NO148959B - Fremgangsmaate ved fremstilling av tumor-motvirkende antracyklinglykosidantibiotika, betegnet ma 144 - Google Patents

Fremgangsmaate ved fremstilling av tumor-motvirkende antracyklinglykosidantibiotika, betegnet ma 144 Download PDF

Info

Publication number
NO148959B
NO148959B NO773353A NO773353A NO148959B NO 148959 B NO148959 B NO 148959B NO 773353 A NO773353 A NO 773353A NO 773353 A NO773353 A NO 773353A NO 148959 B NO148959 B NO 148959B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
streptomyces
atcc
antibiotics
growth
deoxy
Prior art date
Application number
NO773353A
Other languages
English (en)
Other versions
NO773353L (no
NO148959C (no
Inventor
Hamao Umezawa
Tomio Takeuchi
Toshikazu Oki
Taiji Inui
Original Assignee
Microbial Chem Res Found
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP12023776A external-priority patent/JPS5344555A/ja
Priority claimed from JP6090877A external-priority patent/JPS5463067A/ja
Application filed by Microbial Chem Res Found filed Critical Microbial Chem Res Found
Publication of NO773353L publication Critical patent/NO773353L/no
Publication of NO148959B publication Critical patent/NO148959B/no
Publication of NO148959C publication Critical patent/NO148959C/no

