JPH06505402A - カルミノマイシン４−ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードするｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ルミノマイシン４−０−メ　ルトーンスフェラーゼをコニ上ヱ１１臥配置 ｌ肌五±１ 本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ２９０５０以外のス トレプトマイシート及び細菌細胞抽出物中でのカルミノマイシンからダウノルビ シンの産生を改善するようにダウノルビシンの生合成を変えることによって又は それから誘導される精製酵素によって癌の治療に有効なアントラサイクリンを製 造する方法に関する。

１肌ゑ１遣 ダウノルビシン群のアントラサイクリン（例えばドキソルビシン、カルミノマイ シン（ｃａｒｍｉｎｏＴａｙｃｉｎ）及びアクラシノマイシン）は、抗癌治療で 最も広範に使用されてし）る薬であるＣＦ、＾ｒｃａｎ＋ｏｎｅ、　Ｄｏｘｏｒ ｕｂｉｅｉｎ、＾ｃａｄｅ＋＊ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８１．ｐｐ、１２−２５；＾、　Ｇｒｅｉｎ、　Ｐｒｏ ｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６：３４（１９８１）；Ｔ、　Ｋａｎｅｋｏ、　 Ｃｈｉ＋ｅｉｃａｏｇｇｉ　Ｍａｙ：１１（１９８８））　。

特に経口投与によるダウノルビシン及びドキソルビシンの抗癌活性を高め、また 癌治療でのこれらの薬剤の使用に付随する急性毒性及び慢性心臓毒性を除去する ために、これらの物質の改良型誘導体が化学合成によって製造されてｂ）る　（ Ｐｅｎｃｏ、　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅ−ｍ−１５：１２（１９８０）； Ｔ　Ｋａｎｅｋｏ。

Ｃｈｉｍｉｃａｏｇｇｉ　Ｍａｙ：１１（１９８８））　、　４°−エビドキソ ルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ　（登録商標））及び４−デメトキシダウノル ビシン（Ｉｃ１ａｒｕｂｉｃｉｎ　（登録商標））はこのような雇似体の例であ る。

これらの天然化合物は、種々のストレプトミセス株（Ｓ。

ｐｅｕｅｅｔｉｕｓ、　Ｓ、　ｃｏｅｒｕｌｅｏｒｕｂｉｃｌｕｓ、　Ｓ、　ｇ ａｌｉｌａｅｕｓ、　Ｓ。

ｇｒｉｓｅｕｓ、　Ｓ、　Ｈｒｉｓｅｏｒｕｂｅｒ、　Ｓ、　ｉｎｓｉｇｎｉｓ 、　Ｓ。

ｖｉｒｉｄｏｅｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、　Ｓ、　ｂｉｆｕｒｃｕｓ及びＳｔｒｅ ｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、株Ｃ５）並びに＾ｅｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｍｉ ｎａｔａから産生される。ドキソルビシンは、Ｓ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　５ｕ ｂｓｐ、　ｅａｅｓｉｕｓによってのみ産生されるが、ダウノルビシンはＳ、　 ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ及び前述した他のストレプトミセスから産生される。このタ イプの株Ｓ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　５ｕｂｓｐ、　ｃａｅｓｉｕｓ　ＩＭＲＵ 　３９２０　（この株はＡＴＣＣ２７９５２と同一であり、以後省略して“Ｓ、 　ｐｅｕｅｅｔｉｕｓ３９２０″で表す）　、Ｓ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　ＡＴ ＣＣ２９０５０（“Ｓ。

ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２９０５０”）及びＳ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　５ｕｂｓ ｐ、　ｃａｅｓｉｕｓ＾ＴＣＣ２７９５２（Ｓ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２７９ ５２″）は市販されており、また米国特許第３５９００２８号で説明されている 。Ｓ。

ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２９０５０及び２７９５２は＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＨＤ　ＵＳ ＾）に寄託されて、ＡＴＣＣ２９０５０及びＡＴＣＣ２７９５２のインデックス 番号が付けられてν）る。

アントラサイクリンドキソルビシン（２冒よ、添ｆ寸図面の図１に示す経路で、 Ｓ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２７９５２４こよってマロン酸、プロピオン酸及び グルコースから産生される。ε−ロドマイジノン（４）、カルミノマイシン（３ ）及びダウノルビシン（１）はこのプロセス中に産生される中間体である　（Ｇ ｒｅｉｏ、＾ｄｖａｎ、＾ｐｐ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３２：２０３　（１ ９８７）　。

Ｅｅｋａｒｄｔ　ａｎｃｌ　ｌｌａｇｎｅｒ、　Ｊ、　Ｂａ５ｉｃ　Ｎ１ｅｒｏ ｂｉｏ１．２８：１３７（１９８８）　）。この経路での２段階は、別々の中間 体の０−メチル化、即ちアクラノン酸からアクラノン酸メチルへの転化及びカル ミノマイシン（３）からダウノルビシン（１）への転化を包含している。Ｓ、　 ｐｅｕｅｅｔｉｕｓ　２９０５０、Ｓ。

ｉｎｓｉｇｎｉｓ　ＡＴＣＣ３１９山Ｓ、　ｃｏｅｒｕｌｅｏｒｕｂｉｄｕｓ　 ＡＴＣＣ３１２７６及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　Ｃ５の無細胞抽出 物が、Ｓ−アデノシフレ−し一メチオニンの存在下で、前述した後者の段階を触 媒することが判明した［　Ｃｏｎｎｏｒｓ等、Ｊ、　Ｃｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ。

１３６：１８９５（１９９０））　、これらの株の全ては特異的カルミノマイシ ン４−０−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴタンノ（り質）を含んでいる。

クローニング実験によって、Ｓ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２９０５０及びＳ。

ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２７９５２からダウノルビシン生合成及びダウノルビシン 耐性用遺伝子を得た［Ｓｔｕｔｚｓａｎ−Ｅｎｇｖａｌｌ　ａｎｄ■ｕｔｃｈｉ ｎｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ八へ６：３１ ３５（１９８８）：０ｔｔｅｎ等、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７２：３４ ２７（１９９０））　、これらの研究から、これらのクローン化した遺伝子は、 ５ｔｒｅｐｔｏ＋ａｙｃｅｓ１ｉｖｉｄａｎｓ　１３２６内に導入されると、ε −ロドマイジノン産生能力及びダウノルビシン及びドキソルビシン耐性能力をこ の宿主に付与することが判明した０本発明者等はその後の研究で、これらのクロ ーンは、Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓ内に導入されたときにカルミノマイシンをダウ ノルビシンに転化する能力を付与し得るかどうかを調べた。そこで本発明者等は 、カルミノマイシン４−０−メチルトランスフェラーゼ遺伝子（以後省略して“ ｄｎｒＫ”で示す）を含む１．６キロベース（ｋｂ）のＤＮ＾断片を単離した。

