CN1298453A - 制备阿霉素的方法 - Google Patents

Abstract

转化柔红霉素至阿霉素的能力可通过用包含一种DNA分子的重组载体转化一种宿主细胞而改善,所述DNA分子包含:含有编码柔红霉素14－羟化酶的基因doxA的DNA区或片段以及含有一种或多种赋予柔红霉素和阿霉素抗性的基因的DNA区或片段。

Description

制备阿霉素的方法

本发明涉及一种通过用重组载体转化的宿主细胞改善柔红霉素至阿霉素转化的方法，所述重组载体包含编码柔红霉素C-14羟化酶的DNA和赋予对蒽环素类抗生素的抗性的基因。

柔红霉素类蒽环素(例如阿霉素、洋红霉素和阿克拉霉素及其合成的类似物)是抗肿瘤疗法中最广泛应用的药剂(F.Arcamone，阿霉素(Doxorubicin),Academic Press New York,1981,pp.12；A.Grein,生化过程(Process Biochem.),16:34,1981；T.Kaneko,Chimicaoggi,1988年5月11日；C.E.Myers等，基于蒽环素和蒽二酮的抗癌剂的“肿瘤细胞杀伤的生化机制”(“Biochemical mechanism of tumour cellkill”in Anthracycline and Anthracenedione-Based Anti-cancerAgents)(Lown,J.W.编辑)，Elsevier Amsterdam,pp.527～569,1988；J.W.Lown,药物疗法(Parmac.Ther.),60:185,1993)。

柔红霉素类蒽环素通常是通过各种链霉菌属(Streptomyces)[波赛链霉菌(S.peucetius)、天蓝微红链霉菌(S.coeruleorubidus)、加利利链霉菌(S.galilaeus)、灰色链霉菌(S.griseus)、灰红链霉菌(S.griseoruber)、标记链霉菌(S.insignis)、绿色产色链霉菌(S.viridochromogenes)、S.bifurcus和链霉菌菌株C5(S.sp.strainC5)]菌株和通过Actinomyces carminata生产的天然化合物。阿霉素主要是通过波赛链霉菌菌株生产的。具体地说，柔红霉素和阿霉素是在波赛链霉菌ATCC 29050和波赛链霉菌青灰亚种(S.peucetiussubsp.caesius)ATCC 27952中生产的。蒽环素阿霉素是由波赛链霉菌27952通过下列文献中概述的方法从丙二酸、丙酸和葡萄糖生产的：Grein,应用微生物学进展(Advan.Applied Microbiol.),32:203,1987以及Eckart和Wagner，基础微生物学杂志(J.BasicMicrobiol.)28:137,1988。阿克醌霉素(11-脱氧-ε-紫红霉酮)、ε-紫红霉酮、紫红霉素D、洋红霉素和柔红霉素都是该过程中产生的中间体。该途径中的最后步骤涉及柔红霉素至阿霉素的C-14羟基化。

用于柔红霉素生物合成的基因是通过克隆试验从波赛链霉菌29050和波赛链霉菌27952获得的(Stutzman-Engwall和Hutchinson,美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:3135,1988；Otten等，细菌学杂志(J.Bacteriol.)172:3427,1990)。如WO96/27014(公布日期为1996年9月6日)中描述的那样，编码柔红霉素C-14羟化酶(它使柔红霉素转化成阿霉素)的基因是通过克隆试验从波赛链霉菌29050及其突变型获得的，并且，它在链霉菌和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的宿主细胞中被超量表达。

柔红霉素生物合成聚簇的两种基因(drrA和drrB，它们赋予浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)抗阿霉素和柔红霉素的抗性)是从波赛链霉菌ATCC 29050菌株(Guilfoile和Hutchinson，美国国家科学院院报88:8553,1991)(Genbank的入藏登记号为M73758)和从波赛链霉菌7600突变型(EP-0371,112-A和Colombo等，细菌学杂志，174:1641,1992)克隆的。这些基因编码两种翻译上偶联的蛋白质，它们二者都是该宿主中柔红霉素和阿霉素抗性所需的。这两种基因之一的预计产物的序列类似于其它转运基因和抗性基因的产物(最值得注意的是来自哺乳动物肿瘤细胞的P-糖蛋白)。另一种基因drrC(它赋予抗柔红霉素和阿霉素的抗性，与DNA的切除修复中涉及的大肠埃希氏菌和藤黄微球菌(Micrococcus luteus)UvrA蛋白质具有高度的序列相似性)是从波赛链霉菌ATCC 29050克隆的(Lomovskaya等，细菌学杂志178:3238,1996)。

本发明提供了一种通过重组载体在宿主细胞中改善柔红霉素至阿霉素转化的方法，所述重组载体包括：含有编码柔红霉素C-14羟化酶的基因dxrA的DNA区或片段以及含有一种，两种或三种选自赋予抗柔红霉素和阿霉素的抗性的drrA、drrB和drrC的基因的DNA区或片段。最后的三种基因在宿主细胞中赋予抗阿霉素(所述转化过程中的产物)高水平的抗性，使该过程比以前的更有效，以前的过程应用以重组载体(只携带含有dxrA基因的DNA片段)转化的宿主细胞(描述于WO96/27014中，即使应用了强启动子)。

