PT101065B - Sequencias de adn e vectores que codificam carminomicina-4-0-metil-transferase e processo para a preparacao de daunorrubicina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

No.: 101.065

REQUERENTE: phabmacia & upjohn s.p .A., italiana, industrial, com sede em via Robert Koch N° 1.2, Milão, Itália

EPÍGRAFE: Sequências de ADN e vectores que codificam a carminomicina-4-0-metil-transferase e processo para a preparação de daunorrubicina

INVENTORES: Charles Richard Hutchinson;

Krishna Murthy Madduri;

Francesca Torti;

Anna Luisa Colombo;

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4° da Convenção de Paris de de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América, 18 de Novembro de 1991, sob o No.: 793873

Estados Unidos da América, 9 de Outubro de 1992, sob o No.: 07/959,941

DESCRIÇÃO

SEQUÊNCIAS DE ADN E VECTORES QUE CODIFICAM A CARMINOMICINA-4-O-METIL-TRANSFERASE E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DAUNORRUBICINA__

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo para a produção de antraciclinas úteis no tratamento do can cro por modificação da biosíntese da daunorrubicina de modo a melhorar a produção da daunorrubicina a partir da carmino mieina em estreptomicetes diferentes de Streptomyces peucetius 29050 e em extractos celulares bacterianos ou por pu rificação enzimática dos seus derivados.

Antecedentes da Invenção

As antraciclinas do grupo da daunorrubicina, tais como a doxorrubicina, a caminomicina e a aclacinomicina , estão englobadas entre os agentes mais amplamente utilizados em terapia anti-tumoral [F. Arcamone, Doxorubicin, Academic Press , New York , 1981 , pp. 12-25; A. Grein, Process Bio chem. 16:34 (1981); T. Kaneko, Chimicaoggi Maio:11 (1988)]. Foram preparados derivados aperfeiçoados de daunorrubicina e de doxorrubicina por síntese química de modo a aumentar a sua <3ctividade anti-tumor, particularmente no caso de adminis_ tração por via oral , e para combater a toxicidade aguda e a cardiotoxicidade crónica associadas à utilização destes fárma cos de tratamento do cancro [Penco, Process Biochem. 15:12

( 1980); T. Kaneko, Chemicaoggi Maio:1 1 ( 1988)]. Como exem pios desses análogos refere-se os compostos 4'-epidoxorrubicina (Epirubicin (R)) e 4-demetoxidaunorrubicina (Idaru. . . ® X bicm .

Estes compostos que ocorrem naturalmente são produzidos por diversas estirpes de Streptomyces (S. peucetius, S. coeruleorubidus, S. galilaeus, S. griseus, S. griseoruber, S_. insignis, S. viridochromogenes, S. bifurcus e Streptomyces sp. estirpe C5) e por Actinomyces carminata. A doxorrubicina é produzida apenas pelo organismo S. peucetius subesp. caesius mas a daunorrubicina é pro duzida pelo organismo S. peucetius e também pelos outros Streptomyces descritos antes. As estirpes dos tipos S.peu cetius subesp. caesius IMflU 3920 (esta estirpe é a mesma identificada pela designação ATCC 27952 e doravante será iden tificada por S. peucetius 3920), S. peucetius ATCC 29050 (S. peucetius 29050) e S. peucetius subesp. caesius

ATCC 27952 (S. peucetius 27952) encontram-se publicamen te disponíveis e estão descritas na patente de invenção nor te-americana número 3 590 028. Os organismos S. peucetius 29050 e 27952 foram depositados na Colecção Americana de Cul turas Tipo (American Type Culture Collection), RocKville, MD E.U.A., e receberam os números de registo ATCC 29050 e 27952.

A antraciclina conhecida por doxorrubicina (2) é produzida pelo organismo S. peucetius 27952 a partir de ácido malónico, ácido propiónico e glicose em conformidade com o percurso representado na Figura 1 cios desenhos anexos. A £.-rodomicinona (4), a carminomicina (3) e daunerrubicina (1) são intermediários fundamentais neste processo [Grein. Advan. Appl. Microbiol. 32:203 ( 1987). Eckardt e

Wagner, J. Basic Microbiol. 28 : 137 ( 1988)]. Há dois pas_ sos neste percurso que implicam a O-metilação de intermediá rios discretos: a conversão de um ácido aclanónico num aclanonato de metilo e a conversão da carminomicina (3) em daunor rubicina (1). Demonstrou-se que os extractos isentos de células de S. peucetius 29050, S.insignis ATCC 31913 , S.coeruãeorubidus ATCC _31276 e Strptomyces sp. 05 catalisam o último passo na presença de S-adenosil-L-metionina [Connors e colaboradores J. Gen.

