KR100283826B1

KR100283826B1 - 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 dna 서열

Info

Publication number: KR100283826B1
Application number: KR1019930702133A
Authority: KR
Inventors: 리챠드 허친슨 차알스; 무티 마두리 크리쉬나; 토르티 프란체스카; 루이사 콜롬보 안나
Original assignee: 라파엘라 메텔리; 파르마시아 앤드 업존 에스.피.에이; 리챠드 허친슨 차알스
Priority date: 1991-11-18
Filing date: 1992-11-17
Publication date: 2001-03-02
Also published as: RU2115731C1; UA39922C2; US5364781A; PT101065A; TW227575B; ZA928865B; RU2155811C2; PT101065B

Abstract

카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 사용하여 숙주를 형질전환시킴으로써 숙주상에 카미노마이신을 다우노루비신으로 전환시키는 능력을 부여할 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 서열

[발명의 분야]

본 발명은 스트렙토마이세스 페우세티우스(Streptomyces peucetius) 29050 이외의 스트렙토마이세테스(Streptomycetes) 및 세균 세포 추출물에서 또는 이로부터 유래된 정제된 효소를 사용하여 카미노마이신으로부터 다우노루비신으로의 생성이 향상되도록 다우노루비신의 생합성을 변형시킴으로써 암 치료에 유용한 안트라 사이클린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

[발명의 배경]

독소루비신, 카미노마이신 및 아클라시노마이신과 같은 다우노루비신 그룹의 안트라사이클린은, 종양 억제 치료요법에서 가장 널리 사용되는 제제중의 하나이다[참조; F. Arcamone, Doxorubicin, Academic Press, New York, 1981, pp. 12-25; A. Grein, Process Biochem, 16 : 34(1981); T. Kaneko, Chimicaoggi May : 11(1988)]. 특히, 경구 투여에 의해 다우노루비신 및 독소루비신의 종양 억제 활성이 증진되고, 암 치료시 이들 약물의 사용과 관련되는 급성 독성 및 만성 심장 독성이 제거될 수 있도록 다우노루비신 및 독소루비신의 개선된 유도체가 화학합성에 의해서 제조되어왔다.[참조; Penco. Process Blochem. 15 : 12(1980); T. Kaneko, Chimicaoggi May : 11 (1988)]. 4′-에피독소루비신[에피루비신(Epirubicin)] 및 4-데메톡시다우노루비신(다루비신[darubicin)]은 이와 같은 동족체의 예이다.

이들 천연 화합물은 스트렙토마이세스의 다양한 균주(예; 스트렙토마이세스 페우세티우(S. peucetius), 스트렙토마이세스 코에룰레오루비두스(S. coeruleorubidus), 스트렙토마이세스 갈리라에우스(S. galilaeus), 스트렙토마이세스 그리세우스(S. griseus), 스트렙토마이세스 그리세오루베르(S. griseoruber), 스트렙토마이세스 인시그니스(S. insignis), 스트렙토마이세스 비리 도크로모게네스(S. viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비푸르쿠스(S.bifurcus) 및 스트렙토마이세스종 균주 C5] 및 악티노마이세스 카르미나타(Actinomyces carminata)에 의해 생산된다. 독소루비신은 단지 스트렙토마이세스 페우세티우스 아종인 카에시우스에 의해서만 생산되나 다우노루비신은 스트렙토마이세스 페우세티우스외에 상기된 다른 스트렙토마이세스에 의해서도 생산된다. 이러한 유형의 균주인 스트렙토마이세스 페우세티우스 아종 카에시우스 IMRU 3920[이 균주는 기탁번호 ATCC 27952와 동일한 균주이며 이후로는 “스트렙토마이세스 페우세티우스 3920”으로 약술한다], 스트렙토마이세스 페우세티우스 ATCC 29050(“스트렙토마이세스 페우세티우스 29050”), 및 스트렙토마이세스 페우세티우스 아종 카에시우스 ATCC 27952(“스트렙토마이세스 페우세티우스 27952”)는 널리 이용되고 있으며 미합중국 제3,590,028호에 기술되어 있다. 스트렙토마이세스 페우세티우스 29050 및 27952는 기탁번호 ATCC 29050 및 27952로서, 미합중국 메릴랜드 록크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 기탁되어져 있다.

안트라사이클린 독소루비신(2)은 도면의 제1도에 나타낸 합성 경로에 따라서 말론산, 프로피온산 및 글루코스로부터 스트렙토마이세스 페우세티우스 27952에 의해 제조된다. ∈-로도마이시논(4), 카미노마이신(3) 및 다우노루비신(1)은 이 방법에서 확립된 중간체이다[참조; Grein. Advan. Appl. Microbiol, 32 : 203(1987), Eckardt 및 Wagner, J. Basic Microbiol. 28 : 137(1988)]. 이 합성 경로에서의 두 단계에는 독립된 중간체의 0-메틸화, 즉 아클라논산의 메틸 아클라노네이트로의 전환 및 카미노마이신(3)의 다우노루비신(1)으로의 전환이 포함된다. 스트렙토마이세스 페우세티우스 29050, 스트렙토마이세스 인시그니스 ATCC 31913, 스트렙토마이세스 코에룰레오루비두스 ATCC 31276 및 스트렙토마이세스 아종 C5의 무세포 추출물은 S-아데노실-L-메티오닌 존재하에서 후자의 단계를 촉매하는 것으로 알려져 있으며[참조 : Conners et al., J. Gen. Microbiol. 136 : 1895(1990)], 이 사실은 이들 균주 모두가 특이적 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제(COMT 단백질)를 함유함을 나타낸다.

