JP2012501663A - アントラサイクリン産生における生体内変換のための遺伝子組み換え菌株 - Google Patents

Abstract

アントラサイクリン代謝産物を非天然アントラサイクリン抗生物質へと転化する微生物菌株。微生物菌株を使用してアントラサイクリン代謝産物をアントラサイクリン抗生物質へと転化するためのプロセス。
【選択図】なし

Description

本発明は、改善された微生物菌株、ならびにアントラサイクリン抗腫瘍性抗生物質、特にエピルビシンおよびイダルビシンの収率を改善するための、生体内変換プロセスにおけるその使用に関する。

ダウノマイシン類は、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ、Ｓ．ｃｏｅｒｕｌｏｒｕｂｉｄｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｃ５、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ、およびＳ．ｂｉｆｕｒｃｕｓなどのいつかのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．ｓｐによって産生される一群の抗腫瘍性抗生物質である。この群の基本化合物はダウノマイシンである（ＤｉＭａｒｃｏら、１９６４、非特許文献１）。ダウノマイシン類は、一般式Ｉによって記述することができる。

その最も重要な誘導体は表１に示される。

ダウノルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンの半合成誘導体は、非天然アントラサイクリン抗生物質として分類することができるであろう。なぜなら天然に存在する菌株はこれらのアントラサイクリンを産生しないからである。エピルビシンは、多くの種類の癌に対して臨床的に使用される。エピルビシンがドキソルビシンと競合するにつれて、市場は成長している。他の抗癌剤との新しい処方物、接合体および新しい合剤もエピルビシンの使用法を拡げる。エピルビシンは、例えば特許文献１に開示されるように、発酵によりダウノルビシンを生産し、そしてアグリコンおよび糖部分を合成的に修飾することを含むプロセスによって製造される。

イダルビシン（４−デメトキシ−ダウノルビシン）は、白血病、リンパ腫、および骨髄の他の疾患を含めた特定種の癌を治療するために使用される。これは、ドキソルビシンよりも副作用を引き起こさないと主張されている。しかしながら、イダルビシンについての全世界での年間市場は２０ｋｇ以下である。恐らくこれはその極めて高い価格に原因があり、この高い価格は非常に複雑な製造プロセスに起因する。イダルビシノンは、ダウノルビシンの発酵およびその後の酸による加水分解から得られるダウノマイシノンから出発して製造される。ダウノルビシノンは、イダルビシノンへとさらに合成的に修飾される。糖残基、ダウノサミン、は、例えば特許文献２に記載されるように、一連の複雑な合成反応により結合される。

ダウノルビシンおよびエピダウノルビシンなどの重要なアントラサイクリンの発酵産生において、中間体は発酵ブロスの中に蓄積する。両方の場合の典型的な中間体は、ε−ロドマイシノンである（Ｓｔｒｏｈｌら、１９８９、非特許文献２）。しかしながら、エピダウノルビシンは、遺伝子組み換え菌株を使用することにより発酵によって産生されうるので、１３−ジヒドロ−エピダウノルビシン（１３−ＤＨＥＤと呼ばれる）がその発酵ブロスの中に同時に蓄積される。典型的には、これらの代謝産物は廃棄物と考えられる。特許文献３は、ダウノルビシンを生産するためのε−ロドマイシノンの使用を開示し、Ｄｉｃｋｅｎｓら（１９９７）（非特許文献３）は１３−ジヒドロ−アントラサイクリン類をその１３−ケト体へと酸化することを記載している。非天然のアントラサイクリン類についてのプロセスにおける生体内変換を記載する刊行物は存在しない。

米国特許第５，８７４，５５０号明細書 米国特許第４，３２５，９４６号明細書 米国特許第５，６５２，１２５号明細書

Ｄｉ Ｍａｒｃｏ Ａ、Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｎｉ Ｒ、Ｇａｅｔａｎｉ Ｍ、Ｓｏｌｄａｔｉ Ｍ、Ｏｒｅｚｚｉ Ｐ、Ｄａｓｄｉａ Ｔ、Ｓｃａｒｐｉｎａｔｏ ＢＭ、Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ Ｌ、「’ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ’， ａ ｎｅｗ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｏｆ ｔｈｅ ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎ ｇｒｏｕｐ」、Ｎａｔｕｒｅ、１９６４年、第１５巻、７０６−７０７頁 Ｓｔｒｏｈｌ Ｗ．Ｒ、Ｂａｒｔｅｌ Ｐ、Ｃｏｎｎｏｒｓ ＮＣ、Ｚｈｕ Ｃ、Ｄｏｓｃｈ Ｄ、Ｂｅａｌｅ ＪＭ、Ｆｌｏｓｓ ＨＧ、Ｓｔｕｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ Ｋ、Ｏｔｔｅｎ ＳＬおよびＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ＣＲ、「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ ｂｙ ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ．」、Ｃ．Ｌ．Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ、ＳＷ ＱｕｅｅｎｅｒおよびＧ Ｈｅｇｅｍａｎ（編集） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８９年、６８−８４頁 Ｄｉｃｋｅｎｓ Ｍ、Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ ＮおよびＳｔｒｏｈｌ Ｗ、「Ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ε−ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎｏｎｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｔｏ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤａｕＰ， ＤａｕＫ， ａｎｄ ＤｏｘＡ」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９７年、第１７９巻、２６４１−２６５０頁

