP2000548348 A JP 2000548348A JP 2000548348 A JP2000548348 A JP 2000548348A JP 2002514399 A JP2002514399 A JP 2002514399A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rhn
- anthracycline
- streptomyces
- compound
- deoxyfucose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
- C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、突然変異したストレプトマイセス・ガリレウス（Streptomyces galilaeus）株ＤＳＭ １１６３８における融合遺伝子のクローニングにより生じた新規ハイブリッドアントラサイクリンに関する。かかる株は、ストレプトマイセス・ガリレウス野生型（ＡＴＣＣ ３１６１５）の突然変異誘発により得た。得られた化合物のアグリコン部分は、突然変異体に導入された遺伝子産物により生じた修飾アクラビノンであり、糖部分は、宿主株に由来するものであり、ロドサミン−２−デオキシフコース−２−デオキシフコースもしくは２−デオキシフコース−２−デオキシフコース−２−デオキシフコース、または、これらの二糖もしくは単糖形である。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、ストレプトマイセス・ガリレウス（Streptomyces galilaeus）突然
変異株における融合遺伝子のクローニングにより生じる新規アントラサイクリン
に関する。得られた化合物のアグリコン部分は、突然変異体に導入した遺伝子に
より修飾が引き起こされた修飾アクラビノン（aklavinone）であり、糖部分は、
宿主株由来のものである。
変異株における融合遺伝子のクローニングにより生じる新規アントラサイクリン
に関する。得られた化合物のアグリコン部分は、突然変異体に導入した遺伝子に
より修飾が引き起こされた修飾アクラビノン（aklavinone）であり、糖部分は、
宿主株由来のものである。
【０００２】 （発明の背景） アントラサイクリンは、主に二次代謝産物としてストレプトマイセス（Strept
omyces）種により産生され、抗腫瘍剤として大きな価値を有している。一般に、
アントラサイクリン分子は、アグリコン骨格および該骨格に結合している１個ま
たはそれ以上の糖部分からなる。アクラシノマイシンは、アグリコン部分として
アクラビノンを有しており、ロドサミン（アクラシノマイシンＴ）のような糖残
基を有する一群のアントラサイクリンであり、２−デオキシフコース（アクラシ
ノマイシンＳ）および第３の糖（もとは、ロジノース）を逐次的に結合すること
ができる。第３の糖残基の修飾は、一般的である。Okiら（1975）により、スト
レプトマイセス・ガリレウスからアクラシノマイシンＡ（ＡｃｍＡ）、Ｂ（Ａｃ
ｍＢ）、およびＹ（ＡｃｍＹ）からなる最初のアクラシノマイシン複合体がまず
単離された。その後、アクラシノマイシンＡであるアクラルビシンが癌の化学療
法において用いるための臨床試験を通過した。マイナーな修飾を有するアクラシ
ノマイシンを得るための研究が行われ、薬物開発のための新しい候補が見出され
た。これらの研究の間に、糖部分に修飾を有するストレプトマイセス・ガリレウ
ス突然変異株により産生された化合物が見出された（Matsuzawaら，1981）。
omyces）種により産生され、抗腫瘍剤として大きな価値を有している。一般に、
アントラサイクリン分子は、アグリコン骨格および該骨格に結合している１個ま
たはそれ以上の糖部分からなる。アクラシノマイシンは、アグリコン部分として
アクラビノンを有しており、ロドサミン（アクラシノマイシンＴ）のような糖残
基を有する一群のアントラサイクリンであり、２−デオキシフコース（アクラシ
ノマイシンＳ）および第３の糖（もとは、ロジノース）を逐次的に結合すること
ができる。第３の糖残基の修飾は、一般的である。Okiら（1975）により、スト
レプトマイセス・ガリレウスからアクラシノマイシンＡ（ＡｃｍＡ）、Ｂ（Ａｃ
ｍＢ）、およびＹ（ＡｃｍＹ）からなる最初のアクラシノマイシン複合体がまず
単離された。その後、アクラシノマイシンＡであるアクラルビシンが癌の化学療
法において用いるための臨床試験を通過した。マイナーな修飾を有するアクラシ
ノマイシンを得るための研究が行われ、薬物開発のための新しい候補が見出され
た。これらの研究の間に、糖部分に修飾を有するストレプトマイセス・ガリレウ
ス突然変異株により産生された化合物が見出された（Matsuzawaら，1981）。
【０００３】 アクラビノンおよびアミノ糖であるロドサミン（Ｒｈｎ）からなるアクラシノ
マイシン（Ａｃｍ）の一般式は、下記のとおりである：
マイシン（Ａｃｍ）の一般式は、下記のとおりである：
【０００４】
【化５】
【０００５】 ここで、Ｒは、Ｈ、または単糖もしくは二糖部分である糖残基である。
【０００６】
【表１】
【０００７】 ｄＦは、２−デオキシフコースであり、Ｃｉｎは、シネルロースであり、Ａｃｕ
は、アキュロースであり、Ｒｈｏは、ロドノースであり、Ａｍｉは、アミセトー
スである。
は、アキュロースであり、Ｒｈｏは、ロドノースであり、Ａｍｉは、アミセトー
スである。
【０００８】 さらに、アミノ糖部分を有しないアクラビノングリコシドが突然変異誘発処理
により得られたストレプトマイセス・ガリレウス株により産生された（Matsuzaw
aら，1981、およびYlihonkoら，1994）
により得られたストレプトマイセス・ガリレウス株により産生された（Matsuzaw
aら，1981、およびYlihonkoら，1994）
【０００９】 アクラルビシンと称されるアクラシノマイシンＡは、癌の化学療法において用
いられるアクラシノマイシングループの唯一のメンバーである。主に、白血病の
ために用いられる。ダウノマイシングループを代表するアントラサイクリンであ
るドキソルビシンは、最も広範囲に用いられている細胞増殖抑制性抗生物質であ
り、かなり多くの種類の腫瘍に対して活性を示す。残念なことに、蓄積性心臓毒
性のような有害な副作用により、ドキソルビシンによる治療は、その効果にもか
かわらず中断させられる。一方、アクラルビシン治療においては、心臓毒性は、
一般的な副作用ではない。それにもかかわらず、充実性腫瘍に対する活性がない
ために、その使用は、主に白血病およびリンパ腫に限定されている。このため、
癌治療に最適なアントラサイクリンは、ドキソルビシンと同様の臨床適用性を有
するが、副作用は、むしろ、その作用形態に従って、アクラルビシンの副作用と
同様であるべきである。癌の化学療法の現況は、新しい細胞増殖抑制薬を開発す
るために、新しい分子を必要とし続けている。
いられるアクラシノマイシングループの唯一のメンバーである。主に、白血病の
ために用いられる。ダウノマイシングループを代表するアントラサイクリンであ
るドキソルビシンは、最も広範囲に用いられている細胞増殖抑制性抗生物質であ
り、かなり多くの種類の腫瘍に対して活性を示す。残念なことに、蓄積性心臓毒
性のような有害な副作用により、ドキソルビシンによる治療は、その効果にもか
かわらず中断させられる。一方、アクラルビシン治療においては、心臓毒性は、
一般的な副作用ではない。それにもかかわらず、充実性腫瘍に対する活性がない
ために、その使用は、主に白血病およびリンパ腫に限定されている。このため、
癌治療に最適なアントラサイクリンは、ドキソルビシンと同様の臨床適用性を有
するが、副作用は、むしろ、その作用形態に従って、アクラルビシンの副作用と
同様であるべきである。癌の化学療法の現況は、新しい細胞増殖抑制薬を開発す
るために、新しい分子を必要とし続けている。
【００１０】 Matsuzawaら（1981）には、アクラビノン−ロドサミン−２−デオキシフコー
ス−２−デオキフコースの生産が記載されている。このアクラシノマイシンは、
ストレプトマイセス・ガリレウスＡＴＣＣ ３１１３３株由来のストレプトマイ
セス・ガリレウス突然変異株７Ｕ−４９１および７Ｎ−１８８１から単離された
。同様に、該株７Ｕ−４９１および７Ｎ−１８８１は、アクラビノン−Ｒｈｎ−
ｄＦを産生し、さらに、７Ｎ−１８８１の培養物からアクラビノン−ｄＦ−ｄＦ
（ＭＡ１４４ Ｕ９）が得られた。
ス−２−デオキフコースの生産が記載されている。このアクラシノマイシンは、
ストレプトマイセス・ガリレウスＡＴＣＣ ３１１３３株由来のストレプトマイ
セス・ガリレウス突然変異株７Ｕ−４９１および７Ｎ−１８８１から単離された
。同様に、該株７Ｕ−４９１および７Ｎ−１８８１は、アクラビノン−Ｒｈｎ−
ｄＦを産生し、さらに、７Ｎ−１８８１の培養物からアクラビノン−ｄＦ−ｄＦ
（ＭＡ１４４ Ｕ９）が得られた。
【００１１】 （発明の概要） 本発明者らは、突然変異体に修飾アントラサイクリンを産生させるために、ス
トレプトマイセス・ガリレウス野生型株（ＡＴＣＣ ３１６１５）を突然変異さ
せた。得られたストレプトマイセス・ガリレウス突然変異体をＨ０７５と命名し
、受託番号ＤＳＭ １１６３８の下に、ドイツ国、ブラウンシュヴァイク、マシ
ェロダー・ヴェク・１ベーのドイッチェ・サムルンク・フォン・ミクロオルガニ
ズメン・ウント・ツェルクルツレン（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen）にて1997年6月30日にブダペスト条約の規則の下に寄託した
。ストレプトマイセス・ガリレウスＨ０７５自体は、主産生物としてアクラビノ
ン−ロドサミン−２−デオキシフコース−２−デオキシフコース（Ｈ０７５−１
ａ）を産生し、アミノグリコシドを有しないアントラサイクリンであるアクラビ
ノン−ｄＦ−ｄＦ−ｄＦ（Ｈ０７５−１ｄ）を少量産生する。したがって、Ｈ０
７５は、新規化合物であるアクラビノン−デオキシフコース−デオキシフコース
−デオキシフコースも産生するので、Matsuzawaら（1981）の産生性株とは異な
る。この突然変異株を、ノガラマイシン生合成のための既知の遺伝子（ｓｎｏ）
およびロドマイシン生合成のための既知の遺伝子（ｒｄｍ）を発現するための宿
主株として用いて、新規ハイブリッドアントラサイクリンを産生した。ストレプ
トマイセス・ノガラター（S. nogalater）由来のｓｎｏ１−３遺伝子は、Ｃ−９
のエチル基をアクラビノンのメチル基に置換させる。ストレプトマイセス・プル
プラセンス（S. purpurascens）由来のｒｄｍＢおよびＥ遺伝子は、各々、１０
位および１１位のヒドロキシル化を引き起こし、ｒｄｍＣ遺伝子産物は、アグリ
コン部分における１０位を脱炭酸する。この結果、癌の化学療法において有用な
新規化合物が得られる。
トレプトマイセス・ガリレウス野生型株（ＡＴＣＣ ３１６１５）を突然変異さ
せた。得られたストレプトマイセス・ガリレウス突然変異体をＨ０７５と命名し
、受託番号ＤＳＭ １１６３８の下に、ドイツ国、ブラウンシュヴァイク、マシ
ェロダー・ヴェク・１ベーのドイッチェ・サムルンク・フォン・ミクロオルガニ
ズメン・ウント・ツェルクルツレン（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen）にて1997年6月30日にブダペスト条約の規則の下に寄託した
。ストレプトマイセス・ガリレウスＨ０７５自体は、主産生物としてアクラビノ
ン−ロドサミン−２−デオキシフコース−２−デオキシフコース（Ｈ０７５−１
ａ）を産生し、アミノグリコシドを有しないアントラサイクリンであるアクラビ
ノン−ｄＦ−ｄＦ−ｄＦ（Ｈ０７５−１ｄ）を少量産生する。したがって、Ｈ０
７５は、新規化合物であるアクラビノン−デオキシフコース−デオキシフコース
−デオキシフコースも産生するので、Matsuzawaら（1981）の産生性株とは異な
る。この突然変異株を、ノガラマイシン生合成のための既知の遺伝子（ｓｎｏ）
およびロドマイシン生合成のための既知の遺伝子（ｒｄｍ）を発現するための宿
主株として用いて、新規ハイブリッドアントラサイクリンを産生した。ストレプ
トマイセス・ノガラター（S. nogalater）由来のｓｎｏ１−３遺伝子は、Ｃ−９
のエチル基をアクラビノンのメチル基に置換させる。ストレプトマイセス・プル
プラセンス（S. purpurascens）由来のｒｄｍＢおよびＥ遺伝子は、各々、１０
位および１１位のヒドロキシル化を引き起こし、ｒｄｍＣ遺伝子産物は、アグリ
コン部分における１０位を脱炭酸する。この結果、癌の化学療法において有用な
新規化合物が得られる。
【００１２】 本発明の目的は、ノガラマイシン生合成のための遺伝子（ｓｎｏ）および／ま
たはロドマイシン生合成のための遺伝子（ｒｄｍ）をストレプトマイセス・ガリ
レウス株に、好ましくは、Ｈ０７５突然変異体に形質転換することにより新規ハ
イブリッドアントラサイクリンを生成する方法である。
たはロドマイシン生合成のための遺伝子（ｒｄｍ）をストレプトマイセス・ガリ
レウス株に、好ましくは、Ｈ０７５突然変異体に形質転換することにより新規ハ
イブリッドアントラサイクリンを生成する方法である。
【００１３】 ストレプトマイセス・ガリレウスＨ０７５において該遺伝子を発現させてアク
ラビノンにおける９位、１０位および１１位の置換基を変化させることにより生
成される化合物は、本発明に包含される。
ラビノンにおける９位、１０位および１１位の置換基を変化させることにより生
成される化合物は、本発明に包含される。
【００１４】 （発明の詳細な説明） 本発明の新規アントラサイクリンの産生のために宿主として用いられるストレ
プトマイセス・ガリレウス突然変異体Ｈ０７５（ＤＳＭ １１６３８）は、アク
ラビノングリコシドの過剰産生性体（overproducer）である。該化合物について
の一般式ＩＩは、下記のとおりである：
プトマイセス・ガリレウス突然変異体Ｈ０７５（ＤＳＭ １１６３８）は、アク
ラビノングリコシドの過剰産生性体（overproducer）である。該化合物について
の一般式ＩＩは、下記のとおりである：
【００１５】
【化６】
【００１６】
【化７】
【００１７】 ここで、Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ3またはＣＨ3であり、Ｒ2は、ＣＯＯＣＨ3、Ｈまたは
ＯＨであり、Ｒ3は、ＯＨまたはＨである。
ＯＨであり、Ｒ3は、ＯＨまたはＨである。
【００１８】
【表２】
【００１９】 以下の記載において、当該化合物は、番号が上記Ｒ基に基づいて各アグリコン
に付与されており、小文字が式ＩＩの糖部分を表す［ａ＝Ｒｈｎ−ｄＦ−ｄＦ；
ｂ＝Ｒｈｎ−ｄＦ；ｃ＝Ｒｈｎ；ｄ＝ｄＦ−ｄＦ−ｄＦ；ｅ＝ｄＦ−ｄＦ（Ｒｈ
ｎ＝ロドサミン、ｄＦ＝デオキシフコース）］ように式ＩＩに従って称される。
に付与されており、小文字が式ＩＩの糖部分を表す［ａ＝Ｒｈｎ−ｄＦ−ｄＦ；
ｂ＝Ｒｈｎ−ｄＦ；ｃ＝Ｒｈｎ；ｄ＝ｄＦ−ｄＦ−ｄＦ；ｅ＝ｄＦ−ｄＦ（Ｒｈ
ｎ＝ロドサミン、ｄＦ＝デオキシフコース）］ように式ＩＩに従って称される。
【００２０】 宿主としてストレプトマイセス・ガリレウスＨ０７５を用いて得られた形質転