다우노루비신 생합성 및 다우노루비신 내성 유전자는 스트렙토마이세스 페우세티우스 29050 및 스트렙토마이세스 페우세티우스 27952로부터 클로닝 실험에 의해 수득되어져 왔다[참조 : Stutzman Engwall 및 Hutchinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 3135(1988); Otten et al., J. Bacteriol. 172 : 3427 (1990)]. 이들 연구를 통해, 이들 클로닝된 유전자가 스트렙토마이세스 리비단스 1326내로 도입될 경우, ∈-로도마이시논을 생성할 수 있는 능력을 부여하여, 이 숙주가 다우노루비신 및 독소루비신에 대해 내성을 갖게 된다는 사실이 밝혀졌다. 연속되는 연구에서 본 발명자들은 스트렙토마이세스 리비단스내로 도입된 경우 이들 클론이 카미노마이신을 다우노루비신으로 전환시킬 수 있는 능력을 부여할 수 있는지의 여부를 실험하였다. 현재, 본 연구자들은 이후 “dnrk”로 약술되는, 카미노마이신 4-0-메 틸트랜스퍼라제 유전자가 삽입된 1.6kb의 DNA 분절을 분리하였다.

[발명의 요약]

본 발명은 도면의 제2도에 나타낸 제한부위의 배열을 지닌 DNA 또는 이들로 부터 유도되며 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자인, dnrK를 함유하는 제한 단편을 제공한다. 편의상, 제2도에 나타낸 DNA 분절을 “삽입체 DNA”라 칭하며 도면의 제3도에 나타낸 DNA 서열로써 더욱 정의된다. 본 발명은 또한 (1) 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있고 삽입체 DNA 또는 이들로부터 유도되는 dnrK 유전자를 함유하는 제한 단편을 함유하는 재조합 벡터 ; (2) 다우노루비신을 생성하는 스트렙토마이세스 아종 균주내에서 dnrK 유전자의 카피수 및 이의 생산량을 증가시킬 수 있는 재조합 벡터; (3) 정제된 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제 효소를 생성할 수 있도록 에체리키아 콜라이내에서 dnrk 유전자를 발현할 수 있는 재조합 벡터 : (4) 카미노마이신을 순수한 다우노루비신으로 생전환하기 위한 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제의 미생물원을 제공한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 독소루비신 생합성 경로를 요약한 것이다.

제2도는 본 발명의 제1 DNA의 제한 지도 분석 결과를 도시한 것이다. 이것은, SphI 및 PvuII로 분해하여 재조합체 플라스미드 pWHM 901로부터 수득한, 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제(dnrK) 유전자를 함유하는 1.6kb의 SphI/PvuII DNA 단편을, 에체리키아 콜라이-스트렙토마이세스 셔틀 벡터인 pWHM3 플라스미드[참조; Vara et al., J. Bacteriol. 171 : 5872(1989)]의 SphI/SmaI 부위내로 삽입시켜 작제한 재조합체 플라스미드 pWHM 902내의 삽입체이다. 제2도에 나타낸 유전자 지도는 상기 DNA 분절내에 존재하는 모든 제한 부위를 총 망라하는 것은 아니지만, 보고된 부위는 상기 분절의 확실한 인지를 위해 충분하다.

제3도는 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 dnrK DNA 분절에 상응하는 뉴클레오타이드 서열의 개략도이다. 이것은 pWHM902의 SphI 제한부위 및 PvuII 제한부위 사이의 영역을 포함하며 5′ 내지 3′ 방향의 암호화 본쇄를 나타낸다. 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 해독된 개방 판독 프레임의 유도된 아미노산 서열은 하기 dnrK 유전자의 뉴클레오타이드 서열 아래에 나타낸다(서열 : 1, 서열 : 2).

제4도는 본 발명의 제2 DNA의 제한 지도 분석을 도시한 것이다. 이것은 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 pWHM901의 5.8kb의 SphI DNA 단편으로부터 수득된 약 1.4kb의 Ndel/EcoRI DNA 단편을 pT7-7 이.콜라이 발현 플라스미드 벡터[참조; Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 1074(1985))의 Ndel 및 EcoRI 부위내로 삽입시켜 작제한 재조합체 플라스미드 pWHM903내의 삽입체이다. 제4도에 나타낸 유전자 지도가 DNA 분절내에 존재하는 모든 제한부위를 총 망라하는 것은 아니지만, 보고된 부위는 상기 분절의 확실한 인지를 위해 충분하다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명의 삽입체 DNA 및 제한 단편은 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자(dnrK)를 함유한다. 발현될 이와 같은 유전자의 경우, DNA는 자체의 전사 조절 서열 및 특히, 유전자에 작동적으로 연결되며 숙주 세포 RNA 폴리머라제에 의해 인지되는 자체의 프로모터를 지닐 수 있다. 달리, 삽입체 DNA 또는 제한 단편은 정방향으로 다른 전사 조절 서열에 결합되거나 벡터내 전사 조절 서열에 인접하여 적절히 위치한 제한 부위에서 벡터내로 클로닝될 수 있다.