出願人らは、ダウノマイシンおよびエピダウノルビシンの発酵産生で得られる副生成物の利用によってより低いコストでより高い収率の商業的に重要な非天然のアントラサイクリン類、エピルビシンおよびイダルビシンを得るための新しいプロセスを見出した。

本発明は、エピダウノルビシン、１３−ジヒドロエピダウノルビシン、４’−エピフォイドマイシン（ｅｐｉ−ｆｅｕｄｏｍｙｃｉｎ）およびε−ロドマイシノンなどのアントラサイクリン代謝産物をエピルビシンおよびイダルビシンなどの非天然アントラサイクリン抗生物質へと転化する微生物菌株に関する。好ましくはこのような菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属から、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ種から、最も好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ亜種から選択される。本発明の好ましい実施形態では、当該菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｇａｌａｔｅｒ種から単離された異種耐性遺伝子ｓｎｏｒＯを含む。

本発明はまた、本発明に係る微生物菌株を使用する、１３−ジヒドロエピダウノルビシン、およびε−ロドマイシノンなどのアントラサイクリン代謝産物をエピルビシンおよびイダルビシンなどの非天然アントラサイクリン抗生物質へと転化するためのプロセスに関する。本発明に係る好ましい実施形態では、当該プロセスでは、好ましくはイオン性吸着剤および非イオン性吸着剤からなる群から、より好ましくはポリスチレンから、最も好ましくはＸＡＤ−７およびＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０からなる群から選択される樹脂が、アントラサイクリン代謝産物またはアントラサイクリン抗生物質を吸着するためにいつでも使用される。

アントラサイクリン類のダウノマイシン種についての生合成経路の概略図である。 アントラサイクリン類のダウノマイシン種についての生合成経路の概略図である。 本発明に係るエピルビシンおよびイダルビシンの生産のためのプロセスの概略図である。 ４−デオキシ−ε−ロドマイシノンを供給した後の本発明に係る生体内変換菌株の生産プロファイルを示すクロマトグラムである。Ｒｔ＝６．０：１３−ジヒドロ−イダルビシン、Ｒｔ＝６．９：イダルビシン、Ｒｔ＝８．１：１３−デオキシ−イダルビシン、Ｒｔ＝１１．０：４−デオキシ−ε−ロドマイシノン。

本発明は、修飾されたアントラサイクリン中間体を重要な抗腫瘍性アントラサイクリン薬物、イダルビシンおよびエピルビシンへと転化することができる改善されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ菌株に関する。この菌株は、アントラサイクリン代謝産物を最終生成物へと転化するためのプロセスにおいて有用である。

従って、高い率で４−デオキシ−ε−ロドマイシノンをイダルビシンへと安定に転化することができるように操作された、改善されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ菌株を提供することが本発明の目的である。ダウノルビシンを産生するようにブロックされたこのような菌株は、実施例１に記載されるように、菌株Ｇ００１（ＤＳＭ １２２４５）から誘導された（菌株Ｇ００１は野生型Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ ＡＴＣＣ ２７９５２の変異化によって誘導された）。菌株Ｇ００１から誘導されたこの改善された変異菌株は、４−デオキシ−ε−ロドマイシノンをイダルビシンへと転化することができるが、反復性は乏しい。転化を改善するために、耐性遺伝子がこの菌株へと導入された。

遺伝子ｓｎｏｒＯは、Ｓ．ｎｏｇａｌａｔｅｒ（ＡＴＣＣ ２７９５２）から単離されたものであり、ノガラマイシンに対する耐性に関与することが示唆されている（Ｔｏｒｋｋｅｌｌ ２００１）。配列解析に基づいて、遺伝子産物、ＳｎｏｒＯは、耐性のための多機能な遺伝子産物であり、除去修復タンパク質ＵｖｒＡ、およびＡＢＣトランスポーターＡＴＰ結合タンパク質のためのドメインを有する。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４におけるｓｎｏｒＯの異種発現は、この遺伝子はすべての試験された様々なアントラサイクリン、ノガラマイシン、アクラルビシンおよびダウノルビシンから当該菌株を保護するということを示した。遺伝子ｓｎｏｒＯを、Ｇ００１由来の改善された菌株に導入すると、イダルビシンに対する増加した耐性を呈する新しい生体内変換菌株がもたらされた。驚くべきことに、ｓｎｏｒＯは、Ｅ．ｃｏｌｉベクターの中でＧ００１由来の改善された菌株に導入されたとき、転化率を改善し、かつこの菌株を安定化して６回連続の培養においてさえも±１０％の範囲内で転化を維持した。

当該新しい生体内変換菌株は、アクラビノンおよびε−ロドマイシノンなどの天然のアントラサイクリン中間体を供給されでもよく、そして天然のアントラサイクリン、ダウノマイシンが形成される。