換株は、全部で５（糖部分）×１１（アグリコン修飾）種類のアントラサイクリ
ンを産生する。
換株は、全部で５（糖部分）×１１（アグリコン修飾）種類のアントラサイクリ
ンを産生する。
【００２１】 本発明は、詳しくは、上記表１に記載した新規化合物Ｈ０７５−２ａ、ｂ、ｃ
、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−３ａ、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−４ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｈ０７
５−５ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−６ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−７ａ
、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−８ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−９ａ、ｂ、ｃ
、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−１０ａ、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−１１ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｈ
０７５−１２ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、特に、特許請求の範囲第１項記載の新規化合
物Ｈ０７５−２ａ、−２ｂおよび−２ｄ；Ｈ０７５−３ｄ；Ｈ０７５−４ａ；Ｈ
０７５−５ｅ；Ｈ０７５−６ｂおよび−６ｃ；Ｈ０７５−８ａ；Ｈ０７５−１０
ａ；ならびにＨ０７５−１１ｂおよび−１１ｅに関する。
、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−３ａ、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−４ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｈ０７
５−５ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−６ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−７ａ
、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−８ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−９ａ、ｂ、ｃ
、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−１０ａ、ｄ、ｅ、Ｈ０７５−１１ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、Ｈ
０７５−１２ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、特に、特許請求の範囲第１項記載の新規化合
物Ｈ０７５−２ａ、−２ｂおよび−２ｄ；Ｈ０７５−３ｄ；Ｈ０７５−４ａ；Ｈ
０７５−５ｅ；Ｈ０７５−６ｂおよび−６ｃ；Ｈ０７５−８ａ；Ｈ０７５−１０
ａ；ならびにＨ０７５−１１ｂおよび−１１ｅに関する。
【００２２】 本発明の化合物に関連する従来知られていた化合物（式ＩＩに従って命名した
）は、 Ｈ０７５−１ａ（ＭＡ１４４ Ｕ１、Matsuzawaら，1981）、 Ｈ０７５−１ｂ（ＡｃｍＳ、Okiら，1977）、 Ｈ０７５−１ｃ（アクラビン、ＡｃｍＴ、Strelizら，1956）、 Ｈ０７５−１ｅ（ＭＡ１４４ Ｕ９、Matsuzawaら，1981）、 Ｈ０７５−３ｂ（オーラマイシン（auramycin）Ｃ、Hoshinoら，1982）、 Ｈ０７５−３ｃ（オーラマイシンＤ、Hoshinoら，1982）、 Ｈ０７５−１０ｂ（ベタクラマイシン（bataclamycin）Ｓ、Yoshimotoら，198
4）および Ｈ０７５−１０ｃ（ベタクラマイシンＴ、Yoshimotoら，1984） である。
）は、 Ｈ０７５−１ａ（ＭＡ１４４ Ｕ１、Matsuzawaら，1981）、 Ｈ０７５−１ｂ（ＡｃｍＳ、Okiら，1977）、 Ｈ０７５−１ｃ（アクラビン、ＡｃｍＴ、Strelizら，1956）、 Ｈ０７５−１ｅ（ＭＡ１４４ Ｕ９、Matsuzawaら，1981）、 Ｈ０７５−３ｂ（オーラマイシン（auramycin）Ｃ、Hoshinoら，1982）、 Ｈ０７５−３ｃ（オーラマイシンＤ、Hoshinoら，1982）、 Ｈ０７５−１０ｂ（ベタクラマイシン（bataclamycin）Ｓ、Yoshimotoら，198
4）および Ｈ０７５−１０ｃ（ベタクラマイシンＴ、Yoshimotoら，1984） である。
【００２３】 本発明は、式ＩＩで示される化合物の薬物開発を可能にする。本発明によれば
、本研究の化合物は、ダウノマイシンおよびアクラルビシンと比較してＭＥＳ−
ＳＡセルラインに対して活性である。同様に、マウスにおいてＰ３８８白血病細
胞を用いるイン・ビボ活性は、ダウノマイシンの該活性に匹敵した。イン・ビト
ロ細胞増殖抑制活性についての研究のために用いた腫瘍細胞パネルは、アグリコ
ン部分の置換基に依存したアクラシノマイシンまたはダウノマイシンに対する特
性を示している。これらの結果により、癌治療のための新規薬剤を見出し易くな
った。
、本研究の化合物は、ダウノマイシンおよびアクラルビシンと比較してＭＥＳ−
ＳＡセルラインに対して活性である。同様に、マウスにおいてＰ３８８白血病細
胞を用いるイン・ビボ活性は、ダウノマイシンの該活性に匹敵した。イン・ビト
ロ細胞増殖抑制活性についての研究のために用いた腫瘍細胞パネルは、アグリコ
ン部分の置換基に依存したアクラシノマイシンまたはダウノマイシンに対する特
性を示している。これらの結果により、癌治療のための新規薬剤を見出し易くな
った。
【００２４】 形質転換株により産生された化合物は、それらの化学構造のためにアクラルビ
シンよりも親水性である。このために、それらは、物理化学的特性においてアク
ラルビシンよりもドキソルビシンに似ている。ドキソルビシンは、アクラルビシ
ンとは異なるメカニズムで腫瘍細胞に対して作用する。これは、薬物−ＤＮＡ−
酵素複合体を安定化して二重螺旋のＤＮＡ鎖のライゲーションを防止するトポイ
ソメラーゼＩＩの阻害剤であることが示唆されている。この結果、Ｇ２期で細胞
周期を停止させる。アクラルビシンは、トポイソメラーゼのＤＮＡとの相互作用
を阻害すると推定されるが、メカニズムは、よくは知られておらず、当該化合物
は、細胞周期をＧ１期で停止させることが見出されている。本発明のハイブリッ
ドアントラサイクリンは、染色体複製の拘束点であるＧ１期で細胞周期を停止し
、アクラルビシンの作用と類似の作用形態を示すことが見出された。
シンよりも親水性である。このために、それらは、物理化学的特性においてアク
ラルビシンよりもドキソルビシンに似ている。ドキソルビシンは、アクラルビシ
ンとは異なるメカニズムで腫瘍細胞に対して作用する。これは、薬物−ＤＮＡ−
酵素複合体を安定化して二重螺旋のＤＮＡ鎖のライゲーションを防止するトポイ
ソメラーゼＩＩの阻害剤であることが示唆されている。この結果、Ｇ２期で細胞
周期を停止させる。アクラルビシンは、トポイソメラーゼのＤＮＡとの相互作用
を阻害すると推定されるが、メカニズムは、よくは知られておらず、当該化合物
は、細胞周期をＧ１期で停止させることが見出されている。本発明のハイブリッ
ドアントラサイクリンは、染色体複製の拘束点であるＧ１期で細胞周期を停止し
、アクラルビシンの作用と類似の作用形態を示すことが見出された。
【００２５】 本発明の化合物は、アントラサイクリンのための遺伝子を発現することができ
るいずれもの微生物細胞において生成できる。ストレプトマイセス種は、本発明
の目的に有利であり、特定の具体例は、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン）によるストレプトマイセス・ガリレウスＡＴＣＣ ３１
６１５野生型の突然変異誘発により得られる遺伝子工学処理されたストレプトマ
イセス・ガリレウスＨ０７５（ＤＳＭ １１６３８）の使用からなる。
るいずれもの微生物細胞において生成できる。ストレプトマイセス種は、本発明
の目的に有利であり、特定の具体例は、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン）によるストレプトマイセス・ガリレウスＡＴＣＣ ３１
６１５野生型の突然変異誘発により得られる遺伝子工学処理されたストレプトマ
イセス・ガリレウスＨ０７５（ＤＳＭ １１６３８）の使用からなる。
【００２６】 ストレプトマイセスにおいて、アクラビノンの生合成は、ポリケチド経路を経
由して進行する。ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）により、ポリケチド骨格が形
成される。「最小ＰＫＳ」を構成する３つの特異的な遺伝子産物は、ポリケチド
アッセンブリーにおいて用いられる開始ユニットの受け取りおよび伸長ユニット
（アセテート）の数を制御する。アグリコン生合成のための開始ユニットは、上
記構造の９位の置換基を決定する。プロピオネートが、Ｒ1がエチル基であるア
クラビノン生合成において開始物質として用いられることは、従前に知られてい
た。アセテートを用いてノガラマイシンの生合成経路を開始するので（Ylihonko
ら，1996）、このエチル基は、Ｈ０７５においてノガラマイシンのための最小Ｐ
ＫＳ遺伝子を発現することによりメチル基に変換できる。ノガラマイシン最小Ｐ
ＫＳのための遺伝子（ｓｎｏ１−３）は、ｐＳＹ２１を得るためにＳａｃＩ−Ｂ
ｇｌＩＩで制限された５.４ｋｂ ＤＮＡフラグメントとしてプラスミドｐＳＹ１
５（ＤＳＭ ９４３６）から単離できる。該フラグメントは、ストレプトマイセ
ス種において複製するマルチコピープラスミドベクターにおいてクローン化され
る。
由して進行する。ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）により、ポリケチド骨格が形
成される。「最小ＰＫＳ」を構成する３つの特異的な遺伝子産物は、ポリケチド
アッセンブリーにおいて用いられる開始ユニットの受け取りおよび伸長ユニット
（アセテート）の数を制御する。アグリコン生合成のための開始ユニットは、上
記構造の９位の置換基を決定する。プロピオネートが、Ｒ1がエチル基であるア
クラビノン生合成において開始物質として用いられることは、従前に知られてい
た。アセテートを用いてノガラマイシンの生合成経路を開始するので（Ylihonko
ら，1996）、このエチル基は、Ｈ０７５においてノガラマイシンのための最小Ｐ
ＫＳ遺伝子を発現することによりメチル基に変換できる。ノガラマイシン最小Ｐ
ＫＳのための遺伝子（ｓｎｏ１−３）は、ｐＳＹ２１を得るためにＳａｃＩ−Ｂ
ｇｌＩＩで制限された５.４ｋｂ ＤＮＡフラグメントとしてプラスミドｐＳＹ１
５（ＤＳＭ ９４３６）から単離できる。該フラグメントは、ストレプトマイセ
ス種において複製するマルチコピープラスミドベクターにおいてクローン化され
る。
【００２７】 アクラビノンにおける１０位の置換基（基Ｒ2）は、カルボメトキシ基である
。この基は、エステラーゼの活性により、好ましくは、ＲｄｍＣにより除去され
て、化合物Ｈ０７５−７、Ｈ０７５−８、Ｈ０７５−９およびＨ０７５−１２（
Ｒ2＝Ｈ）が生成される。ＲｄｍＣは、鋳型としてｐＪＮ０２８を用いてＰＣＲ
（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりｒｄｍＣ遺伝子を増幅し、増幅されたフラグ
メントをｐＩＪ４８６に挿入してｐＲｄｍ５２を得ることにより得る。Ｒ2は、
ＲｄｍＣおよびＲｄｍＢの同時作用によりヒドロキシル基に変換される。この場
合、ｒｄｍＣの遺伝子産物は、カルボメトキシ基の除去を引き起こすが、ｒｄｍ
Ｂは、Ｒ2をヒドロキシル基にするヒドロキシラーゼをコードしている。ｒｄｍ
ＣおよびｒｄｍＢは、一緒にクローン化されて、カルボメトキシ基のヒドロキシ
ル基への変換を引き起こす。
。この基は、エステラーゼの活性により、好ましくは、ＲｄｍＣにより除去され
て、化合物Ｈ０７５−７、Ｈ０７５−８、Ｈ０７５−９およびＨ０７５−１２（
Ｒ2＝Ｈ）が生成される。ＲｄｍＣは、鋳型としてｐＪＮ０２８を用いてＰＣＲ
（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりｒｄｍＣ遺伝子を増幅し、増幅されたフラグ
メントをｐＩＪ４８６に挿入してｐＲｄｍ５２を得ることにより得る。Ｒ2は、
ＲｄｍＣおよびＲｄｍＢの同時作用によりヒドロキシル基に変換される。この場
合、ｒｄｍＣの遺伝子産物は、カルボメトキシ基の除去を引き起こすが、ｒｄｍ
Ｂは、Ｒ2をヒドロキシル基にするヒドロキシラーゼをコードしている。ｒｄｍ
ＣおよびｒｄｍＢは、一緒にクローン化されて、カルボメトキシ基のヒドロキシ
ル基への変換を引き起こす。
【００２８】 １１−ヒドロキシル基（Ｒ3）は、ヒドロキシラーゼであるｒｄｍＥ遺伝子産
物の作用により付加できる。遺伝子ｒｄｍＥは、ｐＪＮ０１８から得られ、これ
をｐＩＪＥ４８６にクローン化して、ｐＲｄｍ５１が得られる。発現ベクターｐ
ＩＪＥ４８６においてクローン化された適切に融合された遺伝子は、遺伝子産物
の個々の活性に基づく修飾により、本発明の突然変異株Ｈ０７５に対して特徴的
な化合物の誘導体を生じる。発現構築物は、好ましくは、多量の組換えプラスミ
ドを得るためにストレプトマイセス・リビダンス（S. lividans）ＴＫ２４にお
いて構築され、用いた他のストレプトマイセス・ガリレウス株よりも高い形質転
換頻度を示すストレプトマイセス・ガリレウスＨ０３９に導入される。さらに、
該遺伝子の組み合わせを有するプラスミドがＨ０３９から単離され、ストレプト
マイセス・ガリレウスＨ０７５に導入され、上記一般式ＩＩで示される化合物が
産生される。関連するプラスミドおよび遺伝子を表２に示す。
物の作用により付加できる。遺伝子ｒｄｍＥは、ｐＪＮ０１８から得られ、これ
をｐＩＪＥ４８６にクローン化して、ｐＲｄｍ５１が得られる。発現ベクターｐ
ＩＪＥ４８６においてクローン化された適切に融合された遺伝子は、遺伝子産物
の個々の活性に基づく修飾により、本発明の突然変異株Ｈ０７５に対して特徴的
な化合物の誘導体を生じる。発現構築物は、好ましくは、多量の組換えプラスミ
ドを得るためにストレプトマイセス・リビダンス（S. lividans）ＴＫ２４にお
いて構築され、用いた他のストレプトマイセス・ガリレウス株よりも高い形質転
換頻度を示すストレプトマイセス・ガリレウスＨ０３９に導入される。さらに、
該遺伝子の組み合わせを有するプラスミドがＨ０３９から単離され、ストレプト
マイセス・ガリレウスＨ０７５に導入され、上記一般式ＩＩで示される化合物が
産生される。関連するプラスミドおよび遺伝子を表２に示す。