１尻座厘１ 本発明は、カルミノマイシン４−○−メチルトランスフェラーゼをコードする遺 伝子ｄｎｒＫを含んでいる、添付図面の図２に示す制限部位又はこの制限部位か ら誘導された制限断片の配置を有するＤＮＡを提供する０便宜的に、図２に示す ＤＮＡ断片をここでは“挿入ＤＮＡ”と呼び、添付図面の図３に示す［）Ｎ＾配 列で更に詳しく説明する１本発明は更に、（１）宿主細胞を形質転換することが でき、またｄｎｒＫ遺伝子を含んでいる、挿入ＤＮＡ又は挿入ＤＮ＾から誘導さ れた制限断片を含んでいる組換えベクターと、 （２）　ｄｎｒＫ遺伝子のコピー数及びダウノルビシンを産生するＳｔｒｅｐｔ ｏｍｙｃｅｓ　５ｐｐ１株内での産生物の量を増すことができる組換えベクター と、 （３）精製カルミノマイシン４−０−メチルトランスフェラーゼ酵素を産生でき るように大腸菌内でｄｎｒＫ遺伝子を発現できる組換えベクターと、 （４）カルミノマイシンから純粋ダウノルビシンに生物変換させるためのカルミ ノマイシン４−○−メチルトランスフェラーゼの微生＊ｉ とを提供する。

の　ｔ・ 図１はドキンルビシン生合成経路の概略図である。

図２は本発明の第１のＤＮＡの制限マツプ分析である。これは、組換えプラスミ ドｐＭＦＩＭ９０１をＳｐｈ　ｌ及びＰｖｕｌｌで消化して得られたカルミノマ イシン４−０−メチルトランスフェラーゼ（ｄｎｒＫ　）遺伝子を含んでいる１ 、６ｋｂの５ｐｈｌ／ＰｖｕｌｌＤＮＡ断片をｐＷＩＩＭ３プラスミド即ち大腸 菌−ストレプトミセスシャトルベクター（Ｖａｒａ等、Ｊ、　Ｂａｅｔｅｒｉｏ ｌ、　１７１：５８７２（１９８９）　〕の５ｐｈｌ／５ｌｌａ１部位に挿入し て構築した組換えプラスミドｐｌ！ｌＦＩＭ９０２中の挿入物である０図２に示 すマツプは必ずしも、　ＤＮＡセグメントに存在する全ての制限部位を網羅する リストを提供していない、しがしながら、断片の明瞭な認識のためには指示する 部位だけで十分である。

図３は、カルミノマイシン４−０−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮ Ａセグメントに対応するｄｎｒＫ　ＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列の概略 図である。これは、ｐＭｌ（Ｍ２Ｏ３のｓｐｈ　＋制限部位とＰｖｕｌｌ制限部 位との間の領域をカバーし、５°から３°方向へのコード鎖を示している。カル ミノマイシン４−０−メチルトランスフェラーゼをコードする翻訳された読取り 枠の推定アミノ酸配列を、ｄｎｒＫ遺伝子のヌクレオチド配列の下に示す（配列 番号１、配列番号２）。

図４は本発明の第２のＤＨへの制限マツプ分析である。これは、特定部位の突然 変異誘発によってｐＨＦＩＭ９０１の５．８ｋｂの５ｐｈｌ　ＤＮＡ断片から得 られた約１．４ｋｂのＮｄｅ、Ｉ／ＥｅｏＲＴ　ＤＮＡ断片をｐＴ７−７大腸菌 発現プラスミドベクターのＮｄｅｌ　／　ＥｃｏＲＩ部位に挿入して構築した組 換えプラスミドｐＷＨＭ９０３中の挿入物である（　Ｔａｂｏｒ　ａｎｄ　Ｒ１ ｃｈａｒｄｓｏｎ　、　Ｐｒｏｃ　、　Ｎａむ１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳ＾８２：１０７４（１９８５）　）。図４に示すマツプは必ずしも、ＤＮＡ セグメントに存在する全ての制限部位を網羅するリストを提供していない。しか しながら、断片の明瞭な認識のためには指示する部位だけで十分である。

の・　ｔ・ 本発明の挿入ＤＮ＾及び制限断片は、カルミノマイシン４−〇−メチルトランス フェラーゼをコードする遺伝子（ｃｌｎｒＫ）を含んでいる。このような遺伝子 を発現するために、そのＤＮＡは該遺伝子自身の転写調節配列、特に該遺伝子に 作動的に（ｏｐｅｒａｂ　ｌ　ｙ　）接続され且つ宿主細胞のＲＮ＾ポリメラー ゼによって認識される該遺伝子自身のプロモーターを有し得る。これに代えて、 挿入ＤＮＡ若しくは制限断片を他の転写調節配列に正しく連結させるか又はベク ターの転写調節配列に隣接して適切に配置された制限部位でベクター内にクロー ン化してもよい。

カルミノマイシン４−０−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有する挿入ＤＮＡ 又は制限断片を、組換えＤＮＡクローニングベクター内にクローン化してもよい 。１個以上のＤＮＡセグメントを更に付加することのできる［ｌＮＮ背分子含ん でいる任意の自律複製剤及び／又は自律組込み剤を使用してもよい。しかしなが ら通常、ベクターはプラスミドである。

好ましいプラスミドは高コピー数のプラスミドｐＷｌ１Ｍ３又はｐｌＪ７０２　 （Ｋａｔｚ等、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１２９：２７０３（１ ９８３））である、他の適切なプラスミドはｐｌＪ３８５　（Ｍａｙｅｒｉ等、 Ｊ。

Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、１７２：６０６１（１９９０））　＋　ｐｌＪ６８０　（ Ｆｒｏｐｗｏｏｄ等、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｓｔ ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、＾ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｊｏｈｎ　Ｉ ｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｎｏｒｗｉｅｈ、　ＵＫ、　１９８５）、 ｐ［１Ｍ６０１　（（：ｕｉｌｆｏｉｌｅ　ａｎｄ　ｆｌｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ　。