驚くべきことに、当該菌株は、非天然の代謝産物の転化を実施することができ、非天然の４−デオキシ−ε−ロドマイシノンを供給するとイダルビシンの形成をもたらした。加えて、当該菌株は１３−ＤＨＥＤをエピダウノルビシンへと転化することができる。ε−ロドマイシノンの、４−デオキシ−ε−ロドマイシノンへの合成的転化がもたらされる。本発明によれば、４−デオキシ−ε−ロドマイシノンは、その後、ダウノマイシン代謝産物を産生しない上記の新しい生体内変換菌株によってイダルビシンへと生体内変換される。１３−ＤＨＥＤはさらに、同じ変異菌株を使用する生体内変換によってエピダウノルビシンへと転化された。

本発明における使用に適した生体内変換菌株の重要な態様は以下のとおりである：
ｉ）天然および非天然の基質が転化のために受け容れられている；
ｉｉ）当該菌株は、天然および非天然のアントラサイクリンに対して増加した耐性を有する；
ｉｉｉ）当該菌株は、転化のために必要とされる必須の機能を成し遂げる、ならびに
ｉｖ）当該菌株は検出可能な量の天然のダウノマイシンを蓄積しない。

いずれの適切な菌株も、４−デオキシ−半合成中間体のイダルビシンへの生体内変換のために使用することができる。それにもかかわらず、当該菌株は、以下の反応のための内在性のまたは伝達された発現可能な遺伝子のいずれかを有することが非常に重要である：ダウノサミンを形成するためのグルコースの修飾、メチル基を除去するための１０−エステル分解酵素活性とこれに関連する１０−脱炭酸酵素活性、１３−オキシゲナーゼおよび適切な糖転移酵素活性。さらには、生体内変換後の下流プロセスは、生体内変換において宿主として使用された菌株によって天然のアントラサイクリン代謝産物はまったく蓄積されないかまたは少量しか蓄積されない場合にのみ、費用効率が高い。

ダウノマイシン生合成の初期段階でブロックされたＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ変異体；好ましくは最小ＰＫＳ（ｍｉｎｉｍａｌ ＰＫＳ）（最小ポリケタイド合成酵素（ｍｉｎｉｍａｌ ＰｏｌｙＫｅｔｉｄｅＳｙｎｔｈａｓｅ）はアントラサイクリンおよび他のＩＩ型ポリケチド経路における最初の反応、ポリケチド構造体（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ）を触媒する）でブロックされた変異体を使用することが有利である。

上記のとおり野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ ＡＴＣＣ ２７９５２から誘導される新しい生体内変換菌株が非常に好ましい菌株であるが、以下の特徴を共有するいずれの菌株も本発明に係る転化プロセスに適している。

１． ダウノマイシンに向かう初期の経路でブロックされる。対応する遺伝子の相補実験に基づいた最小ＰＫＳのｄｐｓＧ遺伝子の破壊（データは示さず）。
２． 検出可能な量のダウノマイシンを生成しないが、固形培地上に酸性の黄色の物質を蓄積する。当該化合物の構造は知られていないが、これはアントラサイクリンのメンバーではない。
３． ＩＳＰ４＋ｔｓｒ−およびＩＳＰ２＋ｔｓｒ−プレート上で、生体内変換菌株は、通常、胞子形成せず、無色の気菌糸を形成する。
４． ｓｎｏｒＯ機能の結果としていくつかの異なるアントラサイクリンに対する耐性を発現する。
５． ４−デオキシ−ε−ロドマイシノンを２つの主生成物：イダルビシンおよび１３−ジヒドロイダルビシンに転化する。いくつかの他のイダルビシン代謝産物は、少量見出される。

本発明はさらに、短絡生成物（ｓｈｕｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔ）、つまりダウノルビシンおよびエピダウノルビシンの発酵産生において形成されるε−ロドマイシノン、およびエピダウノルビシンの発酵産生において形成される１３−ＤＨＥＤを活用することによる、非天然のアントラサイクリン抗生物質、エピルビシンおよびイダルビシンの産生のためのプロセスに関する。

従って、本発明に係る改善された細菌性宿主菌株を使用する生体内変換によって商業的に有用なアントラサイクリン抗生物質を調製するためのプロセスを提供することがさらなる本発明の目的である。好ましくは、このような宿主菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属から誘導された、好ましくはＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓから誘導された上記の新しい生体内変換菌株である。