Microbiol. 136:1895 (1990], sugerin do que todas estas estirpes contêm uma 4-0-metiltransferase específica da carminomicina (proteína COMT) .

Os genes para a biossíntese da daunorrubicina e que conferem

resistência à daunorrubicina foram obtidos a partir de S.peucetius 29050 e S. peucetius 27952 em experiências de clonagem [Stutzman-Engwall e Hutchinson,

Proc. Natl. Acad.· . Bacteriol.

172:3427 (1990)]. Estes estudos demonstraram que ao serem introduzidos em

Streptomyces lividans 1326, estes genes clonados conferem a capacidade de produzir £L-rodomicinona e fazem com que esse hospedeiro se torne resistente à daunorrubicina e à doxorrubicina. Em trabalhos subsequentes examinou-se a possibilidade de esses clones conferirem capacidade de converter a carminomicina em daunorrubicina quando introduzidos em S. lividans. Presente, isolou-se um

segmento de ADN de 1,6 quilobases (kb) que incorpora o gene

4-0-metiltransferase da carminomicina doravante designado abreviadamente por dnrk2*.

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona segmentos de

ADN possuindo uma configuração de locais de restrição confor. me representado na Fig. 2 dos desenhos anexos ou um fragmen to de restrição daí derivado contendo um gene dnrk codifica dor para a 4-0-metiltransferase da carminomicina. . Por razões de conveniência, o segmento de ADN representado na Fig. 2 é designado por ADN intercalar e é definido ainda pela sequência de ADN representada na Fig. 3 dos desenhos anexos A presente invenção proporciona também:

(D vectores recombinantes que são capazes

de transformar uma célula hospedeira e que contêm um ADN intercalar ou um fragmento de restrição daí derivado contendo o gene dnrk;

(2) vectores recombinantes que são capazes de aumentar o número de cópias do gene dnrk e a quantidade do seu produto numa estirpe de Streptomyces spp. produtora de daunorrubicina ;

(3) vectores recombinantes que são capazes de expressar o gene dnrK em Escherichia coli de modo a facilitar a produção da enzima purificada 4-0-metiltransferase

5da carminomicina;

(4) uma fonte microbiana de 4-0-metiltransfe rase da carminomicina para a bioconversão da carminomicina em daunorrubicina pura.

Breve Descrição dos Desenhos

A Fig. 1 é um resumo do percurso de biossín-

tese da doxorrubicina.

A Fig.

representa a análise do mapa de restrição do primeiro

ADN da presente invenção.

Isto constitui uma inserção no plasmído recombinante pWHM902 que foi construído por inserção de um fragmento de ADN Sphl/PvuII de 1,6 Kb contendo o gene

4-0-metiltransferase da carminomicina (dnrK), o qual foi obtido a partir do plasmido recombinante pWHM901 através da sua digestão com Sphl e

PvuII, no interior dos locais

Sphl/Smal do plasmido PWHM3 que e um vector de tipo vai-vem (Shuttle) de

Escherichia coli - Streptomyces [Vara e colaboradores,

J.

Bacteriol.

171 :5872 ( 1989) 1 · 0 mapa representado na Fig.

não propor.

ciona necessariamente uma listagem exaustiva de todos os lo cais de'restrição existentes no segmento de ADN. Contudo, os locais assinalados são suficientes para um reconhecimen to claro dos segmentos.

A Fig. 3 representa uma ilustração esquema-

tica de uma sequência nucleotídica do segmento de ADN do gene dnrK o qual corresponde ao que codifica a 4-0-metiltransferase da carminomicina. Isto abrange a região entre os locais de restrição Sphl e PvuII do plasmido pWHM902 e representa o cordão de codificação no sentido de 5' para 3'. Sob a sequência nucleotídica do gene dnrK mostra-se a sequência de aminoácidos derivada da estrutura de leitura aberta traduzida que codifica a

4-0-metiltransferase da car

minomicina .

A.’^rFig. 4 representa a análise do mapa de restrição do segundo ADN da presente invenção. Isto é uma inserção no plasmido recombinante pWHM9O3 que foi construída

por inserção de um fragmento de ADN Ndel/EcoRI de aproxima damente 1,4 Kb, obtido a partir do fragmento de ADN do Sphl de 5,8 Kb do plasmido pWHM901 por mutagénese dirigida ao local, no interior dos locais Ndel e EcorI do-vector plasmido de expressão pT7-7 de E.coli [Tabor e Richardson, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 82 : 1074 (1985)]. 0 mapa representado na

Fig. 4 não proporciona necessariamente uma listagem exaustiva de todos os locais de de ADN. Contudo, os locais um reconhecimento claro dos restrição existentes no segmento assinalados são suficientes para segmentos.