Ｓｃｉ、　ＵＳ八へ８：８５５３（９９１））又はｐＰＭ９２７　（Ｓｍｏｋｉ ｎａ等、Ｇｅｎｅ９４：５２（１９９０）　）である、任意の適切な技術を使用 して、挿入［ＩＮ＾又はその制限断片をベクターに挿入してもよい、　ＤＮＡを 適切な制限部位で線状化ベクターに連結させて挿入させることができる。このた めに、付着末端若しくはプラント末端の直接結合、ホモポリマーテーリング、又 はリンカ−若しくはアダプター分子の使用を適用してもよい。

組換えベクターを使用して、適切な宿主細胞を形質転換する。宿主細胞は、カル ミノマイシン又はダウノルビシンに対して感受性のある、即ち一定量のカルミノ マイシン又はダウノルビシンの存在下では増殖できない細胞であるか、又はカル ミノマイシン耐性若しくはダウノルビシン耐性のある細胞であり得る。宿主は微 生物であってもよい、従って、アントラサイクリンを産生するか若しくは産生し ないＳ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ株、特にＳ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２９０５０ 株及び他のストレプトミセス種株を形質転換してもよい。ストレプトミセス株の 形質転換細胞は通常プロトプラストの形質転換によって得られる。　ｄｎｒＫ遺 伝子を他のベクターに組込んで、ストレプトミセス以外の菌（例えば大腸菌）で 発現してもよ髪）。

カルミノマイシンをダウノルビシンに生物変換するのに、形質転換した宿主から 得たＣＯＭＴタンパク質を使用してもよい、この方法では、ダウノルビシンの他 に望ましくな１１１中間体のカルミノマイシンを含んでいる発酵方法で産生した 細胞抽出物を出発材料として、純度の高いダウノルビシンを産生することができ る。

遊離した若しくは固定した形質転換細胞を直接使用するか又はＣＯＭＴタンパク 質を単離して、生物変換方法を実施することができる。このＣＯＭＴタンパク質 は、遊離した形態で使用するか、公知の技術に従ってイオン結合若しくは共有結 合で樹脂、ガラス、セルロース若しくは同様の物質に固定するか、基質透過性の 繊維にグラフトするか又は架橋によって不溶化することができる。ＣＯＭＴタン パク質を未処理の細胞抽出物で使用してもよい。

カルミノマイシンの生物変換を増進し、最終細胞抽出物内での望ましくない中間 体の存在を最小限にするために、本発明の組換えベクターを使用して、ダウノル ビシンを産生ずる適切な宿主細胞を形質転換してもよい、宿主細胞は、カルミノ マイシン耐性細胞、ダウノルビシン耐性細胞又はドキソルビシン耐性細胞、即ち 任意の量のカルミノマイシン、ダウノルビシン又はドキソルビシンの存在下で増 殖できる細胞であり得る。従って、アントラサイクリンを産生するＳ、　ｐｅｕ ｃｅｔｉｕｓ株、特にＳ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２９０５０株及び他のストレ プトミセス種株を形質転換してもよい、ストレプトミセス株の形質転換細胞は通 常プロトプラストの形質転換によって得られる。ｄｎｒＫ遺伝子を含まないＳ、 　ｐｅｕｅｅｔｉｕｓ又は他のストレプトミセス種の形質転換株を培養し、この ようにして産生されたダウノルビシン又は関連アントラサイクリンを回収するこ とによって、ダウノルビシンが得られ得る。

挿入ＤＮ＾はＳ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２９０５０のゲノムＤＮ＾から得られ る。

この株は＾ＴＣＣ２９０５０の受託番号で、＾ｍｅｒｉｅａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＯ，ＵＳＡ）に 寄託された。

Ｓ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２９０５０から誘導された株（例えばＳ。

ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２７９５２）を使用してもよい。この株も通常カルミノマ イシンをダウノルビシンに変換し得る。従って、挿入ＤＮＡを以下のように調製 してもよい。

（ａ　）　Ｓ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２９０５０又はこれから誘導された株の ゲノムＤＮ＾のライブラリーを作成し、 （ｂ）カルミノマイシンをダウノルビシンに変換する能力を備えたクローンに関 しライブラリーをスクリーニングし、（ｃ）ライブラリーの一部分を形成し、カ ルミノマイシンからダウノルビシンに変換する能力に間し陽性零＃中としてスク リーニングされた組換えベクターから挿入ＤＮＡを調製し、 （ｄ）場合によっては、カルミノマイシン４−０−メチルトランスフェラーゼを コードする遺伝子を含んでいる制限断片を挿入ＤＮ＾から調製する。

段階（ａ）では、Ｓ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２９０５０又はこれから誘導され た株のゲノムＤＮ＾を部分的に消化してライブラリーを作成してもよい。制限酵 素Ｍｂｏ　ｌを使用するのが好ましい。

このようにして得られたＤＮＡ断片をサイズ分画することができる。寸法が３〜 ５ｋｂの断片が好ましい、これらの断片を線状化ベクター（例えばｐＨ）１Ｍ３ 又はｐＩＪ７０２）に連結させる。宿主細胞を連結混合物で形質転換する０通常 、宿主細胞はカルミノマイシンもダウノルビシンも産生できないが、カルミノマ イシン又はダウノルビシンに対して感受性を有し、例えば１０μｇ／ｍｌ以下の カルミノマイシン又はダウノルビシンに対して感受性を有し得る０例えば、Ｓ、 　ｌ１ｖｉｄａｎｓＪ１１６２３プロトプラスト（Ｈｏｄｗｏｏｄ等、Ｇｅｎｅ ｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｒ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、＾［、ａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｊｏｈｎ　ＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏ ｎ、　Ｎｏｒｗｉｃｈ、■に、　１９８５）を形質転換してもよい。

段ＦＦ　（ｂ　）では、このようにして得られた形質転換細胞を、カルミノマイ シンを取り込んで（ｔａｋｅ　ｕｐ）−ダウノルビシンに変換し、これを排出す る能力についてスクリーニングする。カルミノマイシンを含んでいる培地の抽出 物をダウノルビシンの存在についてクロマトグラフィーで分析することによって 、カルミノマイシンをダウノルビシンに変換し得るクローンを同定する。このよ うなりローンを単離し、クローン内に含まれている組換えベクターを抽出する０ 段階（ｃ）で組換えベクターを適切な制限酵素で消化することによって、各ベク ターに挿入されたＳ。

ｐｅｕｅｅｔｉｕｓ　２９０５０　ＤＮＡを同定し、寸法を決定し、マツプを形 成し得る。このようにして、ベクターが本発明の挿入ＤＮＡを含んでいることが チェックされ得る。