当該技術分野で、イダルビシノンは例えば米国特許第７，０５３，１９１号明細書に記載されるような複雑な一連の化学合成によりイダルビシンへと転化できるということが知られている。本発明に係るプロセスでは、４−デオキシ−ε−ロドマイシノンをイダルビシンへと転化するための微生物菌種の内因性の一連の生合成反応が使用されることが好ましい。生合成は図１に示される順序で進行するということが知られている。いくつかのアントラサイクリンについての典型的な前駆体であるアクラビノンは１１位でヒドロキシル化されてε−ロドマイシノンを形成し、このε−ロドマイシノンはグリコシル化される。ロドサミンなどの他の糖残基が受け容れられた基質であるとしても、１０位での修飾がグリコシル化体について必要である。１０−位での修飾後、１３位での酸素化が起こり、ダウノルビシン生合成の最終工程はＣ−４でのＯ−メチル化である。驚くべきことに、前述の１０位および１３位の修飾ならびにグリコシル化は、４−デオキシ体にもかかわらず成功裏であった。４−デオキシアクラビノンおよび４−デオキシ−ε−ロドマイシノンはともに、適切な生体内変換菌株を使用してイダルビシンへと転化される。しかしながら、これらの修飾のための遺伝子産物は、Ｃ−１０での置換基がＣＯＯＣＨ_３基である基質を必要とする。

ダウノマイシン代謝産物の発酵プロセスの短絡生成物として得られるε−ロドマイシノンは、合成化学によって４−デオキシ−ε−ロドマイシノンへと処理される。ε−ロドマイシノンの４位からヒドロキシル基を除去するための種々の合成経路が可能である。しかしながら、出願人らは、ケタール化によるＣ７およびＣ９−ヒドロキシル基の保護によって出発することにより、４つの一連の反応を実施することが好ましいと考える。その後、Ｃ４のＯＨ基のトリフラート化（ｔｒｉｆｙｌａｔｉｏｎ）が行われ、次いでＣ４での置換基を除去するために還元される。各工程の後、生成物は、沈殿／結晶化によって単離または精製され、＞２０％、好ましくは＞３０％、最も好ましくは＞４０％の全収率が得られる。このプロセスで得られる４−デオキシ−ε−ロドマイシノンの純度は＞６０％であり、好ましくは＞８０％、最も好ましくは＞９０％が生体内変換のための適切な基質である。

ε−ロドマイシノンは、典型的には発酵ブロスの中に大量に蓄積され、従来の方法による精製がうまく進行する。ε−ロドマイシノンの合成による転化は、＞２０％、好ましくは＞３０％、最も好ましくは＞４０％の純粋な４−デオキシ−ε−ロドマイシノンを与え、この純粋な４−デオキシ−ε−ロドマイシノンはＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓの非生産性の変異菌株に供給される。４−デオキシ−ε−ロドマイシノンのイダルビシンへの生体内変換の効率は、＞２０％、好ましくは＞３０％、最も好ましくは＞４０％であった。１００ｍｇより多い半合成中間体を、当該生体内変換菌株の培養物１リットルに供給することができた。この中間体を供給する時期は重要ではない。ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）の増殖および二次代謝を許容するいずれの発酵条件も使用することができようが、６〜８のｐＨでＥ１培地および２５〜３５℃の温度範囲を使用することが有利である。

当該培養物からのイダルビシンの回収は、遠心分離、濾過などのいずれかの適切な方法を用いて、または適切なイオン性もしくは非イオン性の吸着剤によって実施することができる。イダルビシンの挿入のために、いずれの水溶性の有機溶媒を使用することもできようが、酸性のアルコールが好ましい。アグリコンは、酸性での抽出により除去され、その後、グリコシドは高ｐＨで水相からクロロホルム相へと逆抽出される。最後の抽出液のエバポレーション後の当該化合物のプロファイルに依存して、イダルビシンは、最後に結晶化によって、好ましくはクロマトグラフィおよび結晶化によって精製される。精製のためにシリカカラムを使用することが有利である。

（１３−ＤＨＥＤのエピダウノルビシンへの転化）
１３−ジヒドロ−アントラサイクリンが１３−ケト体と一緒に発酵ブロスに蓄積することは周知である。しかしながら、１３−ＤＨＥＤは、商業的に有用ではなく、その細胞毒性のため、毒性の廃棄物として扱われることになる。驚いたことに、この代謝産物は、天然の代謝産物ではないとしても、生体内変換菌株によって、有用な率、例えば＞２０％、好ましくは＞３０％、最も好ましくは＞４０％でエピダウノルビシンに転化された。

エピダウノルビシン発酵における副生成物である１３−ＤＨＥＤは、エピダウノルビシンの分離と並行に、クロマトグラフィおよびそれに続く結晶化によってグリコシド画分から容易に分離される。１３−ＤＨＥＤは、ダウノマイシン合成についての能力を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ菌株の培地に、とりわけ後期の工程で加えられた樹脂に吸着されうる。いずれの菌株も適切であるとはいえ、初期の生合成経路ではブロックされ、ダウノマイシン代謝産物を蓄積することができない菌株を使用することが有利である。

本発明の好ましい実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属から誘導された、好ましくはＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓから誘導された新しい生体内変換菌株は、１３−ＤＨＥＤをエピダウノルビシンに転化するための生体内変換に対して使用される。本発明に係るエピダウノマイシンの産生について記載される条件における転化率は、＞２０％、好ましくは＞３０％、最も好ましくは＞４０％である。このようにして得られるエピダウノルビシンは、アントラサイクリン回収のために使用されるいずれの従来の方法によって、当該樹脂に結合された他の代謝産物から精製されてもよいが、合成のために十分に精製されたエピダウノルビシンを提供するためにクロマトグラフィ、とりわけ逆相クロマトグラフィが使用されることが好ましい。

