FI111012B - Karminomysiini-4-O-metyylitransferaasia koodaava DNA-sekvenssi - Google Patents

Description

5 111012

Karminomysiini-4-O-metyylitransferaasia koodaava DNA-sek-venssi - DNA-sekvens som kodar för carminomycin-4-O-me-tyltransferas Tämä keksintö koskee tapaa syövän hoitamisessa käyttökelpoisten antrasykliinien tuottamiseksi modifioimalla dau-norubisiinin biosynteesiä niin, että daunorubisiinin tuotanto karminomysiinistä paranee muilla streptomykeeteillä 10 kuin Streptomvces peucetius 29050:llä, ja bakteerisolu- uutteissa tai niistä saaduilla puhdistetuilla entsyymeillä.

Daunorubisiiniryhmään kuuluvat antrasykliinit, kuten esi-15 merkiksi doksorubisiini, karminomysiini ja aklasinomysii-ni, ovat laajimmin käytettyjä aineita syövänvastäisessä hoidossa [F. Arcamone, Doxorubicin, Academic Press, New York, 1981, ss. 12-25; A. Grein, Process Biochem. 16:34 (1981); T. Kaneko, Chimicaoggi, toukokuu:ll (1988)]. Dau-20 norubisiinista ja doksorubisiinista on valmistettu parannettuja johdannaisia kemiallisen synteesin avulla niiden tuumoria vastustavan aktiivisuuden tehostamiseksi, erityisesti oraalisen antoreitin kautta, ja syövän hoidossa näiden lääkeaineiden käyttöön liittyvän akuutin toksisuu-25 den ja kroonisen sydäntoksisuuden torjumiseksi [Penco, Process Biochem. 15.:12 (1980); T. Kaneko, Chimicaoggi, toukokuu:11 (1988)]. 4’-epidoksorubisiini (Epirubicin® ja 4-demetoksidaunorubisiini (Idarubicin®) ovat esimerkkejä sellaisista analogeista.

30 Näitä luonnollisina esiintyviä yhdisteitä tuotetaan useiden eri Streptomvces-kantoien avulla (S. peucetius. S. coeruleorubidus, S. qalilaeus. S. qriseus. S. qriseoru-ber. S. insignis, S. viridochromoqenes. S. bifurcus ja 35 Streptomvces-lalin kanta C5) ja Actinomyces carminatan avulla. Doksorubisiinia tuotetaan vain S. peucetiuksen alalajin caesiuksen avulla mutta daunorubisiinia tuote- » 2 111012 taan S. peucetiuksen sekä muiden edellä kuvailtujen Streptomyces-laiien avulla. Mallikantoja S. peucetius -alalajia caesius IMRU 3920 (tämä kanta on sama kuin ATCC 27952 ja lyhennetään tämän jälkeen "S. peucetius 3920"), 5 S. peucetiusta ATCC 29050 ("S. peucetius 29050") ja S. peucetius -alalajia caesius ATCC 27952 ("S. peucetius 27952") on julkisesti saatavissa ja niitä kuvaillaan US-A 3 590 028:ssa. S. peucetius 29050 ja 27952 on talletettu the American Type Culture Collectioniin, Rockville, MD, 10 USA, talletusnumeroilla ATCC 29050 ja 27952.

Doksorubisiini (2) -antrasykliiniä valmistetaan S. peucetiuksen avulla malonihaposta, propionihaposta ja glukoosista oheen liitettyjen piirrosten kuviossa 1 esitetyn 15 reitin mukaisesti. 6-rodomysinoni (4), karminomysiini (3) ja daunorubisiini (1) ovat tässä prosessissa tunnettuja välituotteita [Grein, Advan. Appi. Microbiol. 32:203 (1987) , Eckardt ja Wagner, J. Basic Microbiol. 28:137 (1988) ]. Tämän reaktioreitin kaksi vaihetta käsittävät 20 erillisten välituotteiden O-metylaation: aklanonihapon muuntuminen metyyliaklanonaatiksi ja karminomysiinin (3) muuntuminen daunorubisiiniksi (1). S. peucetius 29050:n, S. insianis ATCC 31913:n, S. coeruleorubidus ATCC 31276:n ja Streptomvces-lalin C5 soluvapaiden uutteiden on osoi-25 tettu katalysoivan jälkimmäistä vaihetta S-adenosyyli-L-: metioniinin läsnäollessa [Connors et ai., J. Gen. Micro biol. 136:1895 (1990)], mikä osoittaa sen, että kaikki nämä kannat sisältävät spesifisen karminomysiini-4-0-me-tyylitransferaasin (COMT-proteiini).

30

Geenit daunorubisiinin biosynteesiin ja daunorubisiini-resistenssille on saatu S. peucetius 29050:n ja S. peucetius 27952:n kloonauskokeiden yhteydessä [Stutzman-Eng-wall ja Hutchinson, Proc. Natl. Acad. Sei USA 86:3135 35 (1988); Otten et ai., J. Bacteriol. 172:3427 (1990)].

Nämä kokeet ovat osoittaneet, että Streptomyces lividans 1326:een siirrettäessä nämä kloonatut geenit mahdollista- 3 111012 vat tälle isännälle ε-rodomysinonin tuottamisen ja resistenssin daunorubisiinille ja doksorubisiinille. Myöhemmässä tutkimuksessa tutkittiin sitä, voisivatko nämä kloonit mahdollistaa karminomysiinin muuntamisen daunoru-5 bisiiniksi S. lividansiin siirrettäessä. Tämän jälkeen on eristetty 1,6 kiloemästä (ke) sisältävä DNA-pala, joka sisältää karminomysiini-4-O-metyylitransferaasigeenin, joka tämän jälkeen on lyhennettynä "dnrK".

10 Tämä keksintö koskee karminomysiini-4-0- metyylitransferaasia koodaavaa eristettyä DNA-sekvenssiä, joka koodaa sekvenssiluettelon sekvenssissä nro 2 esitetyn aminohapposekvenssin tai osan siitä, joka osa on säilyttänyt karminomys iini-4-O-metyyli t rans f e-15 raasiaktiivisuutensa. Keksinnön mukaista DNA:ta nimitetään mukavuussyistä "DNA-insertiksi". Keksintö koskee myös: (1) yhdistelmävektoreita, jotka kykenevät transformoimaan ·· 20 isäntäsolun, ja jotka sisältävät DNA-insertin tai siitä saadun restriktiofragmentin, joka sisältää dnrK-geenin; (2) yhdistelmävektoreita, jotka kykenevät lisäämään dnrK-geenin kopiolukua ja sen tuotteen määrää Streptomyces- 25 lajin kannassa, joka tuottaa daunorubisiinia; (3) yhdistelmävektoreita, jotka kykenevät ilmentämään dnrK-geenin Escherichia colissa niin, että on mahdollista tuottaa puhdistettua karminomysiini-4-0-metyylitransfe- 30 raasientsyymiä.