【００２９】
【表３】
【００３０】 一般式（ＩＩ）で示されるアントラサイクリンは、表２に挙げたプラスミドを
0有する株であるＨ０７５クローンの発酵により生成される。該株は、Ｈ０７５
−ｐＪＮ０２８、Ｈ０７５−ｐＳＹ２１、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ１、Ｈ０７５−ｐ
ＳＹＲ２、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ３、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ４、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ
５、Ｈ０７５−ｐＲｄｍ５１、Ｈ０７５−ｐＲｄｍ５２、Ｈ０７５−ｐＲｄｍ５
３およびＨ０７５−ｐＲｄｍ５４である。生成されたアントラサイクリンは、有
機溶媒で、好ましくは、ジクロロメタン：メタノール溶液を用いて抽出すること
により単離される。目的のアントラサイクリンは、二段階でカラムクロマトグラ
フィーにより混合物から分取される。精製した化合物の細胞増殖抑制活性は、イ
ンビトロで腫瘍細胞を用いて、および、インビボで白血病モデルにおいて研究さ
れる。
0有する株であるＨ０７５クローンの発酵により生成される。該株は、Ｈ０７５
−ｐＪＮ０２８、Ｈ０７５−ｐＳＹ２１、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ１、Ｈ０７５−ｐ
ＳＹＲ２、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ３、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ４、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ
５、Ｈ０７５−ｐＲｄｍ５１、Ｈ０７５−ｐＲｄｍ５２、Ｈ０７５−ｐＲｄｍ５
３およびＨ０７５−ｐＲｄｍ５４である。生成されたアントラサイクリンは、有
機溶媒で、好ましくは、ジクロロメタン：メタノール溶液を用いて抽出すること
により単離される。目的のアントラサイクリンは、二段階でカラムクロマトグラ
フィーにより混合物から分取される。精製した化合物の細胞増殖抑制活性は、イ
ンビトロで腫瘍細胞を用いて、および、インビボで白血病モデルにおいて研究さ
れる。
【００３１】 以下に、本発明の詳しい具体例を（ｉ）ストレプトマイセス・ガリレウス野生
型（ＡＴＣＣ ３１６１５）の突然変異誘発の実施、（ｉｉ）アグリコンの修飾
を引き起こすためのプラスミドの構築、（ｉｉｉ）Ｈ０７５クローンを得るため
のプラスミドのストレプトマイセス・ガリレウスＨ０７５への導入、（ｉｖ）Ｈ
０７５クローンにより生成した化合物の単離、クローン化された遺伝子により引
き起こされた各修飾を示す該化合物についての精製および同定工程、および（ｖ
）インビトロおよびインビボでの細胞毒性活性の測定からなる実施例として記載
する。
型（ＡＴＣＣ ３１６１５）の突然変異誘発の実施、（ｉｉ）アグリコンの修飾
を引き起こすためのプラスミドの構築、（ｉｉｉ）Ｈ０７５クローンを得るため
のプラスミドのストレプトマイセス・ガリレウスＨ０７５への導入、（ｉｖ）Ｈ
０７５クローンにより生成した化合物の単離、クローン化された遺伝子により引
き起こされた各修飾を示す該化合物についての精製および同定工程、および（ｖ
）インビトロおよびインビボでの細胞毒性活性の測定からなる実施例として記載
する。
【００３２】 実験 使用材料 細菌株： ストレプトマイセス・ガリレウスＡＴＣＣ ３１６１５は、アクラシノマイシ
ンを産生する。ここでは、該株をＮＴＧ−突然変異誘発のために野生型として用
いた。
ンを産生する。ここでは、該株をＮＴＧ−突然変異誘発のために野生型として用
いた。
【００３３】 ストレプトマイセス・ガリレウスＨ０３９（ＰＣＴ出願公開WO 96/10581）は
、アクラビノングリコシドを産生する。ここでは、Ｈ０７５よりも高い形質転換
頻度のために中間株として用いる。
、アクラビノングリコシドを産生する。ここでは、Ｈ０７５よりも高い形質転換
頻度のために中間株として用いる。
【００３４】 ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４（ＰＣＴ出願公開WO 96/10581）は
、アントラサイクリンを産生しない。これは、クローニングにおいて第一宿主と
して用いられる無制限−修飾株である。
、アントラサイクリンを産生しない。これは、クローニングにおいて第一宿主と
して用いられる無制限−修飾株である。
【００３５】 プラスミド： 下流にクローン化された遺伝子の構成的な発現を可能にするプロモーターであ
るｅｒｍＥ（Bibbら，1985）を、一般に用いられるストレプトマイセスクローニ
ングベクターであるｐＩＪ４８６およびｐＩＪ４８７［Wardら，1986；イギリス
国、ジョン・イネス・センター（John Innes Centre）のHopwood教授から入手し
た］のＭＣＳ（マルチクローニング部位）に挿入し、プラスミドｐＩＪＥ４８６
またはｐＩＪＥ４８７を得た。
るｅｒｍＥ（Bibbら，1985）を、一般に用いられるストレプトマイセスクローニ
ングベクターであるｐＩＪ４８６およびｐＩＪ４８７［Wardら，1986；イギリス
国、ジョン・イネス・センター（John Innes Centre）のHopwood教授から入手し
た］のＭＣＳ（マルチクローニング部位）に挿入し、プラスミドｐＩＪＥ４８６
またはｐＩＪＥ４８７を得た。
【００３６】 プラスミドｐＳＹ１５は、ストレプトマイセス・リビダンスＤＳＭ ９４３６
に含まれ、該プラスミドは、ベクターｐＩＪ４８６中にストレプトマイセス・ノ
ガラター由来のノガラマイシンクロモフォアに対する遺伝子を含有する。ｐＳＹ
１５は、ＰＣＴ出願公開WO 96/10581に詳細に記載されている。
に含まれ、該プラスミドは、ベクターｐＩＪ４８６中にストレプトマイセス・ノ
ガラター由来のノガラマイシンクロモフォアに対する遺伝子を含有する。ｐＳＹ
１５は、ＰＣＴ出願公開WO 96/10581に詳細に記載されている。
【００３７】 ｐＳＹ２１は、ｐＩＪ４８６中にｐＳＹ１５からの３.５ｋｂ ＳａｃＩ−Ｂｇ
ｌＩＩ ＤＮＡフラグメントをサブクローニングすることにより得た（Ylihonko
ら，1996）。
ｌＩＩ ＤＮＡフラグメントをサブクローニングすることにより得た（Ylihonko
ら，1996）。
【００３８】 ＥＢ３は、ｐＩＪ４８６中に挿入されたＲｄｍ６（ＰＣＴ出願公開WO92/16629
）の６ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを含有するプラスミドである
。該挿入体は、１１−ヒドロキシラーゼに対する遺伝子、１０−デメチラーゼに
対する遺伝子、１０−ヒドロキシラーゼに対する遺伝子、アミノメチラーゼに対
する遺伝子（ｒｄｍＤ）およびシクラーゼに対する不完全遺伝子（ｒｄｍＡ）を
含有する。最後の２つの遺伝子、ｒｄｍＤおよびｒｄｍＡは、アクラビノン修飾
に関与しない。
）の６ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを含有するプラスミドである
。該挿入体は、１１−ヒドロキシラーゼに対する遺伝子、１０−デメチラーゼに
対する遺伝子、１０−ヒドロキシラーゼに対する遺伝子、アミノメチラーゼに対
する遺伝子（ｒｄｍＤ）およびシクラーゼに対する不完全遺伝子（ｒｄｍＡ）を
含有する。最後の２つの遺伝子、ｒｄｍＤおよびｒｄｍＡは、アクラビノン修飾
に関与しない。
【００３９】 ｐＪＮ０２８は、遺伝子ｒｄｍＢ、Ｃ、Ｄ用の発現構築物である。２.８ｋｂ
ＳｔｙＩフラグメントをｐＩＪＥ４８７中にクローン化した（Niemi および Man
tsala，1995）。
ＳｔｙＩフラグメントをｐＩＪＥ４８７中にクローン化した（Niemi および Man
tsala，1995）。
【００４０】 ｐＪＮ０１８は、ｐＩＪ４８７中にクローン化されたＥＢ３の２.７ｋｂ Ｐｐ
ｕＭＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを含有するプラスミドである。ライゲーション
のために、平滑末端を用いた。該挿入体は、１１−ヒドロキシラーゼに対する完
全遺伝子を含有する（Niemi および Mantsala，1995）。
ｕＭＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを含有するプラスミドである。ライゲーション
のために、平滑末端を用いた。該挿入体は、１１−ヒドロキシラーゼに対する完
全遺伝子を含有する（Niemi および Mantsala，1995）。
【００４１】 栄養培地および溶液
【００４２】 ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）（シグマ（Ｓ
ＩＧＭＡ）） ＤＭＳＯ １ｍｌ当たり５０μｇのチオストレプトン（シグマ）貯蔵溶液。
ＩＧＭＡ）） ＤＭＳＯ １ｍｌ当たり５０μｇのチオストレプトン（シグマ）貯蔵溶液。
【００４３】 ＴＳＢ（トリプトン−大豆ブロス） １リットル当たり：オキソイド（Oxoid）トリプトン−大豆ブロス粉末３０ｇ
。 ＩＳＰ４ Ｂａｃｔｏ ＩＳＰ培地４、ディフコ（Difco）；３７ｇ／リットル
。 Ｅ１ １リットル当たり：グルコース２０ｇ、デンプン２０ｇ、ファーマメデ
ィア（Farmamedia）５ｇ、酵母エキス２.５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏ １.３ｇ、
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ、ＮａＣｌ ３ｇ、ＣａＣＯ3 ３ｇ。１リットルになる
まで水道水を添加し、ｐＨを７.４に調節する。
。 ＩＳＰ４ Ｂａｃｔｏ ＩＳＰ培地４、ディフコ（Difco）；３７ｇ／リットル
。 Ｅ１ １リットル当たり：グルコース２０ｇ、デンプン２０ｇ、ファーマメデ
ィア（Farmamedia）５ｇ、酵母エキス２.５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏ １.３ｇ、
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ、ＮａＣｌ ３ｇ、ＣａＣＯ3 ３ｇ。１リットルになる
まで水道水を添加し、ｐＨを７.４に調節する。
【００４４】 実施例１ ストレプトマイセス・ガリレウスＡＴＣＣ ３１６１５の突然変異
誘発および該突然変異株の特徴付け 突然変異誘発のために、ストレプトマイセス・ガリレウスＡＴＣＣ ３１６１
５を、２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中、ＴＳＢ培地５０ｍｌで培養し
た。突然変異誘発のための全てのフラスコには、培養の間、菌糸を分散させるた
めに瓶の底に糸を入れた。該株の培養は、振盪器中、３０℃、３３０ｒｐｍで２
日間行った。培養物１ｍｌを、さらに、ＴＳＢ ５０ｍｌを入れた次の瓶に接種
し、培養を１日間（３０℃、３３０ｒｐｍ）続けた。この若い培養物を２％Ｎa
ＯＨでｐＨ８.５に調節し、ＮＴＧ ８００μｇ／ｍｌを添加して、３７℃で２０
分間、細胞に作用させた。株の突然変異誘発培養物を２つの管に分け、３００ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離した。合わせたペレットを用いて、ＴＳＢ培地５０ｍｌ
に接種した。３０℃、３３０ｒｐｍで１日間培養した後、全培養物を遠心分離し
、ＴＳＢ培地１０ｍｌに懸濁した。細胞懸濁液の力価は、ＩＳＰ４平板上で、適
当な希釈物、例えば、１：１０希釈物を平板培養することにより測定した。突然
変異誘発培養物のコロニーを野生型のコロニーと比較し、野生型とは異なった特
徴を示しているものをさらなる特徴付けのために選択した。
誘発および該突然変異株の特徴付け 突然変異誘発のために、ストレプトマイセス・ガリレウスＡＴＣＣ ３１６１
５を、２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中、ＴＳＢ培地５０ｍｌで培養し
た。突然変異誘発のための全てのフラスコには、培養の間、菌糸を分散させるた
めに瓶の底に糸を入れた。該株の培養は、振盪器中、３０℃、３３０ｒｐｍで２
日間行った。培養物１ｍｌを、さらに、ＴＳＢ ５０ｍｌを入れた次の瓶に接種
し、培養を１日間（３０℃、３３０ｒｐｍ）続けた。この若い培養物を２％Ｎa
ＯＨでｐＨ８.５に調節し、ＮＴＧ ８００μｇ／ｍｌを添加して、３７℃で２０
分間、細胞に作用させた。株の突然変異誘発培養物を２つの管に分け、３００ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離した。合わせたペレットを用いて、ＴＳＢ培地５０ｍｌ
に接種した。３０℃、３３０ｒｐｍで１日間培養した後、全培養物を遠心分離し
、ＴＳＢ培地１０ｍｌに懸濁した。細胞懸濁液の力価は、ＩＳＰ４平板上で、適
当な希釈物、例えば、１：１０希釈物を平板培養することにより測定した。突然
変異誘発培養物のコロニーを野生型のコロニーと比較し、野生型とは異なった特
徴を示しているものをさらなる特徴付けのために選択した。
【００４５】 突然変異体のうちの１つをＨ０７５と命名した。寒天プレート上に深い黄色で
出現したので、野生型ストレプトマイセス・ガリレウスＡＴＣＣ ３１６１５と
は異なるものであった。野生型と異なる他の特徴は、見出されなかった。
出現したので、野生型ストレプトマイセス・ガリレウスＡＴＣＣ ３１６１５と
は異なるものであった。野生型と異なる他の特徴は、見出されなかった。
【００４６】 選択した突然変異体をＥ１培地６０ｍｌ中で４日間（２８℃、３３０ｒｐｍ）
培養した。１Ｍリン酸緩衝液２５０μｌをＥ１培養物２５０μｌに添加し、該ペ
レットを遠心分離により上清から分取した。該ペレットを、室温で１時間振盪す
ることにより、トルエン−メタノール（１：１）５００μｌにより抽出した。リ
ン酸緩衝液２５０μｌを添加し、遠心分離することにより、有機相を水から分取
した。有機相の１０μｌ試料をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）プレート（キ
ーゼルゲル（Kieselgel）６０、メルク（Merck））上に適用し、トルエン：酢酸
エチル：メタノール：ギ酸（５０：５０：１５：３）により展開させた。該突然
変異株の培養物から得られた主要化合物からは、０.０１６のＲｆ値が得られ、
一方、野生型の主要化合物からは、各々、アクラシノマイシンＡ、ＹおよびＢを
示す０.１１、０.１３および０.２３のＲｆ値が得られた。加水分解フラクショ
ンから得られたアクラビノンの量と比較したアクラビノングリコシドの合計量は
、野生型により産生されたものの少なくとも５倍であった。
培養した。１Ｍリン酸緩衝液２５０μｌをＥ１培養物２５０μｌに添加し、該ペ
レットを遠心分離により上清から分取した。該ペレットを、室温で１時間振盪す
ることにより、トルエン−メタノール（１：１）５００μｌにより抽出した。リ