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20Carbocyclic rings
    • C07H15/24Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465Streptomyces
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465Streptomyces
    • C12R2001/48Streptomyces antibioticus ; Actinomyces antibioticus
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215Microorganisms
    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886Streptomyces
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215Microorganisms
    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886Streptomyces
    • Y10S435/888Streptomyces antibioticus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av tumor-motvirkende antracyklinglykosid-antibiotika MA 144 med den generelle formel
12 '3 hvor R , R og R betegner følgende:
Forskjellige typer antracyklinglykosider er blitt funnet i vekstmedia for mikroorganismer, hvilket er beskrevet i litteraturen. Blandt disse har daunomycin og adriamycin allerede funnet klinisk anvendelse ved behandling av kreft hos mennesker, og aclacinomycin A, carminomycin og rubiazone er under klinisk utprøvning og har vakt stor interesse innen feltet kreft-kjemoterapi.
Ved undersøkelser av kulturer av streptomyces med hensyn til metabolitter med antitumor-aktivitet er det funnet nye forbindelser, og etter rensing og karakterisering basert på deres fysiokjeniske egenskaper er det nå underbygget at de nye antibiotika som er betegnet MA144-G1, -G2, -L, -NI, -Sl, -S2, -Ul, -U2 og -Y,er nye forbindelser med potent antitumor-aktivitet og som utviser lav toksisitet.
Fremstilling av adriamycin ved kultivering av S. peuceticus var. caesius er vist i US-patent nr.' 3.590.028. Kjemisk om-dannelse av daunomycin til adriamycin er vist i US-patent nr. 3.803.124.Daunomycin (fremstilt ved dyrkning av S. peuceticus i GB 1.003.383) kan være den samme som Rhone-Poulenc's 13,057 R.P. (tidligere betegnet med rubidomycin og nå betegnet med daunoribicin, (se de engelske patenter nr. 985.598, 1.188,262 og 1.241.750 og US-patent nr. 3.616. 242) og er sannsynligvis identisk med Ciba's danubomycin som er vist i US-patent nr. 3.092.550 ogGB-patent nr. 901.830. Se også US-patent nr. 3.686.163 vedrørende di-hydrodaunomyc in.
Antracyklin-antibiotika inneholdende aklavinon-aglykongrupper er åpenbart i
(a) aclacinomycin A og B i US-patent nr. 3.988.315 og av
Oki'et al i J, Antibiotics 28:830 (1975).
(b) Aklavin i J. Bacteriol. 72:90 (1956).
Antracyklin-antibiotika med £-pyrromycinon-aglykongrupper
er beskrevet i litteraturen som følger:
(c) musettamycin og marcellomycin fra bohem-syrekompleks i|J, Antibiotics 30:525 (1977).
(d) pyrromycin i Chem. Ber. 92:1904.(1959).
(e) cinerubin A og B i UK 846.130 (se også US-patent nr.
3.864. 48.0 og Keller-Schierlein et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, side 68 (1970)).
Andre antracyklin-antibiotika med aglykongrupper forskjellige fra aklavinon og £-pyrromycinon er beskrevet i (f) Nogalamycin i J. Amer. Chem. Soc. 99:542 (1977).
(g) Steffinmycin i J. Antibiotics 27:805, 809 (1974).
(h) carminomycin i J. Antibiotics 27:254 (1974) i vesttysk patent nr. 2.362.707 og i J. Amer. Chem. Soc. 97:5955
(1975).
(i) Trypanomycin i Antimicrobial Agents and Chemotherapy
1:385 (1972)
(j) Requinomycin i J. Antibiotics 25:393 (1972).
(k) Galirubin A og B i Naturwiss. 52:539 (1965) og Chem.
Abst. 67:90573z (1967).
For ytterligere opplysninger og sammendrag vedrørende antra-cyklinantibiotika se Index of Antibiotics from Actinomycetes, Hamao Umezawa, Editor-in-Chief, University Park Press, State College,Pennsylvania, U.S.A. (1967) som følger:
I boken Antibiotics, bind 1, Mechanism of Action, redigert av David Gottlieb og Paul D. Shaw, Springer-Verlag New York, Inc., N.Y., N.Y. (1967) er det på sidene 190-210 gitt en oversikt av A. DiMarco under overskriften Daunomycin and Related Antibiotics. Information Bulletin, Nr. 10, Inter-national Center of Information of Antibiotics, i samarbeide med WHO, desember 1972, Belgia, gir en oversikt over antra-cykliner og deres derivater.
De antibiotika som fremstilles ved foreliggende oppfinnelse er nyttige ved behandling av bakterieinfeksjoner og for
inhibering av tumorer hos pattedyr.
Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles forbindelsene ved at man dyrker en av de følgende M 144-produserende stammer Streptomyces sp. ME505-HE1 (FERM P-3 667) ATCC 3127 3, Streptomyces galilaeus MA 144-M1 (FERM P-24 55) ATCC 31133, Streptomyces galilaeus ATCC 14969, Streptomyces cinereouber ATCC 19740, Streptomyces niveoruber ATCC 14971, Streptomyces antibioticus ATCC 8663 eller Streptomyces purpurascens ATCC 25489 under submerse aerobe forhold i et næringsmedium som inneholder et hydrokarbon, et nitrogennæringsmiddel, uorganiske salter og spormetaller ved en temperatur mellom 2 0 og 37°C og pH mellom 6 og 9 i 2 til 7 dager, hvoretter man kan opparbeide og isolere respektive antracyklinglykosider ved hjelp av løsningsmiddel-ekstraksjon, eventuelt under anvendelse av gjentatt ekstraksjon med løsningsmidler som er ikke-blandbare med vann ved pH mellom 6 og 9 og med sure vannløs-ninger eller med løsningsmidler som er blandbare med vann ved pH under 4, og eventuelt i forbindelse med dette utføre kolonnekromatografering under anvendelse av kiselsyre som absorbent og inndampe de derved erholdte antracyklinglyko-sidholdige løsninger i vakuum.
Oppfinnelsen tilveiebringer således de følgende antibiotika med antitumor-virkning, nemlig MA14 4-G1, -G2, -L, -NI, -Sl,
-S2, -Ul, -U2 og -Y, som
(a) utviser antimikrobiell aktivitet mot gram-positive
bakterier,
(b) er effektive ved inhibering av vekst av ondartede svuls-ter hos pattedyr, og (c) utviser høy cytotoksisitet og således inhiberer vekst og
dannelse av RNA i pattedyr-tumorceller i kultur.
Fysiokjemiske egenskaper for disse MA144 komponenter er som følger: MA144- G1 kan isoleres som et gult amorft pulver med et smeltepunkt i området 141 - 145°C, det er optisk aktivt med W ^° +54° (c=0,33, CHClj); er et svakt basisk antracyklinglykosid, D-cinerulosyl-2-deoksy-L-fukosyl-L-rhodosaminyl-aklavinon, har den empiriske formel C42H53°i5N-MA144- G2 kan isoleres som et rødt amorft pulver med et smel tepunkt i området 152 - 156°C, og er et svakt basisk antracyklinglykosid, D-cinerulosyl-2-deoksy-L-fukosyl-L-rhodosaminyl- - pyrromycinon, med den empiriske formel <C>42<H>53°16<N>"
MA144- L kan isoleres som et gult amorft pulver med et smeltepunkt i området 134 - 136°C, og er et svakt basisk antracyklinglykosid,
L-cinerulosyl-2-deoksy-L-fukosyl-N-monodemetyl-L-rhodosaminyl-aklavinon, med den empiriske formel <C>41<H>51°15<N>-
MA144- N1 kan isoleres som et gult amorft pulver med et smeltepunkt i området 14 6 - 147°C, og er optisk aktivt medr-O^<0> + 57,5° (c = 0,4, CHC13).; er et svakt basisk antracyklinglykosid, L-rhodinosyl-2-deoksy-L-fukosyl-L-rhodosaminyl-aklavinon med den empiriske formel ^42H55^i5N'
MA144- S1 kan isoleres som et gult amorft' pulver med et smeltepunkt i området 144 - 147°C og er optisk aktivt med[>0^<0> + 77° (c=l ,0 .CHCl-j) ; og er et svakt basisk antracyklinglykosid, 2-deoksy-L-fukosyl-L-rhodosaminyl-aklavinon med den empiriske formel'C^gH^^O^^N.
MA144- S2 kan isoleres som et rødt amorft pulver med et smeltepunkt i området 154 - 158°C, og er et svakt basisk antracyklinglykosid,
2-deoksy-L-fukosyl-L-rhodosaminyl-£-pyrromycinon, med den empiriske formel <C>36H45°i4<N>>