• * (4) karminomysiini-4-0-metyylitransferaasin mikrobiläh-dettä karminomysiinin muuntamiseksi biologisesti puhtaaksi daunorubisiiniksi.

35

Lyhyt selitys piirustuksista 4 111012

Kuvio 1 esittää tiivistettynä doksorubisiinin biosyn-teesireitin.

5 Kuviossa 2 on restriktiokartta-analyysi yhdistelmä- plasmidi pWHM902:sta, joka konstruoitiin liittämällä 1,6 ke SphI/PvuII-DNA -fragmentti, joka sisälsi karminomysii-ni-4-O-metyylitransferaasigeenin (dnrK), joka saatiin yhdistelmäplasmidi pWHM901:stä pilkkomalla Sphl:llä ja 10 PvuII;11a, pWHM3-plasmidin SphI/Smal-kohtiin, joka on

Escherichia coli - Streptomyces -sukkulavektori [Vara et ai., J. Bacteriol. 171:5872 (1989)]. Kuviossa 2 esitetty kartta ei välttämättä esitä tyhjentävää luetteloa kaikista DNA-osasessa läsnäolevista restriktiokohdista. Esite-15 tyt kohdat ovat kuitenkin riittävät palasten tunnistamiseksi yksiselitteisesti.

Kuvio 3 kuvaa kaaviomaisesti dnrK-DNA -palan nukleoti-disekvenssiä, joka vastaa karminomysiini-4-O-metyyli-20 transferaasia koodittavaa nukleotidisekvenssiä. Tämä sek venssi kattaa alueen pWHM902:n Sphl- ja PvuII -restrik-tiokohtien välissä ja esittää kooditusjuosteen 5' ->3' -suuntaan. Karminomysiini-4-0-metyylitransferaasia koodattavasta luetusta avoimesta lukukehyksestä johdettu amino-25 happosekvenssi esitetään dnrK-geenin nukleotidisekvenssin alapuolella (Sekvenssi n:o 1, Sekvenssi n:o 2).

Kuvio 4 esittää restriktiokartta-analyysiä yhdistelmäplasmidi pWHM903:sta, joka konstruoitiin liittämällä « 30 1,4 ke Ndel/EcoRI-DNA -fragmentti, joka saatiin pWHM901:n ·· 5,8 ke Sphl-DNA-fragmentista paikkakohdennetun mutatoin- nin avulla, E. coli -ekspressiovektori pT7-7:n Ndel- ja EcoRI -kohtiin [Tabor ja Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82_:1074 (1985)]. Kuviossa 4 esitetty kartta ei 35 välttämättä esitä tyhjentävää luetteloa kaikista DNA-osasessa läsnäolevista restriktiokohdista. Esitetyt kohdat 5 111012 ovat kuitenkin riittävät palasten tunnistamiseksi yksiselitteisesti .

Keksinnön mukaiset DNA-insertit ja restriktiofragmentit 5 sisältävät geenin (dnrK). joka koodittaa karminomysiini- 4-O-metyylitransferaasia. Sellaisen geenin ilmentämiseksi DNA voi sisältää oman transkriptionaalisen säätelysek-venssin ja erityisesti oman promoottorin, joka on toimivasti kytketty geeniin, ja jonka isäntäsolun RNA-polyme-10 raasi tunnistaa. DNA-insertti tai restriktiofragmentti voidaan vaihtoehtoisesti liittää toiseen transkriptionaa-liseen säätelysekvenssiin oikealla tavalla tai kloonata vektoriin restriktiokohdassa, joka sijaitsee sopivasti transkriptionaalisen säätelysekvenssin vieressä vektoris-15 sa.

Karminomysiini-4-O-metyylitransferaasin sisältävä DNA-insertti tai restriktiofragmentti voidaan kloonata yhdis-telmä-DNA-kloonausvektoriin. Mitä tahansa itsenäisesti 20 replikoituvaa ja/tai integroituvaa agenssia voidaan käyt tää, joka sisältää DNA-molekyylin, johon voidaan lisäksi liittää yksi tai useampi DNA-palanen. Vektori on kuitenkin tyypillisesti plasmidi. Edullinen plasmidi on ko-pioluvultaan suuri plasmidi pWHM3 tai pIJ702 [Katz et 25 ai., J. Gen. Microbiol. 129:2703 (1983)]. Muita sopivia plasmideja ovat pIJ385 [Mayeri et ai., J. Bacteriol. 172:6061 (1990)], pIJ680 (Hopwood et ai., Genetic Manipulation of Streptomvces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985), pWHM601 [Guilfoile ja 30 Hutchinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8553 (1991)] tai pPM927 [Smokina et al., Gene 94:52 (1990)]. Mitä tahansa sopivaa menetelmää voidaan käyttää DNA-insertin tai sen restriktiofragmentin liittämiseksi vektoriin. Liitos voidaan saada aikaan liittämällä DNA lineaariseksi teh-35 tyyn vektoriin sopivassa restriktiokohdassa. Tätä liittämistä varten voidaan käyttää tarttuvien tai tasaisten • 6 111012 päiden suoraa yhdistämistä, homopolymeeripäihin lisäämistä tai kytkijä- tai adapterimolekyyliä.

Yhdistelmävektoria käytetään sopivan isäntäsolun trans-5 formointiin. Isäntäsolut voivat olla karminomysiinille tai daunorubisiinille herkkiä, se on, eivät kykene kasvamaan, kun läsnä on tietty määrä karminomysiiniä tai dau-norubisiinia, tai ne voivat olla karminominomysiini- tai daunorubisiiniresistenttejä. Isäntä voi olla mikro-or-10 ganismi. S. peucetius -kantoja, erityisesti S. peucetius 29050:tä, ja muita Streptomvces-laiien kantoja, jotka tuottavat tai eivät tuota antrasykliinejä, voidaan sen vuoksi transformoida. Streptomvces-kantojen transformant-teja saadaan tavallisesti protoplastitransformoinnin yh-15 teydessä. dnrK-geeni voidaan liittää myös muihin vekto-reihin ja ilmentää ei-streptomykeeteissä kuten E. colis-sa. Transformoidun isännän avulla saatua COMT-proteiinia voidaan käyttää karminomysiinin muuntamiseksi biologisesti daunorubisiiniksi. Tämän menetelmän avulla olisi mah-20 dollista valmistaa hyvin puhdasta daunorubisiinia lähtien solu-uutteesta, joka on tuotettu fermentaatioprosessin avulla, ja joka sisältää ei-toivottua karminomysiinivä-lituotetta daunorubisiinin lisäksi.

25 Biokonversioprosessi voidaan toteuttaa käyttämällä joko suoraan vapaita tai immobilisoituja transformoituja soluja tai eristämällä COMT-proteiini, jota voidaan käyttää vapaassa muodossa, immobilisoituna tunnetuilla menetelmillä hartseihin, lasiin, selluloosaan tai vastaaviin 30 aineisiin ionisidosten tai kovalenttisten sidosten välityksellä, tai ympättynä kuituihin, jotka läpäisevät substraatin, tai silloituksella liukenemattomaksi tehtynä. COMT-proteiinia voidaan käyttää myös raa’assa solu-uutteessa.