本发明的DNA优选包含drrA、drrB和drrC基因的全部三种或者只含drrA和drrB两种基因。

所述DNA可按正确形式连接到异源转录控制序列上或者在适当地处于载体中的转录控制序列附近的限制位点处被克隆入载体中。通常，该载体是一种质粒。所述重组载体可被用于转化合适的宿主细胞。该宿主可以是放线菌(Actinomycetes)菌株(它不生产或者生产蒽环素类)，优选是链霉菌属菌株。

图1(a～c)阐述了实施例1中描述的质粒pIS156的构建。该质粒是通过在强启动子ermE^*(Bibb等，分子微生物学(Molec.Microbiol.)14:533,1994)控制下，将2.9kb的片段插入质粒pWHM3(Vara等，细菌学杂志171:5872,1989)而构建的，所述片段包含doxA(以前是dxrA)、dnrV(以前是dnrORF10)和dnrU(ΔdnrU，以前是dnrORF9)基因的C-末端部分，得自重组质粒pIS70(WO 96/27014和A.InventiSolari等，GMBIM′96,P58)。

为了更好地描述本发明，我们提供了2.867nt的序列1，它包含doxA、dnrV和dnrU(ΔdnrU)基因的C-末端部分(编码链的互补链)。

图2(a～d)阐述了实施例1中描述的质粒pIS284的构建。该质粒包含2.9kb片段，它拥有doxA、dnrV和dnrU基因的C-末端部分，得自重组质粒pIS70，受强启动子ermE^*的控制，以及2.3Kb包含drrA和drrB抗性基因的DNA片段，所述drrA和drrB抗性基因得自被亚克隆入质粒pWHM3的质粒pWHM603(P.Guilfoile和C.R.Hutchinson,美国国家科学院院报88:8553,1991)。

图3(a～c)阐述了实施例2中描述的质粒pIS287的构建。所述质粒是通过在强启动子ermE^*的控制下，将2.9kb的BamHⅠ-HindⅢ片段(它包含doxA(以前是dxrA)、dnrV(以前是dnr-ORF10)和dnrU(ΔdnrU，以前是dnr-ORF9)基因的C-末端部分，得自重组质粒pIS70(WO 96/727014))与2.3kb含drrA和drrB抗性基因的Xbal-HindⅢ DNA片段和3.9kb含drrC抗性基因的EcoRⅠ-HindⅢ片段一起插入质粒pWHM3而构建的。

图1、2和3中示出的图不需详尽列出所述DNA片段中存在的全部限制位点。然而，报导的位点足以清楚识别所述DNA节段。

限制位点缩写：Ap,安普霉素；tsr,藓霉素；amp,氨苄西林；B,BamHⅠ；G,BglⅡ；N,NotⅠ；K,KpnⅠ；E,EcoRⅠ；H,HindⅢ；P,PstⅠ；S,SphⅠ；X,XbaⅠ；L,BglⅠ；T,SstⅠ。

本发明提供了一种DNA分子，其中，将包含编码柔红霉素C-14羟化酶的基因的DNA区或片段连接到包含一种、两种或三种选自drrA、drrB和drrC基因(它们编码赋予宿主细胞抗柔红霉素和阿霉素的抗性的蛋白质)的不同基因的DNA区或片段上。

包含编码柔红霉素C-14羟化酶的基因的DNA区优选是通过用BamHⅠ-HindⅢ酶消化而得自重组质粒pIS70(描述于专利WO96/27014中)的2.9 kb DNA区。该片段包含编码C-14羟化酶的doxA基因。柔红霉素C-14羟化酶将柔红霉素转化成阿霉素。该2.9 kb DNA片段还包含处于NotⅠ-KpnⅠ位点之间的dnrV基因和包含dnrU(ΔdnrU)基因的C-末端部分的NotⅠ-SphⅠ片段。

优选地，编码柔红霉素C-14羟化酶的2.9 kb DNA片段被连接到包含得自质粒pWHM603的drrA和drrB抗性基因的2.3kbXbal-HindⅢ DNA片段和含有得自质粒pWHM264的drrC基因的3.9kbEcoRⅠ-HindⅢ片段上；在另一个优选的实施方案中，该2.9 kb DNA片段只被连接到2.3kb Xbal-HindⅢ DNA片段上。

被描述于WO 96/27014中的、编码柔红霉素C-14羟化酶的全部DNA分子都可应用于本发明中。

特别是，本发明的DNA分子可包含2.9 kb DNA片段的全部或者只是该片段的部分，至少1.2 kb长度相应于含doxA的DNA分子的KpnⅠ-BamHⅠ片段，doxA编码柔红霉素C-14羟化酶(它将柔红霉素转化成阿霉素)。该DNA分子基本上包含专利申请WO 96/27014中报导的序列，该序列被称为“dxrA”序列。此外，柔红霉素C-14羟化酶的推断氨基酸序列也被示于该专利申请中。

本发明的DNA分子可包含至少2247nt的2.3kb Xbal-HindⅢ DNA片段，该片段包含drrA和drrB基因，这些基因编码赋予宿主细胞抗柔红霉素和阿霉素的抗性的蛋白质。

本发明的DNA分子可包含含有drrC抗性基因的3.9 kb EcoRⅠ-HindⅢ片段的全部或部分，至少2.5kb长度相应于含drrC的DNA分子的SstⅠ-SphⅠ片段，drrC编码赋予宿主细胞抗柔红霉素和阿霉素的抗性的蛋白质。

本发明还包括这样的DNA：它包含赋予抗柔红霉素和阿霉素的抗性的基因，该基因的序列至少80％与drrA和drrB基因(Guilfoile和Hutchinson，美国国家科学院院报88:8553,1991)的序列和/或drrC基因(Lomovskaya等，细菌学杂志178:3238,1996)的序列相同。

