FI93860C - Menetelmä antibioottien tuottamiseksi, siinä käyttökelpoisia DNA-jaksoja, yhdistelmä-DNA-konstruktioita ja näitä sisältäviä mikrobikantoja - Google Patents

Description

5 93860

Menetelmä antibioottien tuottamiseksi, siinä käyttökelpoisia DNA-jaksoja, yhdistelmä-DNA-konstruktioita ja näitä sisältäviä mikrobikantoja

Keksinnön kohteena on menetelmä, jossa tunnettujen mikro-organismien avulla, siirtämällä niihin määrättyjä geenejä tietyistä, rakenteeltaan lähisukuisia antibiootteja tuottavista mikrobikannoista, tuotetaan bioteknisesti sellai-10 siä antrasykliiniryhmän antibiootteja, joita nämä mikro-organismit eivät luontaisesti tuota. Keksinnön kohteena ovat myös tällaiseen menetelmään tarvittavat yhdistelmä-DNA-tekniikalla muodostetut mikro-organismit, yhdistelmä-DNA-konstruktiot ja niissä tarvittavat DNA-jaksot. Kek-15 sintö sijoittuu antibioottien bioteknistä tuottoa käsittelevälle alalle, ja koskee hybridiantibioottitekniikan soveltamista antrasykliiniryhmän antibiootteihin.

Hybridiantibiooteiksi kutsutaan molekyylejä, joissa sa-20 massa molekyylissä on rakennepiirteitä kahdesta sellaisesta antibiootista, joita yksi mikro-organismi ei luontaisesti tuota. Sellaisia molekyylejä voidaan periaatteessa ja joissain tapauksissa käytännössäkin tuottaa biotransformaatiolla, eli antamalla yhden mikro-organis-25 min tuottamaa antibioottia toiselle, molekyyliä muuttavalle mikrobille. Nimityksen käyttö on kuitenkin vakiintunut tarkoittamaan sitä, että yhden antibiootin biosyn-teettisiä geenejä siirretään yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla toista antibioottia tuottavaan mikrobiin, ja 30 jälkimmäinen mikrobi saadaan täten tuottamaan antibiootteja, joita sen paremmin se itse kuin geenien luovuttaja-kantakaan eivät luontaisesti tuota. Hybridiantibiootti-tekniikkaa kuvataan esim. H.G. Flossin julkaisussa "Hybrid antibiotics - the contribution of the new gene com-35 binations" (Trends in Biotechnology vol. 5, 1987, sivut 111-115) ja siinä mainituissa viitteissä.

2 93860

Antibioottimolekyyli syntyy sitä tuottavassa mikro-organismissa entsymaattisen reaktiotien vaikutuksesta, johon tyypillisesti kuuluu 10-20 entsyymiä. Ketjun ensimmäiset entsyymit käyttävät substraatteinaan solun aineenvaihdun-5 nan normaaleja välituotteita, mutta molekyylin edetessä reaktioketjussa siihen syntyy yleensä useita ns. primäärisen metabolian pohjalta tarkastellen varsin eksoottisia rakennepiirteitä. Tärkeä ominaisuus hybridiantibioottien aikaansaamisen kannalta on, että näillä entsyymeillä us-10 kotaan olevan suhteellisen vähäinen substraattispesifi-syys, so. että ne pystyvät käyttämään substraattinaan myös yhdisteitä, jotka poikkeavat rakenteeltaan alkuperäisessä mikrobissa esiintyvistä.

15 Toinen tärkeä ominaisuus, jonka antibioottien biosynteesin genetiikkaa koskeva tutkimus on osoittanut Streptomy-ces-mikrobisuvussa on se, että antibiootin biosynteetti-set geenit ovat klusteroituneita, eli että ne sijaitsevat mikrobin DNA:ssa lähellä toisiaan. Tämä on useissa ta-20 pauksissa mahdollistanut muiden antibiootin biosynteesiin osallistuvien geenien eristämisen, kun yksi biosynteesiin osallistuva geeni on voitu jollain menettelyllä tunnistaa.

25 Antrasykliinit ovat laaja yhdisteryhmä, joille yhteinen runkorakenne on 7,8,9,10-tetrahydro-5,12-naftaseenikino-ni, jolla on yleinen kaava I

R1 o R1 1 R1 o

30 r JL JL jL

vCyC^ · R4 o r6 r7

Tyypillisissä antrasykliineissä tähän runkorakenteeseen liittyy useita substituentteja, joista tärkeimmän ryhmän 35 3 93860 muodostavat eräät sokerijohdannaiset. Tämän keksinnön mukaisesti voidaan valmistaa erityisesti kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa RL ja R2 tarkoittavat vetyä, R, ja R6 tarkoittavat hydroksyyliä, R, on -CH2CH3, R,' on hydrok-5 syyli, R10 ja Ru tarkoittavat vetyä tai hydroksyyliä, ja sokeriosa R7 on rodosamiini tai rodosamiini-2-deoksi-L-fukoosi-L-cineruloosi A tai rodosamiini-2-deoksi-L-fukoo-si-L-cineruloosi B.

10 Useat antrasykliiniryhmän aineista ovat käytössä syto-staattisina lääkeaineina syövän hoidossa, kuten esimerkiksi daunorubisiini, doksorubisiini ja aklarubisiini. Antrasykliiniryhmän antibiootteja esitellään esim. A. Fujiwaran ja T. Hoshinon artikkelissa "Anthracycline 15 antibiotics" (CRC Critical Reviews in Biotechnology, voi. 3, 1986, sivut 133-157) ja siinä mainituissa viitteissä. Antrasykliinit kuuluvat ns. polyketidirakenteisiin antibiootteihin.

20 Antrasykliinien suhteellisen monimutkainen rakenne on jarruttanut uusien ja ominaisuuksiltaan parempien yhdisteiden kehittämistä. Suuri joukko antrasykliinejä on pystytty valmistamaan synteettisesti, mutta tärkeän uusien antrasykliinien lähteen on muodostanut myös niitä 25 tuottavien, pääasiassa Streptomyces-sukuun kuuluvien mikro-organismien seulonta maaperästä. Tämä menettely ei ole tyydyttävä, koska se ei mahdollista antrasykliinira-kenteen systemaattista muuttamista, vaan uusien antrasykliinien löytäminen on sattumanvaraista.

30

Hybridiantibioottien periaate näyttää mahdollistavan antrasykliinirakenteen systemaattisen muuntelun. Huolimatta siitä, että ensimmäiset hybridiantibiootit kuvattiin vuonna 1985 (Hopwood et ai., 1985b), vain harvoja 35 onnistuneita kokeita hybridiantibioottien aikaansaamiseksi on tähän mennessä kuvattu. Hutchinson et ai. (1989) luettelevat neljä julkaisua, joissa on kuvattu onnistunut 4 93860 menetelmä hybridiantibioottien tuottamiseksi. He osoittavat useita seikkoja, jotka saattavat estää hybridiantibioottien aikaansaamisen: Joitakin isäntiä ei mahdollisesti voida transformoida vieraalla DNA:11a restriktio- tai 5 ekspressioesteiden takia, vieraat geenit saattavat sisältämiensä säätelysekvenssien vaikutuksesta estää isännän antibioottien tuoton, tuotettu hybridiantibiootti saattaa olla toksinen isännälle, ja siirrettyjen geenien ekspres-sio saattaa vaatia kontrollitekijöitä, joita isännässä ei 10 ehkä ole. Tähän voidaan lisätä se yleinen ongelma, että on tunnistettava ja erotettava muista geeneistä ne geenit, jotka luovuttajassa osallistuvat antibioottien biosynteesiin. Lopuksi niiden entsyymien substraattispesifi-syys, joita koodittavat geenit siirretään, saattaa kui-15 tenkin olla niin tiukka, että isännässä tarjolla olevat substraatit eivät muunnu uusiksi yhdisteiksi.

Näinollen, vaikka voidaankin ennalta arvella, että siirtämällä biosynteesiin osallistuvia geenejä Streptomyce-20 sistä toiseen voitaisiin saada aikaan uusia yhdisteitä, ei ole ennalta pääteltävissä, mitä aikaansaadaan, ja onnistuuko koe ylipäänsä. Siten sellaisen geenijakson tunnistaminen ja yhdistelmä-DNA-konstruktion rakentaminen, joiden avulla sopivaa isäntää käyttämällä onnistu-25 neesti saadaan hybridiantibiootteja, on merkittävä ja . teollisesti käyttökelpoinen keksintö.

