CN100393867C - 格尔德霉素基因工程高产菌株的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及格尔德霉素基因工程高产菌株的构建，具体而言，就是根据在吸水链霉菌17997中发现的两组AHBA合酶基因簇，采用基因阻断技术，破坏可能参与萘醌型安莎类化合物生物合成的AHBA-shn基因，以便通过阻断或减少通往合成萘醌型安莎类化合物前体(N-AHBA)的量，增强苯醌型GDM前体(B-AHBA)供应代谢流，以提高GDM的发酵产量，结果证明，阻断变株比原株发酵产量提高近186%。
Description
技术领域：
本发明涉及基因工程技术在构建抗生素高产菌株中的应用。
背景技术：
格尔德霉素(geldanamycin，GDM)产生菌-吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)，是中国医学科学院医药生物技术研究所从中国土壤中分离得到的[陶佩珍等中国抗生素杂志，1997，22(5)：368]。格尔德霉素具有抗肿瘤和广谱抗病毒作用。近年研究显示，GDM可以特异性抑制热休克蛋白90(Hsp90)的功能。Hsp90是许多信号蛋白的伴侣分子。GDM通过对Hsp90的抑制，可以间接影响细胞内信号蛋白的功能，因此，GDM有望成为一种很有潜力的抗肿瘤和抗病毒药物。GDM的新颖作用机制决定了对其深入研究的潜在科学与经济价值。低毒、高效GDM衍生物的获得，自然也就成为当今新药研究的一个重要目标。目前，已有两个于GDM C17位进行取代的衍生物17-AAG和17-DMAG，相继在美国进行II期和I期临床试验[Goetz MP et al J Clin Oncol.2005，23(6)：1078-1087，Glaze ER et al Cancer Chemother Pharmacol.2005，56(6)：637-647]。因此，提高GDM的发酵产量，对于GDM及其衍生物的产业化具有重要的社会和经济效益。目前，我国江苏沃尔德实业有限公司也已进入GDM产业化阶段。
GDM属于苯安莎类抗生素。安莎类抗生素属于一种大环内酰胺，它们的结构中均含有一个芳香环(苯醌或萘醌)，其脂肪链是连结在芳香环的两个不相邻原子之间。芳香环的脂肪链通过酰胺键连接成为大环结构。安莎类抗生素芳香环的生物合成均以3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid，AHBA)作为起始单元。
利用生物技术实现对产生菌染色体的改造，对于提高GDM发酵产量和研制化学方法难以得到的衍生物具有重要意义。本实验室曾经利用参与GDM生物合成的起始单位AHBA合酶基因[专利申请号：ZL 02125509.1]，从其产生菌基因文库中发现并获得两组AHBA生物合成基因簇及与之连锁的部分PKS基因片段。通过基因阻断实验，鉴定了参与GDM生物合成的基因簇[HE WQ et al.CurrMicrobiol.2006，52(3)：197-203]。基因同源性分析表明，另一组AHBA生物合成基因簇(AHBA-shn)与萘醌型的同源性高于苯醌型基因簇，提示该产生菌中含有编码萘醌型安莎类抗生素的生物合成基因簇。抗生素生物合成中的前体供应，往往成为发酵产量的限制性因素。鉴于苯醌和萘醌型两种安莎类化合物共享AHBA作为其生物合成的起始单元，增加通往其中之一起始单元前体的供应，有望提高相关抗生素的产量。
本发明的目的是，采用基因阻断技术，破坏可能参与萘醌型安莎类化合物生物合成的AHBA-shn基因，通过阻断或减少通往合成萘醌型安莎类化合物前体(N-AHBA)的量，增强GDM前体(B-AHBA)供应代谢流，以提高GDM的发酵产量。
本发明所说的采用基因阻断技术构建格尔德霉素高产菌株的方法，迄今尚未见有相关报道。
发明内容：