카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제 유전자를 지닌 삽입체 DNA 또는 제한 단편은 재조합체 DNA 클로닝 벡터내로 클로닝될 수 있다. 하나 이상의 추가의 DNA 분절이 가해질 수 있는 DNA 분자를 포함하는 모든 자가 복제 인자 및/또는 통합 인자가 사용될 수 있다. 그러나, 통상적으로 이 벡터는 플라스미드이다. 바람직한 플라스미드는 카피수가 큰 플라스미드 pWHM3 또는 pIJ702이다[참조; Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129 : 2703(1983)]. 다른 적합한 플라스미드는 pIJ385[참조; Mayeri et al., J. Bacteriol, 172 : 6061(1990)], pIJ680[참조; Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985). pWHM601[Guifoile 및 Hutchinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 8553(991)] 또는 pPM927[참조; Smokina et al., Gene 94 : 52(1990)]이다. 임의의 적합한 기술을 사용하여 삽입체 DNA 또는 이의 제한 단편을 벡터내로 삽입시킬 수 있다. 삽입은 선형화된 벡터내의 적절한 제한 부위에 DNA를 결합시켜 달성할 수 있다. 이를 위해, 점성 또는 평활 말단의 직접적인 결합, 단독중합체 테일링(tailing), 또는 링커 또는 어뎁터 분자의 사용을 이용할 수 있다.

재조합 벡터를 사용하여 적합한 숙주 세포를 형질전환시킨다. 숙주 세포는 카시노마이신- 또는 다우노루비신-민감성, 즉, 특정량의 카미노마이신 또는 다우노 루비신의 존재하에 성장할 수 없는 것이거나, 카미노마이신- 또는 다우노루비신 내성인 것일 수 있다. 숙주는 미생물일 수도 있다. 따라서 스트렙토마이신 페우세티우스, 특히 스트렙토마이세스 페우세티우스 29050, 및 안트라사이클린을 생산하거나 생산할 수 없는 다른 스트렙토마이세스 종의 균주를 형질전환시킬 수 있다. 스트렙토마이세스 균주의 형질전환체는 통상적으로 원형질체 형질전환에 의해 수득된다. 또한, 이 dnrK 유전자를 다른 벡터내로 통합시켜 이.콜라이와 같은 비-스트렙토마이세테스에서 발현시킬 수 있다. 형질전환된 숙주에 의해 수득된 COMT 단백질은 카미노마이신을 다우노루비신으로 생전환시키는데 사용될 수 있다. 이 방법으로, 발효 방법에 의해서 생산되고 다우노루비신외에 바람직하지 않은 중간체 카미노마이신을 함유하는 세포 추출물로부터 출발하여 고도로 순수한 다우노루비신을 제조할 수 있다.

이 생전환 공정은 유리되거나 고정된 형질전환시킨 세포를 직접 사용하거나 COMT 단백질을 분리함으로써 수행될 수 있는데, 이는 유리된 형태, 이온 결합 또는 공유 결합에 의해 공지된 기술에 따라 수지, 유리, 셀룰로스 또는 유사 물질에 고정되거나, 기질에 투과성이거나 가교-결합에 의해 가용화되지 않는 섬유에 접착된 형태로 사용될 수 있다. 이 COMT 단백질은 또한 천연 세포 추출물로 사용될 수 있다.

카미노마이신의 생전환을 증가시키고 상기의 원하지 않는 중간체가 최종 세포 추출물내에서 존재하는 것을 최소로 하기 위해서, 본 발명의 재조합 벡터를 사용하여 다우노루비신을 생산하는 적합한 숙주 세포를 형질전환시킨다. 숙주 세포는 카미노마이신 다우로루비신- 또는 독소루비신-내성인 즉, 특정양의 카미노마이신, 다우노루비신 또는 독소루비신의 존재하에서 성장할 수 있는 것일 수 있다. 따라서 스트렙토마이세스 페우세티우스, 특히 스트렙토마이세스 페우세티우스 29050 균주, 및 안트라사이클린을 생산하는 스트렙토마이세스 종의 기타 균주도 형질전환될 수 있다. 스트렙토마이세스 균주의 형질전환체는 통상적으로 원형질체 형질전환에 의해 수득된다. 다우노루비신은, dnrK 유전자를 함유하지 않는 스트렙토마이세스 페우세티우스 또는 다른 스트렙토마이세스 종의 형질전환된 균주를 배양하고 이렇게 생산된 다우노루비신 또는 관련된 안트라사이클린을 회수함으로써 수득될 수 있다.