Olemme nyt keksineet menetelmän, jolla eräät antrasyk-liinejä tuottavat Streptomyces-suvun mikro-organismit 30 saadaan tuottamaan niille uusia antrasykliiniantibioot-teja. Olemme siirtäneet niihin jäljempänä kuvattavalla tavalla tunnistettavia, rodomysiinejä tuottavista Strep-tomyces purpurascens-lajiin kuuluvista mikro-organismeista peräisin olevia DNA-jaksoja soveliaana yhdistelmä-DNA-35 konstruktiona ja yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen.

4 5 93860 Lähtökohtana pyrkimyksellemme löytää DNA-jaksoja, joilla voitaisiin saada aikaan antrasykliiniryhmän hybridianti-biootteja, oli Malpartida et al.:n (1987) havainto, että polyketidirakenteisten antibioottien biosynteettisissä 5 geeneissä on merkittäviä samankaltaisuuksia, jotka saattavat mahdollistaa muiden polyketidiantibioottien biosyn-teettisten geenien eristämisen, kun on käytettävissä yhden polyketidiantibiootin biosynteettisten geenien määrätty, eri lajien välillä samankaltaisen DNA-jakson 10 sisältävä koetin, jota käytetään DNA-hybridisaatioteknii-kassa. Tällä menettelyllä ei kuitenkaan löydetä biosyn-teettisiä geenejä luotettavasti, vaan esim. Stutzman-Engwall ja Hutchinson (1989) löysivät tällä menettelyllä S. peucetiuksesta viisi eri geenialuetta, jotka sisälsi-15 vät actl-koettimelle homologisia alueita: näistä vain yhden on osoitettu sisältävän doksorubisiinin biosynteet-tiset geenit. Mainittakoon, että jäljempänä kuvattava acm-koetin tunnistaa S. peucetiuksesta juuri tämän geeni-alueen viidestä mahdollisesta.

20

Eri antrasykliinien biosynteeseille on julkaistujen tietojen perusteella ominaista, että biosynteesissä syntyy ensin aklavinoni-niminen antrasykliiniaglykoni, josta sitten muut antrasykliinit syntyvät useiden modifioivien 25 entsyymien aktiivisuuden seurauksena. Näin ollen päättelimme, että sovelias isäntämikrobi, johon siirrettyinä näiden modifioivien entsyymien ilmeneminen voitaisiin havaita, olisi aklavinonin glykosideja tuottava Strepto-royces-kanta. Soveliaiksi mikrobikannoiksi osoittautuivat 30 Streptomyces galilaeus ATCC 31615 ja ATCC 31133.

Valittaessa mikrobikantaa, josta modifioivien entsyymien geenejä yritettäisiin siirtää, päädyimme Streptomyces purpurascens-mikrobilajiin, koska sillä oletetaan olevan 35 useita aglykoniosaa modifioivia entsyymiaktiivisuuksia, nimittäin asemia 1, 10 ja 11 modifioivat aktiivisuudet, ja nimenomaan asemaa 10 koskevia modifikaatioita näytti 6 93860 puuttuvan tunnettujen aglykonien joukosta. Näinollen geenien luovuttajakannaksi valittiin S. purpurascens ATCC 25489, joka on S. purpurascens-lajin tyyppikanta.

5 Strategia, joka johti tässä hakemuksessa kuvattujen DNA-jaksojen löytämiseen, oli siten seuraava: Eristetään S. purpurascensista Malpartida et ai.:n kuvaaman actl-alueen kanssa homologinen alue, siirretään sitä ympäröivältä alueelta DNA-jaksoja S. galilaeukseen, kasvatetaan näin 10 saatuja yhdistelmä-DNA-kantoja olosuhteissa, joissa isäntäkanta luontaisesti tuottaa antibioottia, ja analysoidaan tuotetut antibiootit sen selvittämiseksi, saako jokin DNA-jakso aikaan uusien yhdisteiden tuottoa. Koettimena käytettiin em. actl-alueen osaa, josta käytetään 15 merkintää actIO.8.

Kun Southern-tekniikalla membraanille siirrettyihin S. galilaeus- ja S. purpurascens-DNA:ihin hybridisoitiin actI0.8-koetin, havaittiin S. galilaeus-DNA:n antavan 20 selvän signaalin, joka vastasi n. 3 kb:n BamHI-fragment-tia. S. purpurascens sensijaan antoi kohtalaisen heikon signaalin, joka vastasi n. 8 kb:n BamHI-fragmenttia.

Koska geenien kloonauksessa heikon ristihybridisaation avulla voi esiintyä vaikeuksia, eristettiin biosynteetti-25 set geenit S. purpurascensista eristämällä ensin actl:tä vastaava DNA-jakso S. galilaeuksesta. ja käyttämällä tätä sitten koettimena, olettaen että se rakenteellisesti lähempänä olevan antibiootin biosynteettisenä fragmenttina antaisi paremman hybridisaatiosignaalin (Kuva 1).

30 S. galilaeuksesta eristetty act10.8:n kanssa homologinen alue, josta käytettiin merkintää acm, osoittautui hyvin käyttökelpoiseksi koettimeksi ainakin joidenkin antrasyk-liinien biosynteettisiä geenejä eristettäessä. Paitsi 35 tässä hakemuksessa kuvatut, hybridiantibiootteja aikaansaaneet geenit, tunnisti tämä koetin S. peucetiuksesta spesifisesti doksorubisiinin biosynteettiset geenit, 7 93860 jotka Stutzman-Engwall ja Hutchinson (1989) ovat kuvanneet.

Kun Southern-hybridisaatio toistettiin käyttäen acm-koe-5 tinta, S. purpurascens-DNA:n todettiin antavan selvän hybridisaatiosignaalin, joka vastasi n. 8 kb:n BamHI-fragmenttia. Tämän signaalin antavan DNA-jakson ympäriltä eristettiin useita DNA-jaksoja, jotka siirrettiin samankaltaisella menettelyllä kuin jäljempänä esimerkkiosassa 10 on kuvattu, S. galilaeukseen. Testatuista DNA-jaksoista kuitenkin ainoastaan keksinnön kohteena oleva jakso aikaansai uusien yhdisteiden tuottoa.

Keksinnön mukaiset kannat voidaan toisintaa seuraavan 15 kuvauksen mukaisesti; lisäksi keksinnön toisinnettavuus on varmistettu tallettamalla keskeiset mikrobikannat ja plasmidit Budapestin sopimuksen mukaiseen talletuslaitokseen. Alan ammattimiehelle on selvää, että yhdistelmä-DNA-tekniikassa käytettävät työvaiheet ovat sinänsä 20 tunnettuja, mutta keksinnöllisyys piilee siinä, että nämä vaiheet toteutetaan määrätyn strategian mukaisesti uuden tuloksen aikaansaamiseksi. Ammattimiehelle on myös selvää, että yksittäisten vaiheiden toteuttamiseen on usein kuvattu vaihtoehtoisia menetelmiä, joilla hyvää ammatti-25 taitoa noudattaen voidaan tässä kuvauksessa esitettyjä vaiheita korvata.

Tämän keksinnön kohteena on siten menetelmä antrasyk-liiniryhmän hybridiantibioottien tuottamiseksi, jossa 30 menetelmässä antrasykliinejä tuottavasta Streptomyces pur-purascens-kannasta eristetään DNA-jakso, jolla saadaan aikaan antrasykliiniryhmän hybridian-35 tibioottien ekspressio, 8 93860 rakennetaan tämän DNA-jakson sisältävä yhdis-telmä-DNA-konstruktio, transformoidaan saatu yhdistelmä-DNA-konst-5 ruktio aklavinonin glykosideja tuottavaan

Streptomyces galilaeus-isäntään, viljellään saatua transformoitua kantaa olosuhteissa, joissa isäntäkanta luontaisesti 10 tuottaa antibioottia, ja otetaan talteen muodostunut hybridiantibioot-ti.

Tämän keksinnön kohteena on myös mainittu Streptomyces 15 purpurascens-bakteerista eristetty DNA-jakso, joka saa aikaan kuvattujen hybridiantibioottien tuoton.

Erityisesti keksinnön kohteena on antrasykliiniryhmän hybridiantibioottien aikaansaamisessa käyttökelpoinen DNA-20 jakso, joka on kuvassa 4 esitetyn, Streptomyces galilaeus -kannassa (DSM 6403) talletetun plasmidin pH2008 kahden EcoRI-restriktioendonukleaasin tunnistuskohdan välinen noin 12000 emäsparin mittainen jakso tai sen funktionaalinen osa. Keksinnön kohteena on myöa tämän jakson sisäl-25 tävä yhdistelmä-DNA-konstruktio.