（エピダウノルビシンのエピルビシンへの転化）
粗製エピダウノルビシン（純度＞６０％、好ましくは＞８０％、最も好ましくは＞９０％）は、しばしば使用される抗癌剤であるエピルビシンを得るための合成化学のための出発物質として使用される。いずれの一連の合成反応または生体触媒反応も、１４−ヒドロキシル化のために使用してよい。

エピダウノルビシンをその１４−ヒドロキシル化体であるエピルビシンへと転化するためのいくつかの可能性がある。内在性の遺伝子産物のみ、つまり１４−ヒドロキシラーゼ、では、当該培養条件では、少量のエピルビシンしか培地中に見いだされないとしても、形成されたすべてのエピダウノルビシンをエピルビシンへと転化するほどに十分には活性ではない。出願人らの実験によれば（データは示さず）、１４−ヒドロキシラーゼについての遺伝子のはるかに高いコピーでも、エピルビシンの産生のためのプロセスを完結することができなかった。それにもかかわらず、２つの米国特許明細書、米国特許第５，９５５，３１９号明細書および米国特許第６，２１０，９３０号明細書は、ｄｏｘＡの遺伝子産物による低レベルでの、ダウノルビシンのドキソルビシンへの転化を開示する。明らかに、この生体内変換は条件に大きく依存し、出願人らはこのプロセスを反復することに成功していない。

ダウノルビシンからのドキソルビシンの合成と同様に、無修飾のエピダウノルビシンのＣ−１４にヒドロキシル基を付加するための種々の可能性がある。

エピルビシンの精製は、合成混合物からのエピルビシンの抽出後のクロマトグラフィによりおよび／または結晶化により実施される。しかしながら、医薬品有効成分にとって要求される品質を達成するために、エピルビシンを＞９７％純度で与えるためのクロマトグラフィによる分離が必須である。

本発明のより詳細な説明は、下記の実施例で与えられる。

技術が進歩するにつれて本発明の技術思想は種々の方法で実行されうるということは、当業者にとっては明らかであろう。本発明およびその実施形態は、下記の実施例に限定されず、特許請求の範囲の範囲内で変わりうる。

図１ａは、ダウノルビシンについての生合成経路を開示する。バウマイシンは、ダウノルビシンから形成される。この生合成経路は、ダウノルビシンの後、（ｉ）ドキソルビシンへ、および（ｉｉ）バウマイシンへと分岐する。これらの工程はこの図には示されていない。

図１ｂは、図１ａのＣ−７−グリコシル化のために使用されるｄＴＤＰ−ダウノサミンについての生合成経路を開示する。

図２は、生体内変換プロセスについてのスキームを開示する。

図３は、４−デオキシ−ε−ロドマイシノンを供給した後の生体内変換菌株の産生プロファイルを示すクロマトグラムを開示する。

（実施例１：生体内変換菌株の構築）
変異化のために、変異化によって野生型Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ ＡＴＣＣ ２７９５２から誘導された菌株Ｇ００１を２５０ｍｌの三角フラスコの中の５０ｍｌのＴＳＢ培地の中で培養した。変異生成のためのすべてのフラスコは、培養中に菌糸体を分散させるために、フラスコの底にストリング（ｓｔｒｉｎｇ）を具えていた。培養は、振盪機の中で３０℃、３３０ｒｐｍで２日間実施した。この培養物１ｍＬを、５０ｍｌのＴＳＢを含む次の瓶にさらに接種し、培養を１日続けた（３０℃、３３０ｒｐｍ）。ＮａＯＨを用いてこのより幼若な培養物をアルカリ性のｐＨにし、ＮＴＧを加えてこの細胞に＞３０℃で２０分間作用させた。この菌株の変異化した培養物を２つのチューブに分割し、遠心分離（３００ｒｐｍ、１０分間）によってペレット化した。合わせたペレットを使用して、５０ｍＬのＴＳＢ培地に接種した。１日後（３０℃、３３０ｒｐｍ）、この細胞懸濁液の力価は、適切な希釈物、例えば１：１０〜１：１０００００をＩＳＰ４−プレート上にプレーティングすることにより決定した。変異化した培養物のコロニーを野生型と比較し、当該野生型と明確に異なる特徴を呈するコロニーをさらなる特性解析のために選択した。

変異体は、ＩＳＰ４−寒天プレート上で暗赤色に着色された野生型から、薄い色に基づいて選択した。

遺伝子ｓｎｏｒＯ（Ｔｏｒｋｋｅｌｌ、２００１）を、大腸菌ベクター、ｐＣＮＢ３０３３を用いてこの変異体へと導入した。組み込みがａｔｔＰ部位により起こっていることが示唆された。得られた改善された生体内変換菌株は、実施例５で詳細に記載するように、＞２０％、好ましくは＞３０％、最も好ましくは＞４０という、供給された４−デオキシ−ε−ロドマイシノンのイダルビシン代謝産物への反復した転化率を与えた。