ン酸緩衝液２５０μｌを添加し、遠心分離することにより、有機相を水から分取
した。有機相の１０μｌ試料をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）プレート（キ
ーゼルゲル（Kieselgel）６０、メルク（Merck））上に適用し、トルエン：酢酸
エチル：メタノール：ギ酸（５０：５０：１５：３）により展開させた。該突然
変異株の培養物から得られた主要化合物からは、０.０１６のＲｆ値が得られ、
一方、野生型の主要化合物からは、各々、アクラシノマイシンＡ、ＹおよびＢを
示す０.１１、０.１３および０.２３のＲｆ値が得られた。加水分解フラクショ
ンから得られたアクラビノンの量と比較したアクラビノングリコシドの合計量は
、野生型により産生されたものの少なくとも５倍であった。
【００４７】 実施例２ アクラビノン修飾を引き起こすプラスミドの構築およびプラスミド
のＨ０７５への形質転換
のＨ０７５への形質転換
【００４８】 ２.１ 一般的な方法 Ｈ０７５産生物のアグリコン部分であるアクラビノンの修飾を引き起こすプラ
スミドを表２に挙げる。該遺伝子の供給源として用いたプラスミドは、「使用材
料」の項において上記している。該プラスミドを関連するストレプトマイセス・
リビダンスＴＫ２４株から単離し、好都合な制限部位を用いて遺伝子融合を行っ
た。製造者の指示に従ってＭＢＩファーメンタス（Fermentas）の制限酵素を用
いて消化を行った。平滑末端ライゲーションのために、挿入体および適当な制限
酵素で消化したベクターを、製造者により推奨された条件を用いて５'−付着末
端の充填を行い得るようにヌクレオチドの存在下においてクレノウ（Klenow）ポ
リメラーゼ（ウィスコンシン州マディソンのプロメガ・コーポレーション（Prom
ega Corp.））で処理した。該ベクターをＣＩＡＰ（ウシ腸アルカリホスファタ
ーゼ（Calf Intestinal Alkaline Phosphatase）、プロメガ（Promega））で処
理して、５'−末端からホスフェートを除去し、ベクター分子の分子内閉鎖を防
止した。ライゲーションは、製造者の指示に従って、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（プ
ロメガ）により行った。
スミドを表２に挙げる。該遺伝子の供給源として用いたプラスミドは、「使用材
料」の項において上記している。該プラスミドを関連するストレプトマイセス・
リビダンスＴＫ２４株から単離し、好都合な制限部位を用いて遺伝子融合を行っ
た。製造者の指示に従ってＭＢＩファーメンタス（Fermentas）の制限酵素を用
いて消化を行った。平滑末端ライゲーションのために、挿入体および適当な制限
酵素で消化したベクターを、製造者により推奨された条件を用いて５'−付着末
端の充填を行い得るようにヌクレオチドの存在下においてクレノウ（Klenow）ポ
リメラーゼ（ウィスコンシン州マディソンのプロメガ・コーポレーション（Prom
ega Corp.））で処理した。該ベクターをＣＩＡＰ（ウシ腸アルカリホスファタ
ーゼ（Calf Intestinal Alkaline Phosphatase）、プロメガ（Promega））で処
理して、５'−末端からホスフェートを除去し、ベクター分子の分子内閉鎖を防
止した。ライゲーションは、製造者の指示に従って、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（プ
ロメガ）により行った。
【００４９】 ２.２ プラスミド構築 ｐＲｄｍ５１： １１位でアクラビノンのヒドロキシル化を引き起こす遺伝子
（ｒｄｍＥ）をｐＪＮ０１８から誘導した。プラスミドｐＪＮ０１８をＢａｍＨ
Ｉ制限酵素で消化し、ｐＩＪＥ４８６のＢａｍＨＩ部位でライゲートした。Ｘｈ
ｏＩを用いてｅｒｍＥプロモーターと平行な配向を確認して、２.２ｋｂおよび
７ｋｂのフラグメントを得た。
（ｒｄｍＥ）をｐＪＮ０１８から誘導した。プラスミドｐＪＮ０１８をＢａｍＨ
Ｉ制限酵素で消化し、ｐＩＪＥ４８６のＢａｍＨＩ部位でライゲートした。Ｘｈ
ｏＩを用いてｅｒｍＥプロモーターと平行な配向を確認して、２.２ｋｂおよび
７ｋｂのフラグメントを得た。
【００５０】 ｐＲｄｍ５２は、ＰＣＲ法によりＥＢ３からの９００ｂｐ ＤＮＡフラグメン
トを増幅することにより作製した。増幅領域と隣接するヌクレオチド配列は、５
'−ＡＣＡＴＧＴＣＣＧＡＡＣＧＣＡＴＣＧＴＧＣＣＧ−３'および５'−ＡＧＣ
ＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＡＣＧＡＴＧ−３'であった。ＢａｍＨＩおよび
ＸｂａＩについての制限部位を、増幅した領域の末端に導入し、該フラグメント
を決定された配向でｐＩＪＥ４８７にクローン化した。
トを増幅することにより作製した。増幅領域と隣接するヌクレオチド配列は、５
'−ＡＣＡＴＧＴＣＣＧＡＡＣＧＣＡＴＣＧＴＧＣＣＧ−３'および５'−ＡＧＣ
ＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＡＣＧＡＴＧ−３'であった。ＢａｍＨＩおよび
ＸｂａＩについての制限部位を、増幅した領域の末端に導入し、該フラグメント
を決定された配向でｐＩＪＥ４８７にクローン化した。
【００５１】 ｐＲｄｍ５３： ｐＪＮ０１８をＢａｍＨＩで消化し、その２.８ｋｂフラグ
メントの末端を平滑化した。該フラグメントを平滑末端化ｐＲｄｍ５２（クレノ
ウ酵素で処理したＨｉｎｄＩＩＩ部位）においてクローン化した。
メントの末端を平滑化した。該フラグメントを平滑末端化ｐＲｄｍ５２（クレノ
ウ酵素で処理したＨｉｎｄＩＩＩ部位）においてクローン化した。
【００５２】 ｐＲｄｍ５４： ＢｇｌＩＩで消化することによりＥＢ３から６ｋｂ ＤＮＡ
フラグメントを分取し、該フラグメントをｐＩＪＥ４８６のＢａｍＨＩ部位にク
ローン化した。ｅｒｍＥプロモーター下での発現のために遺伝子の配向を決定す
るために、ＭｌｕＩ部位を用いた。
フラグメントを分取し、該フラグメントをｐＩＪＥ４８６のＢａｍＨＩ部位にク
ローン化した。ｅｒｍＥプロモーター下での発現のために遺伝子の配向を決定す
るために、ＭｌｕＩ部位を用いた。
【００５３】 ｐＳＹＲ１： ｐＳＹ２１においてｐＪＮ０１８からの１１−ヒドロキシラー
ゼに対する遺伝子を有するＤＮＡフラグメントをサブクローニングすることによ
り、アクラビノンの９位および１１位で修飾を引き起こすプラスミドを構築した
。ｐＪＮ０１８をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、５'−末端をクレ
ノウポリメラーゼにより平滑化した。該２.９ｋｂフラグメントをｐＳＹ２１の
平滑化ＸｂａＩ部位にライゲートした。ｒｄｍＥの発現は、それ自体のプロモー
ターにより促進されたので、クローン化したフラグメントの配向は、重要ではな
かった。
ゼに対する遺伝子を有するＤＮＡフラグメントをサブクローニングすることによ
り、アクラビノンの９位および１１位で修飾を引き起こすプラスミドを構築した
。ｐＪＮ０１８をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、５'−末端をクレ
ノウポリメラーゼにより平滑化した。該２.９ｋｂフラグメントをｐＳＹ２１の
平滑化ＸｂａＩ部位にライゲートした。ｒｄｍＥの発現は、それ自体のプロモー
ターにより促進されたので、クローン化したフラグメントの配向は、重要ではな
かった。
【００５４】 ｐＳＹＲ２： ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩによりプラスミドｐＲｄｍ５２か
ら１.２ｋｂ ＤＮＡフラグメントを消化した。該フラグメントを平滑末端として
ｐＳＹ２１にクローン化した。
ら１.２ｋｂ ＤＮＡフラグメントを消化した。該フラグメントを平滑末端として
ｐＳＹ２１にクローン化した。
【００５５】 ｐＳＹＲ３： ３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを平滑末端
ライゲーションとしてｐＳＹ２１においてクローン化した。
ライゲーションとしてｐＳＹ２１においてクローン化した。
【００５６】 ｐＳＹＲ４： ｐＲｄｍ５４をＢｇｌＩＩで消化し、ｅｒｍＥプロモーターを
含有する６.２ｋｂ ＤＮＡフラグメントを、ＸｂａＩで消化し、クレノウポリメ
ラーゼにより平滑末端化したｐＳＹ２１中にライゲートした。
含有する６.２ｋｂ ＤＮＡフラグメントを、ＸｂａＩで消化し、クレノウポリメ
ラーゼにより平滑末端化したｐＳＹ２１中にライゲートした。
【００５７】 ｐＳＹＲ５： ｐＲｄｍ５３からの３ｋｂ ＢｇｌＩＩフラグメントを、ｐＳ
Ｙ２１の平滑末端化ＸｂａＩ部位においてクローン化した。
Ｙ２１の平滑末端化ＸｂａＩ部位においてクローン化した。
【００５８】 ２.３ 形質転換プロトコール ライゲーション混合物をプロトプラスト形質転換によりストレプトマイセス・
リビダンスＴＫ２４に導入し、該プラスミドをミニプレップ（miniprep）法（Ho
pwoodら，1985）により確認した。いくつかのプラスミドについて、適当な制限
部位を用いて、配向が、ｅｒｍＥプロモーターから下流に向かうことを確認した
。
リビダンスＴＫ２４に導入し、該プラスミドをミニプレップ（miniprep）法（Ho
pwoodら，1985）により確認した。いくつかのプラスミドについて、適当な制限
部位を用いて、配向が、ｅｒｍＥプロモーターから下流に向かうことを確認した
。
【００５９】 適切なプラスミド構築物をＴＫ２４から単離し、ストレプトマイセス・ガリレ
ウスＨ０３９に導入した。ストレプトマイセス・ガリレウス株のプロトプラスト
形質転換のために用いた技法は、ＰＣＴ出願公開WO96/10581に記載されている。
Ｈ０３９中で増幅した該プラスミドを、次いで、ストレプトマイセス・ガリレウ
スＨ０７５に導入して、特徴的なアントラサイクリンのための修飾反応を生じた
。１１種類の形質転換株「Ｈ０７５クローン」が得られ、これらをＨ０７５−ｐ
ＪＮ０２８、Ｈ０７５−ｐＳＹ２１、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ１、Ｈ０７５−ｐＳＹ
Ｒ２、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ３、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ４、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ５、
Ｈ０７５−ｐＲｄｍ５１、Ｈ０７５−ｐＲｄｍ５２、Ｈ０７５−ｐＲｄｍ５３お
よびＨ０７５−ｐＲｄｍ５４と命名した。
ウスＨ０３９に導入した。ストレプトマイセス・ガリレウス株のプロトプラスト
形質転換のために用いた技法は、ＰＣＴ出願公開WO96/10581に記載されている。
Ｈ０３９中で増幅した該プラスミドを、次いで、ストレプトマイセス・ガリレウ
スＨ０７５に導入して、特徴的なアントラサイクリンのための修飾反応を生じた
。１１種類の形質転換株「Ｈ０７５クローン」が得られ、これらをＨ０７５−ｐ
ＪＮ０２８、Ｈ０７５−ｐＳＹ２１、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ１、Ｈ０７５−ｐＳＹ
Ｒ２、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ３、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ４、Ｈ０７５−ｐＳＹＲ５、
Ｈ０７５−ｐＲｄｍ５１、Ｈ０７５−ｐＲｄｍ５２、Ｈ０７５−ｐＲｄｍ５３お
よびＨ０７５−ｐＲｄｍ５４と命名した。
【００６０】 実施例３ ストレプトマイセス・ガリレウスＨ０７５クローンにより蓄積され
た化合物の産生、単離および精製
た化合物の産生、単離および精製
【００６１】 ３.１ アントラサイクリン産生のための培養条件 チオストレプトン（１０μｇ／ｍｌ）で補足したＥ１培地６０ｍｌを含有する
２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ２個にＨ０７５クローンの平板培養物を
接種した。４〜５日後、該フラスコを用いて、チオストレプトン（１０μｇ／ｍ
ｌ）で補足したＥ１培地１３リットルを含有するバイオスタット（Biostat）発
酵容器に接種し、発酵を４〜６日間行った（３３０ｒｐｍ、３０℃、通気速度１
３リットル／分）。
２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ２個にＨ０７５クローンの平板培養物を
接種した。４〜５日後、該フラスコを用いて、チオストレプトン（１０μｇ／ｍ
ｌ）で補足したＥ１培地１３リットルを含有するバイオスタット（Biostat）発
酵容器に接種し、発酵を４〜６日間行った（３３０ｒｐｍ、３０℃、通気速度１
３リットル／分）。
【００６２】 ３.２ アントラサイクリンの単離および精製 発酵ブロス（１３リットル）を１Ｍリン酸緩衝液でｐＨ７.０に調節し、遠心
分離により菌糸をブロスから分取した。菌糸を２回メタノール（２×１リットル
）で抽出した。メタノール抽出物を上清と合わせ、混合物をｐＨ７.５でジクロ
ロメタン／メタノール（３：１）で２回抽出した。合わせた有機相を真空濃縮し
、粘性残留物をクロロホルム：酢酸（９９：１）に溶解し、シリカフラッシュカ
ラム（５ｃｍ）に負荷した。該カラムをメタノールの漸増する直線勾配液で展開
した。純粋なフラクションを合せ、ｐＨ７.０のリン酸緩衝液で中和し、水で２
回洗浄した。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。残留物を酢酸エチル
に溶解し、ヘキサンを用いて沈殿させた。沈殿した固体を真空下で乾燥させた。
分離により菌糸をブロスから分取した。菌糸を２回メタノール（２×１リットル
）で抽出した。メタノール抽出物を上清と合わせ、混合物をｐＨ７.５でジクロ
ロメタン／メタノール（３：１）で２回抽出した。合わせた有機相を真空濃縮し
、粘性残留物をクロロホルム：酢酸（９９：１）に溶解し、シリカフラッシュカ
ラム（５ｃｍ）に負荷した。該カラムをメタノールの漸増する直線勾配液で展開
した。純粋なフラクションを合せ、ｐＨ７.０のリン酸緩衝液で中和し、水で２
回洗浄した。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。残留物を酢酸エチル
に溶解し、ヘキサンを用いて沈殿させた。沈殿した固体を真空下で乾燥させた。
【００６３】 ３.３ 新規化合物の構造 ＮＭＲスペクトルから収集したデータに従って、純粋なアントラサイクリンの
構造を決定した。ＮＭＲデータのシグナルを表３〜６に示す。図１および図２に
は、Ｈ０７５−４ａの1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。得ら
れたシグナルをＨ０７５産生物アクラビノン−Ｒｈｎ−ｄＦ−ｄＦから得たシグ
ナルと比較し、この差異から新規化合物の構造解明を推定した。
構造を決定した。ＮＭＲデータのシグナルを表３〜６に示す。図１および図２に