Mainittu yhdistelmä-DNA-konstruktio voidaan rakentaa liittämällä tällainen DNA-jakso keksinnön mukaisesti sopivaan vektoriin, joka on edullisesti Streptomyces-30 suvun mikro-organismeissa monistuva vektori, esimerkiksi plasmidi pIJ486 (Ward et ai., 1986). Kun tällainen yhdis-~ telmä-DNA-konstruktio transformoidaan S. galilaeus-isän tään, edullisesti sellaiseen, joka tuottaa aklavinonin glykosideja, erityisesti edellä mainittuihin S. galila-35 eus-kantoihin, saadaan aikaan antrasykliiniryhmän antibiootteja tuottava Streptomyces-kanta.

9 93860

Tuotetut yhdisteet ovat uusia antrasykliiniantibiootteja, joille voitiin osoittaa sytostaattinen aktiivisuus (esimerkki 12). Täten nämä keksinnön mukaiset yhdisteet ovat mielenkiintoisia yhdisteitä edelleen kehitettäväksi 5 mahdollista kliinistä käyttöä varten. Näiden yhdisteiden tuottaminen muulla menetelmällä kuin hybridikantaa ferment o ima 11a on huomattavan vaikeaa.

Seuraavassa esitetään esimerkkinä keksinnön mukaisista 10 edullisista suoritusmuodoista yksityiskohtaisesti keksinnön mukaisen DNA-jakson eristäminen S. purpurascens-kannasta ATCC 25489, hybridiantibioottien tuotto saadun kannan avulla sekä tuotettujen hybridiantibioottien aglykoniosien puhdistus ja rakenneanalyysi. Paitsi kuvat-15 tujen ominaisuuksien perusteella, voidaan tämä ATCC

25489:n hybridien tuoton aikaansaava DNA-jakso tunnistaa siitä, että se restriktiokartassa (kuva 3) olevasta vasemmalta lähtien neljännestä BamHI-tunnistuskohdasta alkaen sisältää nukleotidisekvenssin:

1 GATCCCTATG CCAGAGCACC GTCAGCAACG GGCNCTCCGC ATGGGCGTGA 51 TCGGCACGGC GAACATCGCG ATTCGCCGGA TCATGCCCGT GCNCNCCGCG 101 CATGACCACG TCGACCTTGT CGCGGTGGCC AGCCGGGACA AGGCCCGGGC 151 CGAGCGGGTG GGGGCCGCTT TCGGCTGCGG TGGCGTGGGG GATTACGCGG 201 CGCTCGTCGA GCGGACGACC TTGACNCGTC TATATTCCGC TGCCGCCCGG 251 CATGCATCAC GAGTGGGCGC TGCGGGCTTT GCGTTCGGGA AAGCACGTGC 301 TGGTCGAGAA ACCGATGTCG GACACGTACG AGAAAACTCT CGAGCTGATG 351 TCGACCGCGT CGGAACTCGG ACTCGTGCTC GCCGAGAACT TCATGTTCCT 401 GCACCATTCC CAGCACGCNG CGGTACNNCG ATGCTCGACG AGTCCGTGGG 451 AGAACTGCGG CTCTTCTCCN GNNCGTTCNC CGTNNGCCGC TGGCACCCGA 501 GTGTTCCGGT ACCAG

jossa N tarkoittaa yhtä tai useampaa nukleotidia, joita ei ole tunnistettu.

10 93860

Lvhvt kuvaus piirustuksista

Kuva 1 Kaaviollinen esitys menettelystä, jolla poly-ketidiantibioottien biosynteettisten geenien 5 konservoituneelle alueelle actl homologinen alue tunnistettiin S. purpurascens-DNA:sta.

Kuva 2 Plasmidin pIJ2345 restriktiokartta.

10 Kuva 3 Restriktiokartta S. purpurascensista kloona tuista rdm-klooneista ja niiden kattamasta kromosomin osasta, acm-koettimen tunnistama alue merkitty varjostettuna.

15 Kuva 4 Plasmidin pH2008 restriktiokartta.

Kuva 5 Ohutlevy aglykoniseosta fraktioitaessa saa duista fraktioista.

20 Kuva 6 Aglykonin IV protoni-NMR-spektri ja rakenne

Kuva 7 Aglykonin IV massaspektri (kemiallinen io- nisaatio, negatiiviset ionit) 25 Kuva 8 Hybridiglykosidi IVT:n protoni-NMR-spektri ψ

» I

Kuva 9 Hybridiglykosidi IVT:n massaspektri Käytetyt liuokset ia elatusaineet 30 SGYEME litraa kohti

Hiivauute (Difco) 3 g

Bacto-peptoni (Difco) 5 g

Mallasuute (Oxoid) 3 g 35 Glukoosi 10 g

Sakkaroosi 100 g 11 93860

Steriloidaan autoklavoimalla 20 min 121 °C. Autoklavoin-nin jälkeen lisätään steriiliä 2M MgCl2-liuosta 2 ml litraa kohti ja steriiliä 10%:ista glysiiniliuosta 50 ml litraa kohti.

5

LYSOTSYYMILIUOS

Sakkaroosi 0,3 M

Tris (tris-hydroksimetyyliaminometaani) pH 8, 25 mM 10 EDTA (etyleenidiaminotetraetikkahappo) pH 8, 25 mM

Lysotsyymi (Sigma) 2 mg/ml

FENOLISEOS

15 Fenoli (Ultrapure, Gibco BRL) 500 g 8-hydroksikinoliini 0,5 g

Kyllästetään 50 mM Tris-HCl-puskurilla, pH 8 20 "2 * KIRBY MIXTURE"

Natrium-tri-isopropyylinaftaleenisulfonaatti (Fluka) 2 g Natrium-4-aminosalisylaatti 12 g 2 M Tris-HC1-puskuri pH 8, 5 ml 25 Fenoliseos 6 ml H20 ad 100 ml

FENOLI-KLOROFORMI

30 Fenoliseos 50 ml

Kloroformi 50 ml *' Isoamyylialkoholi 1 ml

TE

Tris-HCl-puskuri, pH 8,0 10 mM

EDTA, pH 8,0 1 mM

35 5 12 93860

SSC

Käytetään eri laimennoksia, kuten 2 * SSC, 6 * SSC jne, jotka valmistetaan kantaliuoksesta 20 * SSC: 20 * SSC litraa kohti

NaCl 175,3 g

Na-sitraatti 88,2 g 10 pH säädetään 7:ään NaOH:lla; steriloidaan autoklavoimal-la.

DENHARDTIN LIUOS (Maniatis et ai., s. 448) 15

Kantaliuos 50 *:

Ficoll^ (Pharmacia) 5 g

Polyvinyylipyrrolidoni 5 g

Naudan seerumin albumiini 5 g 20 Tisl. vesi ad 500 ml

Suodatetaan 0,45 μιη steriilin suodattimen läpi, jaetaan 5 ml eriin ja säilytetään pakasteessa -20 °C.

25 El-ELATUSAINE

Litraa kohti:

Glukoosi 20 g 30 Liukoinen tärkkelys 20 g

Pharmamedia^ 5 g

Hiivauute 2,5 g K2HP04 . 3H20 1,3 g

MgS04 . 7H20 1 g 35 NaCl 3 g

CaC03 3 g 13 93860

Sekoitetaan vesijohtoveteen ja säädetään pH 7,5:een NaOHrlla. Steriloidaan autoklavoimalla.

5 ESIMERKKI l. Koettimen valmistus

Malpartida et ai.:n julkaisussa kuvattu actl-koetin, eli actl-alueesta peräisin oleva 2,2 kb:n (=kilobase, tuhatta emäsparia, DNA:n molekyylipituuden mittayksikkö) BamHI-10 fragmentti vektorissa pBR329 = pIJ2345, saatiin professori D. A. Hopwoodilta (John Innes Institute, Norwich, UK). Koettimena käytettiin 0,8 kb:n kokoista BglII-fragment-tia. Restriktiokartta plasmidista pIJ2345 on esitetty kuvassa 2.