MA144- U1 kan isoleres som et gult amorft pulver med et smeltepunkt i området 152 - 155°C og er optisk aktivt med ^ + 31° (c=l,0, CHCl^); er et svakt basisk antracyklinglykosid, 2-deoksy-L-fukosyl-2-deoksy-L-fukosyl-L-rhodosaminyl-aklavinon med den empiriske formel C-4 2H55°16N * ;MA144- U2 kan isoleres som et rødt amorft pulver med et smeltepunkt i omrdået 160 - 164°C, er et svakt basisk antracyklinglykosid, ;2-deoksy-L-fukosyl-2-deoksy-L-fukosyl-L-rhodosaminyl-t-pyrromycinon med den empiriske formel C^^s^-j^N • ;MA144- Y kan isoleres som et gult amorft pulver med et smeltepunkt i området 153 - 155°C, og er optisk aktivt med 66° (c=l,0., CHC13), er et svakt basisk antracyklinglykosid, ;L-akulosyl-2-deoksy-L-fukosyl-L-rhodosaminyl-aklavinon, med den empiriske formel C^^i^is^- ;Fig. 1 viser ultrafiolett og synlig lysabsorpsjonsspektrum for ;MA144-G1 i 90%<1>ig metanol ;Fig. 2 viser ultrafiolett og synlig lysabsorpsjonsspektrum.for ;MA144-G2 i 90%'ig metanol. ;Fig. 3 viser ultrafiolett og synlig lysabsorpsjonsspektrum for ;MA14 4-L i 90%'ig metanol. ;Fig. 4 viser ultrafiolett og .synlig lysabsorpsjonsspektrum for ;MA14 4-N1 i 90%'ig metanol. ;Fig. 5 viser ultrafiolett og synlig lysabsorpsjonsspektrum for MA144-S1 i 90%'ig metanol. Fig. 6 viser ultrafiolett og synlig lysabsorpsjonsspektrum for ;MA14 4-S2 i 90%'ig metanol. ;Fig. 7 viser ultrafiolett og synlig lysabsorpsjonsspektrum for ;MA144-U1 i 90%'ig metanol. ;Fig. 8 viser ultrafiolett og synlig lysabsorpsjonsspektrum for ;MA144-U2 i 90%'ig metanol. ;Fig. 9 viser ultrafiolett og synlig lysabsorpsjonsspektrum for ;MA144-Y i 90%'ig metanol. ;Fig.10 viser infrarødt absorpsjonsspektrum for MA144-G1 i kalium bromid. Fig.11 viser infrarødt absorpsjonsspektrum for MA144-G2 i kalium bromid. Fig.12 viser infrarødt absorpsjonsspektrum for MA144-L i kalium bromid. Fig.13 viser infrarødt absorpsjonsspektrum for MA144-N1 i kalium bromid. Fig.14 viser infrarødt absorpsjonsspektrum for MA144-S1 i kalium bromid. Fig.15 viser infrarødt absorpsjonsspektrum for MA144-S2 i kaliumbromid. Fig. 16 viser infrarødt absorpsjonsspektrum for MA144-U1 i kalium bromid. Fig. 17 viser infrarødt absorpsjonsspektrum for MA144-U2 i kalium bromid. Fig. 18 viser infrarødt absorpsjonsspektrum for MA144-Y i kaliumbromid. ;Fig. 19 viser NMR spektrum av MA144-G1 i CDCI3 (60 MHz). ;Fig. 20 " MA144-G2 ;Fig. 21 " MA-144-L ;Fig. 22 " MA144-N1 " (100 MHz). ;Fig. 2 3 " MA144-S1 " (60 MHz) ;Fig. 24 " MA144-S2 " " ;Fig. 25 " MA144-U1 ;Fig. 26 '* MA144-U2
Fig. 27 " MA144-Y " (100 MHz).
Fig. 28 viser ultrafiolett<l>og synlig lysabsorpsjonsspektrum for det metylerte disakkarid erholdt fra MA 144-Y i metanol (0,04 g/l). Fig. 29 viser infrarødt absorpsjonsspektrum.for det metylerte
disakkarid erholdt fra MA 144-Y i kaliumbromid.
Fig, 30 viser NMR spektrum åv det metylerte disakkarid erholdt fra MA 144-Y i CDC13 (100 MHz).
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ni nye antracyklin-antibiotika, MA 144-Gl, -G2, -L, -NI, -Sl, -S2, -Ul, -U2 og -Y, som er funnet å utvise antibakteriell og antitumor aktivitet. Mer spesielt utviser forbindelsene aktivitet mot gram-positive bakterier, inhiberer veksten av forskjellige pattedyrtumorer så som L1210 og P388 leukemi hos mus, samt utviser lav toksisitet.
Følgelig er de fremstilte forbindelsene nyttige som anti-bakterieTle og antitumor-midler. Som brukt i det etter-følgende betegner MA 14 4 bestanddeler i et antibiotikum om-fattende minst en av MA 144-Gl, -G2, -L', -NI, -Sl, -S2,
-Ul, -U2 og -Y.
En av organismene (som produserer rodirubin-antibiotika)
som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse, ble isolert fra en jordprøve oppbevart i Institute of Microbial Chemistry, Tokyo i juli 1974 og fikk stammenummeret ME505-HE1.
Stammen nr. ME505-HE1 hadde de følgende egenskaper:
1. Morfologiske egenskaper:
Under mikroskopet relativt langt og rectifleksibelt luft-mycel fra forgrenet substrat-mycel. Ferdig'sporekjedé består av mer enn 10 sporer som måler 0,6-0,8X1,0-1,2 p. ogdets over-flate er glatt.
2. Egenskaper på forskjellige media:
Beskrivelsen i parentes følger fargestandarden "Colour Har-mony Manuel" utgitt av Container Corporation of America
U.S.A.
(1) På sucrose-nitrat-agar inkubert ved 27 C; fargeløs til
svak purpurrød vekst (midten av koloniene er lysere til mørk purpur 9 ic til 9 lc, "Raspberry Rose" }. Ikke noe eller lite hvitt luft-mycel; intet løselig pigment. Når en dråpe IN HC1 ble satt til et lite stykke mycel kuttet ut med kork-bor etter 15 dagers inkubasjon, forandret den rødlige purpurfarge i veksten seg til lyserød.
(2) På glucose-asparagin-agar, inkubert ved 27°C; fargeløs
til mørk rødlig orange [5 lc, Kobber] til lys rødlig orange C6 ga,"Lt Coral Rose"J vekst; intet luft-mycel, intet løselig pigment.
(3) . På glycerol-asparagin-agar (ISP medium nr. 5) inkubert
ved 27°C; fargeløs til lys rødorange f^5 lc, kobber] til gulrød f6 ne, Redwood] til purpurrød \_9 nc, bringebær] vekst; intet luft-mycel eller delvis og tynt hvitt til rødhvitt til svakt lyserødt mycel; intet løselig pigment. Når en dråpe IN NaOH ble satt til luftmycelet som var skåret ut til et
lite stykke med korkbor, etter 15 dagers inkubasjon, skiftet den gulrøde fargen i veksten til purpurfarge.
(4) På uorganiske salter (stivelses-agar) (ISP.medium nr. 4) inkubert ved 27°C; fargeløs til grålig rødbrun £4 ni, krydder-brun til 5 lg, kokosbrun] vekst; hvit til svakt lyserødt tynt luft-mycel; lys brunt løselig pigment. (5) På tyrosin-agar (ISP medium nr. 7) inkubert ved 27°C; fargeløst til lys brunt til gulbrunt til grålig rødbrunt, videre, skiftet fargen fra rundt 15 dagers inkubasjon til lys gulbrunt [6 lc, koral] til mørkerødt ]6 ne, RedwoodJ, eller mørkt rødbrunt ^7 pn, Dk Rose Brown til 7 1/2 pl, mørk MaroonJ,; intet eller lite hvitt luft-mycel ble funnet etter 21 dagers inkubasjon; svakt rødbrunt løselig pigment. (6) På nærings-agar inkubert ved 27°C, svakt gulbrun til lysbrun vekst; intet eller lite hvitt luft-mycel etter 15 dagers inkubasjon; brunt løselig pigment.
(7) På gjær-ekstrakt - maltekstrakt agar (ISP medium nr.
2), inkubert ved 27°C; fargeløs til lysegul til lysebrun til mørkerød til mørk purpurrød {_! 1/2 ng, gammelvinrød til 7 1/2 pg, vinrødjvekst, tynt hvitt til lyserødt hvitt luft-mycel etter ca. 2 dagers inkubasjon; meget svakt brunaktig løselig pigment etter 10 dagers inkubasjon. (8) På hvetemels-agar (ISP medium nr. 3) inkubert ved 27°C; fargeløs til lysbrun til mørk rødorange til rødbrun [6 pi, mahognybrun"] vekst; ikke noe luft-mycel; meget svakt mørk orange løselig pigment. (9) På glycerol-nitrat-agar inkubert ved 27°C; fargeløs til blek lyserød til grålig rød til mørkerød [^8 ne, Rosévin] til mørk purpurrød £9 ne, bringebær til 9 pg, rød plommej til mørk brun purpur vekst; ikke noe eller lite hvitt luft-mycel. Når en dråpe IN NaOH ble satt til et lite stykke mycel skåret ut med korkbor etter 15 dagers inkubasjon skiftet den mørke rød-fargen hos veksten til purpur, ikke noe løselig pigment. (10) På stivelses-agar inkubert ved 27°C; fargeløs til svakt lysrød til blek rødbrun til mørk rødorange eller mørkere purpur £8 ne, Rosévin] vekst; svakt rødlig tynt luftmycel; intet løselig pigment. (11) På kalsium-malat-agar inkubert ved 27°C; fargeløs til svakt lysere vekst; nesten ikke noe luft-mycel eller lite hvitt luft-mycel; ikke noe løselig pigment. (12) På cellulose-agar inkubert ved 27°C; fargeløs til svak brun vekst; ikke noe luft-mycel, ikke noe løselig pigment. (13) På gelatin-stikk: På rene gelatin-stikk, inkubert ved 20°C; fargeløs til lys gulbrun til lys brun vekst; ikke noe luft-mycel; brunt løselig pigment.
På glucose-petone-gelatin-stikk, inkubert ved 27°C; farge-
løs til lys gulbrun til lysebrun vekst; ikke noe luft-mycel; mørk brunt løselig pigment. (14) På skummet melk inkubert ved 3 0°C; fargeløs til lys gulbrun til gulbrun vekst; nesten ikke noe eller lite brunaktig hvitt luftmycel, brunt løselig pigment.
3. Fysiologiske egenskaper:
(1). Veksttemperatur-område:
Optimumtemperatur for vekst på gjærekstrakt - stivelses-
agar (oppløselig stivelse 1,0%; gjærekstrakt (Daigoeiyo-
kagaku Co.) 0,2%; agar 3,4%; pH 7,0-7,2) ble undersøkt ved 20, 24, 27, 30, 37 og 50°C. Vekst ble funnet ved hver temperatur bortsett fra 37 og 50°C, og optimumstemperaturen synes å være rundt 27°C. (2) Fordråpning av gelatin (inkubert ved 20°C og 15% ren gelatin; ved 27°C på glucose-pepton-gelatin):