は、Ｈ０７５−４ａの1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。得ら
れたシグナルをＨ０７５産生物アクラビノン−Ｒｈｎ−ｄＦ−ｄＦから得たシグ
ナルと比較し、この差異から新規化合物の構造解明を推定した。
【００６４】 アントラサイクリンの構造は、表３〜６に示されたＮＭＲデータから推定した
。
。
【００６５】
【表４】
【００６６】
【表５】
【００６７】
【表６】
【００６８】
【表７】
【００６９】
【表８】
【００７０】
【表９】
【００７１】
【表１０】
【００７２】 分子の個々の変化は、以下のとおりＮＭＲスペクトル（上記表３、４、５およ
び６）の変化として示された。
び６）の変化として示された。
【００７３】 アグリコン部分の変化： Ｒ9： Ｒ9でのメチルは、エチル側鎖により生じる１.３−１.８ｐｐｍでの連
結した多重項および三重項１ｐｐｍの代わりに１.２０−１.３５ｐｐｍでの水素
３個の一重項を示す。
結した多重項および三重項１ｐｐｍの代わりに１.２０−１.３５ｐｐｍでの水素
３個の一重項を示す。
【００７４】 Ｒ10： Ｒ10での置換基の除去は、炭素スペクトルにおけるＣ−１５およびＣ
−１６の欠損シグナルおよびメトキシ基からの欠損一重項として示される。脱カ
ルボキシル化化合物（Ｈ０７５−７、８、９および１２）は、ＣＨ2基により生
じる二重の二重項および二重項を示し、ヒドロキシル化化合物（Ｈ０７５−２、
６、１０および１１）は、４.５−４.８ｐｐｍでの水素１個の一重項を示す。
−１６の欠損シグナルおよびメトキシ基からの欠損一重項として示される。脱カ
ルボキシル化化合物（Ｈ０７５−７、８、９および１２）は、ＣＨ2基により生
じる二重の二重項および二重項を示し、ヒドロキシル化化合物（Ｈ０７５−２、
６、１０および１１）は、４.５−４.８ｐｐｍでの水素１個の一重項を示す。
【００７５】 Ｒ11： １１位のヒドロキシル化は、Ｈ−１１の欠損シグナルとして示される
。
。
【００７６】 糖部分の変化： 中性グリコシドは、Ｃ3の基Ｎ(ＣＨ3)2により生じる６Ｈの欠損一重項のため
に同定される。
に同定される。
【００７７】 該単糖類および二糖類は、三糖類からのスペクトルと比較し、第１の糖として
ロドサミンまたはデオキシフコースのいずれかを有することが見出され、全ての
場合、第２の糖は、二糖類においてデオキシフコースであることが見出された。
ロドサミンまたはデオキシフコースのいずれかを有することが見出され、全ての
場合、第２の糖は、二糖類においてデオキシフコースであることが見出された。
【００７８】 化合物Ｈ０７５−８ａ、−２ｂ、−２ａ、−３ｄ、−４ａ、−１１ｂ、−５ｅ
、−２ｄ、−１１ｅ、−６ｂ、−６ｃ、および−１０ａは、これらの基準に従っ
て、式ＩＩで示される化合物と同定された。
、−２ｄ、−１１ｅ、−６ｂ、−６ｃ、および−１０ａは、これらの基準に従っ
て、式ＩＩで示される化合物と同定された。
【００７９】 実施例４ インビトロでの細胞毒性活性 ４.１ 新規化合物のインビトロ・スクリーニング ４.１.１ 細胞培養物 新規アントラサイクリンの細胞毒性を２つのセルライン：ヒト子宮肉腫ＭＥＳ
−ＳＡ（ＣＲＬ−１９７６；アメリカ合衆国、メリーランド州、ロックヴィルの
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ））およびＭＥＳ−
ＳＡ／Ｄｘ５（ＣＲＬ−１９７７；アメリカ合衆国、メリーランド州、ロックヴ
ィルのＡＴＣＣ）を用いてインビトロで試験した。ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５は、濃
度が漸増するドキソルビシン中でＭＥＳ−ＳＡ細胞を増殖させることにより開発
された（Harker および Sikic，1985）。選択された変異株は、ドキソルビシン
に対して１００倍の耐性を有し、また、いくつかの他の細胞毒性薬剤に対して顕
著な交差耐性を示す（多剤耐性、ＭＤＲ）。
−ＳＡ（ＣＲＬ−１９７６；アメリカ合衆国、メリーランド州、ロックヴィルの
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ））およびＭＥＳ−
ＳＡ／Ｄｘ５（ＣＲＬ−１９７７；アメリカ合衆国、メリーランド州、ロックヴ
ィルのＡＴＣＣ）を用いてインビトロで試験した。ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５は、濃
度が漸増するドキソルビシン中でＭＥＳ−ＳＡ細胞を増殖させることにより開発
された（Harker および Sikic，1985）。選択された変異株は、ドキソルビシン
に対して１００倍の耐性を有し、また、いくつかの他の細胞毒性薬剤に対して顕
著な交差耐性を示す（多剤耐性、ＭＤＲ）。
【００８０】 単層培養物を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、ギブコ・ビーアールエル（Gibc
o BRL））で補足したＬ−グルタミン（ギブコ・ビーアールエル）を有するマッ
コイの５Ａ培地（McCoy's 5A medium）中で増殖させた。抗生物質は、全く添加
しなかった。耐性が少なくとも２０継代の間安定であるので、ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄ
ｘ５細胞は、アントラサイクリン選択なしで増殖させた（HarkerおよびSikic，1
985）。細胞を５％ＣＯ2を用いて３７℃に維持し、３−５日ごとに継代培養した
。
o BRL））で補足したＬ−グルタミン（ギブコ・ビーアールエル）を有するマッ
コイの５Ａ培地（McCoy's 5A medium）中で増殖させた。抗生物質は、全く添加
しなかった。耐性が少なくとも２０継代の間安定であるので、ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄ
ｘ５細胞は、アントラサイクリン選択なしで増殖させた（HarkerおよびSikic，1
985）。細胞を５％ＣＯ2を用いて３７℃に維持し、３−５日ごとに継代培養した
。
【００８１】 ４.１.２ 細胞毒性アッセイ ９６ウエルのマイクロタイタープレート（透明な底を有する無菌の白色プレー
ト、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ケンブリッジのコーニング・コース
ター・コーポレイション（Corning Costar Corporation））中で細胞毒性試験を
行った。アントラサイクリンをエタノール１０μｌ中で該プレートにピペットで
加え、対照プレートのためには純粋なエタノールを用いた。ダウノルビシンおよ
びアクラルビシンを陽性対照として用いた。エタノールを蒸発させた後、細胞を
適当な培地１００μｌ中で該プレート中に接種した。ウエル当たりの接種細胞の
数は、ＭＥＳ−ＳＡについては２５００個、ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５については３
０００個、ＬＬ／２については３０００個、Ｂ１６−Ｆ０およびＢ１６−Ｆ１に
ついては２０００個、ＫＬＮ−２０５については２０００個、ならびに、ＭＬＴ
Ｃ−１については８０００個であった。５％ＣＯ2を用いて３７℃で３日間細胞
をインキュベートした後、細胞のＡＴＰ含有量を測定した。
ト、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ケンブリッジのコーニング・コース
ター・コーポレイション（Corning Costar Corporation））中で細胞毒性試験を
行った。アントラサイクリンをエタノール１０μｌ中で該プレートにピペットで
加え、対照プレートのためには純粋なエタノールを用いた。ダウノルビシンおよ
びアクラルビシンを陽性対照として用いた。エタノールを蒸発させた後、細胞を
適当な培地１００μｌ中で該プレート中に接種した。ウエル当たりの接種細胞の
数は、ＭＥＳ−ＳＡについては２５００個、ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５については３
０００個、ＬＬ／２については３０００個、Ｂ１６−Ｆ０およびＢ１６−Ｆ１に
ついては２０００個、ＫＬＮ−２０５については２０００個、ならびに、ＭＬＴ
Ｃ−１については８０００個であった。５％ＣＯ2を用いて３７℃で３日間細胞
をインキュベートした後、細胞のＡＴＰ含有量を測定した。
【００８２】 ４.１.３ ルミネッセンスＡＴＰ検出 プレートをひっくり返して増殖培地を取り出し、ＡＴＰ抽出試薬ソマライゼ（
Somalyze）２００μｌをウエルに添加した。次いで、プレートを室温で３０分間
インキュベートした。２２℃でルミノスキャン・ルミノメーター（Luminoskan l
uminometer）（フィンランド国、ヘルシンキのラブシステムズ・オサケ・ユキチ
ュア（Labsystems Oy））を用いてＡＴＰ測定を行った。ルシフェリンおよびル
シフェラーゼを含有するＡＴＰモニタリング試薬２０μｌを分注し、各ウエルに
ついて、２秒の遅延時間を有する１０秒の積分測定（integral measurement）を
行った。用いた全ての試薬は、フィンランド国、トゥルクのバイオ−オービット
・オサケ・ユキチュア（Bio-Orbit Oy）から入手した。
Somalyze）２００μｌをウエルに添加した。次いで、プレートを室温で３０分間
インキュベートした。２２℃でルミノスキャン・ルミノメーター（Luminoskan l
uminometer）（フィンランド国、ヘルシンキのラブシステムズ・オサケ・ユキチ
ュア（Labsystems Oy））を用いてＡＴＰ測定を行った。ルシフェリンおよびル
シフェラーゼを含有するＡＴＰモニタリング試薬２０μｌを分注し、各ウエルに
ついて、２秒の遅延時間を有する１０秒の積分測定（integral measurement）を
行った。用いた全ての試薬は、フィンランド国、トゥルクのバイオ−オービット
・オサケ・ユキチュア（Bio-Orbit Oy）から入手した。
【００８３】 直接ルミノメーター出力（相対的な光単位、ＲＬＵ）を用いて、細胞毒性効果
を算出した。この光シグナルは、広範囲にわたって、ＡＴＰの量に正比例する（
バイオ−オービットＡＴＰ標準を用いて測定した、データは、示さない）。他方
、ＡＴＰの量は、生存細胞の量に正比例する（Kangasら，1984）。結果は、未処
理細胞の対照値のパーセンテージとして表す。ＩＣ50値（未処理対照シグナルの
５０％のＡＴＰシグナルを生じる薬物濃度）を対照の％対薬物濃度プロットから
グラフにより評価した。
を算出した。この光シグナルは、広範囲にわたって、ＡＴＰの量に正比例する（
バイオ−オービットＡＴＰ標準を用いて測定した、データは、示さない）。他方
、ＡＴＰの量は、生存細胞の量に正比例する（Kangasら，1984）。結果は、未処
理細胞の対照値のパーセンテージとして表す。ＩＣ50値（未処理対照シグナルの
５０％のＡＴＰシグナルを生じる薬物濃度）を対照の％対薬物濃度プロットから
グラフにより評価した。
【００８４】 ４.１.４ 新規アントラサイクリンのインビトロ活性
【００８５】
【表１１】
【００８６】 表７に従って、Ｈ０７５−４ａは、研究したヒトセルラインに対して潜在的な
活性を示す。その活性は、アクラルビシンのものと同様である。アミノ糖（ａ、
ｂ、ｃ）を有する化合物は、全て、ＭＥＳ−ＳＡに対して活性を示した。さらに
また、二糖類ｄＦ−ｄＦ（ｅ）を有するアントラサイクリンは、ＭＥＳ−ＳＡに
対して中程度の活性を示した。
活性を示す。その活性は、アクラルビシンのものと同様である。アミノ糖（ａ、
ｂ、ｃ）を有する化合物は、全て、ＭＥＳ−ＳＡに対して活性を示した。さらに
また、二糖類ｄＦ−ｄＦ（ｅ）を有するアントラサイクリンは、ＭＥＳ−ＳＡに
対して中程度の活性を示した。
【００８７】 ４.２ Ｈ０７５−４ａについてのさらなる研究 ４.２.１ マウスセルラインに対するインビトロ活性 Ｈ０７５−４ａは、また、数種類のマウスセルライン（全て、アメリカ合衆国
、メリーランド州、ロックヴィルのＡＴＣＣから購入した）：ルイス（Lewis）
肺癌（ＬＬ／２）（ＣＲＬ−１６４２）、Ｂ１６−Ｆ０黒色腫（ＣＲＬ−６３２
２）、Ｂ１６−Ｆ１黒色腫（ＣＲＬ−６３２３）、ＫＬＮ−２０５肺扁平上皮癌
（ＣＲＬ−１４５３）およびＭＬＴＣ−１ライディヒ細胞腫（ＣＲＬ−２０６５
）を用いて、参照としてダウノマイシン、アクラルビシンおよびＨ０７５−１ａ
（ＭＡ １４４Ｕ１）を用いて、インビトロで試験した。
、メリーランド州、ロックヴィルのＡＴＣＣから購入した）：ルイス（Lewis）
肺癌（ＬＬ／２）（ＣＲＬ−１６４２）、Ｂ１６−Ｆ０黒色腫（ＣＲＬ−６３２
２）、Ｂ１６−Ｆ１黒色腫（ＣＲＬ−６３２３）、ＫＬＮ−２０５肺扁平上皮癌
（ＣＲＬ−１４５３）およびＭＬＴＣ−１ライディヒ細胞腫（ＣＲＬ−２０６５
）を用いて、参照としてダウノマイシン、アクラルビシンおよびＨ０７５−１ａ
（ＭＡ １４４Ｕ１）を用いて、インビトロで試験した。
【００８８】 全ての細胞を、単層として増殖させ、各セルラインについてのＡＴＣＣの標準
的な指示に従って５％ＣＯ2を用いて３７℃で培養した：ＬＬ／２は、４.５ｇ／
リットル グルコースおよび１０％ＦＣＳを有するダルベッコの改変イーグル培
地中で、Ｂ１６−Ｆ０およびＢ１６−Ｆ１は、可欠アミノ酸および１０％ＦＣＳ
を有するアールのＢＢＳ中のＭＥＭ（イーグル）中で、ＫＬＮ−２０５は、可欠
アミノ酸および１０％ＦＣＳを有するアールのＢＳＳ中のＭＥＭ（イーグル）中
で、ＭＬＴＣ−１は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０％ＦＢＳを有するＲＰＭ
Ｉ １６４０中で。全ての培地は、ギブコ・ビーアールエルから購入し、血清は
、ギブコ・ビーアールエル・ウシ胎児血清であった。
的な指示に従って５％ＣＯ2を用いて３７℃で培養した：ＬＬ／２は、４.５ｇ／
リットル グルコースおよび１０％ＦＣＳを有するダルベッコの改変イーグル培
地中で、Ｂ１６−Ｆ０およびＢ１６−Ｆ１は、可欠アミノ酸および１０％ＦＣＳ
を有するアールのＢＢＳ中のＭＥＭ（イーグル）中で、ＫＬＮ−２０５は、可欠
アミノ酸および１０％ＦＣＳを有するアールのＢＳＳ中のＭＥＭ（イーグル）中
で、ＭＬＴＣ−１は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０％ＦＢＳを有するＲＰＭ
Ｉ １６４０中で。全ての培地は、ギブコ・ビーアールエルから購入し、血清は
、ギブコ・ビーアールエル・ウシ胎児血清であった。
【００８９】 細胞毒性アツセイおよびＡＴＰモニターリングは、ヒトセルラインについて記
載したと同様の方法で行った。
載したと同様の方法で行った。
【００９０】
【表１２】
【００９１】 表８から推定されるように、化合物Ｈ０７５−４ａは、試験した種々のセルラ
インに対して活性である。活性は、アクラルビシンの活性と同様である。
インに対して活性である。活性は、アクラルビシンの活性と同様である。
【００９２】 ４.２.２ フローサイトメトリー（Ｈ０７５−４ａの作用形態） 懸濁培養において増殖しているＬ１２１０マウスリンパ性白血病細胞を、５％
