CN101613711B

CN101613711B - 安哥拉糖胺糖基合成酶及糖基转移酶多基因共表达系统的构建及其应用

Info

Publication number: CN101613711B
Application number: CN200910063347XA
Authority: CN
Inventors: 李爱英; 王慧利; 蔡晓凤
Original assignee: Central China Normal University
Current assignee: Huazhong Normal University; Central China Normal University
Priority date: 2009-07-29
Filing date: 2009-07-29
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2029-07-29
Also published as: CN101613711A

Abstract

本发明提出一种安哥拉糖胺基合成酶及糖基转移酶多基因共表达系统的构建及其应用，是以链霉菌基因组文库质粒为模板，通过PCR扩增6个安哥拉糖胺合成酶基因及其糖基转移酶基因，将其依次连接并置于链霉菌启动子P _actIII-actI下游，形成一个转录元；将转录元转移到链霉菌质粒载体pSET152上，构建了多基因共表达的链霉菌表达质粒pAYT55；将pAYT55导入宿主细胞天蓝色链霉菌CH999，得到的工程菌与积累聚酮抗生素(kalafungin)的链霉菌B135进行混合培养，能实现kalafungin的生物转化，变成带有安哥拉糖胺的新抗生素；或者将pAYT55直接导入链霉菌B135，单独培养实现kalafungin的糖基化。所以，利用这套系统可以在胞内合成稀有的安哥拉糖胺，并利用抗生素糖基转移酶的低底物识别特异性对聚酮抗生素进行安哥拉糖胺的修饰。

Description

安哥拉糖胺糖基合成酶及糖基转移酶多基因共表达系统的构建及其应用

技术领域：

本发明涉及的是抗生素稀有糖基合成和转移以及抗生素结构修饰(糖基化)相关的多基因共表达系统，特别是一种含有安哥拉糖胺合成酶和糖基转移酶基因的共表达质粒的构建和表达工程菌的应用。

背景技术：

抗生素等许多天然活性物质结构中都含有糖基，这些糖基连接在抗生素分子母核特定位置上，对化合物发挥生物学活性至关重要，甚至是必需功能团。糖基结构、糖基数量以及在糖基受体上的连接位置和连接方式的差别都会对抗生素的生物学活性产生很大影响。抗生素的糖基结构呈现多样性，相应的糖基转移酶也呈现低底物识别特异性，因此利用糖基化修饰从遗传水平上对现有抗生素进行结构改造是当今抗生素研发中一个重要研究领域【代焕琴，王浩鑫，沈月毛，抗生素糖基转移酶研究进展，中国抗生素杂志，2007，5(32)：257-262；尚珂，胡又佳，朱春宝，朱宝泉，脱氧糖组合生物合成的研究进展，中国医药工业杂志，2007，38(4)304-308】

因为抗生素天然结构中含有的脱氧糖基的体外化学合成往往比较复杂，收率很低。这些脱氧糖基来源的问题在很大程度上限制了在体外对抗生素实现脱氧糖基的修饰，所以利用体外糖基化实验对抗生素进行糖基化修饰研究的例子不是很多。

安哥拉糖胺(angolosamine)是一种稀有的脱氧己糖胺，仅在有限几种链霉菌的次生代谢产物结构中发现，目前也没有商品化，其化学合成需要十几步，收率很低【Fraser-reid B，Kelly DR，Tulshian DB.And Prasad SR，Routes From“Triacetyl Glucal”to 6-Deoxy-Hex-2-Enopyranosides，J Carbohydrate Chemistry，1983，2(2)：105-114】，这就限制了在体外利用这种糖基对抗生素进行安哥拉糖基化修饰的研究。但这个安哥拉糖胺的生物合成酶基因和相应的糖基转移酶基因都已经克隆和测序，可以利用这些基因资源进行体内的糖基化修饰的研究和药物结构的改造。所以本发明旨在把链霉菌来源的安哥拉糖胺合成酶基因和糖基转移酶基因共表达在一个质粒上，在细菌体内实现对聚酮抗生素的安哥拉糖胺修饰(糖基化)。