Descrição Pormenorizada da Invenção

Os segmentos de ADN intercalares e os fragmentos de restrição da presente invenção contêm um gene (dnrK) codificador para a 4-0-metiltransferase da carminomicina.

Para que esse gene possa ser expressado, o

ADN deve conter a sua própria sequência de controlo transcricional e,em par ticular, deve conter o seu proprio promotor o qual se encon tra funcionalmente ligado ao gene e o qual e reconhecido por uma ARN - polimerase da célula do hospedeiro. Em alter nativa, o segmento de ADN intí trição pode eventualmente ser controlo transcricional de for terior de um vector num local calizado na vizinhança de uma rcalar ou o fragmento de resligado a outra sequência de ma correcta ou clonado no inde restrição adequadamente lo sequência de controlo transcricional no vector.

Um segmento de ADN intercalar ou um fragmento de restrição portadores de um gene 4-0-metiltransferase da carminomicina pode eventualmente ser clonado num vector de clonagem de ADN recombinante. Eventualmente é possível uti_

lizar qualquer agente autonomamente replicador e/ou integra dor que contenha uma molécula de ADN à qual seja possível adicionar um ou vários segmentos de ADN. Contudo, o vector é tipicamente um plasmido.

Como plasmido preferencial refere-se o plasmido pWHM3 ou pIJ702 de elevado numero de copias [Katz e colaboradores,

J. Gen. Microbiol. 129: 2703 ( 1983) 1

Outros plasmidos adequados são os plasmidos

PIJ385 [Mayeri e colaboradores, J. Bacteriõl; 172 : 6061 ( 1990) ] , pIJ680 (Hopwood e colaboradores, Genetic Manipu8 lationof Streptomyces.

Foundation, Norwich

A Laboratory Manuel, John Innes UK, 1985), pWHM601 [Guilfoile and Hut chinson, Proc. Natl

Acad.

Sei. USA 88:8553 (991)] ou [Smo kina e colaboradores

Gene 94:52 (1990)].

possíve utili zar qualquer técnica adequada para inserir o segmento de ADN intercalar ou o seu fragmento de restrição no interior do vector. A inserção pode ser conseguida ligando o ADN no inte rior de um vector linearizado num local de restrição adequa do. Para o efeito, é possível utilizar uma combinação direc ta de extremidades aderentes ou embotadas, encadeamento sequencial de homopolímeros ou utilização de uma molécula liga dora ou adaptadora.

vector recombinante e utilizado para tran£ formar uma célula hospedeira adequada.

As células hospede^ ras podem ser células sensíveis à carminomicina ou à daunor rubicina, isto e, não podem crescer na presença de uma determinada quantidade de carminomicina ou de daunorrubicina,

ou células que sejam resistentes à carminomicina ou à daunorrubicina.

consequência, hospedeiro pode ser um microrganismo. Por possível transformar estirpes de S. peucetius, em particular de S.peucetius 29050, e outras estirpes de espécies Streptomyces que produzem antraciclinas ou que as não produzem. Os transformantes das estirpes de Streptomyces são obtidos tipicamente por transformação de protoplastos. 0 gene dnrk também pode ser incorporado noutros vectores e expressado em E. coli diferente de estreptomice tes. A proteína COMT obtida pelo hospedeiro transformado pode

9ser utilizada para a bioconversão da carminomicina em daunorrubicina. Este método permitiria a preparação de daunor rubicina de elevado grau de pureza a partir de um extracto celular produzido por um processo de fermentação e contendo a indesejada carminomicina intermediária para além da daunor rubicina.

processo de bioconversão pode ser realizado alternativamente utilizando por via directa as células transformadas livres ou imobilizadas ou isolando a proteína COMT, a qual pode ser utilizada na sua forma livre, imobilizada por técnicas conhecidas sobre resinas, vidro, celulose ou substâncias de tipo idêntico por ligações iónicas ou covalentes, ou enxertada em fibras permeáveis ao substracto ou insolubilizada por reticulação. A proteína COMT também pode ser utilizada no extracto celular que constitui a matéria prima.

vector recombinante da presente invenção também pode ser utilizado para transformar uma célula hospedeira adequada, a qual produza daunorrubicina, com o objec tivo de melhorar a bioconversão da carminomicina e de minimi za ea presença do referido intermediário indesejado no extrae to celular final. As células hospedeiras podem ser células do tipo resistente à carminomicina, à daunorrubicina ou à doxorrubicina, isto é, podem crescer na presença de qualquer quantidade de carminomicina, daunorrubicina, ou doxor

rubicina. Por consequência, é possível transformar estirpes de 5. peucetius, em particular S. peucetius, 29050, e outras estirpes de espécies de Streptomyces que produzem antraciclinas. Os transformantes das estirpes de Streptomyces são obtidos tipicamente por transformação de protoplas_ tos. A daunorrubicina pode ser obtida por cultura de uma estirpe transformada de S.peucetius ou de outra espécie de Streptomyces que não contenha um gene dorK e recuperando a daunorrubicina ou as antraciclinas afins assim produzidas.