15

Plasmidin pIJ2345 sisältävää E. coli-kantaa W 5445 kasvatettiin, plasmidi eristettiin siitä neutraalin SDS-hajo-tuksen avulla (Maniatis et ai., s. 92) ja plasmidi puhdistettiin cesiumkloridi-etidiumbromidigradienttisentri-20 fugoinnin avulla (Hopwood et ai. 1985a, s. 83, vaiheet 17-21). Gradientista otettu plasmidifraktio uutettiin isopropanolilla ja saostettiin etanolilla (Hopwood et ai. 1985a, s. 127).

25 0,8 kb:n BglII-fragmentti eristettiin digestoimalla edellä valmistettua pIJ2345-plasmidia BglII-endonukleaa-silla (Boehringer Mannheim tai New England Biolabs) valmistajan ohjeen mukaan, sekä erottamalla fragmentti lopusta plasmidista preparatiivisella agaroosigeelielekt-30 roforeesilla (Hopwood et ai. 1985a, s. 137). Geelistä irtileikattu fragmentti puhdistettiin agaroosista käyttäen GeneClean-reagenssisarjaa (Bio 101) valmistajan ohjeen mukaan.

35 Hybridisaatiota varten noin 100 ng eristettyä koetinfrag-menttia leimattiin a32P-deoksiadenosiinifosfaatilla (New England Nuclear NEG-021H, 3000 Ci/mmoolia) käyttäen 14 93860

Boehringer Mannheimin random prime-leimausreagenssisarjaa valmistajan ohjeen mukaan. Leimattu DNA erotettiin radioaktiivisesta nukleotidista Nick-kolonnilla (Pharmacia) valmistajan ohjeen mukaan.

5 ESIMERKKI 2. Kokonais-DNA;n eristys Streptomyces- kannoista

Streptomyces-kannat ATCC 31615 ja ATCC 25489 saatiin 10 American Type Culture Collectionilta. Kokonais-DNA:n eristystä varten niitä kasvatettiin 50 ml:ssa SGYEME-elatusainetta 250 ml:n erlenmeyer-pulloissa, joita ravisteltiin 250 rpm:n kierrosnopeudella 28,5 °C:ssa noin 50 tunnin ajan.

15

Kokonais-DNA eristettiin seuraavalla tavalla, joka on muutettu Hopwood et ai.:n kuvaamasta (Hopwood et ai. 1985a, s. 77).

20 Kasvusto erotettiin sentrifugoimalla 10 min ajan noin 3000 g:ssä, suspendoitiin uudelleen 3 ml:aan lysotsyymi-liuosta ja inkuboitiin 10 min. 37 °C:n vesihauteessa. Lisättiin 4 ml reagenssia "2 * Kirby mixture" ja sekoitettiin varovasti putkea kääntelemällä noin l min. ajan. 25

Lisättiin 8 ml fenoli-kloroformia, sekoitettiin kuten edellä ja sentrifugoitiin 10 min. ajan noin 3000 g:ssä. Siirrettiin putkesta ylempi vesifaasi avokärkisellä pipetillä toiseen koeputkeen, jossa oli 3 ml fenoli-30 kloroformia ja sekoitettiin ja sentrifugoitiin kuten edellä. Siirrettiin vesifaasi avokärkisellä pipetillä toiseen koeputkeen, lisättiin 1/10 vesifaasin tilavuudesta 3 M natriumasetaattia, jonka pH oli säädetty arvoon 6 etikkahapolla, ja sekoitettiin. Tämän jälkeen vesifaasin 35 päälle pipetoitiin varovasti yhtä suuri tilavuus isopropanolia ja vesi- ja isopropanolifaasin rajapintaan saostuva suurimolekyylinen DNA "kehrättiin" varovasti sterii- 15 93860

Iin lasisauvan ympärille. Lasisauva DNA-saostumineen siirrettiin toiseen koeputkeen, jossa oli 7 ml 70%:ista etanolia, saostuma irrotettiin lasisauvasta tyhjään koeputkeen, ja sitä kuivattiin vakuumieksikkaattorissa 5-10 5 min. DNA liuotettiin 1-2 ml:aan TE:tä. Sen konsentraatio ja molekyylikoko mitattiin ajamalla näytteestä agaroosi-geelielektroforeesiajo (Hopwood et ai. 1985a, s. 136, puskuri TAE, 0,3 - 0,6 % agaroosi 4 V/cm).

10 ESIMERKKI 3. Southern-hvbridisaatio DNA:n siirto hybridisointimembräänille

Edellä eristettyjä Streptomyces-DNA-preparaatteja diges-15 toitiin BamHI-endonukleaasilla (Boehringer Mannheim tai

New England Biolabs) valmistajan ohjeen mukaan, ja diges-tit fraktioitiin agaroosigeelielektroforeesilla (Hopwood et ai. 1985a, s. 137, TAE-puskuri, 0,8 % agaroosi, 0,5 V/cm, ajoaika 16 tuntia).

20

Fraktioitu DNA siirrettiin geelistä Hybond N-membraanille (Amersham) käyttäen VacuGene-laitetta (LKB 2016, Pharmacia LKB Biotechnology) valmistajan ohjeen mukaan (Preliminary Instruction Manual, LKB 2016 VacuGene Vacuum Blot-25 ting System, n:o 90 02 5378, Pharmacia LKB Biotechnology AB, Bromma, Sweden) niillä muutoksilla että depurinointi suoritettiin 10 min. ajan (ohjeessa 4 min.), denaturointi 15 min. (3 min.), neutralointi 15 min. (3 min.) ja siirto 1 h (20-60 min.). Membraani, jolle DNA oli siirretty, 30 pestiin 2 * SSC:llä, kuivattiin huoneenlämmössä ja valotettiin UV:11a DNA:n kiinnittämiseksi 2 min. ajan LKB 2011 Macro Vue Transilluminatorilla (Pharmacia LKB Biotechnology) .

« » 16 93860

Hybridisointi

Hybridisoitavat membraanit suljettiin muovipussiin (Hyb-aid) kuumasaumaamalla. Valmistettiin n. 50 ml esihybri-5 disaatioliuosta: 1 % Na-dodekyylisulfaatti 1 M NaCl 5 * Denhardtin liuos 10

Hybridisaatiopussi täytettiin sellaisella määrällä esi-hybridisaatioliuosta, että siitä saatiin helposti poistettua ilmakuplat, ja esihybridisaatioliuos kaadettiin pussista mitta-asteikolla varustettuun astiaan. Kantaja-15 DNA:ta (DNA from calf thymus, Boehringer Mannheim 104 167) denaturoitiin sellainen määrä, että esihybridisaa-tioseoksessa konsentraatioksi tuli 100 hg/ml kuumentamalla kiehuvassa vesihauteessa 10 min. ajan sekä jäähdyttämällä jäähauteessa 5 min. ajan. Denaturoitu kantaja-DNA 20 lisättiin esihybridisaatioliuokseen, joka palautettiin hybridisaatiopussiin, poistettiin ilmakuplat mahdollisimman tarkkaan ja esihybridisoitiin 65 °C:ssa ravistelevassa vesihauteessa vähintään 6 h.

25 Leimattu koetin lisättiin samansuuruiseen määrään kantaja-DNA: ta kuin edellä ja denaturoitiin samoin. Esihybri-disaatioseos otettiin pois pussista ja denaturoitu koetin sekä kantaja lisättiin siihen. Seos palautettiin pussiin, poistettiin ilmakuplat ja hybridisoitiin yli yön samoissa 30 olosuhteissa kuin esihybridisaatio.

Pesu ja autoradiografia

Hybridisaatioseos poistettiin pussista ja tilalle pantiin 35 100 ml pesuliuosta:

• I

17 93860 1 % Na-dodekyylisulfaatti

2 * SSC

Sekoitettiin, kaadettiin pesuliuos pois ja toistettiin 5 pesu. Tämän jälkeen pussiin otettiin 300 ml pesuliuosta ja ravisteltiin 30 min. 65 °C:ssa vesihauteessa. Kaadettiin pesuliuos pois ja toistettiin. Membraanit levitettiin lasilevyille ja peitettiin muovikelmulla. Autora-diografia suoritettiin panemalla päällekkäin muovikelmun 10 suojaama membraani, autoradiografiafilmi (Hyperfilm-MP, Amersham) ja vahvistuslevy (Cronex Quanta Fast Detail, Dupont) sekä valottamalla 1-2 vrk -80 °C:ssa.