发明内容：

本发明目的是利用现有基因资源构建安哥拉糖胺(angolosamine)生物合成酶及糖基转移酶多基因共表达系统，通过生物转化(bioconversion)，在细胞体内对不含糖基的聚酮抗生素实现安哥拉糖胺修饰。

本发明是这样实现的：利用现有基因资源，通过基因工程手段，以含安哥拉糖胺合成酶和转移酶基因的链霉菌基因组文库质粒为模板，进行PCR扩增，得到6个糖基合成酶基因(med-ORF20，18，17，16，15和14)和一个糖基转移酶基因(med-ORF8)(这7个基因序列已经测序和发表，在GenBank中它们的蛋白序列号分别为BAC79028，BAC79029，BAC79030，BAC79031，BAC79032，BAC79033，BAC79040)。将经测序正确的7个基因依次连接并插入到过渡载体pNEB193J的高效启动子P_actIII-actI下游，然后从得到的质粒上切下9kb的表达盒片段(包含7个基因及上游启动区域)，插入到链霉菌质粒pSET152上，获得一个链霉菌多基因共表达质粒pAYT55。然后通过原生质体转化，将pAYT55导入常用的链霉菌表达细胞CH999中，构建多基因共表达系统工程菌CH999/pAYT55；或者通过原生质体转化，将pAYT55导入链霉菌细胞且能产生芳香聚酮抗生素Kalafungin的菌株B135中，构建多基因共表达系统工程菌B135/pAYT55。通过生物转化，在细胞体内对不含糖基的聚酮抗生素实现安哥拉糖胺修饰。

具体步骤为：

1)安哥拉糖胺糖基合成酶及糖基转移酶基因的扩增和测序。

安哥拉糖胺糖基合成酶及糖基转移酶多基因共表达系统的构建是通过PCR方法，以含有安哥拉糖胺合成酶和转移酶基因的链霉菌基因组文库质粒为模板，将6个安哥拉糖胺合成酶基因(med-ORF20，18，17，16，15，14)以及一个稀有的C-糖基转移酶基因(med-ORF8)分别进行扩增克隆，利用常规方法合成引物，应用常规方法进行PCR，在常规PCR条件下，进行扩增，分别扩增0.2-4.2kb 5个DNA片段，分别克隆到pT7Blue载体上，送公司测序。

2)安哥拉糖胺糖基合成酶及糖基转移酶多基因共表达质粒的构建。

将以上获得的测序正确的PCR产物依次连接在过渡质粒载体pNEB193J上，按照基因med-ORF20、18、17、16、15、14和8的顺序置于高效链霉菌启动子P_actIII-actI下游。并用HindIII和EcoRI切下，插入到链霉菌质粒pSET152的HindIII和EcoRI位点之间，构建好链霉菌多基因共表达质粒pAYT55(见图1)。

3)多基因共表达系统工程菌CH999/pAYT55以及B135/pAYT55的构建：

利用常规方法，通过原生质体转化将pAYT55导入常用链霉菌表达宿主----天蓝色链霉菌CH999细胞中，获得多基因共表达系统工程菌CH999/pAYT55，该菌株于2009年7月21日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNo：209160，分类命名为天蓝色链霉菌CH999/pAYT55(Streptomycescoelicolor CH999/pAYT55)(以下简称CH999/pAYT55)；

或者利用常规方法，通过原生质体转化将pAYT55导入产生聚酮抗生素Kalafungin的天蓝色链霉菌B135菌株中，获得多基因共表达系统工程菌B135/pAYT55，该菌株于2009年7月21日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No：209159分类命名为天蓝色链霉菌B135/pAYT55(Streptomyces coelicolor B135/pAYT55)(以下简称B135/pAYT55)。

4)利用多基因共表达重组菌进行聚酮化合物的生物转化和检测：

混合培养方案----吸取工程菌CH999/pAYT55的孢子悬液转入种子培养基(每升种子培养基含葡萄糖4g，蛋白胨0.6g，牛肉膏0.6g，酵母膏0.2g，NaCL0.6g，CaCO₃ 0.2g，pH 7.0)，进行30℃、200转/分的液体培养两天，获得种子培养物，再转接到产素培养基(每升产素培养基含有葡萄糖10g，酵母膏1g，酪蛋白水解物0.1g，K₂SO₄，0.2g，MgCL₂.6H₂O 10g，TES 5.6g，微量元素溶液2毫升，CaCL₂.2H₂O 4g，L-Proline 3g，pH7.2)中，同时等量接种产Kalafungin的链霉菌菌株B135种子培养物，进行30℃、200转/分的混合培养4-7天，对发酵液进行离心、收集上清液，乙酸乙酯萃取后，用LC/MS方法检测糖基化的新聚酮抗生素产物。