本发明的DNA可以正确形式连接到异源转录控制序列上或者在适当地处于载体中的转录控制序列附近的限制位点处被克隆入载体中。优选地，不同基因的转录可通过共同的强启动子如ermE*(Bibb等，分子微生物学14:533,1994)协调。

本发明的DNA分子可被连接入任何自主复制剂和/或整合剂(它包含一种DNA分子，该DNA分子中可被添加一个或多个另外的DNA节段)。不过，通常，所述载体是一种质粒。一种优选的质粒是高拷贝数的质粒pWHM 3或pIJ702(Katz等，普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)129:27031,983)。其它合适的质粒是pIJ680(Hopwood等，“链霉菌属的遗传操作。实验指南”(GeneticManipulation of Streptomyces.A laboratory Manual),John InnesFoundation,Norwich,UK,1985)和pWHM601(Guilfoile和Hutchinson,美国国家科学院院报88:8553,1991)。

可应用任何合适的技术将所述DNA插入载体。可通过将该DNA在适当位点处连接入线性化载体而实现插入。为此，可应用粘性末端或平端的直接组合，均聚物加尾，或者应用接头分子或衔接分子。

可应用重组载体转化不生产或生产环蒽素类的合适的宿主细胞。

宿主细胞可以是柔红霉素或阿霉素敏感的(即，在一定量柔红霉素或阿霉素的存在下不能生长)或者是柔红霉素或阿霉素抗性的。在任何情况下，生成的重组克隆(通过用本发明的新重组载体转化获得的)比亲代宿主显示更高水平抗柔红霉素和阿霉素的抗性。重组浅青紫链霉菌中的阿霉素抗性水平远远高于在生产蒽环素的波赛链霉菌ATCC29050和ATCC 27952菌株中观察到的水平。

所述宿主可以是微生物(例如细菌)。不生产蒽环素类的放线菌属菌株(尤其是浅青紫链霉菌株和其它链雾菌属株)可被转化。与波赛链霉菌dnrN突变型相比，浅青紫链霉菌TK 23是更合适的宿主，所述突变型是用重组质粒pIS70转化的，该pIS70包含用于柔红霉素至阿霉素生物转化的dxrA基因(WO 96/27014)。

本发明的重组载体还可被用于转化生产柔红霉素的合适的宿主细胞，以便增强柔红霉素至阿霉素的转化。

因此，包含它们的生产蒽环素类的突变型的波赛链霉菌ATCC29050和ATCC 27952菌株可被转化。特别是，可应用波赛链霉菌株WMH1654，它是得自波赛链霉菌ATCC 29050的突变菌株，并且被保藏在美国典型培养物保藏中心，10801 UniversityBoulevard,Manassas,Virginia 20110-2209,USA，入藏登记号为ATCC55936。

链霉菌属菌株的转化体一般可通过原生质体转化而获得。

本发明包括改善通过柔红霉素转化的阿霉素生产的方法，该方法包括在不生产蒽环素类的宿主中将添加的柔红霉素变为阿霉素的生物转化过程和在直接生产柔红霉素的宿主中生产阿霉素的发酵过程。柔红霉素至阿霉素的生物转化过程该方法包括：1)培养用本发明载体转化的不生产柔红霉素的重组宿主细胞，往其中添加柔红霉素，以及2)从培养物分离阿霉素。

在该方法中，可在20℃～40℃(例如24℃～37℃)的温度下培养重组菌株。在24～96小时的生长期中往培养基中添加柔红霉素。优选在振动下进行培养。在柔红霉素存在下的培养时间可以是12～72小时。培养液中柔红霉素的浓度可以是20～1000mcg/ml(例如100～400mcg/ml)。通过发酵生产阿霉素该方法包括：1)培养用本发明载体转化的重组柔红霉素生产宿主细胞，以及2)从培养物分离阿霉素。