ＣＯ2を用いて３７℃で、４.５ｇ／リットル グルコース１０％ＦＢＳを有する
ダルベッコの改変イーグル培地中で指数増殖下に維持した。該実験は、２５ｃｍ 2 の細胞培養フラスコにエタノール溶解したアントラサイクリンを適当な最終濃
度になるような量で添加することにより開始した。エタノールを蒸発させた後、
細胞約５００００個／ｍｌの懸濁液５ｍｌをフラスコに添加した。フローサイト
メトリー分析は、初期の細胞懸濁液ならびに１、２および３日の薬物を用いるか
または用いないインキュベーションの後からなっていた。
ＣＯ2を用いて３７℃で、４.５ｇ／リットル グルコース１０％ＦＢＳを有する
ダルベッコの改変イーグル培地中で指数増殖下に維持した。該実験は、２５ｃｍ 2 の細胞培養フラスコにエタノール溶解したアントラサイクリンを適当な最終濃
度になるような量で添加することにより開始した。エタノールを蒸発させた後、
細胞約５００００個／ｍｌの懸濁液５ｍｌをフラスコに添加した。フローサイト
メトリー分析は、初期の細胞懸濁液ならびに１、２および３日の薬物を用いるか
または用いないインキュベーションの後からなっていた。
【００９３】 細胞を、Vindelovら（1985）の方法に従ってフローサイトメトリーＤＮＡ分析
のために調製した。該分析は、エピックス（Epics）ＸＬフローサイトメーター
（フロリダ州マイアミのコールター・コーポレイション（Coulter Corporation
））を用いて行った。試料を１５ｍＶの空冷アルゴンイオンレーザー（４８８ｎ
ｍ）で照明し、ヨウ化プロピジウムの蛍光を６２０ｎｍバンドパスフィルター（
band pass filter）を介して検出した。各試料中の細胞の数は、細胞懸濁液５０
μｌに内部校正物（１×１０6フルオレスブライト（Fluoresbrite）ビーズ／ｍ
ｌを含有する溶液５０μｌ）を添加することにより、別々に計数した。
のために調製した。該分析は、エピックス（Epics）ＸＬフローサイトメーター
（フロリダ州マイアミのコールター・コーポレイション（Coulter Corporation
））を用いて行った。試料を１５ｍＶの空冷アルゴンイオンレーザー（４８８ｎ
ｍ）で照明し、ヨウ化プロピジウムの蛍光を６２０ｎｍバンドパスフィルター（
band pass filter）を介して検出した。各試料中の細胞の数は、細胞懸濁液５０
μｌに内部校正物（１×１０6フルオレスブライト（Fluoresbrite）ビーズ／ｍ
ｌを含有する溶液５０μｌ）を添加することにより、別々に計数した。
【００９４】 フローサイトメトリー研究をベースとして、研究した細胞についての細胞周期
が検出できた。Ｇ１期は、ＲＮＡおよびタンパク質合成のための段階であり、複
製のためではない。Ｇ１期からＳ期への変転は、複製の開始を意味し、該期は、
ＤＮＡの全てが複製されるまで続く。Ｓ期から有糸分裂（Ｍ）までの期間は、Ｇ
２期である。ハイブリッドアントラサイクリンＨ０７５−４ａは、アクラルビシ
ンと同様にＧ１期において細胞を分裂停止した。これは、複製の開始がこの化合
物により防止されたことを示唆している。
が検出できた。Ｇ１期は、ＲＮＡおよびタンパク質合成のための段階であり、複
製のためではない。Ｇ１期からＳ期への変転は、複製の開始を意味し、該期は、
ＤＮＡの全てが複製されるまで続く。Ｓ期から有糸分裂（Ｍ）までの期間は、Ｇ
２期である。ハイブリッドアントラサイクリンＨ０７５−４ａは、アクラルビシ
ンと同様にＧ１期において細胞を分裂停止した。これは、複製の開始がこの化合
物により防止されたことを示唆している。
【００９５】
【表１３】
【００９６】 実施例５ インビボでの細胞毒性活性：白血病モデル デンマーク国、リのエム・アンド・ビー・アクティー・ゼルスカブ（M & B A/
S）から購入したＤＢＡ／２ＪＢｏｍ雌性マウスにおいて連続腹腔内（ｉ.ｐ.）
移植により、Ｐ３８８白血病を維持した。該動物をユニバーシティ・オブ・トゥ
ルク、セントラル・アニマル・ラボラトリーの施設に維持した。該動物ユニット
の管理は、以下のガイドラインをベースとし、それに従う：“European Convent
ion for the protection of Vertebrate Animals used for Experimental and o
ther Scientific Purposes, European Treaty Series No. 123 (EU No. 609/86)
, Official Journal of European Communities No. L 358, Strasbourg 24th No
vember 1986”および“The Statute No. 1360/90 of the Finnish Law, Helsink
i 21st December 1990: Asetus kokeellisiin ja muihin tieteellisiin tarkoi
tuksiin kaytettavien selkaran-kaisten elainten suojelemiseksi tehdyn eur
ooppalaisen yleissopimuksen voimaansaat-tamisesta. Suomen saadoskokoelma
”。
S）から購入したＤＢＡ／２ＪＢｏｍ雌性マウスにおいて連続腹腔内（ｉ.ｐ.）
移植により、Ｐ３８８白血病を維持した。該動物をユニバーシティ・オブ・トゥ
ルク、セントラル・アニマル・ラボラトリーの施設に維持した。該動物ユニット
の管理は、以下のガイドラインをベースとし、それに従う：“European Convent
ion for the protection of Vertebrate Animals used for Experimental and o
ther Scientific Purposes, European Treaty Series No. 123 (EU No. 609/86)
, Official Journal of European Communities No. L 358, Strasbourg 24th No
vember 1986”および“The Statute No. 1360/90 of the Finnish Law, Helsink
i 21st December 1990: Asetus kokeellisiin ja muihin tieteellisiin tarkoi
tuksiin kaytettavien selkaran-kaisten elainten suojelemiseksi tehdyn eur
ooppalaisen yleissopimuksen voimaansaat-tamisesta. Suomen saadoskokoelma
”。
【００９７】 インビボ試験は、０日目にダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水に懸濁したＰ３
８８細胞１０6個をマウスにｉ.ｐ.注射することにより開始した。マウス３匹の
グループを用いた。１日目に、個々の体重に基づいて薬物をｉ.ｐ.投与した。対
照グループには、ビヒクル（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水中１０％エタノ
ール）を投与した。動物の生存時間を記録し、表１０に示す。このデータに従っ
て、本発明の化合物は、ダウノマイシンの活性と比較して高い活性を示す。
８８細胞１０6個をマウスにｉ.ｐ.注射することにより開始した。マウス３匹の
グループを用いた。１日目に、個々の体重に基づいて薬物をｉ.ｐ.投与した。対
照グループには、ビヒクル（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水中１０％エタノ
ール）を投与した。動物の生存時間を記録し、表１０に示す。このデータに従っ
て、本発明の化合物は、ダウノマイシンの活性と比較して高い活性を示す。
【００９８】
【表１４】
【００９９】 寄託した微生物： 以下の微生物を、ＤＭＳＺ（ドイツ国、Ｄ−３８１２４ブ
ラウンシュヴェイク、マシェロダー・ヴェク・１ベーのドイッチェ・サムルンク
・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ゼルクルツレンＧｍｂＨ）にてブダ
ペスト条約の規則の下に寄託した。
ラウンシュヴェイク、マシェロダー・ヴェク・１ベーのドイッチェ・サムルンク
・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ゼルクルツレンＧｍｂＨ）にてブダ
ペスト条約の規則の下に寄託した。
【０１００】 微生物 受託番号 寄託日 ストレプトマイセス・ガリレウスＨ０７５ DSM 11638 1997年6月30日
【０１０１】 引用文献 Bibb, M.J., Janssen, G.R. および Ward, J.M. (1985)。Cloning and analys
is of the promoter region of the erythromycin resistance gene (ermE) of
Streptomyces erythraeus. Gene 38, 215-226。 Harker W.G. および Sikic B.I. (1985)。Multidrug (pleiotropic) resistan
ce in doxorubicin-selected variants of the human sarcoma cell line MES-S
A. Cancer Research 45, 4091-4096。 Hopwood, D.A., Bibb, M.J., Chater, K.F., Kieser, T., Bruton, C.J., Ki
eser, H.M., Lydiate, D.J., Smith, C.P., Ward, J.M. および Schrempf, H. (
1985)。Genetic manipulations of Streptomyces: a laboratory manual. The J
ohn Innes Foundation, Norwich, United Kingdom。 Hoshino, T., Tazoe, M., Nomura, S. および Fujiwara A. (1982)。New anth
racycline antibiotics, auramycins and sulfurmycins. II. Isolation and ch
aracterization of 10 minor components. J. Antibiot. 35, 1271-1279。 Kangas L., Gronroos M. および Nieminen A.-L. (1984)。Bioluminescence o
f cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. M
ed. Biol. 62, 338-343。 Matsuzawa, Y., Yoshimoto, A., Shibamoto, N., Tobe, H., Oki, T., Nagana
wa, H., Takeuchi, T., および Umezawa, H. (1981)。New anthracycline metab
olites from mutant strains of Streptomyces galilaeus MA144-M1. II Struct
ure of 2-hydroxyaklavinone and new aklavinone glycosides. J. Antibiot. 3
4, 959-964。 Niemi, J. および Mantsala, P. (1995) Nucleotide sequences and expressi
on of genes from Streptomyces purpurascens that cause the production of
new anthracyclines in Streptomyces galilaeus. J. Bacteriol. 177, 2942-29
45。 Oki, T., Matsuzawa, Y., Yoshimoto, a., Numata, K., Kitamura, I., Hori,
S., Takamatsu, A., Umezawa, H., Ishizuka, M., Naganawa, H., Suda, H., H
amada, M. および Takeuchi, T. (1975)。New antitumor antibiotics, aclacin
omycins A and B. J. Antibiot. 28, 830-834。 Oki, T., Shibamoto, N., Matsuzawa, Y., Ogasawara, T., Yoshimoto, A., K
itamura, I., Inui, T., Naganawa, H., Takeuchi, T. および Umezawa, H. (19
77). Production of nineteen anthracyclic compounds by Streptomyces galil
aeus MA144-M1. J. Antibiot. 30, 683-687。 Streliz, F., Flon, H., Weiss, U, および Asheshov, I.N (1956)。Aklavin,
an antibiotic substance with antiphage activity. J. Bacteriol. 72, 90-9
3。 Vindelov, L.L., Christensen, I.J. および Nissen, N.I. (1985)。A deterg
ent-trypsin method for the preparation of nuclei for flow cytometric DNA
analysis. Cytometry 6, 348-356。 Ward, J.M., Janssen, G.R., Kieser, T., Bibb, M.J., Buttner, M.J., およ
び Bibb, M.J. (1986)。Construction and characterization of a series of m
ulticopy promoter-probe plasmid vectors for Streptomyces using the amino
glycoside phosphotransferase from Tn5 as indicator. Mol. Gen. Genet. 203
, 468-478。 Ylihonko K., Hakala J., Niemi J., Lundell J. および Mantsala P. (1994)
。Isolation and characterization of aclacinomycin A-non-producing Strep
tomyces galilaeus (ATCC 31615) mutants. Microbiol. 140, 1359-1365。 Ylihonko K., Tuikkanen J., Jussila S., Cong L., Mantsala P. (1996) 。A