可与工程菌CH999/pAYT55进行混合培养接种的菌株，除B135外，还包括有产Kalafungin的链霉菌菌株Streptomyces tanashiensis strain Kala DSM40853，或者是产生带酚羟基的芳香聚酮抗生素的菌株Lambertella hicoriae，Streptomyces rosa，Streptomyces sp.No.9558，或者Actinoplansluojisanenesis，Stretomyces rimosus NRRL3016，或者Streptomycesolivaceus，Streptomyces capoamus。

单独培养方案----吸取多基因共表达系统工程菌B135/pAYT55的孢子悬液转入种子培养基(种子培养基配方同前)中进行30℃、200转/分的液体培养两天，获得种子培养物，再转接到产素培养基(产素培养基配方同前)中，进行30℃、200转/分的单独培养4-7天，对发酵液进行离心、收集上清液，乙酸乙酯萃取后，用LC/MS方法检测糖基化的新聚酮抗生素产物。

单独培养中可以把多基因共表达质粒pAYT55直接导入的菌株还有产Kalafungin的链霉菌菌株Streptomyces tanashiensis strain Kala DSM 40853，或者是产生带酚羟基的芳香聚酮抗生素的菌株Lambertella hicoriae，Streptomyces rosa，Streptomyces sp.No.9558，或者Actinoplansluojisanenesis，Stretomyces rimosus NRRL3016，或者Streptomycesolivaceus，Streptomyces capoamus。

混合培养的生物转化过程是这样的：CH999/pAYT55细胞提供糖基供体NDP-安哥拉糖胺和糖基转移酶Med-ORF8，B135菌株产生糖基供体Kalafungin，混合培养时，糖基供体被CH999/pAYT55细胞吸收进胞内，被糖基转移酶Med-ORF8识别催化，从而导致Kalafungin连接了一个安哥拉糖胺，修饰后的结构预期与天然抗生素medermycin一致(见图2和图3)。

单培养的生物转化过程是这样的：在B135/pAYT55细胞中，细胞本身提供糖基供体Kalafungin，质粒pAYT55上基因表达提供糖基供体NDP-安哥拉糖胺和糖基转移酶Med-ORF8，在Med-ORF8作用下，Kalafungin被糖基化，产生与medermycin一致的糖基化结构(见图2和图3)。

本发明使用的微生物：

1、天蓝色链霉菌CH999(以下简称CH999)：这个菌株是来自链霉菌模式菌株天蓝色链霉菌(基因组已经测序)的突变菌株，遗传背景清晰，其基因组上放线紫红素生物合成基因簇全部缺失，不产生任何聚酮化合物；因为它非常容易接收外来质粒DNA(即通过原生质体转化很容易把质粒导入进去)，所以是最为常用的链霉菌基因异源表达细胞，在世界上多家实验室都保存和共享，在此选用CH999是作为受体细胞构建重组菌来进行多基因的表达。

CH999菌株菌学特性：

A形态特性：是G+细菌，在固体培养基中培养时呈现典型的链霉菌培养特征，即有营养菌丝、气生菌丝和孢子丝的分化。

B生理特性：可以利用多种碳源，如淀粉、葡萄糖，在常规链霉菌培养基中生长良好。生长到对数后期进入次生代谢物积累阶段。含有pAYT55的CH999重组菌株可以与聚酮化合物产生菌共培养，进行生物转化，培养液中会积累发生糖基化修饰的新化合物。