På rent gelatin-medium begynte fordråpning moderat etter ca.
3 dagers inkubasjon. På glucose-pepton-gelatin-medium begynte fordråpning moderat til sterkt etter ca. 3 dagers inkubasjon. (3) Hydrolyse av stivelse (inkubert ved 27°C på uorganiske salter- stivelses-agar og stivelses-agar):
Middels til sterk hydrolytisk aktivitet ble funnet etter
5 dagers inkubasjon.
(4) Koagulering og peptonisering av skummet melk.
(Inkubert ved 3 0°C på skummet melk):
Ingen forandring ble observert inntil etter 7 dagers inkubasjon, koaguleringen var avsluttet etter 10 dagers inkubasjon, og deretter begynte peptonisering og var ferdig etter 3
ukers inkubasjon. Virkningen var middels til sterk.
(5) Melanoid pigment-dannelse (inkubert ved 27°C på trypton-gjærekstrakt-medium, ISP medium nr. 1; peptongjærekstrakt-jern-agar, ISP medium nr. 6; tyrosin-agar, ISP medium nr. 7); Melanoid pigment ble observert på pepton-gjærekstrakt-jern-agar og tyrosin-agar, og ikke på trypton-gjærekstrakt-medium. (6) Anvendelse av karbohydrater (inkubert ved 27°C, Pridham-Gottlieb basis agar, ISP medium nr. 9): God vekst med L-arabinose, D-xylose, D-glucose, D-fruktose, inositol, L-rhamnose, raffinose og D-mannitol, men ingen vekst med sucrose. (7) Fordråpning av kalsium-malat. (Inkubert ved 27°C på kalsium-malat-agar):
Fordråpning av kalsium-malat rundt veksten begynte etter
5 dagers inkubering med moderat til sterk aktivitet.
(8) Nitrat-reduksjon (inkubert ved 27°C på pepton-vann som inneholdt 1,0% kaliumnitrat, ISP medium nr. 8).: Negativ.
Som en konklusjon på ovennevnte egenskaper tilhører stam-
men ME505-HE1 slekten Streptomyces, og luft-mycel danner ikke spiraler eller vinninger og sporeoverflaten er glatt. Veksten på forskjellige medier var lys brun til dyp purpurrød til mørk purpurrød, og ikke noe luft-mycel eller tynt hvit til lys rød-hvit til svakt lyserød farge ble observert. Løselig pigment ble nesten ikke observert på noe medium, men det var noen til-feller hvor man fikk svakt brunlig eller rødbrunt løselig pigmem: Derimot viste baksiden av kolonien karakteristisk vinrød farge ro; pH indikatoregenskaper. Fremstillingen av melanoid pigment var positiv på pepton-gjærekstrakt-jern-agar og tyrosin-agar-medium og negativ på trypton-gjærekstrakt-medium. Hydrolytisk aktivitet av protein og stivelse er begge moderate til sterke. Som et videre karakteristisk punkt ved stammen ble ingen vekst funnet ved 37°C. Av kjente arter i sammenligning med ovennevnte karakteristika finnes Streptomyces capoamus å være nær be-slektet med foreliggende stamme. (Reference 1. Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 22,282,1972).. Når stammen ME505-HE1 ble sammenlignet med standardstammen av Streptomyces capoamus, var resultatene som sammenfattet i den følgende tabell.
Som vist i tabellen forelå forskjellen mellom stammen ME505-
HE1 og Streptomyces capoamus først og fremst i dannelsen av luft-mycel; d.v.s. Streptomyces capoamus danner terminale spiraler av luf t-mycelet, mens stammen ME505-HE1 har dårlig luft-mycel, og så langt man har undersøkt ble ingen spiraler funnet. Dannelse av melanoid pigment på ISP medium nr. 1, koagulering av melk, fordråpning av gelatin og utnyttelse av inositol og L-rhamnose hos de to stammer er forskjellig, men andre egenskaper for begge stammer var temmelig sammen-holdne. En kultur av stammen ME505-HE1 ble deponert hos Fermentation Research Institute 7. august 1976 under nummeret FERM Nr. 3667. Fremstilling i henhold til oppfinnelsen utføres ved kultivering av de ovenfor nevnte stammer av streptomyces i et konvensjonelt vandig næringsmedium inneholdende kjente næringkilder for actinomycetes, dvs. karbonkilder, nitrogen og uorganiske salter. Submers aerob kultivering anvendes for fremstilling av betydelige mengder MA 144 komponenter,
på samme måte som for andre antibiotika. De generelle prosedyrer anvendt for kultivering av andre actinomycetes er anvendbare for kultivering i henhold til foreliggende oppfinnelse. Mediet inneholder fortrinnsvis kommersielt tilgjengelige karbonkilder, slik som glukose, glycerol, stivelse, dekstrin, sukrose, maltose, oljer, fett og lignende enten i renset eller rå tilstand og kommersielt tilgjengelige nitrogenkilder så som soyabønnemel, gjær-ekstrakt, pepton, bomullsfrøpulver, tørket gjær, mais-støpevæske eller uorganiske salter så som ammoniumsulfat, natriumnitrat eller ammoniumklorid. Uorganiske salter,
slik som natriumklorid, kaliumklorid eller fosfater anvendes fortrinnsvis og om nødvendig kan tilsettes spormetallioner og skumhindrende middel, så som "Adekanol" (Asahi Denka Ind. Co.) eller "Silicone" (Shinetsu Chem. Ind. Co.). Fermen-teringstemperaturen ligger i området 20 - 37°C, fortrinnsvis 25 - 3 0°C. pH for mediet holdes i området 6-9. Produksjonen av MA 14 4 komponenter i kulturmediet når et maksimum etter 2-7 døgn enten i rysteflaske eller ved submers,aerob fermentering med lufting og ved omrøring, slik som vist i de etter-følgende eksempler.
Forbindelsene fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse kan gjenvinnes fra et kulturmedium og skilles fra hverandre ved de følgende fremgangsmåter.
MA 144 komponentene fremstilt ved fermentering eksisterer intracellulært såvel som ekstracellulært, men forefinnes i det vesentlige i myceliet. For å gjenvinne MA 144 komponentene fra kulturmediet kan dette filtreres og filtratet ekstraheres med et ikke vannblandbart organisk oppløsnings-middel, såsom kloroform, etylacetat, toluen, benzen, butyl-acetat, n-butanol, metylpropyl-keton, metylenklorid etc, i et surt eller svakt surt miljø.
MA144 komponentene i myceliet kan gjenvinnes ved ekstraksjon med et organisk oppløsningsmiddel såsom kloroform, aceton, n-butanol, metanol,'etanol, etylacetat eller en vandig oppløsning av en organisk eller uorganisk syre såsom saltsyre eller eddiksyre. Alter-nativt kan MA144 bestanddelene ekstraheres direkte fra kulturmediet ved hjelp av de ovenfor nevnte ekstraksjonsmåter uten en foregående separasjon av myceliet. Etter konsentrering i vakuum kan MA144 ekstraktene re-ekstraheres med et med vann uoppløselig organisk oppløsningsmiddel ved en pH i området 6-9. Etter konsentrasjon under forminsket trykk blandes MA konsentratene med en sur /åndig oppløsning med en pH under 4, hvoretter MA144 komponentene i den sure vandige oppløsning re-ekstraheres med et organisk oppløsningsmiddel etter justering til en svakt basisk pH. Ved å gjenta de ovenfor nevnte prosedyrer om nødvendig, kan MA144 komponentene fremstilles i renset form. I forbindelse med dette kan man kolonnekromatografere på kiselgel som adsorbent. Aktive ekstrakter erholdt ved slike fremgangs-
måter konsentreres under nedsatt trykk og erholdes som et rødt eller gult pulver av MA144 komponenter.
Aktive ekstrakter erholdt ved slike fremgangsmåter konsentreres under nedsatt trykk og erholdes som et rødt -eller gult pulver av MA144 komponenter.
Strukturen av MA144-G1, -G2, -L,-Nl, -Sl, -S2, -Ul, -U2 og -Y fremstilt i henhold til oppfinnelsen ble bestemt på følgende måte: Ved sur hydrolyse med 0,1N saltsyre i 30 min ved 85°C stemte de fysiokjemiske egenskaper, såsom absorpsjonsspektra for ultrafiolett, synlig og infrarøde områder, masse- og kjernemagnetisk resonans, smeltepunkt, elementæranalyse og Rf-verdier for silikagel-tynnsjikt av aglycon-delen erholdt fra MA144-G1, -L, -NI, -Sl, -Ul og -Y fullstendig med de for aklavinon (Tetrahedron Lett. nr. 8, 28-34, 1960), og de erholdt fra aglycon-delen erholdt fra MA144-G2, -S2, og -U2 fullstendig med de for £-pyrromycinon (Chem. Ber. 92, 1880-1903, 1959).På den annen side ble sukkerenhetene som eksisterte i den vannoppløselige fraksjon av de ovenfornevnte hydrolysater bestemt ved silikagel-tynnsjikt-kro-matografi (Merck Co. "^^ 254 " sili^agelplate, n-butanol:eddiksyre:vann = 4:1:1) ved å sammenligne deres Rf-verdier, etter nøytralisering og konsentrasjon, med de for autentiske sukre - erholdt fra aklacinomycin A (J. Antibiotics, 28, 830-834, 1975) og streptolydizin (J. Amer. Chem. Soc. 86, 3592-3594, 1972).