本发明所提供的格尔德霉素基因工程高产菌株的构建，是根据在吸水链霉菌17997中发现的两组AHBA合酶基因簇，采用基因阻断技术，破坏可能参与萘醌型安莎类化合物生物合成的AHBA-shn基因，以便通过阻断或减少通往合成萘醌型安莎类化合物前体(N-AHBA)的量，增强苯醌型GDM前体(B-AHBA)供应代谢流，以提高GDM的发酵产量。为此，根据本实验室所测定的AHBA-shn基因簇的SOP基因序列(shnS-NCBI AY077756、shnO-NCBI AF506521、ShnP-NCBI AF506520)设计引物，以吸水链霉菌17997(中国微生物菌种保藏委员会药学微生物菌种保藏中心，保藏号CPHCC200178)基因组为模板进行PCR，分别获得与SOP基因同源的片段，在其中间以相应的酶切位点插入选择性抗性基因，并与能转入吸水链霉菌17997菌中的载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，获得进行基因阻断的重组载体。将构建的基因阻断重组载体导入吸水链霉菌17997中，传代后、单克隆分离，根据抗性表型，筛选获得同源基因双交换阻断突变株。对阻断变株在基因水平发生的DNA双交换进行PCR验证。变株发酵液直接进行HPLC分析，结果表明，吸水链霉菌17997中与萘醌型安莎类化合物前体合成相关的AHBA合酶基因被阻断后，格尔德霉素GDM的产量比原株提高了186％。AHBA的合成可能在吸水链霉菌17997中是个限制性因素，阻断该菌中与萘醌型安莎类抗生素合成相关基因簇shn SOP基因，可以使AHBA代谢流促进B-AHBA的供应，最终有利于GDM的合成。
发明效果：
本发明通过同源基因双交换阻断技术，破坏吸水链霉菌17997中与萘醌型安莎类化合物前体合成相关的AHBA合酶基因，获得了GDM发酵产量提高186％的高产菌株，对于GDM及其衍生物的规模化生产具有显著的社会与经济效益。
附图说明：
图1AHBA-shn基因簇的组成
其中：shnQ-氨基脱氢奎尼酸合酶；shnS-AHBA合酶，；shnO-氧化还原酶；
shnP-磷酸酶，；shnK-激酶，；shnJ-氨基脱氢奎尼酸脱水酶。
注：shnk和shnJ中间两个开放阅读框架不属于AHBA基因簇，故未标明。
图2萘醌型AHBA基因阻断重组载体的构建
图3基因阻断变株PCR产物电泳图
其中：1-S.hygroscopicus 17997原株；2-ΔSOP阻断变株；
M1-λDNA/HindIII分子量标准；M2-DNA分子量标准III。
图4HPLC检测ΔSOP变株发酵液的效价
其中：A-原株；
B-ΔSOP阻断变株；
横坐标：HPLC分析中保留时间(min)；纵坐标：HPLC分析中响应值。
实施方案：
以下所列实施例是为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
<实施例1>萘醌型AHBA基因阻断重组载体的构建
根据shn SOP基因序列任意设计引物，提取吸水链霉菌17997基因组DNA，以此作为模板进行常规PCR。在本实验中采用以下引物及设计的酶切位点，但不限于所说的引物序列。
上游引物：P1 5’-CCGGAATTCACACTCGCACGTCCAGCC-3’带有EcoRI酶切位点；
下游引物：P2 5’GCGGGTACCGCAGCCAGATGCAGTCGG-3’带有KpnI酶切位点；扩增1257bp片段S1。
上游引物：P3 5’-AAAACTGCAGCTGTGGCTCAGACTGCTGC-3’带有PstI酶切位点；
下游引物：P4 5’-CTAGTCTAGATGATGTCGGAAAGTAGCG-3’带有XbaI酶切位点；扩增1265bp片段S2。
本发明中所设计的PCR引物，在萘醌型AHBA基因簇的相应部位见图1。