삽입체 DNA는 스트렙토마이세스 페우세티우스 29050의 게놈성 DNA로부터 수득할 수 있다. 이 균주는 수탁번호 ATCC 29050하에 미합중국 메릴랜드 록크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되어 있다. 스트렙토마이세스 페우세티우스 27952와 유사하게, 스트렙토마이세스 페우세티우스 29050으로부터 유래된 균주도 또한 사용될 수 있는데, 이는 카미노마이신을 다우노루비신으로 전환시킬 수 있다. 따라서 삽입체 DNA는, (a) 스트렙토마이세스 페우세티우스 29050 또는 이로부터 유래된 균주의 게놈성 DNA의 라이브러리를 제조하고; (b) 카미노마이신을 다우노루비신으로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 클론에 대해 이 라이브러리를 스크리닝하며; (c) 라이브러리의 일부를 구성하며 카미노마이신을 다우노루비신으로 전환시킬 수 있는 능력에 대해 양성으로 스크리닝된 재조합 벡터로부터 삽입체 DNA를 수득하고; (d) 임의로, 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자를 함유하는 제한 단편을 삽입체 DNA로부터 수득함으로써 수득될 수 있다.

라이브러리는 스트렙토마이세스 페우세티우스 29050 또는 이로부터 유래된 균주의 게놈성 DNA를 부분적 분해함으로써 단계 (a)에서 제조될 수 있다. 제한 효소 Mbol이 바람직하게 사용된다. 이렇게 수득한 DNA 단편은 크기별 분획화될 수 있는데, 3 내지 5Kb의 크기의 단편이 바람직하다. 이들 단편을 pWHM3 또는 pIJ702와 같은 선형화된 벡터내로 연결시킨다. 숙주 세포를 연결 혼합물로 형질전환시킨다. 통상적으로, 숙주 세포는 카미노마이신 또는 다우노루비신을 생산할 수 없으며 카미노마이신- 또는 다우노루비신-민감성, 예를 들면, ml당 10㎍ 이하의 카미노마이신 또는 다우노루비신에 대해 민감성일 수 있다. 예를 들어, 스트렙토마이세스 리비단스 JI : 623 원형질체[참조; Hobwood et al., Genetic, Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK 1985)가 형질전환될 수 있다.

단계(b)에서, 이렇게 수득한 형질전환체를 카미노마이신의 수취 능력, 이를 다우노루비신으로 전환하는 능력, 및 다우노루비신의 분비 능력에 대해 스크리닝한다. 카미노마이신을 다우노루비신으로 전환시킬 수 있는 클론을, 다우노루비신의 존재에 대해 카미노마이신을 함유하는 배양 배지의 추출물을 크로마토그래피 분석하는 방법으로 동정한다. 이와 같은 클론을 분리하고 이에 함유된 재조합 벡터를 추출한다. 단계(c)에서 적합한 제한 효소를 사용하여 재조합 벡터를 분해하면, 각각의 벡터내로 삽입된 스트렙토마이세스 페우세티우스 29050 DNA가 동정, 규격화 및 유전자 지도화될 수 있다. 이러한 방법에서, 벡터가 본 발명의 삽입체 DNA를 함유하는지를 점검할 수 있다.

또한, 본 발명의 DNA내에 전부 또는 일부 포함된 2개 이상의 중첩(overlap)된 삽입체를 분리할 수 있다. 이를 일반적인 제한 부위에서 절단하고 연속해서 연결하여 함께 융합함으로써 본 발명의 DNA를 수득하고, 필요할 경우 적절한 제한 효소를 사용하여 길이를 단축할 수 있다. COMT 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 삽입체 DNA의 제한 단편은 적절한 제한 효소를 사용하여 삽입체 DNA를 절단함으로써 단계(d)에서 또한 수득될 수 있다.

본 발명의 DNA는 카미노마이신을 다우노루비신으로 전환시키는 능력을 부여하는 자체능에 영향을 미치지 않는 방법으로 돌연변이될 수 있다. 예를 들면 이는 부위-지시된 돌연변이 유발로 달성될 수 있다. 이와 같이 돌연변이된 DNA는 본 발명의 일부를 형성한다.

본 발명의 DNA는 또한 이.콜라이와 같은 비-스트렙토마이세테 숙주에서 dnrK 유전자를 발현시키기에 적합한 벡터 내로 삽입될 수 있다.

하기 실시예에서 본 발명을 설명한다.

[재료 및 방법]

[세균 균주 및 플라스미드]

암피실린 및 아프라마이신에 대해 민감성인, 이.콜라이 균주 DH5_α를 DNA 단편을 서브클로닝하는데 사용하고, 이.콜라이 K3S/Russel ＆ Modet, J. Bacteriol. 159 : 1034(1984)/를 스트렙토마이세스 페우세티우스 dnrK 유전자의 발현에 사용한다. 이.콜라이 JM105는 dnK 유전자를 서열분석하기 위한 일본쇄 DNA를 제조하는데 사용한다.