在该方法中，可在20℃～40℃(例如26℃～34℃)的温度下培养重组菌株。在振动下进行培养。培养时间可以是72～168小时。原料和方法细菌菌株和质粒：大肠埃希氏菌株DH5α(它是氨苄西林和安普霉素敏感的)被用于亚克隆DNA片段。宿主浅青紫链霉菌TK23得自D.A.Hopwood(John Innes Institute,Norwich,United Kindom)，宿主波赛链霉菌WMH1654是得自波赛链霉菌ATCC 29050的突变株，已被保藏在美国典型培养物保藏中心，10801 UniversityBoulevard,Manassas,Virginia 20110-2209,USA，入藏登记号为ATCC55936。质粒克隆载体是pGem-7Zf(+)和相关的质粒(Promega,Madison,WI),pIJ4070(D.A.Hopwood)和大肠埃希氏菌-链霉菌属穿梭载体pWHM3(Vara等，细菌学杂志171:5872,1989)。培养基和缓冲液：大肠埃希氏菌株DH5α被保持在LB琼脂上(Sambrook等，“分子克隆。实验指南”(Molecular Cloning.A Laboratory manual)，第2版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)。当选择转化体时，以100μg/ml的浓度添加氨苄西林或安普霉素。浅青紫链霉菌TK23和波赛链霉菌WMH1654分别被保持在R2YE(Hopwood等，“链霉菌属的遗传操作。实验指南”，John InnesFoundation,Norwich,UK,1985)和ISP4(Difco,Detroit,MI)琼脂培养基上。当选择转化体时，在平板上铺一层含浓度为50μg/ml藓霉素的软琼脂。亚克隆DNA片段：用适当的限制酶消化DNA样品并通过标准方法在琼脂糖凝胶上分离(Sambrook等，“分子克隆。实验指南”，第2版，ColdSpring Harbor PressC,old Spring Harbor,NY,1989)。从凝胶切除包含感兴趣的DNA片段的琼脂糖切片，应用GENECLEAN装置(Bio101,La Jolla,CA)或等效物从这些切片分离DNA。应用标准技术(Sambrook等，“分子克隆。实验指南”，第2版，Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,NY,1989)将分离的DNA片段亚克隆入用于常规操作的大肠埃希氏菌和大肠埃希氏菌-链霉菌属穿梭载体或用于表达实验的链霉菌属载体。链霉菌和大肠埃希氏菌的转化：通过氯化钙法(Sambrook等，“分子克隆。实验指南”，第2版，Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,NY,1989)制备大肠埃希氏菌的感受态细胞并通过标准技术(Sambrook等，“分子克隆。实验指南”，第2版，Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,NY,1989)转化。浅青紫链霉菌TK23生长在液态R2YE培养基中(Hopwood等，“链霉菌属的遗传操作。实验指南”，John Innes Foundation,Norwich,UK,1985)，在48hr后收获。用10.3％(wt/vol)蔗糖溶液将菌丝体颗粒洗涤两次并用于按Hopwood指南中概述的方法(Hopwood等，“链霉菌属的遗传操作。实验指南”，John Innes Foundation,Norwich,UK,1985)制备原生质体。将原生质体颗粒悬浮于约300微升P缓冲液(Hopwood等，“链霉菌属的遗传操作。实验指南”，John Innes Foundation,Norwich,UK,1985)，将50微升该悬浮液的等分样用于每次转化。原生质体是用质粒DNA按Hopwood等(“链霉菌属的遗传操作。实验指南”，John InnesFoundation,Norwich,UK,1985)、Stutzman-Engwall和Hutchinson(美国国家科学院院报86:3135,1988)或者Otten等(细菌学杂志172:3427,1990)的小规模转化法转化的。在30℃的R2YE培养基上再生17hr后，在平板上铺一层200μg/ml的藓霉素，让它在30℃下生长直至孢子形成。柔红霉素和阿霉素抗性水平的评估：该抗性水平以最小抑制浓度(MIC)表示并通过应用R2YE培养基的标准两倍稀释法测定。将菌株置于R2YE培养基斜面上培养并在28℃下培养8～10天。重组菌株是在添加了20μg/ml藓霉素的相同培养基中生长的。包含大约10⁶～10⁷活细胞/ml的细菌培养物是从在28℃、280rpm下、胰胨豆胨培养液(Tryptic SoyBroth)(Difo)中生长了48小时的培养物制备的。通过玻璃珠均化培养物。取一菌环量均化后的培养物接种在含0.39～800μg/ml不同浓度的柔红霉素和阿霉素的琼脂板上。在30℃下将该琼脂板培养7天，以防止可见生长的最低浓度测定MICs。柔红霉素至阿霉素的生物转化：将带有本发明的质粒的浅青紫链霉菌TK23转化体接种入25ml含40μg/ml藓霉素的液态R2YE培养基中。使培养物在300ml锥形瓶中生长，在30℃下280rpm的旋转振荡器上培养。生长2天后，将2.5ml该培养物转移到25ml APM生产培养基：((g/l)葡萄糖(60)、酵母提取物(8)、麦芽提取物(20)、NaCl(2)、3-(吗啉代)丙磺酸(MOPS钠盐)(15)、MgSO₄·7H₂O(0.2)、FeSO₄·7H₂O(0.01)、ZnSO₄·7H₂O(0.01)，补加了20μg/ml藓霉素。在生长期48hr添加400μg/ml柔红霉素。使培养物在300ml锥形瓶中生长，在30℃下280rpm的旋转振荡器上培养72hr。用25mg/ml草酸酸化每一种培养物，在30℃下280rpm的旋转振荡器上培养30min后，用等体积乙腈∶甲醇(1∶1)在30℃和300rpm下提取2hr。将提取液过滤，通过反相高压液相色谱法(RP-HPLC)分析滤液。RP-HPLC是应用Vydac C₁₈柱(4.6×250mm；5μm粒径)以0.385ml/min的流速操作的。流动相A是O.2％三氟乙酸(TFA，得自Pierce Chemical Co.)(于H₂O中)，流动相B是O.078％TFA[于乙腈(得自J.T.Baker Chemical Co.)中]。用20～60％溶于A相中的B相的线性梯度在33分钟内进行洗脱并应用二极管阵列检测器定在488nm(带宽12微米)监测。柔红霉素和阿霉素(10μg/ml于甲醇中)被用作外标而定量分析从培养物分离的这些代谢物的量。阿霉素生产：用本发明的质粒转化波赛链霉菌WMH1654突变型。将转化体接种入25ml补加了20μg/ml藓霉素的R2YE培养基。使培养物在30℃和280rpm旋转振荡器上的300ml锥形瓶中生长。生长2天后，将2.5ml该培养物转移到25ml补加了20μg/ml藓霉素的APM培养基。使培养物在28℃和280rpm旋转振荡器上的300ml锥形瓶中生长96～120小时。用25mg/ml草酸酸化每一种培养物，在30℃下280rpm的旋转振荡器上培养45min后，用等体积乙腈∶甲醇(1∶1)在30℃和300rpm下提取2hr。将提取液过滤，通过RP-HPLC按用于分析所述生物转化产物的同样方法分析滤液。