Rf-verdier for sukkerenhetene erholdt fra MA144 komponentene er vist i den etterfølgende tabell, og det finnes 3 typer sukre i MA144-G1, -G2, -L, -Y og -NI og 2 i MA144-S1, -S2, -Ul og -U2.
Fra en sammenligning med R^-verdier, forskjellige fargereaksjo-ner og optisk rotasjon for autentiske sukre, ble en sukkerenhet tilsvarende R^ = 0,16 identifisert som L-rhodosamin, R^= 0,60
var 2-deoksy-L-fukose, R^ = 0,72 var L-rhodinose og R^ = 0,83
var L-cinerulose,men sukrene med R^ = 0,20 og 0,7 8 var ukjente.
Ved partiell metanolyse av MA144 komponentene i metanol inneholdende 0,01 N saltsyre ved romtemperatur ga MA144- Gl, -NI, -Sl,
-Ul og -Y 1-deoksypyrromycin (L-rhodosaminyl-aklavinon, J. Antibiotics, 28.830-834, 1975), som ble identifisert på bakgrunn av dets fysiokjemiske egenskaper, såsom R^-verdi ved tynnsjikt-kroma-tografi på silikagel, smeltepunkt, IR, UV og synlig lysabsorpsjonsspektra og NMR spektrum, og de tilsvarende metylerte sakkarider, MA144-G2, -S2 og -U2 ga pyrromycin (Chem. Ber. 92, 1880-1903, 1959) og de tilsvarende metylerte sakkarider, og MA144-L
ga et ukjent anthracyklin-glykosid og det tilsvarende metylerte disakkarid.
Den følgende generelle formel, D-cinerulosyl-2-deoksy-L-fukosyl-L-rhodosaminyl-aklavinon og -£-pyrromycinon av MA144-G1 og -G2,
13
ble bestemt ved hjelp av NMR, C-NMR og IR spektra av de nevnte forbindelser og de for de metylerte disakkarider derav.
MA144-L bestod av aklavinon og 3 sukkerenheter, nemlig et
ukjent aminosukker med R^-verdi på 0,20, 2-deoksy-L-fukose og
13 L-cinerulose. Analyse av NMR og C-NMR spektra for aklavinon-glykosid og det metylerte disakkarid erholdt fra MA144-L ved metanolyse viste at de er henholdsvis N-monodemetyl-L-rhodosaminyl-aklavinon og metylcinerulosyl-2-deoksy-L-fukosid, som erholdt fra aclacinomycin A.
Således ble den kjemiske struktur for MA144-L bestemt til å være følgende:
MA144-S1 og -S2 inneholder to typer sukkerenheter, nemlig L-rhodosamin og 2-deoksy-L-fukose.Metyl-2-deoksy-L-fukosid og 1-deoksypyrromycin eller pyrromycin ble dannet ved metanolyse og følgelig ble den følgende struktur for 2-deoksy-L-fukosyl-L-rhodosaminyl-aklavinon eller -pyrromycinon påvist for MA144-Sl og -S2.
MA144-N1 er overensstemmende med aklavinon og tre typer sukkerenheter, nemlig L-rhodosamin- 2-deoksy-L-fukose og L-rhodinose, For å bestemme sukkerrekkefølgen ble en mild hydrolyse i 0,5 %' ig saltsyre utført ved romtemperatur i 10 min i henhold til frem-gangsmåten til Biedermann et al (Pharmazie, 27, 782-789, 1972) og L-rhodinose ble frigjort under en samtidig dannelse av MA 144-Sl. Den kjemiske struktur for MA144-N1 ble således påvist å være følgende: MA144-U1 og -U2 inneholder to typer sukkerenheter, nemlig L-rhodosamin og 2-deoksy-L-fukose. Ytterligere ved metanolyse dannes metyl-2-deoksy-L-fukosyl-2-deoksy-L-fukosid, hvilket ble påvist 13 ved NMR og C-NMR spektra, og 1-deoksypyrromycin eller pyrromycin ble dannet og således er den følgende kjemiske struktur foreslått.
MA144-Y består av aklavinon og 3 typer sukkerenheter, nemlig L-rhodosamin, 2-deoksy-L-fukose og en ukjent sukker. Ytterligere, 1-deoksypyrromycin og et ukjent metylert disakkarid ble erholdt fra MA144-Y ved metanolyse. Det nevnte metylerte disakkarid ble ekstrahert med eter og renset ved kolonnekroma-tografi under anvendelse av silikagel og "Sephadex LH-20", og deretter utkrystallisert som hvite nåler fra benzen. Fysiokjemiske egenskaper for det metylerte disakkarid var som følger:
Elementæranalyse:
Funnet: C = 57,77 % Beregnet: C = 57,34 %
H = 7,31 % H = 7,40 %
Molekylvekt: 272 for C13H20O6 Smeltepunkt: 109-110°C
Optisk rotasjon: [d^2 = -65° (c=l,0, CHC13)
Ultrafiolett og synlig lysabsorpsjonsspektra i metanol:
Fig. 28 ^JJaks. nm 209 <6726>
Infrarødt absorpsjonsspektrum i KBr: Fig. 29
NMR spektrum i CDC13: Fig. 30 (100 MHz)
Som det fremgår av fig. 28 og 29 har metyldisakkaridet fra MA144-Y en absorps jons topp ved 1680 cm 1 og -^Me0H nm (t) :
maKS.
209 (67 26) hvilket indikerer tilstedeværelsen av en a,£3 umettet ketogruppe i strukturen.
Fra proton NMR i fig. 30 ble en tre-proton-dublett ved <5l,26
(J = 6,8 Hz), en to-proton ved S 1,9, en en-proton-dublett av dublett ved $3,74 (J = 1 og 3 Hz), en en-proton-kvartett ved
S 3,94 (J = 6,8 Hz), en en-proton ved<5'4,07 og en en-proton ved
•S 4,8 henført til ni protoner bestående av 2-deoksy-L-fukose, og en tre-proton-dublett ved <S 1,4 (J = 6,8 Hz) og en en-proton-symmetrisk kvartett ved 64,73 (J = 6,8 Hz) ubeskyttet av eter-oksygenatomet koblet med hverandre og ble henført henholdsvis til metylprotonene ved C-6<1> og protonet ved C-5<1>. Ved spinn-de-koblingsforsøk ble en dublett ved 6" 6,86 (J = 3,5 og 10,0 Hz)
og to dubletter ved<S6,ll (J = 10,0 Hz) og 6 5,26 (J = 3,5 Hz) henført til vinylprotonene i ABM-systemet, henholdsvis tilsvarende protonene ved C-2', C-3' og C-l<1>. Således ble sukkerenheten, bortsett fra 2-deoksy-L-fukose i metyldissakkaridet identifisert som 2,3,6-trideoksyheks-2-enopyranos-4-ulose, som var knyttet til C-4 i 2-deoksy-L-fukose.
Fra den ovenfor viste analyse ble strukturen for det metylerte disakkarid bestemt å være et nytt sukker med den følgende formel
og det terminale sukker ble gitt navnet akulose.
Således er den kjemiske struktur for MA144-Y fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse bestemt til å være som føl-ger :
Selv om et antall antracyklinglykosid-antibiotika med aklavinon og t -pyrromycinon-aglykonenheter er kjent innen teknikkens stand er forbindelsene MA144-G1, -G2, -L, -NI, -Sl, -S2, -Ul, -U2 og
-Y klart forskjellige fra noen av disse med hensyn til egenskaper såsom molekylstruktur, degrasjonsprodukter ved sur hydroly-
se, ultrafiolett, synlig og infrarøde - samt NMR spektra og lignende, som ovenfor beskrevet. Blant de kjente antracyklinglykosider, så består aklavin og pyrromycin av aklavinon eller
<£,-pyrromycinon og ett sukker, nemlig L-rhodosamin, som adskiller de fra forbindelsene i henhold til foreliggende oppfinnelse.
Aclacinomycin A og cinerubin A består av tre sukkerenheter; L-cinerulosyl-2-deoksy-L-fukosyl-L-rhodosaminyl, MA144-M1 og -M2 (japansk patentsøknad Showa 51-39688) består også av tre sukkerenheter; L-amicetosyl-2-deoksy-L-fukosyl-L-rhodosaminyl og rhodirubin B (japansk patentsøknad Showa 51-98113) består av L-rhodinosyl-L-rhodinosyl-L-rhodosaminyl, og disse tre kjente antibiotika adskiller seg fra forbindelsene fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse ved de tilstedeværende sukkerenheter. Sukkerenheten i rhodirubin A består av L-rhodinosyl-2-deoksy-L-fukosyl-L-rhodosaminyl er den samme som' den 1MA144-N1 ifølge foreliggende oppfinnelse, men aglykongruppen i MA144-N1
er aklavinon og adskiller seg fra £-pyrromycinon i rhodirubin
A.
Det er således påvist at MA144-G1, -G2, -L, -Ni, -Sl, -S2, -Ul -U2 og -Y fremstilt i henhold til oppfinnelsen er nye forbindelser .
Antimikrobiell aktivitet for MA144 bestanddelene
MA144-G1, -G2, -L, -Sl, -S2, -NI, -Ul, -U2 og -Y utviser antimikrobiell aktivitet overfor forskjellige typer mikroorganismer. Den minimale inhiberende konsentrasjon av det foreliggende antibiotikum ble bestemt ved dyrkingsvæskefortynningsmetoden og er vist i den etterfølgende tabell:
Som vist foran utviser MA144 komponentene fremstilt ifølge oppfinnelsen antimikrobiell aktivitet, spesielt mot gram-positive bakterier, og de er derfor terapeutisk nyttige ved behandling av difteri, tuberkulose', lungebetennelse, tetanus og andre infeksjonssykdom-mer forårsaket av gram-positive bakterier.