更には、本発明のＤＮＡ内に全体が又は一部分が包含されている２個以上の重な り合う挿入物を単離してもよい。共通の制限部位で切断し、その後連結させてこ れら挿入物を融合し、必要とあれば適切な制限酵素を使用して長さにおいて不要 部分を切り取った本発明のＤＮＡを調製してもよい。

挿入ＤＮＡを適切な制限酵素で切断することによって、ＣＯＭＴタンパク質をコ ードする遺伝子を含む挿入ＤＮＡの制限断片を段階（ｄ）で調製してもよい。

カルミノマイシンをダウノルビシンに変換する能力を付与する能力に影響を及ぼ さない方法で本発明のＤＮＡを突然変異させてもよい。例えば特定部位の突然変 異によってこれを実施することができる。このように突然変異したＤＮＡは本発 明の一部を形成する。

えば大腸菌）のｄｎｒＫ遺伝子の１発現に適したベクター内に組込んでもよい。

以下の実施例で本発明を説明する。

材料及び方法 びプラスミド：ＤＮＡ断片をサブクローニングするために、アンピシリン及びア ブラマイシンに対して感受性のある大腸菌株ＤＨ５ａを使用する。Ｓ、　ｐｅｕ ｅｅｔｉｕｓのｄｎｒＫ遺伝子の発現のために、大腸菌に３８／Ｒｕ５ｓｅｌ　 ＆　Ｍｏｄｅｔ、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５９：１０３４（１９８４）／を使用する。　ｄｎｒ Ｋ遺伝子の配列決定のための一重鎖ＤＨへを調製するために、大腸菌ＪＭ１０５ を使用する。

ｐｇ　、大腸菌０１１５αをＬＢ寒天上で維持する（　Ｓａｍｂｒｏｏｋ等−Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

２ｎｄ　ｅｄ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｆｌａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃ ｏ１ｄ　ｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９８９）。形質転換細胞を選 択するときには、アンピシリン及びアブラマイシンをそれぞれ５０μｇ／論１及 び１００μｇ／ｍｌの濃度で加える。大腸菌ＪＭ１０５をＭ９最小寒天培地上で 維持する（　Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　ｅｄ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｆｌａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９８９）　、コロニー をＬＢ培地に移し、３７℃で一晩増殖させて、一本ＭＤＮＡの調製に使用する細 菌を得る。ＨＱ天（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉＢ。

＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　ｅｄ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｉ（ａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 、　ＮＹ、　１９８９）を使用して、複製形態のＭ２Ｓ　ＤＮＡで形質転換した 大腸菌Ｄｌ１５αをプレートする（　（Ｙａｎｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、Ｇｅｎ ｅ　２３：１０３（１９８５））　）　、胞子の調製及びプロトプラストの再生 のために、Ｓ、　ｌ１ｖｉｄａｎｓをＲ２ＹＥ寒天上で維持する（　Ｈｏｐｗｏ ｏｄ等、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｒａｔｉｏｎｏｆ　５ｔｒｅｐｔｏ請ｙ ｃｅｓ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｊｏｈｎ　ＩｎｎｅｓＦｏ ｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｎｏｒｗｉｅｈ、　ＵＫ、　１９８５）　。

ＤＮＡ　の　ブ　ローニン　：ＤＮＡ試料を適切な制限酵素で消化し、標準的な 方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　ｅｄ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、 　ＮＹ、　１９８９）によってアガロースゲル上で分離する。問題のＤＮＡ断片 を含んでいるアガロース切片をゲルから切り出し、にＥＮＥＣＬＥＡＮ装置（Ｂ ｉｏｌＯｌ。

Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃ＾）を使用してこれらの切片からＤＮＡを単離する。標 準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉＢｇ、＾Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　ｅｄ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　１（ａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｆｌａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９８９）を使用して、 生物形質転換実験用大腸菌ベクター、発現実験用大腸菌／ストレプトミセスシャ トルベクター及び配列決定用Ｍ１３ベクター（（Ｙａｎｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等 、Ｇｅｎｅ　３３：１０３　（１９８５）　〕に、単離したＤＮＡ断片をサブク ローニングする。

吐」【糺汲淀１問題のＤＮＡ断片をＭ１３ベクターにサブクローニングした後に 、標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、＾ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　ｅｄ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　 ＮＹ、　１９８９）によって一本ｆｉＤＮ＾を調製して、配列決定に使用する６ 製造業者の指示に従って５ｅｑｕｅｎａｓｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ２．０配列決定用 キット（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌｓ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＲ）を 使用すれば、ＤＮＡ配列データが得られる。圧１１ｉ　（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏ ｎ　）を避けるために、ｄＧＴＰの代わりに７〜Ｄｅａｚａ　ｄＧＴＰを使用す る。最初に、阿１３ベクターの万能プライマーを使用して、最初の２００−２５ ０個の塩基の配列を得る。次に、製造業者の指示に従って＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ　３９１　ＤＮＡ合成器を使用して、これらの配列データから １７マーのオリゴヌクレオチドを合成し、これを１ライマーとして使用して、完 全なりＮＡ配列データが得られるまでＤＮＡの配列決定を継続する。

ストレプトミセス　び　の′　：塩化力ルシラム方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ、八ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、２ ｎｄ　ｅｄ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ　ｆｌａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９８９）によって大腸菌のコンピ テント細胞を調製し、標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　ｅｄ、　 Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９８９）によって形質転換する。Ｓ、　１ｉｖｉ ｄａｎｓ　ＴＫ２４菌糸体をＹＥＭＥ培地で増殖させ（Ｈｏｐｗｏｏｄ等、Ｇｅ ｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ。

＾　しａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｊｏｈｎ　Ｔｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄ ａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｗｉｃｈ。

ＵＫ、　１９８５）　、４８時間後に採取する。菌糸体ベレットを１０．３％ス クロース溶液で２度洗浄し、これを使用して、Ｈｏｐｗｏｏｄのマニアルに記載 の方法（Ｈｏｐｗｏｏｄ等、ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、　ＵＫ、　１ ９８５）に従ってプロトプラストを調製する。プロトプラストのベレットを約３ ００μｌのＰ緩衝液に懸濁させ（Ｈｏｐｗｏｏｄ等、ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐ ｕｒａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌ。

Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｎｏｒｗｉｃｈ、　ＵＫ、　 １９８５）　、この懸濁液のアリコート５０μｍを各形質転換で使用する。Ｈｏ ｐｗｏｏｄ等による小規模形質転換方法（Ｈｏｐｗｏｏｄ等、ＧｅｎｅｔｉｃＭ ａｎｉｐｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、　＾Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｎｏｒｗｉｃｈ、　ＵＫ、　 １９８５）に従って、プロトプラストをプラスミドＤＮＡで形質転換する。Ｒ２ ＹＥ培地上において３０℃で１７時間再生させた後に、プレート上に５０Ｊｉｇ ／＋Ｉのチオストレプトンを重層して、胞子が形成するまで３０℃で増殖させる 。