[배지 및 완충액]

이.콜라이 DH5_α를 LB 한천[참조; Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)상에 유지시킨다. 형질전환체를 선별하기 위해, 암피실린 또는 아프라마이신을 각각 50㎍/ml 및 100㎍/ml의 농도로 가한다. 이.콜라이 JM105를 M9 최소 한천 배지(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)상에 유지시키고, 콜로니를 LB 배지상에 이동시켜 37℃에서 밤새 성장시켜 일본쇄 DNA 제조시 사총되는 세균을 수득한다. H 한천[참조; Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)를 사용하여 Ml3 DNA의 복제형으로 형질전환된 이.콜라이 DH5_α를 플레이팅한다[참조 : Yansch-Perron et al., Gene 33 : 103(1985)]. 스트렙토마이세스 리비단스는 포자 제조외에 원형질체 재생성을 위해 R2YE 한천[참조 : Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwick, UK, 1985)상에 유지시킨다.

[DNA 단편의 서브클로닝]

DNA 샘플을 적절한 제한 효소로 분해하고 아가로스 겔 상에서 표준 방법[참조; Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)을 사용하여 분리한다. 목적 DNA 단편을 함유하는 아가로스 조각을 겔로부터 잘라내어 GENECLEAN 장치(Bio 101, La Jolla, CA 제조원)를 사용하여 이들 조각으로부터 DNA를 분리한다. 분리된 DNA 단편은 표준 방법(참조; Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)을 사용하여, 생형질전환 및 발현 실험을 위해 각각 이.콜라이 및 이.콜라이/스트렙토마이세스 셔틀 벡터내로 서브클로닝하고 서열분석을 위해 Ml3 벡터[참조; Yansch-Perron et al.,, Gene 33 : 103(1985)]내로 서브클로닝 한다.

[DNA 서열분석]

목적 DNA 단편을 Ml3 벡터내로 서브클로닝한 후, 일본쇄 DNA를 표준 방법[참조; Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)으로 제조하여 서열분석하는데 사용한다. DNA 서열 데이타는 제조업자의 제안에 따라서 시쿼나제 버젼 2.0 서열분석 키트(Sequenase version 2.0 sequencing kit; US Biochemicals, Cleveland, OH)를 사용하여 수득한다. 7-데아자 dGTP를 dGTP 대신 사용하여 압착을 방지한다. 우선, Ml3 벡터의 일반적인 프라이머를 사용하여 제1의 200 내지 250개 염기 서열을 수득한 다음, 이 서열 데이타로부터, 17-머(17-mer) 올리고뉴클레오타이드를 제조업자 지시에 따라 어플라이드 바이오시스템스 391 DNA 합성기를 사용하여 합성하고 프라이머로 사용하여 완전한 DNA 서열 데이타가 수득될 때까지 DNA 서열 분석을 계속 수행한다.

[스트렙토마이세스종 및 이.콜라이의 형질전환]

이.콜라이의 수용적격(competent) 세포를 염화칼숨 방법[참조; Sambrook et al., Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)으로 제조하여 표준 기술[참조; Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에 의해 형질전환시킨다. 스트렙토마이세스 리비단스 TK24 균사체를 YEME 배지[참조; Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985)에서 생장시키고 48시간후 수거한다. 균사체 펠렛을 10.3% 슈크로스 용액으로 2회 세척하고 홉우드 매뉴얼[참조; Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwick, UK, 1985)에 요약되어 있는 방법에 따라서 원형질체를 제조하는데 사용한다. 원형질체 펠렛을 P 완충액[참조; Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985) 약 300㎕중에 현탁시키고 이 현탁액의 50㎕ 분액을 각각의 형질전환에 사용한다. 원형질체는 홉우드 등의 소-규모 형질전환 방법[참조; Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985)에 따라 플라스미드 DNA로 형질전환시킨다. 30℃에서 R2YE 배지상에 재생장시킨지 17시간후, 플레이트에 티오스트렙톤 50㎍/ml를 덮고 포자가 생성될 때까지 30℃에서 생장시킨다.

[카미노마이신의 다우노루비신으로의 생전환]

상이한 플라스미드를 지닌 스트렙토마이세스 리비단스 형질전환체를 티오스 트렙톤 5㎍/m1를 함유하는 액체 R2YE 배지[참조; Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985)내로 접종한다. 30℃에서 생장시킨지 2일후, 이 배양물 2.5ml를 티오스트렙톤 20㎍/ml를 함유하는 스트롤 배지(Dekleva et al., Can J. Microbiol. 31 : 287(1985)] 25ml에 이동시킨다. 배양물을 30℃에서 72시간 동안 300rpm의 회전 진탕기상의 배플(baffle)이 장착된 삼각 플라스크중에서 생장시킨 후, 카미노마이신(10mg/m1 농도의 수용액)을 상기 배양물에 가하여 최종 농도가 5㎍/ml가 되게 한다. 진탕기상에서 추가로 배양한지 24시간후, 이 배양물에 150mg/m1 옥살산을 첨가한후 60℃에서 45분 동안 수 욕중에 배양함으로써 안트라사이클린 대사산물의 글리코시드 형태를 가수분해한다. 이 대사산물을, 배양물의 pH를 8.4 내지 8.6으로 조정한후 클로로포름 15m1를 사용하여 배양물로부터 추출한다. 클로로포름 용액을 0.45㎛ 아크로디스크 CR 필터(Acrodisc CR filter; German Sciences, Ann Arbor, MI 제조원)를 통해 여과하고 이 여액 100㎕를 워터스 노바. 팩 C₁₅카트리지(Waters Nova-Pak C₁₅cartridge, 6mm x 10cm) 상에서 인산으로 pH를 2.5로 조정한 메탄을-물(85 : 15)의 유동 속도가 3m1/분인 이동상을 사용하여 HPLC로 분석한다. 컬럼 배출물을 워터스 6000 용매 전달 시스템(Waters 6000 Solvent delivery system), 254nm에서 작동하는 441 UV 검출기, 및 740 데이타 모듈(740 data module)을 사용하여 모니터링한다. 카미노마이신 및 다우노루비신(메탄올중 10㎍/ml)을 외부 표준물로 사용하여 배양물로부터 분리된 이들 대사산물의 양을 적량한다.