gene cluster involved in nogalamycin biosynthesis from Streptomyces nog
alater: sequence analysis and complementation of early blocked mutations
of anthracycline pathway. Mol. Gen. Genet. 251, 113-120。 Yoshimoto, A., Matsuzawa, Y., Ishikura, T., Sawa, T., Takeuchi, T およ
び Umezawa, H. (1984)。New anthracycline derivatives from betaclamycin A
. J. Antibiot. 920-922。
is of the promoter region of the erythromycin resistance gene (ermE) of
Streptomyces erythraeus. Gene 38, 215-226。 Harker W.G. および Sikic B.I. (1985)。Multidrug (pleiotropic) resistan
ce in doxorubicin-selected variants of the human sarcoma cell line MES-S
A. Cancer Research 45, 4091-4096。 Hopwood, D.A., Bibb, M.J., Chater, K.F., Kieser, T., Bruton, C.J., Ki
eser, H.M., Lydiate, D.J., Smith, C.P., Ward, J.M. および Schrempf, H. (
1985)。Genetic manipulations of Streptomyces: a laboratory manual. The J
ohn Innes Foundation, Norwich, United Kingdom。 Hoshino, T., Tazoe, M., Nomura, S. および Fujiwara A. (1982)。New anth
racycline antibiotics, auramycins and sulfurmycins. II. Isolation and ch
aracterization of 10 minor components. J. Antibiot. 35, 1271-1279。 Kangas L., Gronroos M. および Nieminen A.-L. (1984)。Bioluminescence o
f cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. M
ed. Biol. 62, 338-343。 Matsuzawa, Y., Yoshimoto, A., Shibamoto, N., Tobe, H., Oki, T., Nagana
wa, H., Takeuchi, T., および Umezawa, H. (1981)。New anthracycline metab
olites from mutant strains of Streptomyces galilaeus MA144-M1. II Struct
ure of 2-hydroxyaklavinone and new aklavinone glycosides. J. Antibiot. 3
4, 959-964。 Niemi, J. および Mantsala, P. (1995) Nucleotide sequences and expressi
on of genes from Streptomyces purpurascens that cause the production of
new anthracyclines in Streptomyces galilaeus. J. Bacteriol. 177, 2942-29
45。 Oki, T., Matsuzawa, Y., Yoshimoto, a., Numata, K., Kitamura, I., Hori,
S., Takamatsu, A., Umezawa, H., Ishizuka, M., Naganawa, H., Suda, H., H
amada, M. および Takeuchi, T. (1975)。New antitumor antibiotics, aclacin
omycins A and B. J. Antibiot. 28, 830-834。 Oki, T., Shibamoto, N., Matsuzawa, Y., Ogasawara, T., Yoshimoto, A., K
itamura, I., Inui, T., Naganawa, H., Takeuchi, T. および Umezawa, H. (19
77). Production of nineteen anthracyclic compounds by Streptomyces galil
aeus MA144-M1. J. Antibiot. 30, 683-687。 Streliz, F., Flon, H., Weiss, U, および Asheshov, I.N (1956)。Aklavin,
an antibiotic substance with antiphage activity. J. Bacteriol. 72, 90-9
3。 Vindelov, L.L., Christensen, I.J. および Nissen, N.I. (1985)。A deterg
ent-trypsin method for the preparation of nuclei for flow cytometric DNA
analysis. Cytometry 6, 348-356。 Ward, J.M., Janssen, G.R., Kieser, T., Bibb, M.J., Buttner, M.J., およ
び Bibb, M.J. (1986)。Construction and characterization of a series of m
ulticopy promoter-probe plasmid vectors for Streptomyces using the amino
glycoside phosphotransferase from Tn5 as indicator. Mol. Gen. Genet. 203
, 468-478。 Ylihonko K., Hakala J., Niemi J., Lundell J. および Mantsala P. (1994)
。Isolation and characterization of aclacinomycin A-non-producing Strep
tomyces galilaeus (ATCC 31615) mutants. Microbiol. 140, 1359-1365。 Ylihonko K., Tuikkanen J., Jussila S., Cong L., Mantsala P. (1996) 。A
gene cluster involved in nogalamycin biosynthesis from Streptomyces nog
alater: sequence analysis and complementation of early blocked mutations
of anthracycline pathway. Mol. Gen. Genet. 251, 113-120。 Yoshimoto, A., Matsuzawa, Y., Ishikura, T., Sawa, T., Takeuchi, T およ
び Umezawa, H. (1984)。New anthracycline derivatives from betaclamycin A
. J. Antibiot. 920-922。
【図１】 化合物Ｈ０７５−４ａの1Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル。
【図２】 化合物Ｈ０７５−４ａの13Ｃ−ＮＭＲ−スペクトル。
【図３】 ＭＥＳ−ＳＡセルラインに対する化合物Ｈ０７５−４ａの活性。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 19/56 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｎ 15/00 (72)発明者 テロ・クンナリ フィンランド、エフイーエン−20810トゥ ルク、クピッターンカトゥ97番、アーエス ６ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA05 EA04 GA11 HA20 4B064 AF49 BH04 BH05 CA03 CA19 CC24 DA05 4C057 AA17 BB04 CC03 JJ51 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA10 MA01 MA04 NA14 ZB26
Claims (8)
- 【請求項１】 式ＩＩ： 【化１】 ［式中、 Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ3であり、Ｒ2は、ＣＯＯＣＨ3であり、Ｒ3は、ＯＨであり、
Ｒ4は、Ｒｈｎ−ｄＦ−ｄＦである（＝Ｈ０７５−４ａ）か、または Ｒ1は、ＣＨ3であり、Ｒ2は、ＯＨであり、Ｒ3は、ＯＨであり、Ｒ4は、Ｒｈ
ｎ−ｄＦである（＝Ｈ０７５−１１ｂ）か、または Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ3であり、Ｒ2は、Ｈであり、Ｒ3は、Ｈであり、Ｒ4は、Ｒｈ
ｎ−ｄＦ−ｄＦである（＝Ｈ０７５−８ａ）か、または Ｒ1は、ＣＨ3であり、Ｒ2は、ＯＨであり、Ｒ3は、Ｈであり、Ｒ4は、Ｒｈｎ
−ｄＦである（＝Ｈ０７５−６ｂ）か、または Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ3であり、Ｒ2は、ＯＨであり、Ｒ3は、Ｈであり、Ｒ4は、Ｒ
ｈｎ−ｄＦである（＝Ｈ０７５−２ｂ）であるか、または Ｒ1は、ＣＨ3であり、Ｒ2は、ＯＨであり、Ｒ3は、ＯＨであり、Ｒ4は、ｄＦ
−ｄＦである（＝Ｈ０７５−１１ｅ）か、または Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ3であり、Ｒ2は、ＯＨであり、Ｒ3は、Ｈであり、Ｒ4は、Ｒ
ｈｎ−ｄＦ−ｄＦである（＝Ｈ０７５−２ａ）か、または Ｒ1は、ＣＨ3であり、Ｒ2は、ＯＨであり、Ｒ3は、Ｈであり、Ｒ4は、Ｒｈｎ
である（＝Ｈ０７５−６ｃ）か、または Ｒ1は、ＣＨ3であり、Ｒ2は、ＣＯＯＣＨ3であり、Ｒ3は、ＯＨであり、Ｒ4は
、ｄＦ−ｄＦである（＝Ｈ０７５−５ｅ）か、 Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ3であり、Ｒ2は、ＯＨであり、Ｒ3は、Ｈであり、Ｒ4は、ｄ
Ｆ−ｄＦ−ｄＦである（＝Ｈ０７５−２ｄ）か、または Ｒ1は、ＣＨ3であり、Ｒ2は、ＣＯＯＣＨ3であり、Ｒ3は、Ｈであり、Ｒ4は、
ｄＦ−ｄＦ−ｄＦである（＝Ｈ０７５−３ｄ）か、または Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ3であり、Ｒ2は、ＯＨであり、Ｒ3は、ＯＨであり、Ｒ4は、
Ｒｈｎ−ｄＦ−ｄＦである（＝Ｈ０７５−１０ａ）］ で示される癌治療に有用なアントラサイクリン化合物。 - 【請求項２】 Ｒ1がＣＨ2ＣＨ3であり、Ｒ2がＣＯＯＣＨ3であり、Ｒ3がＯ
Ｈであり、Ｒ4がＲｈｎ−ｄＦ−ｄＦである（＝Ｈ０７５−４ａ）か、または Ｒ1がＣＨ3であり、Ｒ2がＯＨであり、Ｒ3がＯＨであり、Ｒ4がＲｈｎ−ｄＦ
である（＝Ｈ０７５−１１ｂ）か、または Ｒ1がＣＨ2ＣＨ3であり、Ｒ2がＯＨであり、Ｒ3がＯＨであり、Ｒ4がＲｈｎ−
ｄＦ−ｄＦである（＝Ｈ０７５−１０ａ）請求項１記載のアントラサイクリン化
合物。 - 【請求項３】 式ＩＩＩ： 【化２】 ［式中、Ｒ1は、ＣＨ3またはＣＨ2ＣＨ3であり、Ｒ2は、ＨまたはＯＨであり、
Ｒ3は、ＨまたはＯＨである］ で示される化合物アクラビノン−Ｒｈｎ−ｄＦ−ｄＦの誘導体。 - 【請求項４】 ストレプトマイセス・ガリレウス（Streptomyces galilaeus
）宿主Ｈ０７５に、アクラビノン骨格の９、１０および１１位のうちの少なくと
も１つの位置の置換基を変化させることができるノガラマイシンおよび／または
ロドマイシン生合成のための遺伝子を導入し、 該遺伝子を発現できる条件下、得られた株を培養し、 産生されたハイブリッドアントラサイクリンを回収することを特徴とするハイ
ブリッドアントラサイクリンの生成方法。 - 【請求項５】 式ＩＩ： 【化３】 ［式中、Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ3またはＣＨ3であり、Ｒ2は、ＣＯＯＣＨ3、Ｈまたは
ＯＨであり、Ｒ3は、ＯＨまたはＨであり、Ｒ4は、Ｒｈｎ−ｄＦ−ｄＦ、Ｒｈｎ
−ｄＦ、Ｒｈｎ、ｄＦ−ｄＦ−ｄＦ、またはｄＦ−ｄＦであり、ここで、Ｒｈｎ
は、ロドサミンであり、ｄＦは、デオキシフコースである］ で示される化合物の生成のための請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 式ＩＩ： 【化４】 ［式中、Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ3であり、Ｒ2は、ＣＯＯＣＨ3であり、Ｒ3は、Ｈであ
り、Ｒ4は、Ｒｈｎ−ｄＦ−ｄＦ、Ｒｈｎ−ｄＦ、Ｒｈｎ、ｄＦ−ｄＦ−ｄＦ、
またはｄＦ−ｄＦであり、ここで、Ｒｈｎは、ロドサミンであり、ｄＦは、デオ
キシフコースである］ で示されるアントラサイクリンの生成方法であって、該アントラサイクリンを産
生できる条件下でストレプトマイセス・ガリレウスＨ０７５（ＤＳＭ １１６３
８）株を培養し、産生されたアントラサイクリンを回収することを特徴とするア
ントラサイクリンの生成方法。 - 【請求項７】 ストレプトマイセス・ガリレウスＨ０７５（ＤＳＭ １１６
３８）。 - 【請求項８】 構築が実施例２に記載されているプラスミドｐＳＹ２１、ｐ
ＪＮ０２８、ｐＳＹＲ１、ｐＳＹＲ２、ｐＳＹＲ３、ｐＳＹＲ４、ｐＳＹＲ５、
ｐＲｄｍ５１、ｐＲｄｍ５２、ｐＲｄｍ５３およびｐＲｄｍ５４においてクロー
ン化された遺伝子組合わせの少なくとも１つを有するストレプトマイセス・ガリ
レウスＨ０７５株。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI981062A FI105554B (fi) | 1998-05-13 | 1998-05-13 | Geenimuunnelluista Streptomyces galilaeus-kannoista saatavat hybridiantrasykliinit |