ルミノマイシンからダウノルビシンへの　六　二異なるプラスミドを含むＳ、　 １ｉｖｉｄａｎｓ形質転換細胞を、５μｇ／ｌのチオストレアトンを含む液体Ｒ ２ＹＥ培地（Ｈｏｐｗｏｏｄ等、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｒａｔｉｏｎ　 ｏｒ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、＾ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｊ ｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｎｏｒｗｉｃｈ、　ＵＫ、　１ ９８５）に接種する。３０℃で２日間増殖させた後に、この培養物２．５ｍｌを 、２０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む２５１の５ｔｒｏｈｌ培地（（Ｄｅ ｋｌｅｖａ等、Ｃａｎ　Ｊ、　Ｎ１ｃｒｏｂｉｏ１．３１：２８７（１９８５） ）　］に移す。３００ｒｐｖｌの回転式撹拌器上のじゃま板を備えた（ｂａｌ’ ｆｌｅｄ）　Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ内にて、３０℃で７２時間培養物を 増殖させる。その後、（Ｌｏｍｇ／＋ｌ濃度の水溶液としての）カルミノマイシ ンを培養物に加えて、最終濃度を５μｇ／ｍ　Ｉにする。撹拌器上で更に２４時 間インキュベートした後に１５０ｍｇ／ｍｌの蓚酸を加えて、培養物を水浴中に て６０”Ｃで４５分間インキュベートして、グリコシド形層のアントラサイクリ ン代謝物を加水分解する。培養物のｐＨを８，４〜８６に調整した後に、代謝物 を１５ｍ１のクロロホルムで培養物から抽出する。０．４５．ａ　ｍ　Ａｃｒｏ ｄｉｓｃ　ＣＲフィルター（にｅ１ｍａｎＳｃ　１ｅｎｃｅｓ　、＾ｎｎ　Ａｒ ｂｏｒ、　Ｍｌ）でクロロホルム溶液を沢過し、流速３ｍ１７分のリン酸でｐＨ ２，５に調整したメタノール−水（８５：１５）移動相を使用するＷａｔｅｒｓ 　Ｎｏｖａ−Ｐａｋ　Ｃ１ｇカートリッジ（８ｍｍ　ｘ　１０ｃｍ）上での）Ｉ ＰＬｃによってこの沢過物１００μ＋を分析する。Ｗａｔｅｒｓ　６０００溶媒 輸送システム、２５４ｎｍで操作する４４１紫外線検出器及び７４０データモジ ユールを使用して、カラム出力を監視した。カルミノマイシン及びダウノルビシ ン（メタノール中１０μｇ／ｍｌ）を外部標準物質として使用して、培！Ｉ物か ら単離したこれらの代謝物を定量した。

実施例１ ルミノマイシン４−０−メ　ルトランスフェーーゼをコード　るｄｎｒＫ遺−の クローニング 約９６ｋｂのＳ、　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ　２９０５０のゲノムＤＮへを示す、Ｓ ｔｕｔｚｍａｎ、Ｅｎｇｗａｌｌ及び）ｌｕｔｃｈｉｎｓｏｎにより記載された 数種のコスミドクローンＣ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳ＾８６・３１３５（１９８９）をＳ、　１ｉｖｉｄａｎｓ　丁に２４内に形 質転換し、材料及び方法の項で説明した方法に基づいて、カルミノマイシンから ダウノルビシンへの生物変換について形質転換細胞を分析する。コスミドクロー ンｐＷＨＭ３３９　（０ｔｔｅｎ等−Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７２：３４２７（１９９０））では、加えたカルミノ マイシンの２２％がダウノルビシンに生物変換される。ｐａｌ（Ｎ３３９中の挿 入物からの１１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、コスミドベクター　ｐＫｃ５０５ 内にサブクローニングして（Ｒ１ｃｈａｒｄｓｏｎ等、（＋ｅｎｅ６１　：２３ １　（１９８７））　、プラスミドｐＷＩＩＭ５３４を得る。　ｐＭｆ１Ｍ５３ ４で形質転換したＳ、ｌ１ｖｉｄａｎｓ　ＴＫ２４では、加えたカルミノマイシ ンからダウノルビシンへの生物変換率は２５〜６０％である。

ｐＷＦＩＭ５３４からの５．８ｋｂのｓｐｈ　＋断片を、高コピー数のプラスミ ドｐＨ）１Ｎ３のｓｐｈ　１部位にサブクローニングして、プラスミドｐＷＨＭ ９０１を得る。　ｐＨ８９０１で形質転換したＳ、　ｌ１ｖｉｄａｎｓでは、カ ルミノマイシンの５０〜８５％がダウノルビシンに生物変換する。１．６ｋｂの ５ｐｈｌ／Ｐｖｕｌｌ断片をまずｐＨ１１Ｍ９０１からｐＵｃ１９のＳｐｈ　ｌ 　／　Ｓｍａ　１部位にクローニングし［Ｙａｎｓｅｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、Ｇｅ ｎｅ３３：１０３（１９８５））、次いで１．６ｋｂのＤＮ＾断片をＦｌｉｎｄ ｌｌｌ／ＥｃｏＲＴ断片として後者のプラスミドからｐＷＦ［Ｎ３のＨｉｎｄｌ 　ｌ　！／ＥｅｏＲ１部位にサブクローニングして、プラスミドｐＮＨＭ９０２ 　（図２）を得る。　ｐＨ８９０１で形質転換したＳ、　１ｉｖｉｄａｎｓでは 、培養物に加えたカルミノマイシン１００％がダウノルビシンに生物変換する。