Os segmentos de ADN intercalares são obtidos a partir de ADN genómico de S. peucetius 29050. Esta estirpe foi depositada na Colecção Americana de Culturas Tipo (American Type Culture Collection) , Rockville, MD, E.U.A. sob o número de registo ATCC 29050. Também é possível utilizar uma estirpe derivada de S. peucetius 29050 tal como S. peucetius 27952, a qual tipicamente é capaz de con verter a carminomicina em daunorrubicina. Por consequência, é possível obter os segmentos de ADN intercalares do modo s£ guinte :

(a) preparando uma biblioteca de ADN genó mico de S. peucetius 29050 ou de uma estirpe daí derivada;

(b) efectuando o rastreio dessa biblioteca para detecção dos clones com capacidade para converter a car minomicina em daunorrubicina;

(c) obtendo um segmento de ADN intercalar

1.1.

a partir de um vector recombinante que faça parte da biblio teca e para o qual o rastreio tenha proporcionado um resulta do positivo no que diz respeito à sua capacidade para conver ter a carminomicina em daunorrubicina; e (d) obtendo facultativamente a partir

do segmento de ADN intercalar um fragmento de restrição que con tenha um gene codificador para a 4-0 -metiltransferase da carminomicina.

A biblioteca pode ser preparada no passo (a) digerindo parcialmente o ADN genómico de S. peucetius 29050 ou de uma estirpe daí derivada. Utiliza-se preferencialmen te a enzima de restrição Mbol. Os fragmentos de ADN assim obtidos podem ser fraccionados dimensionalmente; são pref£ ríveis fragmentos com dimensões compreendidas entre 3 Kb e

Kb. Estes fragmentos são ligados no interior de um vector linearizado tal como pWHM3 ou pIJ702. As células hospedei.

l ras são transformadas com a mis.tura de ligação. Tipicamente, as células hospedeiras não podem produzir carminomicina ou daunorrubicina e podem ser sensíveis à carminomicina ou a daunorrubicina, por exemplo, podem ser sensíveis a concentrações da ordem de 10 jig ou menores de daunorrubicina por mililitro. Por exemplo, é possível trans.

carminomicina ou da formar protoplastos de S. lividans

JI1623 (Hopwood e colaboradores , Genetic Manipulation of

Streptomyces. A Labora tory Manual, John Innes Foundation,

Norwich, UK, 1985).

No passo (b) os transformantes assim obti12

uos são submetidos a rastreio para a determinação da sua ca pacidade para integrarem a carminomicina, para a converterem

em daunorrubicina e para excretarem a daunorrubicina. Os cio nes capazes de converter a carminomicina em daunorrubicina são identificados por análise cromatográfica dos extractos de um meio de cultura que contenha carminomicina pesquisando-se a presença de daunorrubicina. Esses clones são isolados e pro cede-se à extracção dos vectores recombinantes aí contidos. Ao efectuar-se a digestão dos vectores recombinantes com enzimas de restrição adequadas no passo (c) é possível identificar, dimensionar e cartografar o ADN de S. pencetius 29050 inserido em cada vector. Desta forma é possível verificar que o vector contém um segmento de ADN intercalar da presente invenção. ·

Além disso é possível isolar duas ou mais inserções sobrepostas que estejam total ou parcialmente englobadas no âmbito do ADN da presente invenção. Estas inserções podem ser fundidas entre si por clivagem no local de restrição comum e subsequente ligação para proporcionar um segmento de ADN da presente invenção, ajustando-se o seu comprimento utilizando, se necessário, enzimas de restrição adequadas. Os fragmentos de restrição de um segmento ADN intercalar que contenha um gene codificador para a proteína COMT pedem ser cbtidcs no passo (d) também per elivagen de un s^anto de ADN intercalar com uma enzima de restrição adequada.

ADN da presente invenção pode ser muta do de forma a possibilidade não se afectar a sua capacidade para conferir a de converter carminomicina em daunorrubicina.

Isto pod θ ser* conseguido, por exemplo, por mutagenese dirigi.

da a um local. Esses segmentos de ADN mutados fazem parte da invenção.

ADN da presente invenção pode ser tara bém incorporado em vectores adequados para a expressão do gene dnrK num hospedeiro de tipo diferente dos éstreptomicetes tal como exemplos a seguir descritos ilustrara a presente invenção.