35 Tämän keksinnön mukaista yhdistelmävektoria voidaan käyttää myös sopivan isäntäsolun transformointiin, joka tuot- * 7 111012 taa daunorubisiinia, karminomysiinin biokonversion lisäämiseksi ja mainitun ei-halutun välituotteen läsnäolon minimoimiseksi lopullisessa solu-uutteessa. Isäntäsolut * voivat olla karminomysiini-, daunorubisiini- tai doksoru- 5 bisiiniresistenttejä, t.s. ne voivat kasvaa jossakin karminomysiini-, daunorubisiini- tai doksorubisiinimäärässä.

S. peucetius -kantoja, erityisesti S. peucetius 29050:tä, ja muita antrasykliinejä tuottavia Streptomvces-suvun kantoja voidaan sen vuoksi transformoida. Streptomvces-10 kantojen transformantteja saadaan tavallisesti protoplas-tien transformoinnin avulla. Daunorubisiinia voidaan saada viljelemällä transformoitua S. peucetius -kantaa tai muuta Streptomvces-laiia. joka ei sisällä dnrK-geeniä, ja ottamalla siten tuotettu daunorubisiini tai sen kaltaiset 15 antrasykliinit talteen.

Insertti-DNA:ta saadaan S. peucetius 29050:n genomisesta DNArsta. Kanta on talletettu the American Type Culture Collectioniin, Rockville, MD, USA, talletusnumerolla ATCC 20 29050. S. peucetius 29050:stä saatua kantaa, kuten S.

peucetius 27952:ta, voidaan myös käyttää, joka myös tyypillisesti kykenee muuntamaan karminomysiinin daunorubi-siiniksi. Insertti-DNA:ta voidaan sen vuoksi saada: 25 (a) valmistamalla kirjasto S. peucetius 29050:n tai siitä saadun kannan genomisesta DNA:sta; (b) seulomalla kirjastosta kloonit, jotka kykenevät muuntamaan karminomysiinin daunorubisiiniksi; 30 (c) eristämällä insertti-DNA yhdistelmävektorista, joka muodostaa osan kirjastosta, ja joka on kykenee muuntamaan karminomysiinin daunorubisiiniksi; ja 35 (d) valinnaisesti eristämällä insertti-DNA:sta restrik- tiofragmentti, joka sisältää karminomysiini-4-0-metyyli-transferaasia koodattavan geenin.

8 111012

Kirjasto voidaan valmistaa (a)-vaiheessa pilkkomalla osittain S. peucetius 29050:n tai siitä saadun kannan genominen DNA. Edullisesti käytetään restriktioentsyymi Mbol:tä. Siten saadut DNA-fragmentit voidaan fraktioida 5 koon perusteella; kooltaan 3-5 ke fragmentit ovat edullisia. Nämä fragmentit liitetään lineaariseksi tehtyyn vektoriin kuten pWHM3:een tai pIJ702:een. Isäntäsolut transformoidaan ligaatioseoksen kanssa. Isäntäsolut eivät tavallisesti kykene tuottamaan karminomysiiniä tai daunoru-10 bisiinia ja ne voivat olla karminomysiini- tai daunoru-bisiiniherkkiä, esimerkiksi herkkiä, kun ml sisältää 10 mikrogrammaa tai vähemmän karminomysiiniä tai daunoru-bisiinia. Esimerkiksi S. lividans JI1623:n protoplasteja voidaan transformoida (Hopwood et ai., Genetic Manipula-15 tion of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985).

Vaihe (b):ssä siten saadut transformantit seulotaan sen suhteen, kykenevätkö ne ottamaan vastaan karminomysiiniä, 20 muuntamaan se daunorubisiiniksi ja erittämään daunoru-bisiinia. Kloonit, jotka kykenevät muuntamaan karminomysiiniä daunorubisiiniksi, identifioidaan analysoimalla daunorubisiini kromatografisesti karminomysiiniä sisältävän kasvualustan uutteista. Sellaiset kloonit 25 eristetään ja niiden sisältämät yhdistelmävektorit uutetaan. Pilkottaessa yhdistelmävektoreita sopivilla rest-riktioentsyymeillä vaiheessa (c), S. peucetius 29050:n kuhunkin vektoriin liitetty DNA voidaan identifioida, määrittää kooltaan ja kartoittaa. Tällä tavalla voidaan 30 tarkistaa, että vektori sisältää keksinnön mukaisen DNA-insertin.

Lisäksi voidaan eristää kaksi tai useampia toisiaan peittäviä inserttejä, jotka sisältyvät kokonaan tai osittain 35 keksinnön mukaiseen DNA:hän. Nämä voidaan liittää yhteen katkaisemalla yhteisessä restriktiokohdassa ja ligoimalla sen jälkeen, jotta saadaan keksinnön mukaista DNA:ta, 9 111012 pituusleikattuna käyttäen tarvittaessa sopivia restrik-tioentsyymejä. COMT-proteiinia koodittavan geenin sisältävän DNÄ-insertin restriktiofragmentteja voidaan saada vaihe (d):ssä myös leikkaamalla insertti-DNA sopivalla 5 restriktioentsyymillä.

Keksinnön mukainen DNA voidaan mutatoida tavalla, joka ei vaikuta sen kykyyn mahdollistaa karminomysiinin muuntaminen daunorubisiiniksi. Tämä voidaan saada aikaan esimer-10 kiksi paikkakohdennetun mutatoinnin avulla. Sellainen mutatoitu DNA muodostaa osan keksinnöstä.

Keksinnön mukainen DNA voidaan myös liittää vektoreihin, jotka ovat sopivia dnrK-geenin ilmentämiseen ei-strepto-15 mykeetti-isännässä kuten E. colissa.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä.

Materiaalit ja menetelmät 20

Bakteerikannat 1a plasmidit: E. coli -kantaa DH5a, joka on herkkä ampisilliinille ja apramysiinille, käytetään DNA-fragmenttien subkloonauk-seen ja E. coli K3S:ää/Russel & Modez, J. Bacteriol. 159-25 :1034 (1984)/ käytetään S. peucetiuksen dnrK-geenin il- ’ mentämiseen. E. coli -kantaa JM105 käytetään yksijuostei- sen DNA:n valmistamiseen dnrK-geenin sekvensointia varten.

30 Alustat la puskurit:

E. coli DH5a -kantaa säilytetään LB-agarilla (Sambrook et ai., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. painos. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Valikoitaessa transformantteja, ampisilliiniä ja apra-35 mysiiniä lisätään pitoisuuksissa 50 pg/ml ja vastaavasti 100 pg/ml. E. coli JM105 -kantaa säilytetään M9-minimaa-liagaralustalla (Sambrook et ai., Molecular Cloning. A

w · 10 111012

Laboratory Manual, 2. painos. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) ja pesäke siirrostetaan LB-alustaan ja kasvatetaan yli yön 37°C:ssa, jotta saadaan bakteereja, joita käytetään yksijuosteisen DNA:n valmis-5 tukseen. H-agaria (Sambrook et ai., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. painos. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) käytetään E. coli DH5a:n maljaviljelyyn, joka kanta on transformoitu M13 DNA:n replikoituvalla muodolla [(Yanisch-Perron et ai., Gene 10 33*· 103 (1985)]. S. lividansia säilytetään R2YE-agarilla (Hopwood et ai., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985) itiöiden valmistusta varten samoin kuin protoplas-tien regenerointia varten.