2、天蓝色链霉菌B135(以下简称B135)：这个菌株也是来自链霉菌模式菌株天蓝色链霉菌(基因组已经测序)的突变菌株，基因组上放线紫红素生物合成基因簇发生部分缺失，导致可以积累聚酮抗生素Kalafungin【Cole，S.P.，B.A.M.Rudd，D.A.Hopwood，C.-J.Chang，and H.G.Floss.1987.Biosynthesis of theantibiotic actinorhodin：analysis of blocked mutants of Streptomyces coelicolor.J.Antibiot.40：340-347】，因此遗传背景也非常清晰。这个菌株原生质体转化效率也非常高，外来质粒DNA很容易导入进去，另外因为可以积累聚酮抗生素Kalafungin，所以在此选用这个细胞B135是用来提供糖基受体Kalafungin。

B135菌株菌学特性：

B生理特性：可以利用多种碳源，如淀粉、葡萄糖，在常规链霉菌培养基中生长良好。生长到对数后期进入次生代谢物积累阶段。重组菌B135/pAYT55单独培养，在培养液中会积累发生糖基化修饰的新化合物。

本发明产生的积极技术效果：

1、本发明将安哥拉糖胺合成酶基因和转移酶基因(共7个基因)克隆出来，构建了一个多基因表达质粒pAYT55，实现了多基因共表达，将这样一个质粒进行转化可以简化工程菌的转化和筛选，因为以前文献中对于其它的脱氧糖基的合成酶和转移酶的多基因表达是采用两个质粒来实现的，后续操作(重组菌获得和筛选)要麻烦一些；

2、这个多基因共表达质粒构建中使用的载体pSET152是个多宿主范围的链霉菌载体，所以这个表达质粒可以转化较多的链霉菌细胞；质粒中使用的启动子P_actIII-actI是最常用链霉菌启动子，在多种链霉菌细胞中都可以高效启动下游基因的表达，因此保证了在质粒上的7个基因在许多不同链霉菌中可以正常表达；

3、安哥拉糖胺的合成酶及转移酶多基因共表达质粒pAYT55在链霉菌细胞中表达，可以导致原本无糖基的抗生素发生糖基修饰，表明(I)这套系统可以在链霉菌体内积累NDP-活化形式的安哥拉糖胺(因为糖基转移酶仅识别转移NDP活化的糖基底物)，并在糖基转移酶的作用下，转移到糖基受体Kalafungin上；(II)可以绕开安哥拉糖胺化学合成困难的问题，而是在细胞体内进行抗生素的结构转化，使之连接上一个稀有的脱氧糖胺；(III)前人研究工作中都是使用的O-糖基转移酶来实现抗生素糖基化修饰(形成C-O-C糖苷键)，而本发明中这个多基因共表达系统上含有的med-ORF8可以编码一个C-糖基转移酶，催化稀有的C-C糖苷键形成，因此有利于产生含有C-C糖苷键的新化合物。

4、一般而言，天然活性产物合成中的糖基转移酶具有低底物识别特异性，可以识别不同糖基受体来进行糖基化修饰。本发明中构建的多基因共表达质粒pAYT55携带基因之一就是安哥拉糖胺的糖基转移酶基因，所以这套系统将来也有进行延伸使用的潜力，即对除kalafungin(带有酚羟基的含氧杂环并萘醌类抗生素)之外的带有酚羟基的芳香聚酮化合物也可以进行安哥拉糖胺修饰(比如带有酚羟基的并环萘醌或蒽醌抗生素都有可能成为这个糖基转移酶作用的底物)。

5、本发明实施过程中引入两种生物转化方法：方案1是重组菌CH999/pAYT55与一个出发菌混合培养，方案2是重组菌B135/pAYT55单独培养，二者实际是殊途同归，实施中可以视具体情况来选择哪种方案：这里的出发菌株之一B135是天蓝色链霉菌突变菌株，可以积累聚酮化合物Kalafungin，也可以较为方便地将外源质粒pAYT55导入进B135，所以对Kalafungin进行安哥拉糖基修饰，这两种方法都可以使用。如果使用产生Kalafungin的其它菌株(如Streptomyces tanashiensis strain Kala DSM 40853)，这样的产生菌有可能不能接收外来的质粒DNA，即质粒pAYT55可能较难转化进去(这也是很常见现象)，在这种情况下，就可以使用方案1(混合培养法)，就避开了链霉菌转化困难的问题。同样，在将来进一步延伸使用这套系统，计划对除kalafungin之外的带有酚羟基的芳香聚酮化合物进行安哥拉糖胺修饰时，也要用到其它产生菌，例如Lambertella hicoriae(产生lambertellin)，Streptomyces rosa(产生nanaomycins)，Streptomyces sp.No.9558(产生napyradiomycin)，Actinoplans luojisanenesis(产生1，8-二羟基蒽醌)，Stretomyces rimosusNRRL3016(产生tetrangomycin)，Streptomyces olivaceus(产生rabelomycin)，Streptomyces capoamus(产生cyclacidin)等菌株，如果pAYT55不能导入这些产生菌，也可以直接使用方案1(混合培养法)，以避开链霉菌转化困难的问题，这样使得本发明使用范围拓宽。