（実施例２：アントラサイクリン代謝産物の産生のためおよび生体内変換のための生体内変換菌株の培養）
実施例１に記載したようにして選択した適切な変異体を、吸着剤樹脂（１５ｇ／ｌ）を補った５０ｍＬのＥ１培地の中で培養した。（Ｅ１：水道水１リットルあたり：グルコース２０ｇ；可溶性デンプン２０ｇ；ペプチド５ｇ；酵母エキス２．５ｇ；Ｋ_２ＨＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏ １．３ｇ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １ｇ；ＮａＣｌ ３ｇ；ＣａＣＯ_３ ３ｇ；ｐＨ７〜７．５）。

アントラサイクリン代謝産物を測定するために、インキュベーションの１０日目に当該化合物を抽出した。分析のために、水を用いて１つの培養フラスコから吸着剤樹脂をデカンテーションし、洗浄した樹脂を、少なくとも３０分間振盪しながら４０ｍＬの酸性アルコールで抽出した。この試料を分析するためにＨＰＬＣを使用した。Ｅ１培地の中での吸着剤樹脂の使用は、当該条件におけるアントラサイクリン代謝産物の産生を増加させることが知られている。

この吸着剤の存在下で、培養の最後で、コロニーの形態の変化は見出されなかった。

アントラサイクリン代謝産物の産生は、当該変異菌株の培地の中では検出されなかった。

しかしながら、変異菌株は、図１の生合成経路に従うアグリコンのグリコシル化および修飾のための機能的生合成遺伝子を有し、これは食餌実験によって実証されたとおりである。天然のアグリコン、ε−ロドマイシノンおよびアクラビノンを当該変異菌株に供給すると（培地１リットルあたり少なくとも１００ｍｇのアグリコン）、供給したアグリコンは２日でダウノマイシン代謝産物へと転化された。しかしながら、この変異菌株に４−デオキシ−ε−ロドマイシノンを供給しても、イダルビシン代謝産物への反復的な転化を与えなかった。この不能の理由は、供給された産物または形成された産物に対する耐性が乏しいことによって引き起こされると示唆された。

この改善された生体内変換菌株は、予想したとおり、天然のアグリコン、ε−ロドマイシノンおよびアクラビノンを転化することができた。この菌株はまた、下記の実施例４に記載したように、非天然の類似の生合成中間体、４−デオキシ−ε−ロドマイシノンおよび１３−ＤＨＥＤをイダルビシンに、およびエピダウノルビシンに転化した。

（実施例３：ε−ロドマイシノンの４−デオキシ−ε−ロドマイシノンへの合成による転化）
＞６０％、好ましくは＞８０％、最も好ましくは＞９０％のクロマトグラフィによる純度の精製されたε−ロドマイシノンを、４−デオキシ−ε−ロドマイシノンの合成のために使用した。４−デオキシ−ε−ロドマイシノンの合成は、４工程からなる：Ａ）保護、Ｂ）トリフラート化、Ｃ）還元およびＤ）脱保護。

各工程後、生成物は、クロロホルム−メタノール混合物から沈殿／結晶化によって単離した。合成反応は、ＴＬＣでモニターした。

Ａ）保護
ε−ロドマイシノンを室温でクロロホルムに溶解した。２当量の２−メトキシプロペンを混合物に加え、次いで１当量のＴＭＳＣｌを加えた。反応をＴＬＣによって追跡した。ＴＬＣプレート上で検出してこの反応が完結したとき、この混合物を冷却し、沈殿物を集め、次の工程のために乾燥した。

Ｂ）トリフラート化
保護工程から得た出発物質をクロロホルムに溶解した。ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を加え、最後にＰｈＮＴｆ２を加えた。反応は、ＴＬＣを用いてモニターした。水およびクエン酸を混合物に加えることによりこの化合物を沈殿させた。沈殿物を濾過し、ＫＨＳＯ_４で洗浄した。結晶を濾過し、真空下で乾燥した。

Ｃ）還元
トリフラート化から得た物質を、アルゴン下でＣＡＮに懸濁させた。（Ｐｈ３Ｐ）４Ｐｈを加え、次いで（エチル）_３ＮおよびＨＣＯＯＨを加えた。反応混合物を加熱し、反応をＴＬＣによって追跡した。１時間後、反応は完結した。反応混合物を冷却し、生成物を濾別した。

Ｄ）脱保護
還元から得た生成物をクロロホルムに溶解し、１当量のＴｓＯＨ×Ｈ_２Ｏを室温で加えた。反応は０．５時間以内に進行した。溶液を１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、乾固するまでエバポレーションした。

４−デオキシ−ε−ロドマイシノンの精製
脱保護反応混合物（ＣＨＣｌ_３／ＴｓＯＨ×Ｈ_２Ｏ）をクロロホルムで希釈し、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で洗浄した。このクロロホルム画分を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し乾固するまでエバポレーションした。結晶化を、クロロホルム−メタノールから行った。結晶を濾過し真空下で乾燥した。