15 DNA-fraqmenttien subkloonaus DNA-näytteet pilkotaan sopivilla restriktioentsyymeillä ja erotetaan agaroosigeeleillä tavanomaisilla menetelmillä (Sambrook et ai., Molecular Cloning. A Laboratory Ma-20 nual, 2. painos. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring

Harbor, NY, 1989). Kiinnostavia DNA-fragmentteja sisältävät agaroosipalaset leikataan irti geelistä ja DNA eristetään näistä paloista käyttäen GENECLEAN-laitetta (BiolOl, LaJolla, CA). Eristetyt DNA-fragmentit subkloo-25 nataan käyttäen tavanomaisia menetelmiä (Sambrook et ai., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. painos. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) E. coli - ja E. coli/Streptomyces -sukkulavektoreihin bio-transformaatiota ja vastaavasti ekspressiokokeita varten, 30 ja M13-vektoreihin [(Yanisch-Perron et al., Gene 33:103 (1985)] sekvensointia varten.

DNA:n sekvensointi:

Kiinnostuksen kohteena olevien DNA-fragmenttien subkloo-35 nauksen jälkeen M13-vektoriin, yksijuosteista DNA:ta valmistetaan vakiomenetelmillä (Sambrook et ai., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. painos. Cold Spring Har- 11 111012 bor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) ja käytetään sekvensoinnissa. DNA:n sekvenssitiedot saadaan käyttäen Sequenase-sekvensointipakkausta, versio 2, (US Biochemi-cals, Cleveland, OH) valmistajan suositusten mukaisesti.

5 7-deatsa dGTP:tä käytetään dGTP:n asemesta tiivistymisten välttämiseksi. Alussa käytetään M13-vektorin yleisaluket-ta, jotta saadaan 200-250 ensimmäisen emäksen sekvenssi, sen jälkeen näistä tuloksista syntetisoidaan 17-meerinen oligonukleotidi käyttäen Applied Biosystems 391 DNA-syn-10 teesilaitetta valmistajan ohjeiden mukaisesti ja sitä käytetään alukkeena DNA:n sekvensoinnin jatkamiseksi kunnes saadaan täydelliset DNA-sekvenssitiedot.

Streptomvces-lalin 1a E. colin transformointi 15 Kompetentteja E. coli -soluja valmistellaan kalsiumklori-dimenetelmällä (Sambrook et ai., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. painos. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) ja transformoidaan va-kiomenetelmillä (Sambrook et al., Molecular Cloning. A 20 Laboratory Manual, 2. painos. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). S. lividans -rihmastoa kasvatetaan YEME-alustassa (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985) ja kerätään talteen 48 25 tunnin kuluttua. Rihmastopelletti pestään kahdesti 10,3 %:isella sakkaroosiliuoksella ja käytetään protoplastien valmistukseen Hopwoodin käsikirjassa esitetyn menetelmän mukaisesti (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, 30 Norwich, UK, 1985). Protoplastipelletti suspendoidaan

noin 300 mikrolitraan P-puskuria (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985), ja 50 mikrolitran erä tätä suspensiota käytetään kuhunkin transformaatioon. 35 Protoplastit transformoidaan plasmidi-DNA:lla Hopwoodin et al. pienimittaisen transformaatiomenetelmän mukaisesti (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A

12 111012

Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985). Regeneration kestettyä 17 tuntia R2YE-alustalla 30°C:ssa, maljoille lisätään 50 pg/ml tiostreptonia ja annetaan kasvaa 30°C:ssa itiövaiheeseen saakka.

5

Karminomvsiinin biologinen muuntaminen daunorubisiiniksi Erilaisia plasmideja sisältäviä S. lividans -transfor-mantteja siirrostetaan nestemäiseen R2YE-alustaan (Hop-wood et ai., Genetic Manipulation of Streptomyces. A La-10 boratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985), joka sisältää 5 pg/ml tiostreptonia. Kahden päivän kasvatuksen jälkeen 30°C:ssa, 2,5 ml tästä viljelmästä siirretään 25 ml:aan Strohlin alustaa [(Dekleva et ai.. Can. J. Microbiol. 31:287 (1985)], joka sisältää 20 pg/ml 15 tiostreptonia. Viljelmiä kasvatetaan haitoilla varustetuissa erlenmeyerpulloissa pyriväliikkeisessä ravisteli-jassa nopeudella 300 kierrosta minuutissa (rpm) 30°C:ssa 72 tunnin ajan, minkä jälkeen karminomysiiniä (vesiliuoksena pitoisuudessa 10 milligrammaa/ml) lisätään viljel-20 miin, jolloin loppupitoisuudeksi saadaan 5 pg/ml. Jat- koinkuboinnin kestettyä 24 tuntia ravistelijassa viljelmiä inkuboidaan vesihauteessa 60°C:ssa 45 min. ajan sen jälkeen kun on lisätty 150 milligrammaa/ml oksaalihappoa antrasykliinimetaboliittien glykosidisten muotojen hydro-25 lysoimiseksi. Metaboliitit uutetaan viljelmistä 15 ml:11a kloroformia sen jälkeen kun viljelmien pH on säädetty tasoon 8,4-8,6. Kloroformiliuos suodatetaan 0,45 pm Acro-disc CR -suotimen läpi (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) ja 100 mikrolitraa tätä suodosta analysoidaan HPLC:n 30 avulla Waters'in Nova-Pak C18 -patruunalla (8 mm x 10 cm) liikkuvan faasin ollessa metanoli-vesi (85-15) säädettynä pH-arvoon 2,5 fosforihapon avulla virtausnopeudella 3 ml/min. Kolonnin ulostuloa seurattiin käyttäen Waters 6000 -liuotinannostussysteemiä, 441-UV -detektoria toimi-35 en aallonpituudessa 254 nm ja 740-tulosmoduulia. Karminomysiiniä ja daunorubisiinia (10 pg/ral metanolissa) • 4 13 111012 käytettiin ulkoisina standardeina näiden viljelmistä eristettyjen metaboliittien määrän määrittämiseksi.