ESIMERKKI 4. Geenipankin valmistaminen S. aalila- 15 eus-DNA:sta

Edellä kuvatulla tavalla valmistetusta S. galilaeus-DNA:sta valmistettiin geenipankki λ-vektoriin EMBL3. DNA digestoitiin osittain 5au3A-endonukleaasilla (Maniatis et 20 ai., s. 282-285) ja fraktioitiin sakkaroosigradientti-sentrifugoinnilla saman ohjeen mukaan. Noin 20 kb:n kokoinen DNA-fraktio ligatoitiin vektorin kanssa (EMBL3 BamHI Arms Cloning System, Promega Biotech.) valmistajan ohjeen mukaan ja pakattiin λ-partikkeleiksi saman valmis-25 tajän Packagene-reagenssisarjaa käyttäen valmistajan ohjeen mukaan. Isäntänä käytettiin Escherichia coli~ kantaa GM2163 (E. coli Genetic Stock Center, Department of Biology 255 OML, Yale University, New Haven, USA). Isäntäsolut valmistettiin infektointia varten Maniatis et 30 al.:n (s. 63) ohjeen mukaan. Isäntäsolut infektoitiin saadulla pakkausseoksella ja levitettiin maljoille Prome-gan ohjeen mukaan.

E8IMERKKI 5. acm-iakson eristäminen geenipankista 150 mm maljoilta, joilla oli infektoituja isäntäsoluja niin, että λ-faagin muodostamia plakkeja oli n. 10000 35 18 93860 kpl/malja immobilisoitiin faagi-DNA Colony/Plaque Screen (New England Nuclear) membraaneille valmistajan ohjeen mukaan siten, että kustakin maljasta valmistettiin kaksi membraania. Näin saadut membraanit hybridisoitiin ja 5 autoradiografoitiin käyttäen actIO.8-koetinta, kuten edellä on kuvattu. Sellaiset plakit, jotka antoivat molemmilta membraaneilta positiivisen signaalin autoradio-grafiassa, poimittiin erilleen ja niistä eluoitiin faagit (Maniatis et ai., s. 64).

10

Puhtaiden positiivisten faagipopulaatioiden saamiseksi kustakin kandidaatista valmistettiin laimennos, joka antoi n. 300 plakkia/malja infektoitaessa E.coli-isäntä-kanta LE392 (Promega), immobilisoitiin faagi-DNA membraa-15 neille kuten edellä ja hybridisoitiin kuten edellä. Kutakin kandidaattia kohti poimittiin yksi selvästi erillinen plakki, josta eluoitiin faagit, ja infektoitiin isäntä-kanta LE392 sellaista laimennosta käyttäen, että saatiin maljoille ns. konfluentti lyysis. Näistä maljoista val-20 mistettiin faagikantaliuokset, joiden tiitteri eli faagi-en konsentraatio määritettiin (tyypillisesti 1010/®1).

Kustakin näin saadusta kloonista valmistettiin λ-faagia % litran mittakaavassa infektoimalla NM538-isäntä (Promega) 25 Maniatis et al.:n ohjeessa s. 77-78 kuvatulla tavalla. Lysaatista puhdistettiin X-faagi-DNA Kaslow:n (1986) menetelmällä sillä muutoksella, että faagi-DNA seostettiin polyetyleeniglykolin sijasta isopropanolilla (Hop-wood et ai. 1985a, s. 124).

30 ESIMERKKI 6. acm-koettimen valmistus

Saatujen kloonien X-DNA:ta digestoitiin BamHI-endonukle-aasilla ja se fraktioitiin agaroosigeelielektroforeesil-35 la, siirrettiin membraanille ja hybridisoitiin käyttäen actI0.8-koetinta kuten edellä on kuvattu kromosomaalisel- 19 93860 le DNA:lie. Yksi klooneista, josta käytettiin nimitystä X-acm5, antoi n. 3 kb:n BamHI-fragmentin, joka antoi selvän hybridisaatiosignaalin; muilla positiivisilla klooneilla hybridisoituva fragmentti ei irronnut vektorista 5 BamHI-endonukleaasilla.

X-acm5-DNA:ta digestoitiin BamHI-endonukleaasilla ja digesti fraktioitiin preparatiivisella agaroosigeeli-elektroforeesilla. 3 kb:n BamHI-fragmentti eristettiin ja 10 puhdistettiin kuten edellä on kuvattu, ja ligatoitiin se BamHI-endonukleaasilla avattuun plasmidivektoriin pBR322 (Bolivar et ai., 1977 ja Sutcliffe, 1978) (Maniatis et ai., s. 391). Plasmidi on yleisesti saatavana, mm. American Type Culture Collectionin E. coli-kannassa ATCC 15 37017.

Ligaatioseoksella transformoitiin kompetentit E. coli HBlOl-solut (Hopwood et ai. 1985a, s. 120) ja saatujen transformanttien joukosta etsittiin 3 kb BamHI-fragmentin 20 sisältävä klooni valmistamalla klooneista plasmidi-DNA:ta pienessä mittakaavassa (Hopwood et ai. 1985a, s. 85), digestoimalla näytteet BamHI-endonukleaasilla ja tunnistamalla insertin omaavat kloonit agaroosigeelielektrofo-reesilla. Insertin sisältävä plasmidi nimettiin pacm5:k-25 si, ja sitä valmistettiin suuressa mitassa, kuten edellä on kuvattu plasmidin pIJ2345 kohdalla. Koetin, josta käytetään lyhennettä acm, on plasmidin pacm5 sisältämä 3 kb:n BamHI-fragmentti, joka eristettiin vastaavalla tavalla kuin actIO.8-koetin pIJ2345:stä.

30 ESIMERKKI 7. Geenipankin valmistus S. purpuras- cens-DNA:sta S. purpurascens-DNA:sta valmistettiin geenipankki edellä 35 S. galilaeukselle kuvatulla tavalla, kuitenkin siten, että käytetty vektori oli X-EMBL4, ja vektoripreparaatti- 20 93860 na käytettiin "X-EMBL4 BamHI Arms", RPN.1254X, Amersham International pic.

ESIMERKKI 8. S♦ purpurascens-geenioankin seulonta 5 ia kloonien kartoitus S. purpurascens-geenipankista seulottiin positiivisen hybridisaatiosignaalin antavat kloonit samalla menettelyllä kuin edellä on kuvattu S. galilaeus-geenipankin 10 osalta käyttäen acm-koetinta, kloonit puhdistettiin ja niistä valmistettiin faagikantaliuokset. Klooneista valmistettiin λ-DNA:ta edellä kuvatulla tavalla, ja kloonit kartoitettiin eräiden restriktioendonukleaasien tunnis-tuskohtien suhteen (Maniatis et ai., s. 374-378). Näin 15 saatu kartta klooneista, jotka nimettiin lyhenteellä rdm ja järjestysnumerolla, on esitetty kuvassa 3.

ESIMERKKI 9. S. purpurascens-DNA-iaksoien siirto S. aalilaeukseen ia hvbridiantibioot-20 tien tuottajan löytyminen

Saatujen kloonien inserttejä ryhdyttiin siirtämään Strep-tomyces galilaeukseen mahdollisten uusien tuotteiden havaitsemiseksi. Koska S. galilaeuksella on ilmeisesti 25 varsin voimakas restriktiosysteemi, ei ollut mahdollista transformoida ligaatioseoksia suoraan S. galilaeukseen, vaan kloonit täytyi ensin siirtää helposti transformoituvaan Streptomyces-isäntään, jona käytettiin S. lividans TK24 (Hopwood et ai. 1985a, s. 266 ja Kieser et ai.

30 1982), joka saatiin professori D.A. Hopwoodilta John

Innes Institutesta (Norwich, UK).

Rekombinanttifaagi X-rdm6 digestoitiin JFcoRI:llä (Boeh-ringer Mannheim) valmistajan ohjeen mukaisesti. N. 12 35 kb:n insertti ajettiin erilleen käsivarsista 0,5%:isella SeaPlaque LGT-agaroosi-geelillä (FMC Corporation) 8 V:n jännitteellä yli yön. Insertti-DNA otettiin talteen gee- 21 93860 listä GeneClean-reagenssisarjaa (Bioioi) käyttäen valmistajan ohjeen mukaisesti.