ｄｎｒＫ遺　を　んでいる　−のＤＮＡ０．４ｋｂの５ｐｈｌ／Ｘｈｏｌ断片、 ０．７ｋｂのＸｈｏｌ／５ｓｔｌ断片、０．６ｋｂの５ｓｔｌ／５ａｌｌ断片及 び０．８ｋｂのＳａ　Ｉ　Ｉ／Ｘｈｏ　Ｉ断片をｐＷＨＭ９０２から河１：（ａ ｐ１８ベクター及びＭ１３ｍｐ１９ベクターにサブクローニングして、ｐＨ１１ ９０４の５．８ｋｂのｓｐｈ　＋断片の２．５ｋｂのＤＮＡセグメントの配列を 決定して（Ｙａｎｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、Ｇｅｎｅ　３３：１０３（１９８５ ））、各ＤＮＡセグメントの両配−向を得る。材料及び方法の項で記載したよう に、得られた４個のクローンのＤＮＡ配列を決定する。ｄｎｒＫ遺伝子を含んで いる１　、６ｋｂのＤＮＡ断片について得られたＤＮＡ配列と＋　Ｄｅｖｅｒｅ ｕｘ等が記載するＣ０ＤＯＮＰＲＥＦＥＲＥＮＣＥプログラム（Ｎｕｃｌ、　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：３８７（１９８４））によるこのＤＮＡ配列の分析 によって推定されるＣＯＭＴタンパク質のアミノ酸配列とを図３に示す。Ｃ０Ｄ ＯＮＰＲＥＦＥＲＥＮＣＥ及びＴＲＡＮＳＬＡＴＥ分析（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ等、 Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：３８７（１９８４）　）によって同定 したｄｎｒＫ読取り枠は、ＣＯＭＴタンパク質をコードする。

実施例２ でのｃｌｎｒＫ　−の　ベクターの ｄ　ｎ　ｒ　Ｋ　読取り枠仝休とある種のフランキング（ｆｌｉｎｋｉｎｇ）配 列とを含む１．６ｋｂの５ｐｈｌ／Ｐｖｕ［Ｉ　ＤＮＡ断片（図３）を、Ｓ　ｐ 　Ｉｔ　Ｉ及びＳ浦ａ１でＷｌ　／ヒしたν１Ｊｃ１９内にサブクローニングし て（Ｙａｎｓｃｈ−Ｉ’ｅｒｒｏｎ等、Ｇｅｎｅ　３３：１０３　（１９８５） 　）　、プラスミドｐＷＨＭ９０４　（図示せず）を得る。　ｄｎｒＫを含んで いる増幅すべき断片の両側の配列に対応する次の２個のオリゴデオキシヌクレオ チドブライマーを、製造業者の指示に従って＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ　３９１　ＤＮ＾合成器で合成する。

ｓｐｈ工　ＰＩＩｔ工 ３−−　ＡＣＣＧＣＴＡＧ　ＣＣＴ　ＧＡＣＧＡＧ　ＣＴＣＣＴＣＣＧＴＡＣＧ 　ＧＡＣＧＴＣＣＣＣ−５−＋フ９　イア　−９２（配列番号４） プライマー＃１を使用して、ｃｌｎｒＫ遺伝子の（ボールドフェースレターで示 す）第２、第３及び第６のコドンの各３番目の位ｉ？（即ち塩基〉を変えて、大 ＢｗＩのｄｎｒＫ遺伝子の発現を強めるための手段として高度に発現された大腸 ｒ：Ｍ遺伝子で最も頻繁に使用されるコドンにする。

これら２つのプライマーを使用して、ｐＨ１１Ｍ９０４のｄｎｒＫ配列を、スト レプトミセスＤＮＡとのポリメラーゼ連錯反応のための標準的な方法〔例えば、 Ｇｕｉｌｆｏｉｌｅ　ａｎｄ　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、　１７４：３６５９（１９９２）参照〕によって 、図３のヌクレオチド２０５　（ｄｎｒＫ　ｏｒｆの開始）から４４５まで増幅 させる。増幅した産生物から、８８ｂｐのＮｄｅｌ／Ｎｃｏｌ断片を切り出し、 これを残りのｄｎｒＫ遺伝子（図２及び図３）と、Ｎｄｅｌ／ＥｃｏＲＩで消化 したｐＴ７−７（Ｔａｂｏｒ　ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ八へ２　：１０７４　（１９８５））と を含んでいる（　ｐＨ１１Ｍ９０２から得た）　１．３ｋｂのＮｃｏｌ／Ｅｃｏ ＲＩ断片に連結させる。

その結果ｄｎｒＫ　ｏ＋（がこの大腸菌発現ベクターのＴ７遺伝子１０プロモー ターに融合する。大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞を、連結したＤＮＡで形質 転換し、形質転換細胞をｄｎｒＫをもつｐＴ７−７についてスクリーニングした 。得られたプラスミドをｐＷＨＭ９０３　（図４）と称する。

でのｄｎｋＫ　の アンピシリン（１００μｓ／ｍｌ　）とカナマイシン（５０ｔｚ　ｇ／ｍｌ　） とを含むＬＢ寒天（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎＦ ｉ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　ｅｄ、　Ｃｏ１ｄ　５ ｐｒｉｎ８Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９８９）上で、プラスミド ｐｃｐｔ−２を含んでいるコンピテント大腸菌細胞（Ｔａｂｏ＋・ａｎｄＲｉｃ ｈａｒｄｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、）を３０　’Ｃて増殖させた後に選択した。

ｐＧＰＩ−２を含んでいる大腸菌のコンピテント細胞の調製方法は、他の大腸菌 株の調製方法と同じである。但し培養物を３７℃ではなく、３０℃で維持する。

カナマイシンを含むＬＢ培地中にて３０℃で０Ｄｓｓｏ０．５〜０．６に増殖さ せた細胞がら、ｐにＰｉ−２を含む大腸菌のコンビテンｌ−細胞を調製する。１ 里ｐＧＰ１−２及びｐＷＨＭ９０３を含んでいる一個の形質転換細胞を、１００ μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０Ｊ、Ｌｇ／ＩＩＩのカナマイシンとを含む２５ ｍ１の２ｘＹＴ培地（５ａｌｌｌｂｒｏｏｋ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎ ｉＢ。

＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　ｅｄ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　 ＮＹ、　１９８９）に接種して、強く撹拌しながら３０°Ｃで一晩増殖させる。

翌朝、振盪水浴中、４２℃で３０分間培ｇ！物への熱ショックを行い、次いで３ ０”Ｃに下げる。更に９０分間インキュベートした後に、培養物１ｍｌをマイク ロ遠心分離器にて１４，０ＯＯｒｐ−で１分間遠心分離し、上清を捨てて、細胞 ペレットを１００ＪｉＩのＬａｅ＋ｒｍｌｉｌｌ衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａ ｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、　２２７：６８０（１９７０））に再度懸濁させ、 ５分間沸騰させる。沸騰した試料中に含まれるタンパク質を、標準的な方法（Ｌ ａｅｍ＋＊Ｉｉ、　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、　２２７：６８０（１９７ ０）　）を使用して１０％５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析し、ｄｎｋ Ｋ遺伝子を含まないｐＴ７−７ベクターで形質転換した大腸菌の細胞抽出物から 得たタンパク質と比較する。　ＣＯＭＴタンパク質はＭ、３８，７００に移動す る。