Materiais e Métodos

Estirpes bacterianas e plasmidos: Utiliza-se a estirpe DH5ck de E. coli a qual é sensível à ampici. lina e á apramicina para efectuar a subclonagem de fragmen tos de ADN- e utiliza-se E. coli Κ3δ (Russel & Modet,. J. Ba£ teriol. 159 : 1034 (1984) para a expressão do gene dnrK de S. peucetius. Utiliza-se E. coli JM105 para preparar ADN de cordão simples para a sequenciação do gene dnrK.

Meios e soluções tampão: Mantém-se a estirpe de Ξ. coli DH5 em gelose LB (Sambrook e colabora dores, Molecular Cloning. A laboratory Manual, 2§ ed. Cold

Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, NY , 1989). Ao efecturar-se a selecção dos transformantes adiciona-se a ampicilina ou a apramicina em concentrações respectivamente. Mantem-se a estirpe de

Ξ. coli JM105 em

colaboradores, Molecular Cloning.

A Laboratory Manual

Cold Spring Harbor Press, Cold Spring

Harbor, NY,

1989) e procede-se a trans ferência de. uma colónia para

LB permitindo-se o seu desenvolvimento durante a noite à temperatura de 37°C para se obter as bactérias utilizadas na preparação do ADN de cordão

simples. Utiliza-se gelose H (Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning. A. Laboratory

Manual,

2ã ed.

Cold. Spring de placas de estirpe de E. coli DH5 transformadas com a for ma replicativa do ADN de M13 [ (Yansch-Perron e colaboradores.

Gene 33:103 (1985)]·

Mantém-se a estirpe S. lividans sobre gelose R2YE (Hopwood e colaboradores,

Genetic Manipulation of Streptomyces . A Laboratory Manual,

John Innes

Foundation ,

Norwich, UK, 1985) para a preparação de esporos e também para

a regeneração de protoplastos.

Subclonagem de fragmentos de ADN: As amostras de ADN são digeridas com enzimas de restrição adequadas e separadas sobre geles de agarose através de métodos normalizados (Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning.

2§ ed .

Cold Spring Harbor Press,

Cold Spring Harbor, NY,

1989). A partir do gel procedeu-se à excisão de lamelas de aga rose que contem os fragmentos de ADN com interesse e isola-se o ADN a partir dessas lamelas utilizando o dispositivo GENE

CLEAN (Bio 101, La Jolla, CA).

Os fragmentos de ADN isolados são subclonados segundo técnicas normalizadas (Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2½ ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) em E. coli e em vectores de tipo vai-vem (Shuttle) de E. coli/Streptomyces para experiências de biotransformação e de expressão, respectivamente, e vectores de M13 [(Yansch-Perron e colaboradores, Gene 33:103 (1985) para a sequen ciação.

tuar a

Sequenciação do ADN:

Depois de se ef ec subclonagem dos fragmentos de ADN com interesse num vector M13, procede-se à preparação de ADN de cordão simples utilizando técnicas normalizadas (Sambrook e colabora dores ,

Molecular Cloning

A Laboratory Manual, ed. Cold

Spring Harbor Press, Cold

Spring

Harbor, NY, 1989) e utiliza-se na sequenciação. Os dados da sequência do ADN são o_b tidos utilizando-se para o efeito o estojo de sequenciação com a versão 2,0 de Sequenase (US Biochemicals, Cleveland,

-se em conformidade com as sugestões do fabricante. Utiliza desaza dGTP em vez de dGTP para evitar compressões.

Inicialmente , utiliza-se um precursor universal do vector ΜΊ3 para se obter a sequência das primeiras 200 - 250 bases e de pois partir destes dados sequenciais, efectua-se a síntese de um oligonucleotido de 17 unidades fundamentais (17 mero) utilizando-se para o efeito um sintetizador de ADN

Applied Biosystems 391 em conformidade com as instruções do fabricante e utiliza-se um precursor para continuar a sequenciação do ADN até se obter a sequência de ADN completa.

Transformação de espécies de Streptomyces e E. coli: procede-se à preparação de células competentes de E. coli pelo método do cloreto de cálcio (Sambrook e co laboradores, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2§ ed.

Cold Spring Harbor press,Cold Spring Harbor, NY, 1989) e efectua-se a sua transformação segundo técnicas normaliza das (Sambrook e colaboradores,

Molecular Cloning. A Labora tory Manual,

Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Ha£

bor, NY, crescer em meio

Deixa-se o micélio de

S. liviaans TK24

ΥΞΜΞ (Hopwood e colaboradores pulation of Streptomyces. A Laboratory Manual

Genetic Mani

John Innes

Foundation, Norwich, UK, 1985) e proceue-se à sua colheita decorridas 48 horas. Lava-se o agregado de micélios duas vezes com uma solução de sacarose de 10,3 % e utiliza-se para a preparação de protoplastos em conformidade com o método evidenciado no manual de Hopwood (Hopwood e colaboradores, Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John