实施例1实施例1(图1(a～c)和图2(a～d))。为了除去非必需区，质粒pIS70(WO96/27014)是预先用EcoRⅠ-HindⅢ消化，将3.5kb片段亚克隆入质粒pGEM-7Zf(+)(Promega,Madison-WIUSA)多克隆位点序列的相同位点而获得另一种BamHⅠ限制位点。新质粒pGendoxAUV是BamHⅠ消化的，在强启动子ermE^*控制下，将所述片段(现已减小到2.9kb)转移入质粒pIJ4070(得自John InnesInstitute,Norwich,UK)。该新质粒(被称为p7doxAUV)是消化的BgⅢ，将所述片段插入质粒pWHM3(J.Vara等，细菌学杂志171:5872～5881,1989)而获得质粒pIS156(图1c)。

包含drrA和drrB抗性基因的2.3kb BgⅡ片段在弄成平端后被从质粒pWHM603转移入质粒pBluescriptⅡ SK+(Stratagene)的SmaⅠ位点而获得质粒pdrrAB，再将XbaⅠ-HindⅢ片段从pdrrAB转移入载体pIJ4070而获得pIS278。然后，pIS278被EcoRⅠ-XbaⅠ消化后被插入EcoRⅠ-XbaⅠ质粒pWHM3中而获得质粒pIS281。用XbaⅠ消化该质粒，插入质粒pIS156的XbaⅠ片段而获得质粒pIS284。

实施例2质粒pIS287的构建(图3(a～c))：通过EcoRⅠ-HindⅢ消化切除含于质粒pWHM264中的drrC抗性基因，再将它插入质粒pIJ4070而获得质粒pIS282。从该质粒将drrC抗性基因作为BglⅡ片段转移到pIS252(该质粒是包含靠近EcoRⅠ位点的额外BglⅡ位点的pWHM3的修饰形式)而获得质粒pIS285。质粒pIS285是EcoRⅠ消化的，将它与从质粒pIS284切除的5.5kbDNA片段连接而获得质粒pIS287。

实施例3上述重组质粒对阿霉素的抗性：按“原料和方法”中描述的操作，在R2YE培养基上作为MICs测定了用重组质粒pIS70、pIS284或pIS287转化的浅青紫链霉菌TK23抗柔红霉素和阿霉素的抗性水平(与浅青紫链霉菌TK23、用载体pWHM3转化的浅青紫链霉菌TK23以及蒽环素生产波赛链霉菌ATCC 29050和ATCC 27952菌株比较)。包含drrA、drrB和drrC抗性基因的质粒pIS287获得了最大水平的柔红霉素和阿霉素抗性。只包含drrA和drrB抗性基因的质粒的阿霉素抗性水平也增大了64倍(表1)。表1．重组菌株对阿霉素的抗性菌株                             有关阿霉素的MIC(μg/ml)波赛链霉菌ATCC 29050                     12.5波赛链霉菌ATCC 27952                     12.5浅青紫链霉菌TK23                         12.5浅青紫链霉菌TK23(pWHM3)                  12.5浅青紫链霉菌TK23(pIS284)                 800浅青紫链霉菌TK23(pIS287)                 ＞800

实施例4在用包含doxA柔红霉素C-14羟化酶基因和不同抗性基因的质粒转化的浅青紫链霉菌TK23中，添加的柔红霉素生物转化成阿霉素：按“原料和方法”部分中描述的操作，通过选择藓霉素抗性的转化而将pIS70、pIS284或pIS287质粒引入浅青紫链霉菌TK23。应用APM培养基如上述那样测试生成的浅青紫链霉菌TK23(pIS70)、浅青紫链霉菌TK23(pIS284)和浅青紫链霉菌TK23(pIS287)转化体生物转化高含量(400μg/ml)柔红霉素至阿霉素的能力。浅青紫链霉菌TK23(pIS70)转化体能转化至多11.5％添加的柔红霉素至阿霉素(表2)。浅青紫链霉菌TK23(pIS284)和浅青紫链霉菌TK23(pIS287)转化体能转化多达73.5％添加的柔红霉素至阿霉素(表2)。表2．通过浅青紫链霉菌菌株生物转化柔红霉素至阿霉素菌株                                  蒽环素(μg/ml)DOX  DNR  13-二氢DNR浅青紫链霉菌TK23(pIS70)(对比)         46   250          70浅青紫链霉菌TK23(pIS284)              294   33          21浅青紫链霉菌TK23(pIS287)              288   24          35实施例5在用包含doxA柔红霉素C-14羟化酶基因和不同抗性基因的质粒转化的波赛链霉菌WMH1654dnrX突变型中的阿霉素生产：按“原料和方法”部分中描述的操作，通过选择藓霉素抗性的原生质体转化而将pIS284和pIS287质粒引入波赛链霉菌WMH1654 dnrX突变株。将生成的波赛链霉菌化体发酵，按前文描述的方法分析发酵液。在120hr发酵后，波赛链霉菌WMH1654(pIS284)生产多达81pg/ml阿霉素和多达18μg/ml柔红霉素(表3)。波赛链霉菌WMH1654(pIS287)生产多达92μg/ml阿霉素和没有可检测量的柔红霉素(表3)。表3．波赛链霉菌WMH1654 dnrX菌株的阿霉素生产菌株                                    蒽环素(pg/ml)DOX    DNR   13-二氢DNR波赛链霉菌WMH1654                       41      35        18波赛链霉菌WMH1654(pIS284)               81      18         6波赛链霉菌WMH1654(pIS287)               92       0         0