| FI981062 | 1998-05-13 | ||
| PCT/FI1999/000385 WO1999058544A1 (en) | 1998-05-13 | 1999-05-10 | Hybrid anthracyclines from genetically engineered streptomyces galilaeus strains |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002514399A true JP2002514399A (ja) | 2002-05-21 |
| JP2002514399A5 JP2002514399A5 (ja) | 2006-06-15 |
Family
ID=8551716
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000548348A Withdrawn JP2002514399A (ja) | 1998-05-13 | 1999-05-10 | 遺伝子工学処理したストレプトマイセス・ガリレウス株由来のハイブリッドアントラサイクリン |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6399583B1 (ja) |
| EP (1) | EP1000078B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002514399A (ja) |
| AT (1) | ATE246198T1 (ja) |
| DE (1) | DE69909938T2 (ja) |
| DK (1) | DK1000078T3 (ja) |
| ES (1) | ES2205825T3 (ja) |
| FI (1) | FI105554B (ja) |
| WO (1) | WO1999058544A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006011485A1 (ja) * | 2004-07-27 | 2006-02-02 | Osaka Bioscience Institute | アミロイドペプチドの凝集を抑制する蛋白質とその作用 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2350597A1 (en) * | 1998-12-02 | 2000-06-08 | Barbara Ann Foster | Methods and compositions for restoring conformational stability of a protein of the p53 family |
| US7799904B2 (en) * | 2003-06-13 | 2010-09-21 | University Of Kentucky Research Foundation | Gilvocarcin gene cluster, recombinant production and use thereof |
| US20070270504A1 (en) * | 2003-06-20 | 2007-11-22 | Avalon Pharmaceuticals, Inc. | Identification of Therapeutic Agents Using Genetic Fingerprinting |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI93860C (fi) | 1991-03-25 | 1995-06-12 | Leiras Oy | Menetelmä antibioottien tuottamiseksi, siinä käyttökelpoisia DNA-jaksoja, yhdistelmä-DNA-konstruktioita ja näitä sisältäviä mikrobikantoja |
| KR0145943B1 (ko) | 1995-02-03 | 1998-08-01 | 김은영 | 아클라비논 c-11 히드록실라제, 그 유전자, 발현벡터 및 이를 이용한 하이브리드 항생제의 제조방법 |
-
1998
- 1998-05-13 FI FI981062A patent/FI105554B/fi not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-05-10 DK DK99923618T patent/DK1000078T3/da active
- 1999-05-10 AT AT99923618T patent/ATE246198T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-05-10 US US09/462,671 patent/US6399583B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-10 ES ES99923618T patent/ES2205825T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-10 JP JP2000548348A patent/JP2002514399A/ja not_active Withdrawn
- 1999-05-10 DE DE69909938T patent/DE69909938T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-10 EP EP99923618A patent/EP1000078B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-10 WO PCT/FI1999/000385 patent/WO1999058544A1/en active IP Right Grant
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006011485A1 (ja) * | 2004-07-27 | 2006-02-02 | Osaka Bioscience Institute | アミロイドペプチドの凝集を抑制する蛋白質とその作用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI105554B (fi) | 2000-09-15 |
| ATE246198T1 (de) | 2003-08-15 |
| FI981062A0 (fi) | 1998-05-13 |
| DE69909938T2 (de) | 2004-05-13 |
| DK1000078T3 (da) | 2003-11-17 |
| ES2205825T3 (es) | 2004-05-01 |
| WO1999058544A9 (en) | 2000-01-20 |
| DE69909938D1 (de) | 2003-09-04 |
| EP1000078A1 (en) | 2000-05-17 |
| FI981062A (fi) | 1999-11-14 |
| US6399583B1 (en) | 2002-06-04 |
| WO1999058544A1 (en) | 1999-11-18 |
| EP1000078B1 (en) | 2003-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Madduri et al. | Production of the antitumor drug epirubicin (4′-epidoxorubicin) and its precursor by a genetically engineered strain of Streptomyces peucetius | |
| DRAUTZ et al. | Metabolic products of microorganisms. 234 Urdamycins, new angucycline antibiotics from streptomyces fradiae I. Isolation, characterization and biological properties | |
| Gaisser et al. | Analysis of seven genes from the eryAI–eryK region of the erythromycin biosynthetic gene cluster in Saccharopolyspora erythraea | |
| Fujiwara et al. | Anthracycline antibiotics | |
| DRAUTZ et al. | Metabolic products of microorganisms. 225 elloramycin, a new anthracycline-like antibiotic from streptomyces olivaceus isolation, characterization, structure and biological properties | |
| US3686163A (en) | Dihydrodaunomycin antibiotic and derivatives thereof | |
| NO148959B (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av tumor-motvirkende antracyklinglykosidantibiotika, betegnet ma 144 | |
| Menéndez et al. | Tailoring modification of deoxysugars during biosynthesis of the antitumour drug chromomycin A3 by Streptomyces griseus ssp. griseus | |
| Cassinelli et al. | New anthracycline glycosides: 4-O-demethyl-11-deoxydoxorubicin and analogues from Streptomyces peucetius var. aureus | |
| Yoshimoto et al. | Microbial conversion of ε-pyrromycinone and ε-isorhodomycinone to 1-hydroxy-13-dihydrodaunomycin and N-formyl-1-hydroxy-13-dihydrodaunomycin and their bioactivities | |
| HU195979B (en) | Process for producing antracyclin derivatives and pharmaceutical compositions containing them | |
| US6399583B1 (en) | Hybrid anthracyclines from genetically engineered streptomyces galilaeus strains, process for production and uses thereof | |
| JOHDO et al. | Anthracycline metabolites from Streptomyces violaceus A262 I. Isolation of antibiotic-blocked mutants from Streptomyces violaceus A262 | |
| EP0030255B1 (en) | 2-hydroxyaclacinomycin a, pharmaceutical composition containing it; 2-hydroxyaclavinone and fermentative process for preparing same | |
| US4942155A (en) | Biosynthetic anthracyclines related to daunorubicin | |
| CA2547560A1 (en) | Polyketides and their synthesis | |
| Miyamoto et al. | Production of a new hybrid anthracycline 4-O-methylepelmycin by heterologous expression of dnrK in epelmycin-producing Streptomyces violaceus | |
| JP2012501663A (ja) | アントラサイクリン産生における生体内変換のための遺伝子組み換え菌株 | |
| Vetrivel et al. | Isolation and characterization of stable mutants of Streptomyces peucetius defective in daunorubicin biosynthesis | |
| KR100636653B1 (ko) | 신규한 올리보실 피크로마이신 유도체 및 그 제조방법 | |
| DK161338B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af 2-hydroxyaclacinomycin a, b og n eller syreadditionssalte deraf samt en rekombinant mikroorganisme til anvendelse derved | |
| KR0146968B1 (ko) | 신규 아클라시노마이신 화합물 및 그의 제조방법 | |
| Maezawa et al. | BIOLOGICAL GLYCOSIDATION OF MACROLIDE AGLYCONES. II ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF DESOSAMINYL-PLATENOLIDE I | |
| US4370474A (en) | 11-Deoxy-carminomycin compounds | |
| Nakagawa et al. | Microbial conversion of anthracyclinones to carminomycins by a blocked mutant of Actinomadura roseoviolacea |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060412 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060412 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20060621 |