Innes Foundation, Norwich, UK, 1985). Com essa massa de pro toplastos prepara-se uma suspensão em cerca de 300 microli-

tros de tampão P (Hopwood e colaboradores,	Genetic Manipula-
tion of Streptomyces. A Laboratory Manual,	John Innes Founda

tion, Norwich, UK, 1985) e utiliza-se para cada transformação uma alíquota de 50 microlitros dessa suspensão. Os proto plastos são transformados com o ADN plasmíaico em conformidade com um método de transformação em pequena escala de Ho£ wood e colaboradores (Hopwood e colaboradores, Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Founda-17 tion, Norwich, UK, 1985 ). Decorridas 17 horas de regeneração em meio R2YE à temperatura de 30°C prepara-se sobre as placas uma camada com tiostreptona na concentração de 50 ^ug/rnl e deixa-se prosseguir o crescimento à temperatura de 30°C ate à esporulação.

Bioconversão da carminomicina em daunorrubicina : Os transformantes de S. lividans·-· que alojam diferentes plasmídos são inoculados no interior do meio R2YE lí quido (Hopwwod e colaboradores, Genetic Manipulation of

Streptomyces. A Laboratory Manual, John innes Foundation,

Norwich ^ug/ml de 30°C para 25 concentração de

Decorridos 2 dias de crescimento transferiu-se uma quantidade de 2 ml de

J. Microbiol.

concentração a temperatura desta cultura meio de Strohl [(Dekleva e colaboradores,Can

31:287 (1985)1 contendo tiostreptona na das culturas ocorreu em balões de Erlen-/:

meyer com deflector em agitadora centrífuga a em agitadora centrífuga a 300 rpm à temperatura de 30°C durante 72 horas após o que se adicionou carminomicina (sob a forma de uma solução aquosa na concentração de 10 mg/ml) às culturas para proporcionar uma concentração final de 5 yUg /ml. Decorridas mais 24 horas de' incubação na agitadora procedeu-se à incu bação das culturas em banho-maria à temperatura de 60°C durante 45 minutos após a adição de ácido oxálico na concentração de 150 mg/ml para hidrolisar as formas glicosídicas dos metabolitos da antraciclina. Efectua-se a extracção

uos metabolitos a partir das culturas utilizando 15 ml de clorofórmio depois de se ajustar o pH das culturas para um valor compreendido entre 8,4 - 8,6. Efectua-se a filtração da solução de clorofórmio através de um filtro Acrodisc CR de 0,45 pm (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) e submete-se 100 pl deste filtrado a uma análise por cromatografia era líquido-líquido de elevada pressão (CLEP) numa coluna ^flWaters Nova-Pak C^g (8 mm x 10 cm) com uma fase móvel constituída por metanol/água (85:15) ajustada para o valor de pH 2,5 com ácido fosfórico, sendo o débito de 3 ml/minuto. A saída da coluna foi verificada utilizando um sistema de fornecimento de dissolvente Waters 6000, um detector

441 UV funcionando a 254 nm e um módulo de dados 740.Uti lizou-se carminomicina e daunorrubicina (10 yug/ml em metanol ) com padrões externos para quantificar a quantidade des ses metabolitos a partir das culturas.

Exemplo 1

Clonagem do gene dnrK que codifica a 4-0-metiltransferase da carminomicina

Procedeu-se à transformação de diversos dos clones cósmicos descritos por Stutzman-Engwall e Hut. chinson [(Proc. Natl. Acad: Sei. USA 86:31 35 ( 1989 )], reprq sentando aproximadamente 96 Kg de ADN genómico de S. peuce tius 29050 em S. lividans TK24 e efectuou-se a análise dos

transformantes para determinação da bioconversão da carminomicina em daunorrubicina em conformidade com o método des. crito na secção relativa a materiais e métodos. 0 clone cós. mido pWHM339 [Otten e colaboradores, J. Bacteriol. 172 : : 3^27 (1990)] efectua a bioconversão em daunorrubicina de 22 * da carminomicina adicionada. Um fragmento de 11,2 Kg de EcoRl proveniente da inserção em pWHM339 e subclonado no interior do vector cósmido pKC505 [Richardson e colaboradores, Gene 61:231 (1987)] Dara oroporcionar o Dlasmido pWHM534. 0 S. lividans TK24 transformado com PWHM534 exibe entre 25 e 60 %.ãe bioconversão em daunorrubicina da carminomicina adicionada. Um fragmento de 5,8 Kb de Sphl proveniente de DWHM534 é subclonado no local Sphl do plasmido pWHM3 de elevado número de cópias para proporcionar o plasmido pWHM901. O S. lividans transformado com pWHM901 exibe uma bioconversão de 50 a 85 * de carminomicina em dau norrubicina. Um fragmento de 1,6 kg de Sphl/PvuII é clonado a partir de pWHM901 primeiro no interior dos locais Sphl/ /Smal do pUC19 (Yansch - Perron e colaboradores, Gene 33'· (1985))] e depois o fragmento de ADN de 1,6 Kb é subclonado a partir do ultimo plasmido sob a forma de um fragmento HindIII/EcoRl no interior dos locais HindlII/EcoRl do pWHM3 para proporcionar o plasmido pWHM902 (Fig. 2). 0 S. lividans transformado com o pWHM902 efectua a bioconversão em daunorrubicina de 100 % da carminomicina adicio nada a cultura.