序列11 GGATCCGCAC CGGGTACACG GCACGGGACC GCCCACCGCG CGGTGCGCGG51 TGGGCGGTCC CGTGCCGGTC GCGGCCGGCG GATCAGCGCA GCCAGACGGG101 CAGTTCGGTG AGCCGCGCCG TCTGGGCCCC CTTCCGGCAC CACCGCAACT151 CGTCGTACGG CACGGCCAGT CGGGCCTCGG GGAACCTGCT GCGCAGTACG201 CCGATCATCG TGCGCGACTC CAGCTGGGCG AGCTGCTCCC CGATGCAGTA251 GTGCGGCCCG TCGCCGAAGG TGAGCCGCCG CCACGAGGGA CGGTCCGGGT301 GGAAGGCGTG CGGGGCGTCG TGATGGCGGC CGTCGGTGTT GGTGCCCTCG351 ATGTCCACCA GCACCGGCGC TCCGCGGGGC AGCCGGACGC CGCCGATGGT401 CACCTCCGTG GCAGCGAACC TCCACAACGT GTAGGGCACC GGCGGGTGGT451 AGCGCAGCGC CTCCTCCACG AACCGGGAGA CGGCGTCCTC GTCGGCATCC501 GCCGCGAGGC GGCCCGCCAG GACCTCCGCG AGCAGGAAGC CCAGGAAGGA551 GCCGGTGGTG TCGTGGCCGG CGAAGATGAG CCCGGTGATC ATGTAGACGA601 GCTGGTCGTC GGAGACCGAG CCGAACTCGG CCTGCGCGCG CTCGTACAGC651 ACGCGGGTCA TGGTCGGGGT GTCGTTCCGC CGGGCTGAGT GCACGGCTTC701 GAGGAGCAGG CTCTCCAGGG CCGAGGTGTC CGGCACGCCC CCGGCAGGGT751 CCGTGCCGTC ACCCCCGCCG CTCTGCGGGC CGCCGAGGCC GAGTGCCTTG801 AGAACGCTGA CGGCCTCGCG GGCCATCGCC GGATCGGTGA CCGGCACACC 851 GAGCAGCTCG CAGATGACCA ACAGCGGGAA GTGGTACGCG AAGCCGCCGA901 TCAGCTCGGC CGGTTTGCCC GACCGGCCGG AGGCGTCGGC GAGTTCGGTG951 AGCAGCCGGC CGGCGATCGC GGCGATGCGA TCCGTCCGCT CGGCCAGCCG1001 GCGCGGGTTG AACGCAGGTG CGTGGATGCG GCGCAGGCGC CGGTGGGCCT1051 CGCCGTCCAC GGCGATGAGC GTGAACGGAC GCAGCTCCGG AACGGGGATG1101 TCGAGACCGT CGTCCACCCC CCGCCAGGCG GCGGGGGCGA GGTCGGGGTC1151 CTTCACGAAC CGGGGATCGG CCAGCACCTC GCGGGCGAGG GCGTCATCGG1201 TGATGACCCA GGCGGGTCCG CCCGCGGGGG CGTTCACCTC GACGACCGGG1251 CCCGCCTCCC GGAAGGCGTC GTGCACCTCG GGCTTGCGCT GCATGGTCAT1301 CATGGGACAC GCGAACGGGT CGACGGCCAC CCGGGGCGCC TCGCCGCTCA1351 CGAGGCACCG CCCGCCGCCG CGGGGTACCC CTCCCGCAGT TCGACCACCG1401 AGAAGCCGGC CCCGTGCGGG TCGAGCAGGT CCGCCCGCCG CCCCCTGGGC1451 GTGTCGGCGG GCTCGTTCTC GACGGAGCCG CCGAGTTCAA CGGCGCGCCG1501 GACCGTCGCG TCGCAGTCGT GCACGGCGAA CAGCACGGCC CAGTGCGGCC1551 GTACCGCGCC GGTGACGCCC AGCTCCTGGG TGCCGGCGAC CGGTGTGTCA1601 CCGATGTGCC AGACCGGGTC GGTGACGCCC TTCAGTCCGG TGTCGGCCGG1651 AGCCAGGCCG AGGGTCGCCG GGTAGAAGTC CCGGGCGGCC CCGATGCCGT1701 CGGTCACCAG CTCGACCCAG CCGACCGAGC CGGGCACGCC CGTCACCTCC1751 GCGCCCTCCA TGACTCCCTT GCGCCAGACC GCGAACGCGG CCCCGGCGGG1801 GTCGGCGAAG ACCGCCATCC GGCCGAGGCC GAGGACGTCC ATCGGAGTCA1851 TGATGACCTC GCCGCCCGCC GTCTCGACCC GCTTGGTCAG TGCGTCGGCG1901 TCGTCGGTGG CGAAGTACAC GGTCCAGATG GCCGGCATGC CGTGCTGGTC1951 GTTCCCGGGC CCGTACGGCC GGTGGTAGGG GGTGTCGATC TGGTGGCGGG2001 CGACCGCGGC GACCAGCTTC CCGTCGGAGC TGAACGTCGT GTATCCCCCG2051 GCGCCCGGGT CGCTGACCAC GGTGGCGGTC CAGCCGAACA GGCCGGTGTA2101 GAAGTCGGCC GAGGCGGCGA CATCGGGCGA ACCGAGGTCG AACCATGCGG2151 GGGCGCCGGG CGCGAACCTG GTCACGAATC GTTCCTTTCG ATGGATCGGC2201 ACACGAGCGT CTGCGCTCGC GGATGAGACG GACATCTCGC GGATGAGACG2251 GACATGCGGG CGGGGCGGGC CGCCGCCGTC AGTGCGCGGT GTCGCCGACG2301 GCGGCCGCGC CGGCCTCCCA GAGCTTCGCC GCGAGGCCGG CGTCGGCGGT2351 CGGGCCGCTC ACCGGGGACA GCCGCCGGTC GCTGTAGTAG CCGCCCGTGG2401 TCAACTCCTC GGCCGGCGCG GACGCCAGCC ACACGAGGGT GTCGGCGCCC2451 TTCGCCGCGG AGCGCAGGAA GGGGTTGAAC CGGAAGTAGG ACGAGGCGAC2501 CGTGCCCCGT CCGATGCGGG TGCGGACCTC ACCGGGGTGA TAGCTGACCG2551 CCAGCACGTC CGGCCAGCGC CTGGCGGCCT CCGCCGCGGT CATGATGTTG2601 GCCTGTTTGG ACGTGCCGTA CGCCTGGCCG GCGCTGTAGC GGTGACGGTC2651 GCCGTTGAGG TCGTCCGGGT CGATCCGGCC CTGGGTGTAC GCGTCGGACG2701 AGGTGAGGAT CAGCCGCCCG CCCGCGAGCC GCTCCCGCAG CAGCCGTGCC2751 AGCAGGAAGC CTGCGAGGTG ATTGACCTGG ATGGTGGCCT CGAACCCGTC2801 CTGGGTCGTG GTGCGCGACC AGAACATGCC GCCGGCGTTG CTGGCCATGA2851 CATCGATGCG CGGGTACCGG