[실시예 1]

[카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 dnrK 유전자의 클로닝]

대략 96kb의 스트렙토마이세스 페우세티우스 29050 게놈성 DNA를 나타내는, 슈츠맨-엔왈 및 휴친슨(Stutzman-Engwall 및 Hutchinson)이 기술한 몇몇의 코스미드(cosmid) 클론[참조; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 3135(1989)]을 스트렙토마이세스 리비단스 TK24내로 형질전환시키고, 상기 재료 및 방법 단락에서 기술한 방법에 따라서 이 형질전환체를 카미노마이신의 다우노루비신으로의 생전환에 대해 분석한다. 코스미드 클론 pWHM339[참조; Otten et al., J. Bacteriol. 172 : 3427(1990)]은 가해진 카미노마이신 22%를 다우노루비신으로 생전환시킨다. pWHM339의 삽입체로부터의 11.2Kb의 EcoRI 단편을 코스미드 벡터 pKC505[참조; Richardson et al., Gene 61 : 231 (1987))내로 서브클로닝시켜 플라스미드 pWHM534를 수득한다. pWHM534로 형질전환시킨 스트렙토마이세스 리비단스 TK24에서는 가해진 카미노마이신의 25 내지 60%가 다우노루비신으로 생전환된다. pWHM534로부터의 5.8Kb SphI 단편을 고-카피수의 플라스미드 pWHM3의 SphI 부위내로 서브클로닝시켜 플라스미드 pWHM901을 수득한다. pWHM901로 형질전환시킨 스트렙토마이세스 리비단스에서는 카미노마이신의 50 내지 80%가 다우노루비신으로 생전환된다. 우선 1.6Kb의 SphI/PvuII 단편을 PWHM901로부터 pUC19[참조 : Yansch Perron et al.,Gene 33 : 103(1985))의 SphI/SmaI 부위내로 클로닝시킨 다음, HindIII/EcoRI 단편으로서 후자의 플라스미드로부터 1.6Kb의 DNA 단편을 pWHM3의 HindIII/EcoRI 부위내로 서브클로닝시켜 플라스미드 pWHM902 (제2도)를 수득한다. pWHM902로 형질전환시킨 스트렙토마이세스 리비단스에서는 배양물에 가해진 카미노마이신의 100%가 다우노루비신으로 생전환된다.

[dnrK 유전자를 함유하는 영역의 DNA 서열]

pWHM901내의 5.8Kb SphI 단편의 2.5Kb DNA 분절의 서열분석은, pWHM902로부터의 0.4Kb의 SphI/XhoI, 0.7Kb의 XhoI/SstI, 0.6Kb의 SstI/SalI, 및 0.8Kb의 SalI/XhoI 단편을 M13mp18 및 M13mp19 벡터[참조; Yansch-Perron et al., Gene 33 : 103(1985)]내로 서브클로닝시켜 양 방향의 각각의 DNA 분절을 수득하는 방법으로 수행한다. 수득되는 4개 클론의 DNA 서열분석을 상기 재료 및 방법 단락에 기술한 바와 같이 수행한다. dnrK 유전자를 함유하는 수득된 1.5Kb DNA 단편의 DNA 서열, 및 데버룩수 등[참조; Devereux et al.; Nucl. Acids Res. 12 : 387(1984)]이 기술한 CODON-PREFERENCE 프로그램으로 이 DNA 서열을 분석하여 유추한 COMT 단백질의 아미노산 서열은 제3도에 제시된다. CODON-PREFERENCE 및 TRANSLATE 분석[참조; Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12 : 387(1984)]에 의해 동정된 dnrK 개방 판독 프레임은 COMT 단백질을 암호화하고 있다.