Sequência de ADN da região que contém o gene dnrK

Efectua-se a sequenciação de um fragmento de ADN de 2,5 kb do fragmento Sphl de 5,8 kb em pWHM901 através da sua subclonagem dos fragmentos de 0,4 Kb de Sphl/ /Xhol, de 0,7 Kb de Xhol/SstI, de 0,6 kb de SstI/SalI e de Sall/Xhol provenientes de pWHM902 no interior dos vectores M13mpl8 e -mp19 [Yansch-Perron e colaboradores, Gene 33 : : 103 (1985)] para se obter as duas orientações de cada seg mento de ADN. A sequenciação do ADN dos quatro clones resul

tantes efectua-se conforme descrito na secção correspondente a materiais e métodos. A sequência do ADN resultante delurn fragmento de ADN de 1,6 kb contendo o gene dnrK e a sequência de aminoácidos da proteína COMT deduzida por análise desta sequência de ADN com o programa CODON PREFERENCE descrito por DEVEREUX e colaboradores [Nicl. Acids. Res.12 : : 387 (1984], encontram-se representadas na Fig. 3- 0 gene dnrK de estrutura de leitura aberta identificado por análise efectuada com os programas CODON PREFERENCE e TRANSLATE [Devereux e colaboradores, Nucl. Acids Res. 12:387 · (1984)] codifica a proteína COMT.

Exemplo 2

Construção de um vector para a expressão do gene dnrK em

E. coli.

Submete-se um fragmento de ADN de Sphl/

ZvuII de aproximadamente de 1,6 kb contendo toda a estrutura de leitura aberta dos genes dnrk em conjunto com algumas sequências de flanqueamento (Fig. 3) a. subclonagem no interior do pUC19 digerido com SpHI e Smal [Iansch-Perron e colaboradores, Gene 33 · 103 (1985)] para proporcionar o plasmido pWHMÇOM (não representado). Os dois precur sores oligodesoxinucleotídicos, correspondentes às sequências em qualquer dos lados do fragmento que contêm o gene dnrK que se pretende amplificar são sintetizados utilizando um sintetizador de ADN Applied Biosystems 391 de acordo com as._instruções do fabricante:

Xbal BamHI rbs

Ndel

5’ - GGG TCTAGA GGATCC AGGAG CAG CATATG ACC GCT GAA CCG

ACC GTC GCG GCC CGG CCG CAG CAG AT - 3 ' : Précurscr # 1 Sphl PstI

3' - AC CGC TAG CCT GAC GAG CTC CTC CGTACG GACGTC CCC - 5’:

Precursor #2

A terceira posição do segundo, terceiro e sexto codãos (indicada pelas letras a negrito) do gene dnrK é modificada utilizando-se o precursor #1 apra reflectir o codão mais frequentemente utilizado em genes de elevada expressão em E. coli como meio para aumentar a expressão do gene dnrK em E. coli.

ATG ACC GCT GAA CCG ACC GTC GCG GCC CGG CCG CAG CAGA: Sequên cia mutada

-22ATG ACA GCC GAA CCG ACG GTC GCG GCC CGG CCG CAG CAGA: : Sequência ue tipo primitivo

Estes dois precursores são utilizados para amplificar a sequência do dnrK do pWHM904 desde o nucleotido 205 (o inicio da estrutura de leitura aberta dnrK) até ao nucleotido 445 da Fig. 3 em conformidade com métodos normalizados para a reacção em cadeia da polimerase com o ADN· de Streptomyces [veja-se por exemplo Guilfolle e Hutchínson, J. Bacteriol. 174 : 3659 ( 1992)]. A partir do produto ampl.i ficado procede-se à excisão de um fragmento de 88 pb de ndel/Ncol e liga-se a um fragmento de 1,3 kb de NcoI/EcoRI (obtido a partir de pWHM902) , contendo o gene dnrK restante (Figuras 2 e 3) e o pT7-7 digerido com ndel/EcoRI [Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:1074 (1985)], o que tem como consequência a fusão da estrutura de leitura aberta' dnrK do promotor 10 do gene T7 deste vector de expres. são em E. coli. As células competentes de E. coli DH5©< são transformadas com o ADN ligado e os transformantes são sub metidos a rastreio para a detecção de pT7-7 com dnrK. Ό plasmido resultante é designado por pWHM9O3 (Fig. 4).