序列表<110>PHARMACIA & UPJOHN S.P.A.<120>制备阿霉素的方法<130>1615-9003<140>PCT/UNKNOWN<141>1999-04-22<150>09/065,606<151>1998-04-24<160>1<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2870<212>DNA<213>波赛链霉菌<220><221>misc_feature<222>Comolement((I)..(2870))<223>编码链的互补链<400>1ggatccgcac cgggtacacg gcacgggacc gcccaccgcg cggtgcgcgg cgggcggtcc 60cgtgccggtc gcggccggcg gatcagcgca gccagacggg cagttcggtg agccgcgccg 120tctgggcccc cttccggcac caccgcaact cgtcgtacgg cacggccagt cgggcctcgg 180ggaacctgct gcgcagtacg ccgatcatcg tgcgcgactc cagctgggcg agctgctccc 240cgatgcagta gtgcggcccg tcgccgaagg tgagccgccg ccacgaggga cggtccgggt 300ggaaggcgtg cggggcgtcg tgatggcggc cgtcggtgtt ggtgccctcg atgtccacca 360gcaccggcgc tccgcggggc agccggacgc cgccgatggt cacctccgtg gcagcgaacc 420tccacaacgt gtagggcacc ggcgggtggt agcgcagcgc ctcctccacg aaccgggaga 480cggcgtcctc gtcggcatcc gccgcgaggc ggcccgccag gacctccgcg agcaggaagc 540ccaggaagga gccggtggtg tcgtggccgg cgaagatgag cccggtgatc atgtagacga 600gctggtcgtc ggagaccgag ccgaactcgg cctgcgcgcg ctcgtacagc acgcgggtca 660tggtcggggt gtcgttccgc cgggctgagt gcacggcttc gaggagcagg ctctccaggg 720ccgaggtgtc cggcacgccc ccggcagggt ccgtgccgtc acccccgccg ctctgcgggc 780cgccgaggcc gagtgccttg agaacgctga cggcctcgcg ggccatcgcc ggatcggtga 840ccggcacacc gagcagctcg cagatgacca acagcgggaa gtggtacgcg aagccgccga 900tcagctcggc cggtttgccc gaccggccgg aggcgtcggc gagttcggtg agcagccggc 960cggcgatcgc ggcgatgcga tccgtccgct cggccagccg gcgcgggttg aacgcaggtg 1020cgtggatgcg gcgcaggcgc cggtgggcct cgccgtccac ggcgatgagc gtgaacggac 1080gcagctccgg aacggggatg tcgagaccgt cgtccacccc ccgccaggcg gcgggggcga 1140ggtcggggtc cttcacgaac cggggatcgg ccagcacctc gcgggcgagg gcgtcatcgg 1200tgatgaccca ggcgggtccg cccgcggggg cgttcacctc gacgaccggg cccgcctccc 1260ggaaggcgtc gtgcacctcg ggcttgcgct gcatggtcat catgggacac gcgaacgggt 1320cgacggccac ccggggcgcc tcgccgctca cgaggcaccg cccgccgccg cggggtaccc 1380ctcccgcagt tcgaccaccg agaagccggc cccgtgcggg tcgagcaggt ccgcccgccg 1440ccccctgggc gtgtcggcgg gctcgttctc gacggagccg ccgagttcaa cggcgcgccg 1500gaccgtcgcg tcgcagtcgt gcacggcgaa cagcacggcc cagtgcggcc gtaccgcgcc 1560ggtgacgccc agctcctggg tgccggcgac cggtgtgtca ccgatgtgcc agaccgggtc 1620ggtgacgccc ttcagtccgg tgtcggccgg agccaggccg agggtcgccg ggtagaagtc 1680ccgggcggcc ccgatgccgt cggtcaccag ctcgacccag ccgaccgagc cgggcacgcc 1740cgtcacctcc gcgccctcca tgactccctt gcgccagacc gcgaacgcgg ccccggcggg 1800gtcggcgaag accgccatcc ggccgaggcc gaggacgtcc atcggagtca tgatgacctc 1860gccgcccgcc gtctcgaccc gcttggtcag tgcgtcggcg tcgtcggtgg cgaagtacac 1920ggtccagatg gccggcatgc cgtgctggtc gttcccgggc ccgtacggcc ggtggtaggg 1980ggtgtcgatc tggtggcggg cgaccgcggc gaccagcttc ccgtcggagc tgaacgtcgt 2040gtatcccccg gcgcccgggt cgctgaccac ggtggcggtc cagccgaaca ggccggtgta 2100gaagtcggcc gaggcggcga catcgggcga accgaggtcg aaccatgcgg gggcgccggg 2160cgcgaacctg gtcacgaatc gttcctttcg atggatcggc acacgagcgt ctgcgctcgc 2220ggatgagacg gacatctcgc ggatgagacg gacatgcggg cggggcgggc cgccgccgtc 2280agtgcgcggt gtcgccgacg gcggccgcgc cggcctccca gagcttcgcc gcgaggccgg 2340cgtcggcggt cgggccgctc accggggaca gccgccggtc gctgtagtag ccgcccgtgg 2400tcaactcctc ggccggcgcg gacgccagcc acacgagggt gtcggcgccc ttcgccgcgg 2460agcgcaggaa ggggttgaac cggaagtagg acgaggcgac cgtgccccgt ccgatgcggg 2520tgcggacctc accggggtga tagctgaccg ccagcacgtc cggccagcgc ctggcggcct 2580ccgccgcggt catgatgttg gcctgtttgg acgtgccgta cgcctggccg gcgctgtagc 2640ggtgacggtc gccgttgagg tcgtccgggt cgatccggcc ctgggtgtac gcgtcggacg 2700aggtgaggat cagccgcccg cccgcgagcc gctcccgcag cagccgtgcc agcaggaagc 2760ctgcgaggtg attgacctgg atggtggcct cgaacccgtc ctgggtcgtg gtgcgcgacc 2820agaacatgcc gccggcgttg ctggccatga catcgatgcg cgggtaccgg            2870