Antitumor aktivitet og akutt toksisitet for MA14 4 bestanddelene MA144 komponentene fremstilt ifølge oppfinnelsen utviser markert antitumor-aktivitet og lav toksisitet i eksperimentielle dyre-forsøk og er således terapeutisk nyttige ved inhibering av vekst av pattedyrstumorer. Spesielt viste forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen en markant inhiberende effekt mot museleukemi L1210. F.eks. ble BDFmed vekt 19-22 g inokulert introperitonealt med 1 x 10 L1210 celler/mus og 24 t etter in okulering ble forbindelsen fremstilt i henhold til oppfinnelsen injisert intraperitonealt én gang daglig i 9 på hverandre følgende dager. På den 3o. dag ble den prosentvise forlengelse av overlevelsestiden i forhold til kontrollmus målt og denne fremgår av den etterfølgende tabell saumen med-
de respektive LD^^-verdier for en enkelt intraperitoneal injek-sjon i mus.
Terapeutisk effektivitet mot museleukemi
L1210 og toksitet for MA144 bestanddeler.
Toksisitet (mus) LD50
Intraperitoneal
administrasjon 28,5 17,0 45,5 .32,5 24,4 12,5 30,2 14,5 40-50 '(mg/kg)
Cytotoksisitet av MA14 4 komponentene overfor
kultiverte L 1210 celler
MAI4 4 komponentene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse inhiberer vekst av pattedyrtumorceller i en kultur, spesielt ved lav konsentrasjon, og inhiberer fullstendig RNA syntese. Ved dette forsøk ble L1210 celler inokulert i RPMI 1640 medium (Nissui, Rosewell Park Memorial Institute 1640) inneholdende 20 % kalveserum og kultivert ved 37°C i 3 døgn i en CO2 inkubator. På den første dag ble den fremstilte forbindelsen tilsatt'i.
14
en konsentrasjon pa 0,1 jag/ml. I forsøket hvor C ble innarbei-det ble forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen tilsatt ved en konsentrasjon på 0,5 pg/ml for RNA syntese og 1,0 pg/ml for DNA syntese, og ytterligere ble C 14-thymidin eller -uridin tilsatt mediet i 60 min ved 3 7°C. Effektene på vekst og syntese av DNA og RNA ble indikert som prosent inhibering i forhold til kontroll
i den etterfølgende tabell. Fra resultatene fremgår det at MA144 komponentene markant inhiberer veksten og RNA syntesen for kultiverte L1210 celler ved lav konsentrasjon. Disse resultater understøttes av den terapeutiske effektivitet på eksperimentelle tumorer hos dyr.
Terapeutisk anvendelse av '
MA144 komponenter
Som angitt ovenfor er komponentene MA144-G1, -G2, -L, -NI, -Sl, -S2,
-Ul, -U2 og -Y fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse nye anti-
biotika som er nyttige både som human og veterinær medisin, og som ytterligere utviser en markant inhiberende virkning mot ond-artete tumorer hos dyr og mot gram-positive bakterier.
Forbindelsene fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse danner ikke-toksiske syreaddisjonssalter med et antall organiske og uorganiske saltdannende forbindelser og danner ikke-toksiske komplekser med deoksyribonukleinsyre. Således kan syreaddisjonssalter dannet med slike farmasøytisk aksepterbare syrer, som svovelsyre, fosforsyre, saltsyre, eddiksyre, propionsyre, olje-syre, palmitinsyre, sitronsyre, ravsyre, vinsyre, glutaminsyre, pantotensyre etc. og ikke-toksiske komplekser med deoksyribonukleinsyre anvendes på samme måte som MA144 komponentene i seg
selv.
EKSEMPEL 1
Et næringsmedium med den følgende sammensetning ble fremstilt: 50 ml av dette medium ble sterilisert ved 120°C i 15 min i en 500 ml flaske og ble deretter inokulert med 1 ml frossen kultur av Streptomyces galilaeus MA144-M1(FERM P-2455) ATCC 31133 og inkubert ved 30°C i 4 8 timer i en roterende ryster. 10 1 av det nevnte medium ble sterilisert og innført i et 2o liter rustfritt stil-kar og inokulert med 200 ml av den ovenfor nevnte podningskul-tur. Fermentering ble utført ved 2 8°C i 18 timer under omrøring (300 omdr.) og luftning (5 l/min). 10 liter av denne kultur ble overført til 600 liter av det ovenfor nevnte, steriliserte medium i en 2000 1 rustfri ståltank og kultivert ved 28°C i 36 timer under omrøring (180 omdr./min) og luftning (300 l/min).
Det således erholdte dyrkningsmedium (580 1) ble justert til pH 5,0 med svovelsyre og filtrert gjennom diatoméjord. Den erholdte filterkake (56 kg) ble suspendert i 50 liter aceton og filtrert etter omrøring i 1 time. Residuet ble reekstrahert med 50 liter aceton og begge ekstrakter konsentrert til 25 liter under nedsatt trykk og tilsatt 20 liter etylacetat og omrørt. Etylacetat-laget ble fraskilt og konsentrert til 1 liter under nedsatt trykk og en uren blanding av MA144 ble presipitert ved tilsetning av 15 liter n-heksan til konsentratet, og det ble erholdt 36 g av et rødt pulver etter vasking to ganger med n-heksan; Det ovenfor erholdte filtrat ble justert til pH 6,8 med natrium-hydroksyd og ekstrahert med 100 liter toluen. Ekstraktet ble konsentrert til 10 liter under nedsatt trykk og omekstrahert med 10 liter acetatpuffer ved pH 3,5. Det vandige lag som ble oppnådd ble justert til pH 6, 8-, ekstrahert med 4 liter toluen som ble redusert til et volum på 30 ml under nedsatt trykk. En uren blanding av MA14 4 ble presipitert ved tilsetning av 300 ml n-heksan og 2,5 g av et rødt pulver ble erholdt.
EKSEMPEL 2
Det urene pulver av MA144 blandingen erholdt fra filterkaken i henhold til eksempel 1 (10 g) ble oppløst i 100 ml toluen og innført i en kolonne (5 x 40 cm) fylt med 300,g silikagel. Det første eluat med 1,5 %'ig metanol-inneholdende toluen ble kastet, hvoretter MA144-G1, -G2 og -L fraksjonene ble eluert i rekkefølge med 2%'ig metanol-inneholdende toluen. Deretter ble MA144-N1 fraksjonen eluert med 3%'ig metanol-inneholdende toluen, og MA144-S1 og -S2 fraksjonene og MA144-U1 og -U2 fraksjonene ble eluert med 5%'ig metanol-inneholdende toluen. Etter konsentrasjon av hver av de erholdte fraksjoner ble det erholdt urene oransje-røde pulvere av 210 mg MA144-G1 og -G2 blandinger, 190 mg MA144-L, 570
mg MA144-N1 og rhodirubin A blanding, 360 mg MA144-S1 og -S2 blanding, 270 mg MA144-U1 og -U2 blanding ved tilsetning av n-heksan.
EKSEMPEL 3
2,5 g av det urene pulver av MA144 blandingen erholdt fra kul-turfiltratet som angitt i eksempel 1 ble oppløst i 6 ml toluen og innført i en kolonne fylt med 100 g silikagel og MA144-Y fraksjonen ble eluert med 1,7 %'ig metanol-inneholdende toluen ved 5°C. Den resulterende fraksjon ble konsentrert til tørrhet un-
der nedsatt trykk, 400 mg rå MA144-Y ble erholdt som et oransje-rødt pulver.
EKSEMPEL 4
210 mg av MA144-G1 og -G2 blandingen erholdt i henhold til eksempel 2 ble oppløst i en liten mengde etylacetat og innført i en kolonne fylt med 30 g "Column-Lite" (Fuji Chem. Co. for silikagel) og eluert med en etylacetat-metanolblanding (1:1). Den gule fraksjon ble konsentrert til tørrhet under nedsatt trykk,
og det erholdte residuum oppløst i 50 ml kloroform, rystet med
50 ml 0,01 M fosfatpuffer inneholdende 10 -3M EDTA for å fjerne gjenværende metallioner, og kloroformlaget ble vasket to ganger med vann, tørket med vannfritt natriumsulfat og deretter inndampet til tørrhet under nedsatt trykk. Det ble erholdt 110 g gult pulver av MA144-G1.
Den ovenfor nevnte "Column-Lite" kolonne ble etter eluering av
-3
den gule fraksjon behandlet med 10 M EDTA-inneholdende 30%'ig metanolblanding, og det erholdte røde eluat ble inndampet til tørrhet og oppløst i et lite volum kloroform, og gjenværende metallioner ble fjernet som ovenfor nevnt, og det ble erholdt 22 mg MA144-G2 som rødt pulver. (EDTA = etylendiamintetraeddiksyre).
Det urene pulver av MA144-L erholdt i henhold til eksempel 2
ble behandlet på samme måte som ovenfor beskrevet for MA14 4-G1 og 115 mg av et gult pulver av MA144-L ble oppnådd. Ved å anvende den samme rensemetode som for MA144-G1 og -G2, som beskrevet ovenfor, ble det erholdt rensete pulvere av 260 mg MA144-N1, 150 mg MA144-S1, 88 mg MA144-S2, 128 mg MA144-U1, 54 mg MA144-U2 og 114 mg MA144-Y.
EKSEMPEL 5
Ved å anvende den generelle metode i henhold til eksemplene 1,
2 og 4 ble forbindelsene i henhold til foreliggende oppfinnelse erholdt ved anvendelse av de nedenfor viste streptomyces-stammer:
S. = Streptomyces