Streptomyces-plasmidi pIJ486 (Ward et ai., 1986; plasmidi 5 saatiin prof. Hopwoodilta, John Innes Institute) lineari-soitiin EcoRlillä kuten rekombinanttifaagi ja käsiteltiin alkalisella fosfataasilla (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, CIAP, Boehringer Mannheim 713023) seuraavasti: 10 Mg lineaarista vektori-DNA:ta ja 0,5 U CIAP:ia 10 inkuboitiin +37 eC:n vesihauteessa 100 μ1:η tilavuudessa (50 mM Tris-HCl, pH 8 ja 0,1 mM EDTA) 0,5 h. CIAP inakti-voitiin kuumentamalla 65 °C:ssa n. 0,5 h ja uuttamalla sen jälkeen 2 kertaa neutraalilla fenoli-kloroformi (1:1)-seoksella. Plasmidi saostettiin 2-propanolilla, 15 pestiin n. 70%:isella etanolilla ja liuotettiin TE-pusku-riin (n. 1 pq/pl).

Plasmidi pIJ486 ja insertti-DNA ligoitiin T4-DNA-ligaa-silla (Boehringer Mannheim) valmistajan ohjeen mukaisesti 20 20 μ1:η tilavuudessa.

Ligaatioseos transformoitiin -20 °C:ssa säilytettyihin S. lividans TK24 protoplasteihin. Protoplastien valmistus ja transformaatio suoritettiin Hopwood et ai.:n (1985a) ku-25 vaarnan menetelmän mukaisesti (sivut 12-14 ja 108-109).

1 vrk:n kuluttua maljoille lisättiin tiostreptonia (tsr) vesisuspensiona 0,5 mg/malja. Regeneroituneet protoplas-tit kerättiin hammastikuilla n. 6 vrk:n kuluttua ISP4-maljoille (Difco), joihin oli lisätty tiostreptonia 50 30 μg/ml. ISP4-maljoilta siirrettiin kasvustoa silmukalla

Falcon-putkiin, joissa oli 3 ml TSB-mediumia (Oxoid Tryp-tone Soya Broth 30 g/1) ja selektiopaineen ylläpitämiseksi tiostreptonia 5 Mg/ml. 3 vrk:n kuluttua 42:sta kasvustosta eristettiin plasmidit Kieserin (1984) kuvaamalla 35 menetelmällä. Eristetyistä plasmideista insertillisiä oli 8. Näistä 1 (pH2008) kasvatettiin 500 ml:ssa TSB-mediu- 22 93860 mia, ja siitä eristettiin plasmidi Kieserin menetelmällä. Plasmidin pH2008 kartta on esitetty kuvassa 4.

Streptomyces galilaeuksen transformoimiseksi vaadittavat 5 muutokset yllä mainittuun, S. lividansille käytettyyn transformaatiomenetelmään on aikaisemmin kuvattu (Ylihon-ko, K. Pro gradu-tutkielma, Turun yliopisto, 1986). Protoplastien valmistusta varten käytettiin YEME-elatus-aineen sijasta SGYEME-elatusainetta (ks. yllä), johon oli 10 lisätty 0,8 % glysiiniä. Plasmidipreparaatista transformoitiin 1-2 μq S. galilaeus-kantaan ATCC 31615. Transfor-mantteja saatiin 1.

Kantaa ATCC 31615/pH2008 kasvatettiin El-elatusaineessa, 15 johon oli lisätty tiostreptonia 5 /xg/ml ja 7 vrk:n kuluttua uutettiin kasvustosta tuotteet tolueeni-metanoli(1:1) -seoksella. Kontrollina eristettiin kannan ATCC 31615 tuotteet vastaavasti. Tuotteiden eristykseen käytettiin n. 1 ml kasvustoa, josta solut erotettiin elatusaineesta 20 sentrifugoimalla. Uuttoon käytettiin ainoastaan soluja, koska supernatanttiin jäi vain pieni osa tuotteista. Uutoksen tolueenifaasista erotettiin tuotteet ohutlevy-kromatografiällä, käyttämällä ajoliuoksena tolueeni-etyyliasetaatti-metanoli-muurahaishappo (50:50:15:10)-25 seosta. Todettiin kannan ATCC 31615/pH2008 muodostaneen antrasykliinejä, joita isäntäkanta ATCC 31615 ei luontaisesti tuota.

Varmistettiin ominaisuuksien olevan peräisin plasmidista 30 transformoimalla rekombinanttiplasmidi pH2008 uudelleen ATCC 31615:ään, jolloin todettiin uusien yhdisteiden muodostuvan niin ikään tällä kannalla. Rekombinanttikan-nan kasvatus tuottomediumissa El ilman tiostreptonilla aikaansaatua selektiopainetta aiheutti uusien antrasyk-35 liinien tuoton katoamisen.

23 93860

Hybridituotteet hydrolysoitiin kuumentamalla niitä 0,5-1 tuntia 0,lM:isessa HCl-liuoksessa. Aglykonit erotettiin oksaalihapolla käsitellyllä TLC-levyllä, ja niitä verrattiin kannan ATCC 31615 tuottamiin aglykoneihin. Ajoliuok-5 sena oli kloroformi-asetoni (10:1). Tuotteille saatiin taulukossa I esitetyt Rf-arvot:

Rf-arvo ATCC 31615 ATCC 31615/pH2008 0,11 - + 0,15 - + 0,19 - + 0,21 + + 0,30 - + 0,36 - + 0,42 - + 0,46 + + 0,50 - + 0,53 - + 0,56 + + 0,61 - + - = Tuotetta ei ole kannalla + = Kanta tuottaa Rf-arvoa vastaavan tuotteen

Taulukko I.

• ESIMERKKI 10, Hvbridiantibioottien tuotto ia aqlv- konien puhdistus

Fermentointi 5 S. galilaeus ATCC 316l5/pH2008 siirrostettiin ISP4 + tsr-maljalta ravistelupulloon, jossa oli 60 ml elatusliuosta El, johon oli lisätty 5 Mg/ml tiostreptonia, ja kasvatettiin 4 vrk ajan 300 kierr/min ravistelijassa lämpötilassa 10 30 °C. Valmisteltiin 7 1 fermentori, jossa oli 5,5 1 elatusliuosta El, 5 ml vaahdonestoainetta (Polypropy-leeniglykoli P 2000, Fluka) ja 5 Mg/ml tiostreptonia.

* 24 93860

Ympättiin fermentori en. esikasvatuksella ja fermentoi-tiin 5 vrk. 30 °C:n lämpötilassa, sekoittaen 350 kierr/ min ja ilmansyötön ollessa 6 1/min.

5 Uutto

Valmisteltiin 10 l:n reaktiokolvi uuttoa varten lisäämällä siihen:

Celatom00 400 g 10 Na2HP04 . 2H20 47 g sitruunahappo 24,4 g vesi 500 g metyylietyyliketoni (MEK) 3 1 15 Kasvustoliuos siirrettiin fermentorista alipaineella uuttoastiaan ja sekoitettiin 45 min. Seos suodatettiin Bvichner-suodattimella, ja suodatinkakku pestiin 300 ml:11a MEK:iä. Suodokseen liuotettiin 500 g NaCl ja annettiin erottua erotussuppilossa yli yön.

20

Alempi kerros (vesifaasi) poistettiin. Ylempi kerros laskettiin astiaan, johon oli punnittu 400 g Na2S04. Sekoitettiin 10 min. ja suodatettiin Biichner-suodattimel-la. Suodatinkakku pestiin 200 ml:11a MEK:iä.

25

Glykosidien erotus Näin saatu raaka MEK-uute haihdutettiin pyöröhaihdutti-mella lähes kuiviin. Lisättiin tolueenia 200 ml ja haih-30 dutettiin kuiviin. Täytettiin 150 ml:aan tolueenilla. Lisättiin: “ isopropanolia 150 ml 0,1 M HC1 150 ml heksaania 75 ml 35

Siirrettiin erotussuppiloon, sekoitettiin ja annettiin kerroksien erottua. Alakerros (vesifaasi) otettiin toi- « < 25 93860 seen erotussuppiloon, ja siihen lisättiin 40 ml dikloori-metaania. Sekoitettiin ja annettiin faasien erottua. Alafaasi (dikloorimetaani) laskettiin astiaan, jossa oli 30 ml 1 M fosfaattipuskuria, pH 7,0. Erotussuppiloon jää-5 neeseen vesifaasiin lisättiin 10 ml dikloorimetaania, uutettiin, ja MeCl2-faasi yhdistettiin em. fosfaattipuskurin alla olevaan MeCl2-f aasiin. Ensimmäisen uutoksen tolueenifaasiin lisättiin: 10 isopropanolia 75 ml 0,1 M HC1 150 ml

Toistettiin uutto metyleenikloridiin kuten edellä, ja metyleenikloridifaasit yhdistettiin. Haihdutettiin mety-15 leenikloridiliuos pyöröhaihduttajalla kuiviin. Lisättiin metanolia n. 10 ml ja haihdutettiin uudelleen kuiviin. Liuotettiin haihdutusjäännös 200 ml:aan tolueenia.