[실시예 2]

[이.콜라이내에서 dnrK 유전자의 발현을 위한 벡터의 작제]

일부 플랭킹 서열(flanking sequence; 제3도)과 함께 전체의 dnrk 개방 판독 프레임을 함유하는 대략 1.6Kb의 SphI/PvuII DNA 단편을 SphI 및 SmaI-분해된 pUC19[참조; Yansch Perron et al., Gene 33 : 103(1985)]내로 서브클로닝시켜 플라스미드 pWHM904(나타내지 않음)를 수득한다.증폭시킬 dnrK-함유 단편의 부위상에서 서열에 상응하는, 하기의 2개 올리고데옥시 뉴클레오타이드 프라이머를 제조업자 지시에 따라서 어플라이드 바이오시스템스 391 DNA 합성기(Applied Biosystems 391 DNA Synthesizer)로 합성한다:

이.콜라이에서 dnrK 유전자의 발현을 증진시키기 위한 수단으로서, dnrK 유전자의 2, 3 및 6번째 코돈 제3위치(굵은 활자로 표시)를 프라이머 #1을 사용하여 변화시켜, 고 수준으로 발현된 이.콜라이 유전자내에서 가장 널리 사용된 코돈이 반영되도록 한다.

이 2개의 프라이머를 사용하여, 스트렙토마이세스 DNA를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응에 대한 표준 방법[참조 : Guilfoile 및 Hutchinson, J. Bacteriol. 174 : 3659(1992)]에 의해 pWHM904의 dnrk 서열(제3도의 뉴클레오타이드 205[dnrK ori의 개시부]로부터 445)을 증폭시킨다. 증폭된 산물로부터, 88bp의 NdeI/NcoI 단편을 잘라내고, 잔존 dnrK 유전자(제2도 및 제3도)를 포함하는 1.3Kb의 NcoI/EcoRI 단편(pWHM902로부터 수득함) 및 NdeI/EcoRI-분해된 pT7-7[참조; Tabor 및 Richardson, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 82 : 1074(1985)]에 연결시킴으로써, 이. 콜라이 발현 벡터의 T7 유전자 10 프로모터에 dnrK ori가 융합된다. 이. 콜라이 DH5_α의 수용적격 세포를 연결된 DNA로 형질전환시키고 이 형질전환체를 pT7-7에 대해 dnrK를 사용하여 스크리닝한다. 수득된 플라스미드를 pWHM903(제4도)으로 지정한다.

[이.콜라이내에서 dnrK 유전자의 발현]

플라스미드 pGP1-2를 포함하는 수용적격 이.콜라이 세포[참조; Tabor 및 Richardson, Proc.]를 30℃에서 생장시킨후 암피실린(100㎍/ml) 및 가나마이신(50㎍/ml)을 함유하는 LB 한천[참조; Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)상에서 선별한다. pGPl-2를 포함하는 이.콜라이의 수용적격 세포를 제조하는 방법은 배양물을 37℃ 대신 30℃에서 유지시키는 것을 제외하고는, 기타 다른 이.콜라이 균주에서의 방법과 동일하다. pGPl-2를 포함하는 이.콜라이의 수용적격 세포를, 가나마이신을 함유하는 LB 배지중 30℃에서 OD₅₅₀0.5 내지 0.6으로 생장시킨 세포로부터 제조한다. 통상의 유지 및 예비-유도 생장을 위해 pGPl-2를 포함하는 균주를 30℃에서 유지하여 T7 RNA 폴리머라제의 과발현을 피하는 것이(그렇지 않은 경우 돌연변이된 플라스미드가 생성될 수 있다)이 매우 중요하다.

pGPl-2 및 pWHM903 모두를 지니고 있는 단일 형질전환체를 암피실린 100㎍/ml 및 가나마이신 50㎍/ml를 함유하는 2x YT 배지[참조; Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) 25m1내에 접종한 다음 격렬히 교반하면서 30℃에서 밤새 생장시킨다. 다음날 아침 교반하는 수욕내에서 30분 동안 42℃로 배양물에 열 충격을 가하고 다시 30℃로 옮긴다. 추가로 배양한지 90분후, 배양물 1ml를 마이크로원심분리기(microcentrifuge) 내에서 14,000rpm으로 1분 동안 원심분리하고, 상층액을 버린후, 세포 펠렛을 래믈리 완충액[참조; Laemmli, Nature (London), 227 : 680 (1970)] 100㎕중에 재현탁시키고 5분 동안 비등시킨다. 비등한 샘플중에 함유된 단백질을 표준 방법[참조 : Laemmli, Nature (London), 227 : 680(1970)]을 사용하여 10% SDS-플리아크릴아미드 겔상에서, dnrK 유전자를 함유하지 않는 pT7-7벡터로 형질전환시킨 이.콜라이의 세포 추출물로부터 수득한 단백질과 비교하여 분석한다. 이 COMT 단백질은 Mr 38,700에서 이동한다.

[실시예 3]

[COMT 단백질을 함유하는 세포에 의한 카미노마이신의 다우노루비신으로의 전환]

pGPl-2 및 pWHM903 모두를 함유하는 단일의 이.콜라이 형질 전환체를 암피실린 100㎍/ml 및 가나마이신 50㎍/ml를 함유하는 2x YT 배지 25m1내로 접종하고 격렬하게 교반하면서 30℃에서 밤새 생장시킨다. 다음날 아침, 교반하는 수욕중에서 30분 동안 42℃로 배양물에 열 충격을 가한 다음 카미노마이신 5㎍/ml를 가한후 다시 30℃로 옮긴다. 배양물을 추가로 90분 동안 생장시킨 후, 표준 방법을 사용하여 암피실린 대사산물을 분리시킨 다음 HPLC 상에서 분석한다. HPLC 크로마토그램에서 카미노마이신 및 다우노루비신에 대한 단일 피크의 상대적인 영역을 비교한 결과 배양 배지에 가해진 카미노마이신의 75 내지 80%가 다우노루비신으로 전환되었다.