* Esimerkki 1 5 Karminomysiini-4-O-metwlitransferaasia koodittavan dnrK-aeenin kloonaus

Useita Stutzman-Engwallin ja Hutchinsonin [(Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:3135 (1989)] kuvailemia kosmidikloone-10 ja, jotka edustavat suunnilleen 96 kiloemästä S. peuce-tius 29050:n genomisesta DNA:sta, transformoidaan S. li-vidans TK24:ään ja transformanteista analysoidaan kar-minomysiinin biologinen muuntuminen daunorubisiiniksi menetelmän mukaisesti, jota kuvailtiin "materiaalit ja 15 menetelmät" -jaksossa. Kosmidiklooni pWHM339 [Otten et ai., J. Bacteriol. 172:3427 (1990)] muuntaa biologisesti 22 % lisätystä karminomysiinistä daunorubisiiniksi. 11,2 ke EcoRI-fragmentti insertistä pWHM339:ssä subkloonataan kosmidivektori pKC505:een [Richardson et ai., Gene 61:231 20 (1987)], jolloin saadaan plasmidi pWHM534. S. lividans TK24:ssä, joka on transformoitu pWHM534:llä, esiintyy 25-60 % lisätyn karminomysiinin biologista muuntumista daunorubisiiniksi. 5,8 ke Sphl-fragmentti pWHM534:stä subkloonataan kopioluvultaan suuren plasmidin pWHM3 Sphl-25 kohtaan, jolloin saadaan plasmidi pWHM901. pWHM901:llä transformoidulla S. lividansilla esiintyy 50-85 % karminomysiinin biologista muuntumista daunorubisiiniksi.

1,6 ke SphI/FvuII-fraqmentti kloonataan pWHM901:stä ensin pUCl9-plasmidin Sphl/Smal-kohtiin [(Yanisch-Perron et 30 ai., Gene 33.:103 (1985)], sen jälkeen 1,6 ke DNA-frag-mentti subkloonataan jälkimmäisestä plasmidista Hindll-I/EcoRI-fragmenttina pWHM3:n Hindlll/EcoRI-kohtiin, jolloin saadaan plasmidi pWHM902 (Kuvio 2). pWHM902:lla transformoitu S. lividans muuntaa biologisesti 100 % vil-35 jelmään lisätystä karminomysiinistä daunorubisiiniksi.

* 14 111012 dnrK-qeenin sisältävän alueen DNA-sekvenssl 2,5 ke DNA-palan sekvensointi 5,8 ke Sohi-fragmentista pWHM901:ssä suoritetaan subkloonaamalla 0,4 ke 5 Sphl/Xhol-, 0,7 ke Xhol/Sstl-, 0,6 ke Sstl/Sall- ja 0,8 ke SaiI/XhoI-fragmentit pWHM902:sta M13mpl8 ja -mpl9-vek-toreihin [(Yanisch-Perron et ai., Gene M'· 103 (1985)3 , jolloin saadaan kummatkin orientaatiosuunnat kustakin DNA-osasesta. Tuloksena saatujen neljän kloonin DNA-sek-10 vensointi suoritetaan kuten "materiaalit ja menetelmät" -jaksossa on kuvailtu. Kuviossa 3 esitetään dnrK-qeenin sisältävän 1,6 ke DNA-fragmentin tuloksena oleva DNA-sek-venssi ja COMT-proteiinin aminohapposekvenssi johdettuna tämän DNA-sekvenssin analysoinnin avulla CODON PREFERENCE 15 -ohjelmalla, jonka Devereux et ai. [Nucl. Acids Res.

12:387 (1984)] on kuvannut. CODON PREFERENCE - ja TRANSLATE -analyyseillä identifioitu dnrK:n avoin lukukehys [Devereux et ai., Nucl. Acids Res. 12:387 (1984)] koodit-taa COMT-proteiinia.

20

Esimerkki 2

Vektorin konstruointi dnrK-qeenin ilmentämistä varten E. colissa 25 Suunnilleen 1,6 ke SphI/PvuII-DNA -fragmentti, joka sisältää dnrK:n kokonaisen avoimen lukukehyksen yhdessä joidenkin viereisten sekvenssien kanssa (kuvio 3), sub-kloonataan Sphl:llä ja Smal:llä pilkottuun pUC19-plasmi-diin [(Yanisch-Perron et ai., Gene 33:103 (1985)], jol-30 loin saadaan plasmidi pWHM904 (ei esitetty). Seuraavat kaksi oligodeoksinukleotidialuketta, jotka vastaavat sekvenssejä dnrK:n sisältävän, monistettavan fragmentin kummallakin puolella, syntetisoidaan Applied Biosystems’in 391 DNA-synteesilaitteella valmistajan ohjeiden mukaises-35 ti: 15 111012

Xbal BamHI rbs Ndel 5' - GGG TCTAGA GGATCC AGGAG CAG CATATG ACC GCT GAA CCG ACC GTC GCG GCC CGG CCG CAG CAG AT - 3': aluke # 1 (Sekvenssi n:o 3) 5

SphI PstI

3' - AC CGC TAG CCT GAC GAG CTC CTC CGTACG GACGTC CCC -5': aluke # 2 (Sekvenssi n:o 4) 10 dnrK-geenin toisen, kolmannen ja kuudennen kodonin kolmas paikka (osoitettu puolilihavoiduin kirjaimin) vaihdetaan käyttäen aluketta # 1 kuvastamaan useimmin käytettyä ko-donia runsaasti ilmentyneissä E. colin geeneissä keinona 15 lisätä dnrK-geenin ilmentymistä E. colissa: ATG ACC GCT GAA CCG ACC GTC GCG GCC CGG CCG CAG CAGA: Mutatoitu sekvenssi (Sekvenssi n:o 5) 20 ATG ACA GCC GAA CCG ACG GTC GCG GCC CGG CCG CAG CAGA: Villityypin sekvenssi (Sekvenssi n:o 6) Näitä kahta aluketta käytetään pWHM904:n dnrK-sekvenssin monistamiseksi nukleotidista 205 (dnrK-orf:n alku) nukle-25 otidiin 445 kuviossa 3 vakiomenetelmillä polymeraasiketjureaktiolle Streptomvces-DNA:n kanssa [esimerkiksi, Guilfoile ja Hutchinson, J. Bacteriol. 174:3659 (1992)]. Monistetusta tuotteesta leikataan 88 emäsparia sisältävä Ndel/Ncol-fragmentti ja liitetään 1,3 ke Ncol/EcoRI-frag-30 menttiin (saatu pWHM902:sta), joka sisältää loput dnrK-geenistä (kuviot 2 & 3), ja Ndel/EcoRI-pilkottuun pT7-7:ään [Tabor ja Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:1074 (1985)], josta on seurauksena dnrK-orf:n fuusioituminen tämän E. coli -ekspressiovektorin T7-geenin 10-35 promoottoriin. Kompetentit E. coli DH5a -solut transformoidaan ligoidulla DNA:11a ja transformantit seulottiin • « ♦ · « 16 111012 kohdistuen pT7-7:ään dnrK:n kanssa. Tuloksena olevaa plasmidia merkitään tunnuksella pWHM903 (kuvio 4).

dnrK-aeenin ilmentäminen E. colissa 5

Kompetentteja E. coli -soluja, jotka sisälsivät plasmidin pGPl-2 [Tabor ja Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:1074 (1985)].