Glykosidien hydrolyysi aglykoneiksi 20

Edellä saatuun tolueeniliuokseen lisättiin 200 ml 0,1 M HCl, sekoitettiin ja vesifaasi erotettiin. Vesifaasia inkuboitiin 2 tuntia 85 °C:n vesihauteessa. Liuos jäähdytettiin ja sitä uutettiin kolmesti 100 ml:11a tolueenia. 25 Yhdistettyä tolueenifaasia uutettiin sitten 150 ml:11a 0,1 M Na-fosfaattipuskuria, pH 7,0. Tolueenifaasi haihdutettiin kuiviin pyöröhaihduttajalla, lisättiin 20 ml metanolia, haihdutettiin uudelleen kuiviin ja liuotettiin 10 ml:aan tolueenia.

30

Aglykonien kromatografinen erotus

Aglykonit erotettiin kromatografisesti kahdessa vaiheessa. Ensimmäinen kromatografia-ajo suoritettiin oksaali-35 happo-silikageelipylväällä seuraavasti: 26 93860

Oksaalihappo-silikageeli valmistettiin sekoittamalla 100 g Kieselgel 60:ta (Merck) 200 ml:aan 0,25 M oksaalihappoa, poistamalla suurin osa oksaalihappoliuoksesta Biich-ner-suodattimella ja kuivaamalla silikageeli yli yön 110 5 °C:n lämpökaapissa. Näin saatu oksaalihappo-silikageeli lietettiin tolueeniin ja pakattiin halkaisijaltaan 4 cm:n kromatografiapylvääseen.

Edellä saatu aglykoniseos tolueenissa aplikoitiin pylvää-10 seen ja eluoitiin liuoksella, jossa oli 10 % asetonia tolueenissa. Eluaatista kerättiin n. 15 ml:n faktioita, ja fraktiot analysoitiin ohutlevykromatografiällä edellä kuvatulla tavalla. Kuvassa 5 on valokuva näin saadusta ohutlevystä, jonka perusteella eluaatti jaettiin neljään 15 fraktioon: I, II, III ja IV.

Fraktiot I ja II näyttivät sisältävän kahta pääkomponent-tia, josta syystä ne kromatografoitiin uudelleen käyttäen oksaalihappo-silikageeliä, mutta käytetty pylväs oli 20 halkaisijaltaan 1,5 cm ja pituudeltaan n. 50 cm. Eluoin-tiin käytettiin 5 % asetonia metyleenikloridissa. Näin saatiin puhdistettua fraktioiden I ja II pääkomponentit, jotka merkittiin IA, IB, IIA ja IIB.

25 Saadut aglykonit kiteytettiin metanolista.

Aglykonien rakenneselvitykset

Saatuja aglykonifraktioita karakterisoitiin ohutlevykro-30 matografiällä, massaspektrometrialla ja protoni-NMR:llä. IA:n todettiin olevan aklavinoni, eli isäntäkannan ATCC “ 31615 tuottama aglykoni. IB on e-rodomysinoni, joka on geenien luovuttajakannan S. purpurascens tuottama aglykoni, samoin kuin IIB, joka on 0-rodomysinoni. IIA on 10-35 dekarbometoksiaklavinoni, joka on kuvattu aklavinonin kemiallisen demetylaation ja dekarboksylaation tuotteena (Tanaka et ai., 1980), mutta tekijät eivät ole löytäneet 27 93860 kirjallisuudesta tietoa, että mikään mikrobi tuottaisi sitä. III:n havaittiin olevan IIA:n 7-epimeeri, ja se on todennäköisesti syntynyt hydrolyysin yhteydessä.

5 Aglykonille IV saatiin kuvassa 6, protoni-NMR-spektrin yhteydessä esitetty rakenne, jota tekijät eivät ole löytäneet kirjallisuudesta.

Aglykonit IIA ja IV ovat siis tuotteita, joita sen parem-10 min geenien vastaanottajakanta kuin luovuttajakantakaan eivät luonnostaan tuota, s.o. hybridiantibiootteja. Agly-kohi IV on myös absoluuttisesti uusi.

ESIMERKKI 11. Hvbridiantibioottien tuotto ia qlv- 15 kosidien puhdistus

Fermentointi, uutto ja glykosidien erotus tehtiin kuten esimerkissä 10.

20 Glykosidien IVA ja IVB puhdistus 2 ml edellä saatua glykosidiuutetta aplikoitiin kapeana juovana ohutlevykromatografialevylie (20 cm x 20 cm x 0,5 mm, Kieselgel 60, Merck). Levy eluoitiin ajoliuoksella 25 kloroformi:metanoli:etikkahappo (20:5:1). Levyltä raaputettiin ja uutettiin metanoliin yhdisteet IVA (keltainen .. tuote, Rf-arvo 0,40) ja IVB (keltainen tuote, Rf-arvo 0,55).

30 Glykosidien osittaishydrolyysi

Noin 200 ml glykosidiuutetta uutettiin lisäämällä 200 ml 0,05 M HC1, sekoittamalla ja erottamalla vesifaasi. Vesifaasia inkuboitiin 30 min. 55 °C:n vesihauteella.

35 Inkubaation jälkeen liuos neutraloitiin lisäämällä 20 ml 1 M fosfaattipuskuria, pH 7.

28 93860

Liuos uutettiin kolmasti 100 ml:11a kloroformia. Kloro-formifaasi haihdutettiin kuiviin ja liuotettiin 20 ml:aan dikloorimetaania.

5 IVT:n puhdistus IVT puhdistettiin edellä saadusta osittain hydrolysoidusta glykosidifraktiosta kromatografisesti kahdessa vaiheessa. Molemmat vaiheet suoritettiin silikageelipylvääl-10 lä.

Ensimmäisessä vaiheessa Kieselgel 60 lietettiin dikloori-metaaniin ja pakattiin halkaisijaltaan 4 cm pylvääseen. Edellä saatu glykosidiseos aplikoitiin pylvääseen ja 15 eluoitiin ajoliuoksella dikloorimetaani:metanoli:etikka-happo (100:20:1). Eluaatista kerättiin noin 15 ml:n fraktioita ja fraktiot analysoitiin ohutlevykromatrogra-fiällä käyttäen ajoliuosta kloroformi:metanoli:etikka-happo (20:5:1). Lähinnä IVT:tä sisältävät fraktiot (kel-20 täinen tuote, Rf 0,21) yhdistettiin. Yhdistetyistä fraktioista uutettiin etikkahappo veteen neutraloimalla liuos 1 M NaOH-liuoksella. Keltainen dikloorimetaanifaasi haihdutettiin kuiviin ja liuotettiin 2 ml:aan metanolia, joka sekoitettiin 20 ml:aan tolueenia.

25

Tolueeni-metanoliliuoksessa oleva antrasykliini aplikoitiin toisessa vaiheessa tolueeniin lietetystä Kieselgel 60:sta valmistettuun kromatografiapylvääseen. Pylvästä eluoitiin ajoliuoksella tolueeni:metanoli (1:1) ja kerät-30 tiin noin 15 ml:n fraktioita. Ohutlevykromatografiän perusteella valittiin IVT:tä sisältävät fraktiot kuten ·· edellä. Fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin.

Glykosidien IVA, IVB ja IVT rakenneselvitykset 35 IVA:n, IVB:n ja IVT:n todettiin antavan aglykoni IV:ää hydrolysoitaessa 1 M HCl:llä kiehuvalla vesihauteella.

t - 29 93860 IVA:n ja IVB:n todettiin antavan IVT:tä hydrolysoitaessa 0,05 M HClrllä 30 min. 55 °C:n vesihauteella. Tällä käsittelyllä IVT muuttui vähäisissä määrin aglykoniksi. Massa- ja HNMR-spektrien (kuvat 8 ja 9) perusteella IVT 5 osoittautui yksisokeriseksi glykosidiksi, jonka sokeri-osana on rodosamiini.

Glykosidin IVB biotransformaatio IVA:ksi 10 Noin 1 mg IVB:tä liuotettiin 1 ml:aan metanolia.