（実施例４：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓから誘導されたエピダウノルビシンを産生する変異菌株の培地からの１３−ＤＨＥＤの回収）
エピダウノルビシンの生産のための発酵ブロスは、以下の順に３つの主要な代謝産物を含有する：エピダウノルビシン、１３−ＤＨＥＤおよびエピフォイドマイシン（ｅｐｉ−ｆｅｕｄｏｍｙｃｉｎ）（ｅｐｉ−特許出願を参照）。樹脂に吸着された置換基を、発酵から得た２０リットルの培地からデカンテーションした。この樹脂を水によって洗浄して細胞片を除去した。ペレットを、１〜５回アルコールで抽出した。合わせたアルコール抽出液にクロロホルムを加えることにより、アグリコンをクロロホルムで抽出した。溶媒層および水層を分離した。わずかにアルカリ性のｐＨで水相のグリコシドをクロロホルムへと抽出し、飽和ＮａＨＣＯ_３でｐＨを安定させた。水で洗浄することにより塩を除去した。最後に、このクロロホルム相をカートリッジフィルターに通して濾過した。

この代謝産物を分離するために、シリカゲルクロマトグラフィを実施した。濾過したクロロホルムをシリカカラムの中へとポンプ輸送し、クロロホルム−メタノール溶液を移動相として使用してクロマトグラフィによって精製した。各３つの代謝産物の純粋な画分を集め、各生成物の画分を結晶化のためにプールした。１３−ＤＨＥＤの画分を、エタノール−水の溶液によって結晶化した。結晶を濾過し、吸着剤樹脂に吸着させた。

（実施例５：４−デオキシ−ε−ロドマイシノンおよび関連する代謝産物の、イダルビシンへの生合成的転化）
４００ｍＬのＥ１培地が入った２つのフラスコの中で３日間生体内変換菌株を培養することにより種培養を行った。この培養物を合わせ、この培地８００ｍＬを使用して、ＸＡＤ−７を補った２０リットルのＥ１培地に接種した。１０リットル／分で空気混和をしながら、３０℃の温度、３５０ｒｐｍで、２０リットルの体積の中で８日間発酵を行った。ｐＨはわずかに酸性に保たれる必要がある。このわずかに酸性のｐＨにより、供給された４−デオキシ−ε−ロドマイシノンのイダルビシンへのより安定な転化が確実になる。４−デオキシ−ε−ロドマイシノンは、ＥｔＯＨ中の少なくとも５ｍｇ／ｍｌの４−デオキシ−ε−ロドマイシノンでの接種の２４時間後に始めて、４日間連続的に供給される。供給された４−デオキシ−ε−ロドマイシノンの量は少なくとも１００ｍｇ／ｌである。

変異菌株による生体内変換の間、供給された４−デオキシ−ε−ロドマイシノンから２つの主要な二次代謝産物が生成した；つまりイダルビシンおよび１３−ジヒドロ−イダルビシン。他の少量の代謝産物は、イダルビシノン、１３−ジヒドロイダルビシノン、バウマイシンならびに１３−デオキシ−イダルビシンおよびそのアグリコンであった。イダルビシンの安定な力価は＞２０ｍｇ／Ｌであり、加えて＞２０ｍｇ／Ｌのこれまでの中間体１３−ＤＨＩが生成され；従って合わせて量は＞４０ｍｇ／Ｌである。バウマイシンは、酸性条件中で加熱することにより（＋４５℃、１時間）、イダルビシンへと加水分解されうる。

生体内変換菌株から得られた生成物のクロマトグラフを図３に示す。

（実施例６：エピダウノルビシンへの１３−ＤＨＥＤの生合成的転化）
生体内変換菌株の予備培養を、実施例５に詳細に記載したようにして行った。この培地の少なくとも５０ｍｇ／ｌに対応する樹脂に吸着される１３−ＤＨＥＤを１日後に培養物に加え、培養を４日間続けた。５０ｍｌのＥ１培地を含むフラスコ中、３４℃、３００ｒｐｍで発酵を行った。

クロマトグラフィによる分析によれば、１３−ＤＨＥＤの５０％がエピダウノルビシンに転化された。＜１０％の範囲の少量のエピルビシンが検出された。

（実施例７：アグリコンおよびアントラサイクリンの分析測定）
ＴＬＣ
１． ０．５ ＭＱ−水
２． ０．１ ＨＣＯＯＨ
３． ２５ ＭｅＯＨ
４． ７５ ＣＨＣｌ_３、慎重に溶液１、２および３と混合する。

ＨＰＬＣ
装置：ダイオードアレイ検出器を具えるシリーズ１１００に属するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄクロマトグラフィ装置。
カラム：Ｚｏｒｂａｘ、ＳＢ−Ｃ８、Ａｇｉｌｅｎｔ、４．６×１５０ｍｍ ３．５−ミクロン（３．５μｍ）
使用した溶媒：０．０５％ ＴＦＡ、および１：１ ＭｅＣＮ−テトラヒドロフラン
カラムの温度：３０℃
流速度：１ｍｌ／分
検出：２５４±８ｎｍ、参照波長６００ｎｍ±５０ｎｍ
注入量：５μｌ
圧力：最低２０ｂａｒ（２ＭＰａ）、最大３００ｂａｒ（３０ＭＰａ）。
使用したパラメータ：