[서열 목록]

(1) 일반 정보 :

(i) 출원인 : 차알스 알. 허친슨

크리쉬나 엠. 마무리

프란체스카 토르티

안나 엘. 콜롬보

(ii) 발명의 명칭 : 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 서열

(iii) 서열 : 6

(iv) 서신 주소 :

(A) 주소 : 머레이 앤드 오람 마멜스테인, 니카이도,

(B) 거리 : 슈트 330 15번가 엔. 더블유. 655

(C) 도시 : 워싱톤

(D) 주 : 디.씨.

(E) 국가 : 미합중국

(F) 우편번호 : 20005-5701

(v) 컴퓨터 판독 형태 :

(A) 매체형 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성

(C) 운영 체계 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : 파텐트인 릴리즈 #1.0, 버전 #1.25

(vi) 현 출원 정보 :

(A) 출원번호 : US

(B) 출원일 :

(C) 분류 :

(vii) 우선권 정보 :

(A) 출원번호 : 미합중국 제793,873호

(B) 출원일 : 1991년 11월 18일

(viii) 위임장/대리인 정보 :

(A) 명칭 : 모니카 에프.친

(B) 등록번호 : 제P-36,105호

(C) 참조/도켓 번호 : 1615-1816CIP

(ix) 통신정보 :

(A) 전화 : (202)638-5000

(B) 팩시밀리 : (202)638-4810

(2) 서열 1에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 1632개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄 : 이본쇄

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형 : DNA(게놈성)

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 위치 : 204..1271

(xi) 서열 기술 : 서열 : 1

(2) 서열 2에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 356개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자 유형 : 단백질

(xi) 서열 기술 : 서열 : 2

(2) 서열 3에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 67개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄 : 일본쇄

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자 유형 : DNA

(xi) 서열 기술 : 서열 : 3

(2) 서열 4에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 38개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄 : 일본쇄

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자 유형 : DNA

(xi) 서열 기술 : 서열 : 4

(2) 서열 5에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 40개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄 : 일본쇄

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자 유형 : DNA

(xi) 서열 기술 : 서열 : 5

(2) 서열 6에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 40개 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 쇄 : 일본쇄

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자 유형 : DNA

(xi) 서열 기술 : 서열 : 6

Claims

카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 서열 : 1의 유전자를 포함하는 분리된 DNA 서열.
카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 서열 : 1의 유전자를 포함하는 벡터.
제2항에 있어서, 플라스미드인 벡터.
제3항에 있어서, pWHM901, pWHM902 및 pWHM903으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 플라스미드인 벡터.
카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 서열 : 1의 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는, 이.콜라이 및 스트렙토마이세스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형질전환된 숙주 세포.
제5항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 형질전환된 숙주 세포.
제5항에 있어서, 벡터가 pWHM901, pWHM902 및 pWHM903으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 플라스미드인 형질전환된 숙주 세포.
카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 서열 : 1의 유전자를 발현하는 벡터를 사용하여 형질전환시킨 세포로부터 수득된 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제 활성을 나타내는 펩타이드.
하기 아미노산 서열(서열 : 2)을 포함하는, 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제 활성을 나타내는 펩타이드.
카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 서열 : 1의 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 이.콜라이 및 스트렙토마이세스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 숙주 세포를 형질전환시키고, 이 숙주 세포를 적절한 배지중에서 배양하며, 이렇게 수득된 유전자를 발현시킴을 특징으로하여, 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제 활성을 나타내는 펩타이드를 제조하는 방법.
제10항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 방법.
제11항에 있어서, 플라스미드가 pWHM901, pWHM902 및 pWHM903으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 서열 : 1의 유전자를 포함하는 벡터를 사용하여 스트렙토마이세스 숙주 세포를 형질전환시키고, 적절한 배지중에서 이 숙주 세포를 배양하며, 이 유전자를 발현시키고 다우노루비신을 회수함을 특징으로 하여, 다우노루비신을 제조하는 방법.
제13항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 방법.
제14항에 있어서, 플라스미드가 pWHM901, pWHM902 및 pWHM903으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제 활성을 나타내는 서열 : 2의 펩타이드를 함유하는 제제 또는 제5항에 따른 형질전환된 숙주 세포를 사용하여, 카미노마이신을 다우노루비신으로 전환시키는 방법.
제16항에 있어서, 제제가 필수적으로 제9항에 따른 펩타이드로 이루어진 방법.
제16항에 있어서, 제제가 필수적으로 제8항에 따른 카미노마이신 4-0-메틸트랜스퍼라제 활성을 나타내는 펩타이드로 이루어진 방법.