Claims (19)

1．一种DNA分子，它包含：一个含有编码柔红霉素14-羟化酶的基因doxA的DNA区和一个含有至少一种赋予柔红霉素和阿霉素抗性的基因的DNA区。

2．权利要求1的DNA分子，它进一步包含一种强启动子。

3．权利要求2的DNA分子，其中，所述强启动子是ermE^*。

4．权利要求1的DNA分子，其中，所述赋予柔红霉素和阿霉素抗性的基因选自drrA、drrB和drrC基因及其任意混合物。

5．权利要求4的DNA分子，其中，所述赋予柔红霉素和阿霉素抗性的基因是drrA和drrB基因。

6．权利要求4的DNA分子，其中，所述赋予柔红霉素和阿霉素抗性的基因是drrA、drrB和drrC基因。

7．权利要求1的DNA分子，其中，包含编码柔红霉素14-羟化酶的基因doxA的区的长度是2.9kb。

8．权利要求7的DNA分子，其中，包含基因doxA的片段相应于包含doxA核苷酸序列的KpnⅠ-BamHⅠ片段。

9．权利要求5的DNA分子，其中，包含所述drrA和drrB基因的所述区是2.3kb XbaⅠ-HindⅢ DNA片段。

10．权利要求1的DNA分子，其中，所述赋予柔红霉素和阿霉素抗性的基因与选自drrA、drrB和drrC基因的基因至少是80％相同的。

11．一种包含权利要求1的DNA分子的载体。

12．权利要求11的载体，其中，所述载体是质粒。

13．权利要求12的质粒，其中，所述质粒选自pIS284和pIS287。

14．一种用权利要求11的载体转化的或转染的宿主细胞。

15．权利要求14的宿主细胞，其中，所述宿主细胞不生产柔红霉素。

16．权利要求14的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是生产柔红霉素的细菌细胞。

17．权利要求14的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞是链霉菌属细胞。

18．一种用于将柔红霉素生物转化成阿霉素的方法，它包括如下步骤：

在含有柔红霉素的培养基中培养一种重组宿主细胞，其中，

所述宿主细胞包含一种DNA分子，该DNA分子包含一个含有编码

柔红霉素14-羟化酶的基因doxA的DNA区和一个含有至少一种赋

予柔红霉素和阿霉素抗性的基因的DNA区，其中，所述宿主细胞

不生产柔红霉素，以及

从所述培养基分离任何生成的阿霉素。

19．一种通过发酵生产阿霉素的方法，它包括如下步骤：

在培养基中培养一种重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含一种DNA分子，该DNA分子包含一个含有编码柔红霉素14-羟化酶的基因doxA的DNA区和一个含有一种或多种赋予柔红霉素和阿霉素抗性的基因的DNA区，其中，所述宿主细胞是生产柔红霉素的细菌细胞，以及

从所述培养基分离任何生成的阿霉素。

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