10 .... valikoitiin LB-agarilla (Sambrook et ai., Molecular

Cloning. A Laboratory Manual, 2. painos. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), joka sisälsi ampisilliiniä (100 pg/ml) ja kanamysiiniä (50 pg/ml), kasvatuksen jälkeen 30°C:ssa. Menettelytapa kompetenttien, 15 pGPl-2:n sisältävien E. coli -solujen preparoimiseksi on sama kuin millä tahansa muulla E. coli -kannalla, paitsi että viljelmiä pidetään 30°C:ssa 37°C:n asemesta. Kompetentteja, pGPl-2:n sisältäviä E. coli -soluja preparoidaan soluista, jotka ovat kasvaneet 30°C:ssa OD550-tasoon 20 0,5-0,6 LB-alustassa, joka sisältää kanamysiiniä. On hy vin tärkeää ylläpitää pGPl-2:n sisältäviä kantoja 30°C:ssa tavanomaisessa inkuboinnissa ja esi-induktiokasvatukses-sa, jotta vältetään T7 RNA -polymeraasin liikailmentymi-nen, josta saattaisi muutoin olla tuloksena mutatoitu 25 plasmidi.

Yksi transformantti, joka sisältää Sekä pGPl-2:n että pWHM903:n, siirrostetaan 25 ml:aan 2xYT-alustaa (Sambrook et ai.. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. pai-30 nos. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), joka sisältää 100 pg/ml ampisilliiniä ja 50 pg/ml kanamysiiniä, ja kasvatetaan yli yön 30°C:ssa voimakkaasti sekoittaen. Seuraavana aamuna viljelmille annetaan kuu-mashokki 42°C:ssa 30 min. ajan ravistelevassa vesihau-35 teessä ja siirretään sen jälkeen takaisin 30°C:seen. Jat-koinkuboinnin kestettyä 90 min. yksi millilitra viljelmää sentrifugoidaan 14 000 rpm mikrosentrifugissa 1 min.

# 17 111012 ajan, supernatantti heitetään pois ja solupelletti resus-pendoidaan 100 mikrolitraan Laemmlin puskuria [Laemmli, Nature (London), 227:680 (1970)] ja keitetään 5 min.

“ ajan. Keitetyn näytteen sisältämät proteiinit analysoi- 5 daan 10 %:isella SDS-polyakryyliamidigeelillä käyttäen ' tavanomaisia menetelmiä [Laemmli, Nature (London), 227:680 (1970)], vertailemalla proteiineihin, jotka on saatu E. colin solu-uutteesta, joka on transformoitu pT7- 7-vektorilla, joka ei sisällä dnrK-geeniä. COMT-proteiini 10 kulkeutuu kohtaan Mr 38 700.

Esimerkki 3

Karminomvsiinin muuntaminen daunorubisiiniksi COMT-prote-iinin sisältävän solun avulla 15

Yksi E. coli -transformantti, joka sisältää sekä pGPl-2:n että pWHM903:n, siirrostettiin 25 ml:aan 2xYT-alustaa, joka sisälsi 100 pg/ml ampisilliiniä ja 50 pg/ml kanamy-siiniä, ja kasvatettiin yli yön 30°C:ssa voimakkaasti se-20 koittaen. Seuraavana aamuna viljelmille annetaan kuuma-shokki 42°C:ssa 30 min. ajan ravistelevassa vesihauteessa ja siirretään sen jälkeen takaisin 30°C:seen sen jälkeen kun on lisätty 5 pg/ml karminomysiiniä. Viljelmien annetaan kasvaa vielä 90 minuuttia, minkä jälkeen antrasyk-25 liinimetaboliitit eristetään käyttäen tavanomaisia menetelmiä ja analysoidaan HPLC:n avulla. Yksittäisten kar-minomysiinin ja daunorubisiinin piikkien suhteellisten alueiden vertailu HPLC-kromatogrammissa osoittaa, että 75-80 % kasvualustaan lisätystä karminomysiinistä muuntuu 30 daunorubisiiniksi.

( · ie 111012

Sekvenssiluettelo (2) Informaatio sekvenssi n:o l:lle: (i) Sekvenssin tunnusmerkit: (A) : Pituus: 1632 emäsparia (B) : Tyyppi: nukleiinihappo (C) : Juosteisuus: kaksijuosteinen (D) : Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (ix) Yksityiskohdat:

(A) Nimi/Selitys: CDS

(B) Sijainti: 204..1271 (xi) Sekvenssin kuvaus: sekvenssi n:o 1: GCATGCCGGC AACCGGGCGC CGGTTCTCCG GTGAGCAGAT CCACCTCATC CGCATCGTCG 60 ACGGCAAGAT CCGCGATCAC CGCGACTGGC CCGACTACCT CGGCACCTAC CGCCAGCTCG 120 GCGAGCCCTG GCCCACCCCC GAGGGCTGGC GCCCCTGACC CCCCATCACC CCGCCGACGC 180 CACGACAGGA GCACGGACAC ACC ATG ACA GCC GAA CCG ACG GTC GCG GCC 230

Met Thr Ala Glu Pro Thr Vai Ala Ala 1 5 CGG CCG CAG CAG ATC GAC GCC CTC AGG ACC CTG ATC CGC CTC GGA AGC 278

Arg Pro Gin Gin Ile Asp Ala Leu Arg Thr Leu Ile Arg Leu Gly Ser 10 15 20 25 CTG CAC ACG CCC ATG GTC GTC CGG ACG GCC GCC ACC CTG CGG CTC GTC 326

Leu His Thr Pro Met Vai Vai Arg Thr Ala Ala Thr Leu Arg Leu Vai 30 35 40 * CAC CAC ATC CTG GCC GGG GCC CGC ACC GTG AAG GCC CTG GCG GCC AGG 374

Asp His Ile Leu Ala Gly Ala Arg Thr Vai Lys Ala Leu Ala Ala Arg 45 50 55 ACA GAC ACC CGG CCG GAA GCA CTC CTG CGA CTG ATC CGC CAC CTG GTG 422

Thr Asp Thr Arg Pro Glu Ala Leu Leu Arg Leu Ile Arg His Leu Vai 60 65 70 GCG ATC GGA CTG CTC GAG GAG GAC GCA CCG GGC GAG TTC GTC CCG ACC 470

Ala Ile Gly Leu Leu Glu Glu Asp Ala Pro Gly Glu Phe Vai Pro Thr 75 80 85 GAG GTC GGC GAG CTG CTC GCC GAC GAC CAC CCA GCC GCG CAG CGT GCC 516'

Glu Vai Gly Glu Leu Leu Ala Asp Asp His Pro Ala Ala Gin Arg Ala SO 95 100 105 TGG. CAC GAC CTG ACG CAG GCC GTG GCG CGC GCC GAC ATC TCC TTC ACC 566

Trp His Asp Leu Thr Gin Ala Vai Ala Arg Ala Asd Ile Ser Phe Thr 110 115 ‘ 120 19 111012