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av tumor-motvirkende antracyklinglykosidantibiotika MA 144 med den generelle formel 12 3
hvor R , R og R betegner følgende:
karakterisert ved at man dyrker en av de følgende MAl44-produserende stammer Streptomyces sp. ME505-HE1 (FERM P-3667) ATCC 31273, Streptomyces galilaeus MA 144-M1 (FERM P-2455) ATCC 31133, Strep-tomyces galilaeus ATCC 14969, Streptomyces cinereoruber ATCC 19740, Streptomyces niveoruber ATCC 14971, Streptomyces antibioticus ATCC 8663 eller Streptomyces purpurascens ATCC 25489 under suhmerse aerobe forhold i et næringsmedium som inneholder et hydrokarbon, et nitrogennæringsmiddel, uorganiske salter og spormetaller ved en temperatur mellom 20 og 37° C og pH mellom 6 og 9 i 2 til 7 dager, hvoretter man kan opparbeide og isolere respektive antracyklinglykosider ved hjelp av løsningsmiddel- ekstraksjon, eventuelt under anvendelse av gjentatt ekstraksjon med løsningsmidler som er ikke-blandbare med vann ved pH mellom 6 og 9 og med sure vannløsninger eller med løsningsmidler som er blandbare med vann ved pH under 4, og eventuelt i forbindelse med dette utføre kolonnekromatografering under anvendelse av kiselsyre som adsorbent og inndampe de derved erholdte antracyklinglykosid-holdige løsninger i våkum.
NO773353A 1976-10-05 1977-09-30 Fremgangsmaate ved fremstilling av tumor-motvirkende antracyklinglykosidantibiotika, betegnet ma 144 NO148959C (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP12023776A JPS5344555A (en) 1976-10-05 1976-10-05 Anthracyclin.glycoside antibiotics
JP6090877A JPS5463067A (en) 1977-05-24 1977-05-24 Oncostatic drugs and their preparation