参考文献一覧
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Claims (33)

1. アントラサイクリン代謝産物を非天然アントラサイクリン抗生物質へと転化する微生物菌株。
2. 前記アントラサイクリン代謝産物は、エピダウノルビシン、１３−ジヒドロエピダウノルビシン、４’−エピ−フォイドマイシンおよびε−ロドマイシノンからなる群から選択される、請求項１に記載の菌株。
3. 前記非天然アントラサイクリン抗生物質は、エピルビシンおよびイダルビシンからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の菌株。
4. 前記菌株はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属から選択される、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の菌株。
5. 前記菌株は、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ種から選択される、請求項４に記載の菌株。
6. 前記菌株は、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ亜種から選択される、請求項５に記載の菌株。
7. 異種耐性遺伝子ｓｎｏｒＯを含む、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の菌株。
8. 前記遺伝子はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属から単離される、請求項７に記載の菌株。
9. 前記遺伝子は、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｇａｌａｔｅｒ種から単離されたものである、請求項８に記載の菌株。
10. 前記菌株は、＞２０％の、前記非天然アントラサイクリン抗生物質への前記アントラサイクリン代謝産物の転化率を与える、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の菌株。
11. 前記菌株は、好ましくは＞３０％の、前記非天然アントラサイクリン抗生物質への前記アントラサイクリン代謝産物の転化率を与える、請求項１０に記載の菌株。
12. 前記菌株は、最も好ましくは＞４０％の、前記非天然アントラサイクリン抗生物質への前記アントラサイクリン代謝産物の転化率を与える、請求項１１に記載の菌株。
13. 微生物菌株を使用して、アントラサイクリン代謝産物をアントラサイクリン抗生物質へと転化するためのプロセス。
14. 前記アントラサイクリン代謝産物は、エピダウノルビシン、１３−ジヒドロエピダウノルビシン、４’−エピ−フォイドマイシンおよびε−ロドマイシノンからなる群から選択される、請求項１３に記載のプロセス。
15. 前記アントラサイクリン抗生物質は、エピルビシンおよびイダルビシンからなる群から選択される、請求項１３または請求項１４に記載のプロセス。
16. 前記菌株はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属から選択される、請求項１３から請求項１５のいずれか１項に記載のプロセス。
17. 前記菌株は、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ種から選択される、請求項１６に記載のプロセス。
18. 前記菌株は、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ亜種から選択される、請求項１７に記載のプロセス。
19. 前記菌株は遺伝子組み換えされている、請求項１３から請求項１８のいずれか１項に記載のプロセス。
20. 前記菌株は、＞２０％の、前記非天然アントラサイクリン抗生物質への前記アントラサイクリン代謝産物の転化率を与える、請求項１３から請求項１９のいずれか１項に記載のプロセス。
21. 前記菌株は、好ましくは＞３０％の、前記非天然アントラサイクリン抗生物質への前記アントラサイクリン代謝産物の転化率を与える、請求項２０に記載のプロセス。
22. 前記菌株は、最も好ましくは＞４０％の、前記非天然アントラサイクリン抗生物質への前記アントラサイクリン代謝産物の転化率を与える、請求項２１に記載のプロセス。
23. 生体内変換のために使用される粗製アントラサイクリン代謝産物の純度は＞６０％である、請求項１３から請求項２２のいずれか１項に記載のプロセス。
24. 生体内変換のために使用される粗製アントラサイクリン代謝産物の純度は、好ましくは＞８０％である、請求項２３に記載のプロセス。
25. 生体内変換のために使用される粗製アントラサイクリン代謝産物の純度は、最も好ましくは＞９０％である、請求項２４に記載のプロセス。
26. 前記アントラサイクリン代謝産物またはアントラサイクリン抗生物質を吸着するために、樹脂がいつでも使用される、請求項１３から請求項２５のいずれか１項に記載のプロセス。
27. 前記樹脂は、イオン性吸着剤および非イオン性吸着剤からなる群から選択される、請求項２６に記載のプロセス。
28. 前記樹脂はポリスチレンの群から選択される、請求項２７に記載のプロセス。
29. 前記樹脂は、ＸＡＤ−７およびＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０からなる群から選択される、請求項２８に記載のプロセス。
30. 前記樹脂は１〜１００ｇ／ｌの量で加えられる、請求項２６から請求項２９のいずれか１項に記載のプロセス。
31. 前記樹脂は、好ましくは１０〜５０ｇ／ｌの量で加えられる、請求項３０に記載のプロセス。
32. 前記樹脂は、最も好ましくは１５〜３０ｇ／ｌの量で加えられる、請求項３１に記載のプロセス。
33. 微生物菌株を使用してアントラサイクリン抗生物質へと転化するための、エピダウノルビシン、１３−ジヒドロエピダウノルビシン、４’−エピ−フォイドマイシンまたはε−ロドマイシノンの使用。

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