Arg Leu Pro Asp Ala He Arg Thr Gly Arg Pro Thr Tyr Glu Ser He -125 130 135 TAC GGC AAG CCG TTC TAC GAG GAC CTG GCC GGC CGC CCC GAC CTG CGC 662

Tyr Gly Lys Pro Phe Tyr Glu Asp Leu Ala Gly Arg Pro Asp Leu Arg 140 145 150 GCG TCC TTC GAC TCG CTG CTC GCC TGC GAC CAG GAC GTC GCC TTC GAC 710

Ala Ser Phe Asp Ser Leu Leu Ala Cys Asp Gin Asp Val Ala Phe Asp 155 160 165 GCT CCG GCC GCC GCG TAC GAC TGG ACG AAC GTC CGG CAT GTG CTC GAC 758

Ala Pro Ala Ala Ala Tyr Asp Trp Thr Asn Val Arg His Val Leu Asp 170 175 180 185 GTG GGT GGC GGC AAG GGT GGT TTC GCC GCG GCC ATC GCG CGC CGG GCC 806

Val Gly Gly Gly Lys Gly Gly Phe Ala Ala Ala lie Ala Arg Arg Ala 190 195 200 CCG CAC GTG TCG GCC ACC GTG CTG GAG ATG GCG GGC ACC GTG GAC ACC 854

Pro His Val Ser Ala Thr Val Leu Glu Met Ala Gly Thr Val Asp Thr 205 210 215' GCC CGC TCC TAC CTG AAG GAC GAG GGC CTC TCC GAC CGT GTC GAC GTC 902

Ala Arg Ser Tyr Leu Lys Asp Glu Gly Leu Ser Asp Arg Val Asp Val 220 225 230 GTC GAG GGG GAC TTC TTC GAG CCG CTG CCC CGC AAG GCG GAC GCG ATC 950

Val Glu Gly Asp Phe Phe Glu Pro Leu Pro Arg Lys Ala Asp Ala He 235 240 245 ATC CTC TCT TTC GTC CTC CTC AAC TGG CCG GAC CAC GAC GCC GTC CGG 998

He Leu Ser Phe Val Leu Leu Asn Trp Pro Asp His Asp Ala Val Arg 250 255 260 265 » .

AT'C CTC ACC CGC TGC GCC GAG GCC CTG GAG CCC GGC GGG CGC ATC CTG 104 6

He Leu Thr Arg Cys Ala Glu Ala Leu Glu Pro Gly Gly Arg He Leu 270 275 280 ATC CAC GAG CGC GAC GAC CTC CAC GAG AAC TCG TTC AAC GAA CAG TTC 1094

He His Glu Arg Asp Asp Leu His Glu Asn Ser Phe Asn Glu Gin Phe 285 290 295 ACA GAG CTC GAT CTG CGG ATG CTG GTC TTC CTC GGC GGT GCC CTG CGC 1142 . Thr Glu Leu Asp Leu Arg Met Leu Val Phe Leu Gly Gly Ala Leu Arg 300 305 310 . ACC CGC GAG AAG TGG GAC GGC CTG GCC GCG TCG GCG GGC CTC GTG GTC 1190

Thr Arg Glu Lys Trp Asp Gly Leu Ala Ala Ser Ala Gly Leu Val Val 315 320 325 GAG GAG GTG CGG CAA CTG CCG TCG CCG ACC ATC CCG TAC GAC CTC TCG 1238 m 20 111012

Glu Glu Vai Arg Gin Leu Pro Ser Pro Thr lie Pro Tyr Asp Leu Ser 330 335 340 345 CTC CTC GTC CTT GCC CCC GCG GCC ACC GGC GCC TGACACACGA GGTACGGGAA 1291

Leu Leu Val Leu Ala Pro Ala Ala Thr Gly Ala 350 355 GGGTTCATCA GCAATGCCGA CACGCATGAT CACCAACGAT GAGGTGACCC TGTGGAGCGA 1351 AGGGCTCGGC GATCCGGCCG ACGCCCCGTT GCTCCTGATC GCCGGCGGCA ACCTCTCGGC 1411 CAAATCGTGG CCGGACGAGT TCGTCGAACG CCTGGTCGCG GCCGGGCACT TCGTGATCCG 1471 CTACGACCAC CGGGACACCG GGCGCTCCTC CCGGTGCGAC TTCGCGCTCC ACCCCTACGG 1531 CTTCGACGAG CTGGCCGCCG ACGCGCTGGC CGTCCTGGAC GGCTGGCAGG TCCGCGCCGC 1591 CCATGTGGTG GGCATGTCGC TGGGCAACAC CATCGGCCAG C 1632 (2) Informaatio sekvenssi n:o 2:lie: (i) Sekvenssin tunnusmerkit: (A) : Pituus: 356 aminohappoa (B) : Tyyppi: aminohappo (D): Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: sekvenssi n:o 2:

Met Thr Ala Glu Pro Thr Vai Ala Ala Arg Pro Gin Gin Ile Asp Ala 15 10 15

Leu Arg Thr Leu Ile Arg Leu Gly Ser Leu His Thr Pro Met Vai Vai 20 25 30

Arg Thr Ala Ala Thr Leu Arg Leu Vai Asp Kis Ile Leu Ala Gly Ala 35 40 45

Arg Thr Vai Lys Ala Leu Ala Ala Arg Thr Asp Thr Arg Pro Glu Ala 50 55 60

Leu Leu Arg Leu Ile Arg His Leu Vai Ala Ile Gly Leu Leu Glu Glu 65 70 75 80

Asp Ala Pro Gly Glu Phe Vai Pro Thr Glu Vai Gly Glu Leu Leu Ala 85 90 95

Asp Asp His Pro Ala Ala Gin Arg Ala Trp His Asp Leu Thr Gin Ala 100 105 110 21 111012