実施例３ ＣＯＭＴタンパ　゛い　、こ　ル≧ノマイシンか　ウノルビシンへの ｐＧＰｌ−２及びｐＨＩＩＭ９０３を含んでいる単一の大腸菌形質転換細胞を、 １００μｇ／ｅｉｌのアンピシリンと５０μｇ／輸１のカナマイシンとを含む２ ５ｍ　ｌの２　×ＹＴ培地に接種して、強く撹拌しながら３０℃で一晩増殖させ た。翌朝、振盪水浴中、４２℃で３０分間培養物への熱ショックを行い、次いで ５μｇ／＋ａ　Ｉのカルミノマイシンを加えた後に３０℃に下げる。培養物を更 に９０分間増殖させ、その後標準的な方法を使用してアントラサイクリン代謝物 を単覆し、ＨＰＬＣで分析する。ＨＰＬＣクロマトグラムでのカルミノマイシン とダウノルビシンとの信号ピークの相対面積を比較すれば、培地に加えたカルミ ノマイシンの７５〜８０％がダウノルビシンに変換されたことが分かる。

配列表 （１）一般情報・ （ｉ）出願人：　ＨｔｌＴＣＨＩＮＳＯＮ、　Ｃｈａｒｌｅｓ　ＲＭＡＤＤｔｌ ＲＩ、　Ｋｒ１ｓｈｎａ　Ｍ。

ＴＯＲＴＩ、　Ｆｒａｎｃｅｓｃａ ＣＯＬＯＭＢＱ　、＾ｎｎａ　Ｌ （ｉｉ）発明の名称：ダウノルビシンの製造方法（ｉｉｉ）配列の数：６ （ｉｖ）連絡のための住所。

（＾）宛名：　Ｎ１ｋａｉｄｏ、Ｍａｒｓｅｌｓｔｅｉｎ、　Ｍｕｒｒａｙ＆　 ０ｒａ− （Ｂ）通り＋　８５５　Ｆｉｆｔｅｅｎｔｈ　５ｔｒｅｅｔ　ＮＪ、　５ｕｉｔ ｅ　３３０（Ｃ）市＋　ｌｌａｓｈｉｎｇｔｏｎ （Ｄ）州・Ｄ、Ｃ。

（Ｅ）国：　Ｕ、Ｓ、＾。

（Ｆ）郵便番号：２０００５−５７０１（Ｖ）コンピューターの読取り可能形態 ：（＾）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューターＳ１ＮＰＣ（互換性）（Ｃ）オペレーティングシステム： 　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ １ｅａｓｅ　＃１．Ｏ。

Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５ （ｖｌ）本出願データ： （＾）出願番号：ＵＳ （Ｂ）出願日： （ＣＪ分Ｎ： （Ｖｉｉ）先頭データ： （＾）出願番号：　ＵＳ　７９３，８７３（Ｂ）出願日：　１９９１年１１月１ ８日（Ｖｉｉｉ）代理人の情報： （＾）氏名：　Ｃｈｉｎ、　Ｍｏｎ１ｃａ　Ｆ（Ｂ）登録番号：　Ｐ−３８，１ ０５ （Ｃ）参照／事件整理番号：　１６１５−１８１６ＣＩＰ（ｉｘ）電気通信情報 ： （＾）電話、　（２０２）６３８−５０００（Ｂ）テレファックス：　（２０２ ）６３８−４８１０（２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴・ （＾）長さ：　１８３２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｇの数二二木鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 ＜ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉ×）特徴： （＾）特徴を表す記号・ＣＤ５ （Ｂ）存在位置二２（１４，，１２７１ＣＧＣＣｒＣＣＣＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣ （：ＧＴ　ＡＣＣにＧＣＣＧＣＣＣＣＡＣＧ　ＴＡＣＧＡＧ　ＴＣＣＡｒｇ　６ １４ＧＡＧ　ＧＡＧ　Ｇ’！’Ｇ　ＣＧＧ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＣＣＧ　ＴＣＧ　 ＣＣＧ　Ａｃｅ　ＡＴＣＣＣＧ　ＴＡＣＧＡＣＣＴＣＴＣＧ　１Q３１ −Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　入ｒｇ　Ｇｉｎ　ＩＪ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｂａｒ　Ｐｒ ｏ　Ｔｈｒ　Ｉｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　入ｇｐ　Ｌａｕ　Ｓ≠■ ココＯココ５　コ４ｏ　コ４５ （２）配列番号２の情報： （１）配列の特徴： （＾）長さ・３５６アミノ酸 （Ｂ）１１１　二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列番号２の配列： 入ｒｑＴｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｍ　Ａｌａ　Ｌａｕ　入１ａ入１ａ　Ａｒｇ　Ｔｈ ｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＡｌａＡＨｐ　Ａｌａ　Ｐｒｏ 　ｃｘｙ　Ｇｌｕ　ｐｈ＊　’Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ＧＩ Ｙ　Ｇｌｕ　Ｌ＠ｕ　Ｌａｕ　Ａｌ■ Ａｇｐ　ＪＬＩＩＰ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇユｎ　ＡｒｇＡユａ 　Ｔｒｐ　Ｈ工Ｓ　入ｓｐ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｌ■ Ｚｏｏ　１０５　１１０ Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　１）ｒｏ　Ｔｈｒ　？ｆｒ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　工１ｍ 　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈａ　Ｔｙｒ　Ｇｌ■ １３０　λココ　１４゜ Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｊｕａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　！’ｒｅ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　入ｒ９ 人１ｍ　Ｓａｒ　Ｐｈａ　入ｇｐ　ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ人ユｍ　Ｃｙｓ　Ａ ｊｐ　Ｇｉｎ　Ａｊｐ　Ｖａｌ　入１ａ　ｌｉ’ｈａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｐｒｏ 　入１ａ　Ａｌａ　入１ａ　Ｔｙｒ　入唐■ ユ６５　１フ０　１７５ Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｓ＠ｒ　Ａ！ＩＰ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　人ｓｐ　Ｖａｎ 　ｖａｌ　にｌｕ　Ｇｌｙ　Ａ！！Ｐ　Ｐｈａ　Ｐｈａ　Ｇ撃■ ２２５　２コ０　２コ５　２４０ Ｌａｕ　入１ａ　入１ａ　Ｓａｒ　λｌａ　にｌｙ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　ＶＪＬＩ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　ＰｒB コ２５　ココＯ、ココ５ Ｓ龜ｒＰｒロ　Ｔｈｒ　Ｉｌａ　Ｐｌ”ｏ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　′ＩＡｕ　Ｓｅｒ 　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　ＩＪｕ　入１ａ　Ｐｒｏ　Ａｌ■ ｌミコ４　コ４５　コ５０ （２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ：６７塩基対 ＣＢ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 （１１）分子の型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列番号３の配列： （２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ＝３８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｇの数ニー重鎖 （０）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の型：ＤＮＡ （ｘｉ）配列番号４の配列： ｋｃｃＧｃＴｋＧｃｃ　ＴＧｋＣＧｋＧＣＴＣＣＴＣＣＧＴｋＣＧＧ　ｋｃＧＴ ｃｃｃｃ　、。