总之，这套多基因共表达系统可以在将来抗生素结构定向改造的研究中发挥其应用潜力。

附图及说明

图1本发明安哥拉糖胺合成酶和糖基转移酶基因共表达质粒示意图，

图2本发明生物转化示意图，

图3 LC/MS检测结果。

在图1中安哥拉糖胺合成酶基因和糖基转移酶基因是来自于链霉菌基因组，由链霉菌基因组文库质粒携带(这个文库质粒在此作为PCR模板)。多基因共表达质粒pAYT55启动子是链霉菌启动子P_actIII-actI，转录调节因子(activator的表达产物)作用于这个启动子，促进转录启动，导致下游基因的高效表达。其载体部分含有整合位点(attP)和整合酶基因(int)，有助于质粒稳定地整合到宿主染色体上；在原生质体转化不理想的情况下，可以利用接合转移方法将质粒导入宿主细胞中(oriT的存在可以介导属间接合转移)。

在图2中生物转化过程实际就是在胞内提供一个糖基供体、一个糖基受体以及一个糖基转移酶，然后糖基转移酶就可把糖基供体和受体连接起来，从而让糖基供体上实现糖基化修饰。

具体实施方式：

根据已经发表的基因序列，应用PCR扩增方法，以含安哥拉糖胺合成酶和转移酶基因的质粒为模板，进行PCR扩增，得到6个糖基合成酶基因(med-ORF20，18，17，16，15和14)和一个糖基转移酶基因(med-ORF8)。将经测序正确的7个基因依次连接并插入到过渡载体pNEB193J的高效启动子P_actIII-actI下游，然后从得到的质粒上切下9kb的表达盒片段(包含7个基因及上游启动区域)，插入到链霉菌质粒pSET152上，获得一个链霉菌多基因共表达质粒pAYT55。然后通过原生质体转化，将pAYT55导入常用的链霉菌表达细胞CH999中，获得的基因工程菌株CH999/pAYT55；同时通过原生质体转化，将pAYT55导入链霉菌细胞且能产生芳香聚酮抗生素Kalafungin的菌株B135中，获得的基因工程菌株为B135/pAYT55。

实施例1：

鉴定含有pAYT55的转化子CH999/pAYT55若干(5-8个)，在固体培养基上30℃培养5天至产孢，收集孢子，保存在甘油管中(孢子滴度大于10⁶个/μL)，取10微升孢子悬液接种2mL种子培养基(培养基配方见发明内容)，置于恒温摇床中30℃，200转/分，培养2天，然后按1∶50的比例，取种子培养物转接入产素培养基中((培养基配方见发明内容)，同时接种等量产聚酮化合物的菌株B135的种子培养物，30℃，200转/分，摇床培养5天。将发酵液转入离心管中，室温5000转，离心10min，收集上清，直接进行LC/MS检测。检测条件如下：色谱柱为TSK gel ODS-80TM(4.6mm i.d.X 150mm，TOSHO C18反向柱子)，离子化方式为APCI，进行梯度洗脱(条件：0-5min，20％A；5-25min，20-70％A；25-28min，70-95％A；28-32min，95％A；32-35min，95-20％，其中试剂A为含0.5％乙酸的乙腈，试剂B是含0.5％乙酸的超纯水)，洗脱速度为1.0mL/min，检测波长为254nm。