Vai Ala Arg Ala Asp Ile Ser Phe Thr Arg Leu Pro Asp Ala Ile Arg '115 120 125

Thr Gly Arg Pro Thr Tyr Glu Ser Ile Tyr Gly Lys Pro Phe ‘Tyr Glu 130 135 140

Asp Leu Ala Gly Arg Pro Asp Leu Arg Ala Ser Phe Asp Ser Leu Leu 145 150 155 160

Ala Cys Asp Gin Asp Vai Ala Phe Asp Ala Pro Ala Ala Ala Tyr Asp 165 170 175

Trp Thr Asn Vai Arg His Vai Leu Asp Vai Gly Gly Gly Lys Gly Gly 180 185 190

Phe Ala Ala Ala Ile Ala Arg Arg Ala Pro His Vai Ser Ala Thr Vai 195 200 205

Leu Glu Met Ala Gly Thr Vai Asp Thr Ala Arg Ser Tyr Leu Lys Asp 210 215 220 *

Glu Gly Leu Ser Asp Arg Vai Asp Vai Vai Glu Gly Asp Phe Phe Glu 225 230 235 240

Pro Leu Pro Arg Lys Ala Asp Ala Ile Ile Leu Ser Phe Vai Leu Leu 245 250 255

Asn Trp Pro Asp His Asp Ala Vai Arg Ile Leu Thr Arg Cys Ala Glu 260 265 270

Ala Leu Glu Pro Gly Gly Arg Ile Leu Ile His Glu Arg Asp Asp Leu 275 280 285

His Glu Asn Ser Phe Asn Glu Gin Phe Thr Glu Leu Asp Leu Arg Met 290 295 300

Leu Vai Phe Leu Gly Gly Ala Leu Arg Thr Arg Glu Lys Trp Asp Gly 305 310 315 320

Leu Ala Ala Ser Ala Gly Leu Vai Vai Glu Glu Vai Arg Gin Leu Pro 325 330 335

Ser Pro Thr Ile Pro Tyr Asp Leu Ser Leu Leu Vai Leu Ala Pro Ala 340 345 350 - Ala Thr Gly Ala 355 * (2) Informaatio sekvenssi n:o 3:lie: (i) Sekvenssin tunnusmerkit: (A): Pituus: 67 emäsparia « 111012 22 (B) : Tyyppi: nukleiinihappo (C) : Juosteisuus: yksijuosteinen (D) : Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: DNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: sekvenssi n:o 3: GGGTCTAGAG GATCCAGGAG CAGCATATGA CCGCTGAACC GACCGTCGCG GCCCGGCCGC 60 AGCAGAT 67 (2) Informaatio sekvenssi n:o 4:lie: (1) Sekvenssin tunnusmerkit: (A) : Pituus: 38 emäsparia (B) : Tyyppi: nukleiinihappo (C) : Juosteisuus: yksijuosteinen (D) : Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: DNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi n:o 4: ACCGCTAGCC TGACGAGCTC CTCCGTACGG ACGTCCCC 38 (2) Informaatio sekvenssi n:o 5:lie: (1) Sekvenssin tunnusmerkit: (A) : Pituus: 40 emäsparia (B) : Tyyppi: nukleiinihappo (C) : Juosteisuus: yksijuosteinen (D) : Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: DNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi n:o 5: ATG ACCGCTG AACCGACCGT CGCGGCCCGG CCGCAGCAGA 40 (2) Informaatio sekvenssi n:o 6:lie: (i) Sekvenssin tunnusmerkit: (A): Pituus: 40 emäsparia « 23 111012 (B) : Tyyppi: nukleiinihappo (C) : Juosteisuus: yksijuosteinen (D) : Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: DNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi n:o 6: ATGACAGCCG AACCGACGGT CGCGGCCCGG CCGCAGCAGA 40

Claims (19)

111012

1 MTAEPTVAAR PQQIDAIRTL UUjGSUfTPM WRTAATLRL VDHILAGART 51 VKALAAKTDT RPEALLRIilR HliVAIGIiLEE DAPGEFVPTE VGELLADDHP 10 101 AAQRAWHDLT QAVARADISF TI&PDÄIRTG RPTYESIYGK PFYEDLAGRP

151 DLRASFDSLL ACDQDVAFDA PAAAYDWTOV RHVLDVGGGK GGFAAAIARR 201 APHVSATVLE MAGTVÖTÄRS YEKDEGISDR VDWEGDFFE PLPKKADAII 251 LSFVLLNWPD HDAVRlLTEC AEÄfiEPGGRI LIHERDDLHE NSFNEQFTEL 301 DLRMLVFDGG ALRTREKWDG IiÄGLVVE EVHQLPSPTI PYDLSLLVLA 351 PAATG 15

11. Menetelmä peptidin valmistamiseksi, jolla on kar-minomysiini-4-O-metyylitransferaasiaktiivisuutta, tunnettu siitä, että sopivia isäntäsoluja transformoidaan eks-pressiovektorilla, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka 20 koodaa karminomysiini-4-O-metyylitransferaasia, joka sisältää sekvenssiluettelon sekvenssissä nro 2 esitetyn aminohapposekvenssin tai osan siitä, mainittuja isäntäsoluja viljellään sopivassa alustassa, joka saa aikaan mainitun DNA-sekvenssin ilmentymisen, jolloin 25 saadaan karminomysiini-4-O-metyylitransferääsi. • · « «

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on E. coli tai Streptomy-ces. 30

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu >·' siitä, että mainittu vektori on plasmidi.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu 35 siitä, että mainittu plasmidi valitaan ryhmästä, joka käsittää pWHM901:n, pWHM902:n ja pWHM903:n, joiden valmistus on kuvattu selityksen sivulla 13. « 111012

15. Menetelmä daunorubisiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että sopivia isäntäsoluja transformoidaan vektorilla, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa karminomysiini-4-O-metyylitransferaasia, joka sisältää 5 sekvenssiluettelon sekvenssissä nro 2 esitetyn aminohapposekvenssin tai osan siitä, mainittuja isäntäsoluja viljellään sopivassa alustassa, mainitun DNA-sekvenssin annetaan ilmentyä ja daunorubisiini otetaan talteen. 10

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut isäntäsolut ovat Streptomyces-solu-ja. 15 17, Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu vektori on plasmidi.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu plasmidi valitaan ryhmästä, joka 20 käsittää pWHM901:n, pWHM902-.n ja pWHM903:n, joiden valmistus on kuvattu selityksen sivulla 13.

19. Menetelmä karminomysiinin muuntamiseksi daunorubisii-niksi, tunnettu siitä, että käytetään valmistetta, joka 25 sisältää patenttivaatimuksen 11 mukaisen, karminomysiini-

1. Karminomysiini-4-O-metyylitransferaasia koodaava eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa-5 sekvenssiluettelon sekvenssissä nro 2 esitetyn aminohapposekvenssin tai osan siitä, joka osa on säilyttänyt karminomysiini-4-O-metyyli-transferaasiaktiivisuutensa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se käsittää kokonaan tai osaksi kuvion 3 mukaisen DNA:n.

3. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää 15 patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se on plasmidi.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen plasmidi, tunnettu sii tä, että se valitaan ryhmästä, joka käsittää pWHM901:n, pWHM902:n ja pWHM903:n, joiden valmistus on kuvattu selityksen sivulla 13.

6. Transformoitu isäntäsolu, tunnettu siitä, että se si sältää patenttivaatimuksen 3 mukaisen vektorin.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen transformoitu isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu vektori on plasmi- 30 di.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen transformoitu isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on E. coli tai Streptomyces. 35

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen transformoitu isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu vektori on plasmidi, joka valitaan ryhmästä, joka käsittää pWHM901:n, 25 111012 pWHM902m ja pWHM903:n, joiden valmistus on kuvattu selityksen sivulla 13.

10. Karminomysiini-4-O-metyylitransferaasiaktiivisuutta 5 omaava eristetty ja puhdistettu peptidi, tunnettu siitä, että se käsittää kokonaan tai osaksi j aminohapposekvenssin: (Sekvenssi n.*o 2)

4-O-metyylitransferaasiaktiivisuutta omaavan peptidin, • tai että käytetään patenttivaatimuksen 6 mukaista isäntä- solua . 27 111012