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO773353L NO773353L (no) 1978-04-06
NO148959B true NO148959B (no) 1983-10-10
NO148959C NO148959C (no) 1984-01-18

Family

ID=26401967

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO773353A NO148959C (no) 1976-10-05 1977-09-30 Fremgangsmaate ved fremstilling av tumor-motvirkende antracyklinglykosidantibiotika, betegnet ma 144
NO78781949A NO147953C (no) 1976-10-05 1978-06-05 Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive antracyklinglukosider

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO78781949A NO147953C (no) 1976-10-05 1978-06-05 Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive antracyklinglukosider

Country Status (18)

Country Link
US (2) US4207313A (no)
AU (1) AU505971B2 (no)
CA (1) CA1100895A (no)
CH (1) CH637160A5 (no)
DE (1) DE2743654B2 (no)
DK (1) DK145200C (no)
ES (1) ES471823A1 (no)
FI (1) FI57444C (no)
FR (1) FR2403350A1 (no)
GB (1) GB1589536A (no)
GR (1) GR63996B (no)
HU (1) HU181999B (no)
IE (1) IE46236B1 (no)
LU (1) LU78242A1 (no)
NL (1) NL176004C (no)
NO (2) NO148959C (no)
SE (1) SE425798B (no)
YU (1) YU40483B (no)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4123608A (en) * 1977-07-18 1978-10-31 Bristol-Myers Company Antibiotic compound
JPS5543012A (en) * 1978-09-20 1980-03-26 Sanraku Inc Novel anthracycline derivatine and its preparation
JPS6023679B2 (ja) * 1979-07-13 1985-06-08 メルシャン株式会社 ロドマイシン群抗生物質とその製造法
JPS5648893A (en) * 1979-09-07 1981-05-02 Sanraku Inc Preparation of anthracycline glycoside
EP0030255B1 (en) * 1979-09-07 1986-01-29 Sanraku Incorporated 2-hydroxyaclacinomycin a, pharmaceutical composition containing it; 2-hydroxyaclavinone and fermentative process for preparing same
CH648327A5 (de) * 1980-10-16 1985-03-15 Hoffmann La Roche Anthracycline.
JPS5874694A (ja) * 1981-10-29 1983-05-06 Sanraku Inc アントラサイクリン誘導体
JPS5995891A (ja) * 1982-11-26 1984-06-02 Kitasato Inst:The 新規な制癌性抗生物質80−217およびその製造法
JPS61236792A (ja) * 1985-04-12 1986-10-22 Sanraku Inc 新規アントラサイクリン抗生物質
DE3524117A1 (de) * 1985-07-05 1987-02-05 Hoechst Ag Neue anthracyclin-tetrasaccharide, ein verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatik
DE3641833A1 (de) * 1986-12-08 1988-06-09 Behringwerke Ag Zytostatisch wirksame anthracyclinderivate
US4977084A (en) * 1989-02-16 1990-12-11 Board Of Trustees Operating Michigan State University Production, isolation, and identification of novel antifungal compounds
US5013549A (en) * 1989-02-16 1991-05-07 Board Of Trustees Operating Michigan State University Production, isolation, and identification of novel antifungal compounds
US5066585A (en) * 1990-07-09 1991-11-19 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method of inhibiting fungus using novel antifungal compounds
KR970000591B1 (ko) * 1993-09-03 1997-01-14 동국제약 주식회사 신균주 스트렙토마이세스 라벤도폴리아 DKRS 및 이를 이용한 아클라시노마이신 A, B, Y 및 아글리콘(Aglycone)의 제조방법
US6589591B1 (en) * 2001-07-10 2003-07-08 Baylor College Of Medicine Method for treating medical devices using glycerol and an antimicrobial agent
US20040256561A1 (en) * 2003-06-17 2004-12-23 Allyson Beuhler Wide band light sensing pixel array
TW200510719A (en) * 2003-08-06 2005-03-16 Pharmacia Italia Spa Method for detecting contaminants in pharmaceutical products
WO2005096990A2 (en) * 2004-04-02 2005-10-20 Baylor College Of Medicine Novel modification of medical prostheses

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB846130A (en) 1956-03-23 1960-08-24 Ciba Ltd New antibiotic and derivatives and salts thereof, preparations containing the same and process for the manufacture of these substances
CH362490A (de) 1957-10-29 1962-06-15 Ciba Geigy Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums
US3092550A (en) * 1957-10-29 1963-06-04 Ciba Geigy Corp Antibiotic danubomycin and process for its manufacture
FR1533151A (fr) 1962-05-18 1968-07-19 Rhone Poulenc Sa Nouvel antibiotique et sa préparation
FR1527892A (fr) 1967-03-15 1968-06-07 Rhone Poulenc Sa Nouveau procédé de préparation de l'antibiotique 13057 r.p.
YU33730B (en) * 1967-04-18 1978-02-28 Farmaceutici Italia Process for preparing a novel antibiotic substance and salts thereof
US3803124A (en) * 1968-04-12 1974-04-09 Farmaceutici It Soc Process for the preparation of adriamycin and adriamycinone and adriamycin derivatives
US3686163A (en) * 1968-05-14 1972-08-22 Farmaceutici Italia Dihydrodaunomycin antibiotic and derivatives thereof
FR1593235A (no) 1968-11-18 1970-05-25
US3616624A (en) * 1969-11-04 1971-11-02 Becton Dickinson Co Laminar flow work bench
US3828021A (en) * 1972-06-14 1974-08-06 Merck & Co Inc Gentamicin c1 derivatives
GB1440626A (no) * 1973-05-02 1976-06-23 Farmaceutici Italia
GB1426637A (en) 1973-12-04 1976-03-03 Vnii Izyskaniju Novykh Antibio Manthracyclic antibiotic and a method of production thereof
US3864480A (en) * 1974-05-06 1975-02-04 Merck & Co Inc Cinerubin A and B As Antiparasitic Agents
JPS5134915B2 (no) * 1974-07-27 1976-09-29
US4009328A (en) * 1975-05-02 1977-02-22 Schering Corporation Aminoglycoside 66-40C, method for its manufacture, method for its use as an intermediate in the preparation of known antibiotics and novel antibacterials
JPS5231051A (en) * 1975-09-03 1977-03-09 Kowa Co Preparation of amino sugar derivatives
US4039736A (en) * 1976-04-15 1977-08-02 Bristol-Myers Company Antibiotic compounds marcellomycin and musettamycin

Also Published As

Publication number Publication date
US4207313A (en) 1980-06-10
ES471823A1 (es) 1979-02-01
AU505971B2 (en) 1979-12-06
NL176004B (nl) 1984-09-03
NO773353L (no) 1978-04-06
NL7710380A (nl) 1978-04-07
FI57444C (fi) 1980-08-11
SE425798B (sv) 1982-11-08
AU2933777A (en) 1979-04-12
DK145200B (da) 1982-10-04
DE2743654B2 (de) 1979-12-13
US4245045A (en) 1981-01-13
YU40483B (en) 1986-02-28
IE46236L (en) 1978-04-05
NO781949L (no) 1978-04-06
FI772915A (fi) 1978-04-06
CH637160A5 (fr) 1983-07-15
HU181999B (en) 1983-11-28
DK435577A (da) 1978-04-06
DE2743654C3 (no) 1980-08-21
NO148959C (no) 1984-01-18
FR2403350A1 (fr) 1979-04-13
LU78242A1 (no) 1978-01-26
IE46236B1 (en) 1983-04-06
NO147953C (no) 1983-07-20
GB1589536A (en) 1981-05-13
GR63996B (en) 1980-01-18
FI57444B (fi) 1980-04-30
DK145200C (da) 1983-02-28
NO147953B (no) 1983-04-05
DE2743654A1 (de) 1978-04-06
FR2403350B1 (no) 1981-04-30
NL176004C (nl) 1985-02-01
CA1100895A (en) 1981-05-12
YU235277A (en) 1982-06-30
SE7710972L (sv) 1978-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO148959B (no) Fremgangsmaate ved fremstilling av tumor-motvirkende antracyklinglykosidantibiotika, betegnet ma 144
Kiyoto et al. A NEW ANTITUMOR ANTIBIOTIC, FR-900482 II. PRODUCTION, ISOLATION, CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL ACTIVITY
CA1156578A (en) Rhodomycin-group of antibiotics and process for preparing same
JPH0641182A (ja) Bbm−2478b抗生物質
KR100659680B1 (ko) 항생 물질 카프라자마이신류 및 그 제조법
US4219622A (en) Process for producing antibiotics MA 144-M1 and MA 144-M2
CA1093998A (en) Antitumor antibiotic baumycin complex and components thereof
EP0012159B1 (en) New anthracycline derivatives and process for preparing the same
US4127714A (en) Anthracycline glycosides
CA1156577A (en) Process for preparing 2-hydroxyaklavinone and 2-hydroxyaclacinomycin-a
EP0110155B1 (en) Novel anthracycline derivatives, a process for preparing the same by a microorganism strain, the novel strain streptomyces cyaneus, and use of the anthracycline derivatives as medicaments
US5320955A (en) 10&#39;desmethoxystreptonigrin production by Streptomyces albus
FI69099C (fi) Foerfarande foer framstaellning av farmaceutiskt aktiv kijanimicin
US4204038A (en) Process for preparing antibiotics MA 144-M1 and MA 144-M2
US4942155A (en) Biosynthetic anthracyclines related to daunorubicin
US5162330A (en) Dynemicin c antibiotic, its triacetyl derivative and pharmaceutical composition containing same
US4565861A (en) Serirubicum
US4743594A (en) Antibiotic, antitumor compounds and their use
JP3055973B2 (ja) 抗生物質アルデカルマイシンとその製造法、並びにその誘導体とその製造法
US4192915A (en) Anthracycline glycosides from streptomyces
Umezawa et al. Antitumor antibiotics MA 144-M 1 and MA 144-M 2