60 ml ATCC 31615-kasvustoa, jota oli kasvatettu 2 vrk El-elatusaineessa, pestiin sentrifugoimalla ja suspendoimal-la solut 60 ml:aan fysiologista suolaliuosta ja siirret-15 tiin ravistelupulloon. Metanoliin liuotettu IVB lisättiin pulloon ja pulloa ravisteltiin 6 h 300 kierr/min 30 °C:n lämpötilassa. Inkubaation jälkeen tuotteet uutettiin kasvustosta kuten esimerkissä 9. Ohutlevykromatografiän perusteella todettiin IVB:n muuttuneen IVA:ksi.

20

Kannan ATCC 31615 on todettu näissä olosuhteissa muuttavan aklasinomysiini B:tä A:ksi (Hoshino et ai., 1983). Reaktion on todettu tapahtuvan myös yhdisteillä, joiden aglykoniosa eroaa aklavinonista, mutta sokeriosa on sama 25 kuin aklasinomysiini B:llä. Tämän reaktion perusteella voidaan todeta IVA:n rakenteen vastaavan aklasinomysiini A:ta ja lVB:n rakenteen aklasinomysiini B:tä. Tätä raken-nemääritystä tukevat myös hydrolyyseistä saadut tulokset.

30 ESIMERKKI 12. Glvkosidien IVA. IVB ia IVT biologi nen aktiivisuus

Yhdisteiden aktiivisuus määritettiin sytotoksisuustestil-lä, jossa mitattiin yhdisteiden kykyä estää hiiren leuke-35 miasolukannan L1210 (ATCC CCL 219) kasvua in vitro (Mat-suzawa et ai., 1981). Vertailuaineena käytettiin aklasinomysiini A:ta. Yhdisteille saatiin seuraavat ED^-arvot: 30 93860

Yhdiste EDjo/ninoolia/l

Aklasinomysiini A 10 5 IVA 75 IVB 24 IVT 22

10 TALLETETUT MIKRO-ORGANISMIT

Seuräavat mikro-organismikannat on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti Deutsche Sammlung von Mikroorganis-men und Zellkulturen GmbH (DSM) -talletuslaitokseen, 15 Mascheroder Weg 1 B, D-3300 Braunschweig, Saksa.

Mikro-organismi Talletusnumero Talletuspäivä

Streptomyces galilaeus 20 ATCC 31615/pH2008 DSM 6403 4.3.1991

Escherichia coli HB101/pacm5 DSM 6404 4.3.1991 93860 31

Viiteiulkaisut

Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heynecker, H.L., Boyer, H.W., Crosa, J.H. ja Fal-5 kow, S.: Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene 2.

(1977) 95

Hopwood, D.A., Bibb, M.J., Chater, K.F., Kieser, T., 10 Bruton, C.J., Kieser, H.M., Lyndiate, D.J., Smith, C.P., Ward, J.M. ja Schremp, H.: Genetic Manipulation of strep-tomyces, A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, UK, (1985a) 15 Hopwood, D.A., Malpartida, F., Kieser, H.M., Ikeda, H., Duncan, J., Fujii, I., Rudd, B.A.M., Floss, H.G. ja Omura, S.: Production of 'hybrid' antibiotics by genetic engineering, Nature 314 (1985b) 642-644 20 Hoshino, Y., Sekine, Y. ja Fujiwara, A.: Microbial conversion ov aclacinomycin B to aclacinomycin A, J. Anti-biot. 36 (1983) 1458-1462

Hutchinson, C.R., Borell, C.W., Otten, S.L., Stutzman-25 Engwall, K.J. ja Wang, Y.: Drug Discovery and Development through the Genetic Engineering of Antibiotic-Producing Microorganisms, J. Med. Chem. 32_ (1989) 929-937

Kaslow, D.C.: A rapid biochemical method for purifying X-30 DNA from phage lysates, Nucl. Acids Res. 14 (1986) 6767

Kieser, T.: Plasmid 12 (1984) 19-36

Kieser, T., Hopwood, D.A., Wright, H.M. ja Thompson, 35 C.J.: Mol. Gen. Genet. 185 (1982) 223-228 32 93860

Malpartida, F., Hallam, S.E., Kieser, H.M., Motamedi, H., Hutchinson, C.R., Butler, M.J., Sugden, D.A., Warren, M., McKillop, C., Bailey, C.R., Humphreys, G.O. ja Hopwood, D.A.: Homology between Streptomyces genes coding for 5 synthesis of different polyketides used to clone antibiotic biosynthetic genes, Nature 325 (1987) 818-821

Maniatis, Fritsch ja Sambrook: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982) 10

Matsuzawa, Y., Oki, T., Takeuchi, T. ja Umezawa, H.: Structure - activity relationships of anthracyclines relative to cytotoxicity and effects on macromolecular synthesis in L1210 leukemia cells, J. Antibiot. 34 (1981) 15 1596-1606

Stutzman-Engvall, K.J. ja Hutchinson, C.R.: Multigene families for anthracycline antibiotic production in Streptomyces peucetius, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86 20 (1989) 3135-3139

Sutcliffe, J.G.: Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43 (1978) 77.

25

Tanaka, H., Yoshioka, T., Shimauchi, Y., Matsuzawa, Y., Oki, T., ja Inui, T.: Chemical modification of anthracycline antibiotics. I. Demethoxycarbonylation, 10-epime-rization and 4-O-methylation of aclacinomycin A, J. Anti-30 biot. 33 (1980) 1323-1330 *' Ward, J.M., Janssen, G.R., Kieser, T., Bibb, M.J., Butt- ner, M.J. ja Bibb, M.J.: Construction and characterisation of a series of multi-copy promoter-probe plasmid 35 vectors for Streptomyces using the aminoglycoside phosphotransferase gene from Tn5 as indicator. Molec. Gen. Genet. 203 (1986) 468-478.

Claims (10)

33 93860

1. Antrasykliiniryhmän hybridiantibioottien aikaansaamisessa käyttökelpoinen DNA-jakso, tunnettu siitä, 5 että se on kuvassa 4 esitetyn, Streptomyces galilaeus -kannassa (DSM 6403) talletetun plasmidin pH2008 kahden EcoRI-restriktioendonukleaasin tunnistuskohdan välinen noin 12000 emäsparin mittainen jakso rdm-6 tai funktionaalinen osa siitä. 10

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-jakso, tunnettu siitä, että se on eristetty Streptomyces purpurascens -kannasta ATCC 25489.

3. Antrasykliiniryhmän hybridiantibioottien aikaansaami sessa käyttökelpoinen yhdistelmä-DNA-konstruktio, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen DNA-jakso on liitetty Streptomyces-suvun mikro-organismeissa monistuvaan vektoriin. 20

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen yhdistelmä-DNA-konstruktio, tunnettu siitä, että se on plasmidi pH2008, jonka restriktiokartta on esitetty kuvassa 4, ja joka on eristettävissä Streptomyces galilaeus -kannasta

25 DSM 6403.

5. Antrasykliiniryhmän hybridiantibiootteja tuottava Streptomyces-kanta, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen yhdistelmä-DNA-konstruktio 30 on saatettu aklavinonin glykosideja luontaisesti tuottavaan Streptomyces galilaeus -kantaan.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen Streptomyces-kanta, tunnettu siitä, että isäntänä käytettävä, akla- 35 vinonin glykosideja tuottava Streptomyces galilaeus -kanta on ATCC 31615 tai ATCC 31133. 34 93860

7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen Streptomyces-kanta, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-konstruktio on plasmidi pH2008, jonka restriktiokartta on esitetty kuvassa 4, ja joka on talletettu Streptomyces 5 galilaeus -kannassa ATCC 31615/pH2008 talletusnumerolla DSM 6403.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen Streptoroyces-kanta, tunnettu siitä, että se on Streptomyces galilaeus

10 DSM 6403.

9. Menetelmä antrasykliiniryhmän hybridiantibioottien tuottamiseksi, tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuksista 5-8 mukaista Streptomyces-kantaa 15 kasvatetaan olosuhteissa, joissa isäntäkanta luontaisesti tuottaa antibioottia, erotetaan kasvuliuoksesta tuotetut antibiootit ja puhdistetaan saadut hybridiantibiootit.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, t u n -20 n e t t u siitä, että tuotettu hybridiantibiootti on IVA, IVB tai IVT, joiden rakennekaavat ovat • « t 35 93860 O OH 0 OH OH O OH [ OH O OH ] 0 ™ 0 IVA 1 I N(CH ) N (CH ) O O 0 d ~ OH O O /T“°\ I0 "J ¢5 O O OH OH O OH J O IVT /[ ‘\ (w HO 1 N (CH3) 2 36 93860