回收PCR产物片段S1和S2，在其中间以PstI-KpnI酶切位点插入Am抗性基因，[来源于质粒载体pKC1139(英国John Innes Centre，Norwich ResearchPark，Colney Norwich R4 7UH)]，并以EcoRI-XbaI酶切位点与可在吸水链霉菌转化的载体如pGH112载体(中国科学院微生物研究所提供，通过正常渠道可以向公众提供)相应酶切位点进行连接。pGH112载体携带硫链丝菌素，Tsr抗性)。连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取转化子DNA，经酶切证明获得基因阻断载体pGHEX-shn。基因阻断载体构建流程见图2。
<实施例2>基因阻断株的获得及鉴定
基因阻断株的筛选按照文献[赫卫清等中国抗生素杂志，2006，31(3)：168-171]进行。将构建的基因阻断载体pGEX-shn通过能与吸水链霉菌进行接合转移的大肠杆菌，如大肠杆菌ET12567/pUZ8002[英国John InnesCentre，Norwich Research Park，Colney Norwich R4 7UH]导入到吸水链霉菌17997中，并在MY培养基中传3～4代后，再进行单克隆分离，根据对Tsr和Am抗性表型，筛选获得经同源基因双交换Am抗性、Tsr敏感的阻断突变株ΔSOP。对ΔSOP阻断变株在基因整合水平进行PCR验证。以原株和ΔSOP变株的基因组为模板，选取构建基因阻断载体的S1和S2片段两翼外测序列所设计引物的P5和P6(见图1)进行PCR，结果见图3。结果表明，使用引物P5和P6原株基因组PCR产物大小约4kb左右，而在ΔSOP变株中扩增出将近6kb的
P5上游引物：5’GGCCTCTAGAAGCGCATAGGTTACGA3’(XbaI)
P6下游引物：5’CTAGTCTAGATGATGTCGGGAAAGTAGCG3’(XbaI)
特异性条带。PCR结果揭示在同源基因片段之间，插入了1.5kb左右的Am抗性基因，符合预期结果。ΔSOP变株在不加药连续传代中Am抗性表型很稳定，说明该变株中确实发生了DNA同源重组双交换所造成的Am抗性基因插入，并使shn SOP基因由于阻断而受到破坏。
<实施例3>格尔德霉素在ΔSOP变株中发酵产量的提高
ΔSOP变株按照文献[高群杰等中国抗生素杂志2002，27(1)：13～17]所述方法进行发酵培养5天，发酵液离心，直接取5μl发酵液样品使用ShimadzuLC-10Avp高压液相色谱仪，SPD-M10AvP二极管阵列检测器，CLASS-VP工作站进行HPLC检测，采用甲醇∶水＝40～100％梯度洗脱30min，选择波长304nm进行检测，结果见图4和表一。
表一HPLC检测GDM的发酵产量
根据峰面积测算，ΔSOP变株发酵液中Gdm的含量比17997原株提高约186％。说明在吸水链霉菌17997原株中，阻断shn SOP基因可以明显提高菌株的Gdm产量。
Claims (2)
1.格尔德霉素基因工程高产菌株的构建方法，其特征是通过同源基因双交换阻断技术，破坏吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus17997)中参与萘醌型安莎类化合物前体合成的AHBA合酶基因，以获得格尔德霉素高产菌株。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是根据AHBA-shn基因簇的SOP基因序列任意设计引物，以吸水链霉菌17997基因组为模板进行PCR，分别获得与SOP基因同源的片段，在其中间以相应的酶切位点插入选择性抗性基因，并与能转入吸水链霉菌17997菌中的载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，获得进行基因阻断的重组载体；将构建的基因阻断重组载体导入吸水链霉菌17997中，传代后、单克隆分离，根据抗性表型，筛选获得同源基因双交换阻断突变株；对阻断变株在基因水平发生的DNA双交换进行PCR验证，变株和原株的发酵液直接进行HPLC分析比较，证明该阻断变株的GDM发酵产量得到明显提高。
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