（２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ：４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の型：ＤＮＡ （ｘｌ）配列番号５の配列： ＡＴＧＡＣＣＧＣＴＧ　入ＡＣＣＧＡＣＣＧＴ　ＣＧＣＧＧＣＣＣＧＧ　ＣＣＧ ＣＡＧＣＡＧＡ　４６（２）配列番号６の情報： （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ：４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本領 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）分子の型、ＤＮＡ （ｘｉ）配列番号６の配列・ 入ＴＧ＾Ｃ入ＧＣＣＧ　入ＡＣＣＧＡＣＧＧ丁　ＣＧＣＧＧＣＣＣＧＧ　（：Ｃ ＧＣＡＧＣ入Ｇ入　４０ｄｕｋ遺伝子を含む９Ｗｌ１Ｍ９０２の制限マツプＳ 工 工 ｍｃＧＧｃＡαＩｔσ■℃ＴＡＧＧＧＣＡＴＧσｔＧＩＪＧＡＧｃＧＡＧＧＡＧ ｃ八ＧＧ入ＡｃｔズχｔＧα℃工 工 ＡＣＣＡＴＣＧＧＣＣＡＧＣ １６２１−一へ−−＝−−１６３０ ＴＧＧＴＡＧＣＣＧＧＴＣＧ カルミノマイシン４−０−メチルトランスフェラーゼの推定されるアミノ酸配列 （配列番号２） コ５１　ＰＡＡＴＧ八＊ ＦＩへ、４ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒに４６５） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１８５） （Ｃ１２Ｎ　９／１０ Ｃ１２Ｒ１：１８５） （ＣＩ　２Ｎ　９／１０ Ｃ１２Ｒ１：４６５） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ 、ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、Ｃ３，ＦＩ、ＨＵ。

ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、ＲＯ ，ＲＵ、５Ｄ （７２）発明者　トルティ、フランチェスカイタリー国、２０１２トミラン、コ ルソ・ガリバルデイ・ヌメロ・７０ （７２）発明者　コロンボ、アンナ・ルイーサイタリー国、２０１４４・ミラン 、ピア・エルバ・ヌメロ・１４

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．カルミノマイシン４−Ｏ−メチルトランスフエラーゼをコードする遺伝子を 含んでいる単離したＤＮＡ配列。
2. ２．図３のＤＮＡ全体を又はその一部分を含んでいる請求項１に記載のＤＮＡ配 列。
3. ３．カルミノマイシン４−Ｏ−メチルトランスフエラーゼをコードする遺伝子を 含んでいるベクター。
4. ４．プラスミドである請求項３に記載のベクター。
5. ５．ｐＷＨＭｇ０１、ｐＷＨＭ９０２及びｐＷＨＭ９０３からなる群の中から選 択される請求項４に記載のプラスミド。
6. ６．カルミノマイシン４−Ｏ−メチルトランスフエラーゼをコードする遺伝子を 含んでいるベクターを含んでいる形質転換した宿主細胞。
7. ７．前記ベクターがプラスミドである請求項６に記載の形質転換した宿主細胞。
8. ８．前記宿主細胞が大腸菌及びストレプトミセスからなる群の中から選択される 請求項７に記載の形質転換した宿主細胞。
9. ９．前記ベクターが、ｐＷＨＭ９０１、ｐＷＨＭ９０２及びｐＷＨＭ９０３から なる群の中から選択されたプラスミドである請求項６に記載の形質転換した宿主 細胞
10. １０．カルミノマイシン４−Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子 を発現するベクターで形質転換された細胞から得られた細胞抽出物。
11. １１．以下のアミノ酸配列：（配列番号２）【配列があります】 の全体を又はその一部分を含んでいる、カルミノマイシン４．−Ｏ−メチルトラ ンスフエラーゼ活性を示すペプチド。
12. １２．カルミノマイシン４−Ｏ−メチルトランスフエラーゼ活性を示すペプチド の製造方法であって、カルミノマイシン４−Ｏ−メチルトランスフエラーゼ活性 をコードする遺伝子を発現ベクター内に含有させ、適切な宿主細胞を前記発現ベ クターで形質転換し、該宿主細胞を適切な培地で培養し、このようにして得られ た前記遺伝子を発現させることからなる方法。
13. １３．前記宿主細胞が大腸菌及びストレプトミセスからなる群の中から選択され る請求項１２に記載の方法。
14. １４．前記ベクターがプラスミドである請求項１２に記載の方法。
15. １５．前記プラスミドが、ｐＷＨＭ９０１、ｐＷＨＭ９０２及びｐＷＨＭ９０３ からなる群の中から選択される請求項１４に記載の方法。
16. １６．カルミノマイシン４−Ｏ−メチルトランスフエラーゼをコードする遺伝子 を含んでいるベクターで適切な宿主細胞を形質転換し、該宿主細胞を適切な培地 で培養して、前記遺伝子を発現し、ダウノルビシンを回収することからなるダウ ノルビシンの製造方法。
17. １７．前記宿主細胞がストレプトミセス細胞である請求項１６に記載の方法。
18. １８．前記ベクターがプラスミドである請求項１６に記載の方法。
19. １９．前記プラスミドが、ｐＷＨＭ９０１、ｐＷＨＭ９０２及びｐＷＨＭ９０３ からなる群の中から選択される請求項１８に記載の方法。
20. ２０．カルミノマイシン４−Ｏ−メチルトランスフエラーゼ活性を示すペプチド を含んでいる調製物又は請求項６に記載の形質転換した宿主細胞を使用してカル ミノマイシンをダウノルビシンに変換する方法。
21. ２１．前記調製物が本質的に請求項１１に記載のペプチドからなる請求項２０に 記載の方法。
22. ２２．前記調製物が本質的に請求項１０に記載の細胞抽出物からなる請求項２０ に記載の方法。