Expressão do gene dnrK em E. coli

As células competentes de E. coli que contém o plasmido pGP.1-2 [Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:1074 (1985)] são seleccionadas sobre ge-

lose LB . (Sambrook et al., Molecular Cloning. A laboratory Manual, 2§ ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989) contendo ampicilina (Ί00 jig/ml) e canamicina (50 pg/ml) após crescimento à temperatura de 30°C. 0 procedimento para a preparação de células competentes de E. coli contendo pGP1-2 é idêntico ao utilizado para qualquer outra estirpe de E. coli com a excepção de as culturas serem mantidas à temperatura de 30°C em vez de 37°C. As célu las competentes de E. coli contendo pGPÍ-2 são preparadas a partir de células desenvolvidas à temperatura de 30°C até um valor de densidade ÓDtica D0___n compreendido entre bbu

0,5 e 0,6 em meio LB contendo canamicina. È muito importante manter as estirpes que contêm pGP1-2 à temperatura de 30°C durante a manutenção de,rotina e durante o crescimento de pré-indução para se evitar a expressão excessiva da T7 ARN-polimerase o que a não ser assim poderia eventualmente originar um plasmido mutado.

Inocula-se um único transformante que obrigue simultaneamente os pGP1-1 e pWHM9O3 em 25 ml de meio de 2 x YT (Sambrook et al.,

Molecular

Cloning

A laboratory Manual

2â ed

Cold Spring Harbor

Press

Cold Spring

Harbor, NY

1989) contendo ampicilina na concentração de

100 pg/ml e contendo canamicina na concentração de 50 /tg/ /ml e deixa-se enícultura durante a noite à temperatura de 30°C com agitação vigorosa. Na manhã seguinte as culturas são submetidas a um choque térmico à temperatura de 42°C durante 30 minutos em banho-maria agitado e depois são nova

mente recolocadas à temperatura de 30°C. Decorridos mais' minutos de incubação submete-se a centrifugação 1 ml

da cultura a 14 000 rpm numa microcentrifugadora durante 1 minuto, elimina-se o sobrenadante e com a massa celular prepara-se uma nova suspensão em 100 ^il de solução tampão Laemmli, Nature (London), 227 : 680 (1970)] e depois ferve-se durante 5 minutos. Procede-se à análise das proteínas contidas na amostra fervida, sobre um gel de poliacril_ amida contendo 10 ? de SDS utilizando-se métodos normalizados [Laemmli, Nature (London), 227 : 680 (1970)] por comparação com as proteínas obtidas a partir do extracto celular de E. coli transformadas com o vector pT7-7 que não contém qualquer gene dnrK. A proteína COMT migra,para o valor M.H 38 700.

Exemplo 3

Conversão da carminomicina em daunorrubicina por uma célula que contenha a proteína COMT

Inoculou-se um único transformante de E.

Coli que obriga simultaneamente os pGP1-2e pWHM9O3 em ml de meio 2 x YT contendo ampicilina na concentração de 100 yag/ml e contendo canamicina na concentração de 50 yjg/ /ml e permitiu-se o seu crescimento durante a noite à temperatura de 30°c com agitação vigorosa. Na manhã seguinte as culturas foram submetidas a um choque térmico à temperatura de 42°C durante 30 minutos em banho-maria agitado e depois foram recolocadas novamente à temperatura de 30°C depois de se lhes adicionar carminomicina na concentração de 5 yjg/ml. Permitiu-se o desenvolvimento das culturas durante mais 90 minutos após o que se procedeu ao isolamento dos metabolitos de antraciclina utilizando-se para o

efeito métodos normalizados e CLEP. A comparação das áreas para a carminomicina e ma da CLEP indica que 75 a 80 cionou ao meio de cultura foi procedeu-se à sua análise por relativas dos picos do sinal cromatogra que se adi.

daunorrubicina.

para a daunorrubiqina no * da carminomicina convertida em

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1.- Sequência isolada de ADN, caracterizada por compreen der um gene que codifica a carminomicina-4-0-metil-transfera2.- Sequência de ADN de acordo com a reivindicação

   1, caracterizada por incorporar a totalidade ou uma parte do

   ADN da figura 3

   FIG. 3: sequência nucleotídica do gene da carminomicina-4-0-metil-transferase (dnrk). Os sítios prováveis de começo e de interrupção translacionais do gene dnrk estão sublinhados nos nucleótidos 205 e 1273, respectivamente A sequencia de aminoácidos deduzida a partir da traduçao da estrutura de leitura aberta do dnrk está representada a seguir à sequência de ADN.