在以上条件下检测100微升发酵液，可以检测到糖基化修饰的化合物出现，分子量为457(M+1：458)，保留时间在12分钟左右。Kalafungin被安哥拉糖基修饰后的新结构预期与链霉菌AM-7161产生的抗肿瘤抗生素medermycin结构相同。LC/MS检测结果中的液相和质谱图都初步表明聚酮抗生素Kalafungin被转化成了含糖基的medermycin(见图2和图3)。

实施例2：

鉴定含有pAYT55的转化子B135/pAYT55若干(5-8个)，在固体培养基上培养5天至产孢，收集孢子，保存在甘油管中(孢子滴度大于10⁶个/μL)，取500微升孢子悬液接种20mL种子培养基(培养基配方见发明内容)，置于恒温摇床中30℃，200转/分，培养2天，然后按1∶25的比例，取种子培养物转接入产素培养基中(培养基配方见发明内容)，将发酵液转入离心管中，室温下5000转，离心10min，收集上清。上清用1N HCl或1N NaOH调pH至中性，用乙酸乙酯萃取三遍，萃取液混合后，加水萃取一遍(洗)，无水硫酸钠粉剂过滤除水，滤纸过滤，旋转蒸发去掉乙酸乙酯，最后在乙酸乙酯中溶解，进行LC/MS检测。检测条件：色谱柱为TSK gel ODS-80TM(4.6mm i.d.X 150mm，TOSHOC18反向柱子)，离子化方式为APCI，进行梯度洗脱(条件：0-5min，20％A；5-25min，20-70％A；25-28min，70-95％A；28-32min，95％A；32-35min，95-20％，其中试剂A为含0.5％乙酸的乙腈，试剂B是含0.5％乙酸的超纯水)，洗脱速度为1.0ml/min，检测波长为254nm。

在以上条件下检测10微升萃取粗提物，可以检测到糖基化修饰的化合物出现，分子量为457(M+1：458)，保留时间在12分钟左右。Kalafungin被安哥拉糖基修饰后的新结构预期与链霉菌AM-7161产生的抗肿瘤抗生素medermycin结构相同。LC/MS检测结果中的高压液相和质谱图都初步表明聚酮抗生素Kalafungin被转化成了含糖基的medermycin(见图2和图3)。

Claims

1.一种安哥拉糖胺糖基合成酶及糖基转移酶的基因工程菌CH999/pAYT55，保藏号为CCTCC No：209160。

2.一种安哥拉糖胺糖基合成酶及糖基转移酶的基因工程菌B135/pAYT55，保藏号为CCTCC No：209159。

3.一种安哥拉糖胺合成酶和糖基转移酶的基因工程菌的应用，其特征在于吸取权利要求1所述的基因工程菌CH999/pAYT55的孢子悬液转入种子培养基，进行30℃、200转/分钟液体培养两天，获得种子培养物，再转接到产素培养基中，同时等量接种产Kalafungin的链霉菌菌株B135种子培养物，进行30℃、200转/分钟液体混合培养4-7天，对发酵液进行离心、收集上清液，乙酸乙酯萃取后，用LC/MS方法检测糖基化的新聚酮抗生素产物。

4.一种安哥拉糖胺合成酶和糖基转移酶的基因工程菌的应用，其特征在于将权利要求2所述的基因工程菌B135/pAYT55的孢子悬液转入种子培养基中，进行30℃、200转/分钟液体培养两天，获得种子培养物，再转接到产素培养基中，进行30℃、200转/分钟单独液体培养4-7天，对发酵液进行离心、收集上清液，乙酸乙酯萃取后，用LC/MS方法检测糖基化的新聚酮抗生素产物。

5.根据权利要求3所述的安哥拉糖胺合成酶和糖基转移酶基因工程菌的应用，其特征在于混合培养接种的菌株还有产Kalafungin的链霉菌菌株Streptomyces tanashiensis strain Kala DSM 40853，或者是产生带酚羟基的芳香聚酮抗生素的菌株Lambertella hicoriae，Streptomyces rosa，Streptomyces sp.No.9558，或者Actinoplans luojisanenesis，Stretomyces rimosus NRRL3016，或者Streptomyces olivaceus，Streptomyces capoamus。