DE2743654B2

DE2743654B2 - Anthracyclinglycoside der Gruppe MA 144-, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Glycoside enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

Info

Publication number: DE2743654B2
Application number: DE2743654A
Authority: DE
Inventors: Taiji Chigasaki Kanagawa Inui; Toshikazu Yokohama Oki; Tomio Takeuchi; Hamao Prof. Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1976-10-05
Filing date: 1977-09-28
Publication date: 1979-12-13
Also published as: GB1589536A; NL176004B; US4207313A; GR63996B; SE7710972L; NL7710380A; FI57444C; FR2403350A1; CH637160A5; FR2403350B1; CA1100895A; ES471823A1; DE2743654C3; FI772915A; IE46236L; AU505971B2; LU78242A1; AU2933777A; DE2743654A1; NO147953C

Description

OH

(D

mit folgenden Bezeichnungen und Zuordnungen von R¹, R² und R³:

Gl G 2

NI

SI
S2

Ul

U2

H
OH

R²

CH₃
CH₃

CH.,

O=

/t-O ()=<CH₃

/T-O

HO

CH₃
CH₃

CH.,

H H

Submersbedingungen in einem Nährmedium bei einer Temperatur zwischen 20 und 37⁰C sowie bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 züchtet, das gebildete Anthracyclinglycosid-Gemisch, jeweils in an sich bekannter Weise, aus dem Kulturmedium gewinnt und zu den einzelnen Anthracyclinglycosiden gemäß Anspruch 1 fraktioniert und letztere gegebenenfalls in ein nichttoxisches Säureadditionssalz überführt

3. Verfahren zur Herstellung von Anthracyclinglycosid MA 144-N1 durch Reduktion von Aclacinomycin A, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reduktion durch Einwirkung von

A) in Säugetierlebern enthaltenen Enzymsystemen und von Nicotinamidadenin-dinucleotidphosphat oder dessen reduzierter Form bei einer Temperatur zwischen 20 und 42° C und einem pH-Wert von 5,5 bis 10,5 oder von

B) Natriumborhydrid, Lithiumhydrid, Aluminiumhydriden oder Lithiumaluminiumhydrid durchführt

und nach A) oder B) gebildetes Anthracyclinglycosid MA 144-N1 in an sich bekannter Weise gewinnt.

4. Verfahren zur Herstellung von Anthracyclinglycosid MA 144-Y, dadurch gekennzeichnet, daß man Aciacinomycin A in Gegenwart von Enzymsystemen die aus der Kulturbrühe von Streptomyces sp. ME505-HE1 (FERM P-3667) ATCC 31273, Streptomyces galilaeus MA 144-M1 (FERM P-2455) ATCC 31133, Streptomyces galilaeus ATCC 14969, Streptomyces cinereoruber ATCC 19740, Streptomyces niveoruber ATCC 14971, Streptomyces antibioticus ATCC 8663 oder Streptomyces purpurascens ATCC 25489 oder Mutanten davon erhalten worden sind, bei einer Temperatur von 20 bis 50⁰C sowie bei einem pH-Wert von 4 bis 9 in Gegenwart von Sauerstoff umsetzt und das gebildete Anthracyclinglycosid MA 144-Y in an sich bekannter Weise gewinnt.

5. Verfahren zur Herstellung von Anthracyclinglycosid MA 144-S1, dadurch gekennzeichnet, daß man MA 144-M1 mit einer verdünnten wäßrigen Lösung einer Mineralsäure partiell hydrolysiert.

6. Pharmazeutische Zubereitungen mit antibakterieller Wirkung oder Antitumorwirkung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Anthracyclinglycosid MA 144-G1.MA 144-G2.MA 144-L.MA 144-N1, MA 144-S1, MA 144-S2, MA 144-Ul, MA 144-LJ2 und/oder MA 144-Y oder nichttoxischen Säureadditionssalzen davon gemäß Anspruch 1.

und deren nichttoxische Säureadditionssalze.

2. Verfahren zur Herbteilung der Anthracyclinglycoside MA 144- gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. ME505-HE1 (FERM P-3667) ATCC 31273, Streptomyces galilaeus MA 144-Ml (FERM P-2455) ATCC 31133, Streptomyces galilaeus ATCC 14969, Streplomyces cinereoruber ATCC 19740, Streptomyces niveoruber ATCC 14971, Streptomyces antibioticus ATCC 8663 oder Streptomyces purpurascens ATCC 25489 oder Mutanten davon unter aeroben Verschiedene Typen von Anthracyclinglycosiden wurden in der Kulturbrühe von Mikroorganismen

ho gefunden und in der Literatur beschrieben. Von diesen Glycosiden wurden bereits Daunomycin und Adriamycin klinisch zur Bekämpfung von Krebs beim Menschen eingesetzt. Aciacinomycin A, Carminomycin sowie Rubidazon werden klinisch auf dem Gebiet der Krebsche-

tiT motherapie getestet.

Anthracyclinantibiotika mit einem Aklavinonaglyconanteil werden in folgenden Literaturstellen beschrieben:

(a) Aclacinomyc in A und B in der US-PS 39 88 315 sowie von Oki et aL in »J. Antibiotics 28,830 (1975).

(b) Aklavin in »J. Bacteriol. 72,90 (1956).

Anthracyclinantibiotika mit einem ε-Pyrromycinonaglyconanteil werden in folgenden Literaturstellen beschrieben:

(c) Musettamycin und Marcellomycin aus Bohemsäurekomplex in »J. Antibiotics« 30,525 (1977).

(d) Pyrromycin in »Chem. Ber.« 92,1904(1959).

(e) Cinerubin A und B in der G B-PS 8 46 130 (vgl. auch die US-PS 38 64 480 sowie Keller-Schierlein et al. »Antimicrobial Agents and Chemotherapy«, S. 68 (1970).

Andere Anthracyclinantibiotika mit einem anderen Aglycon als Aklavinon und ε-Pyrromycinon werden in folgenden Veröffentlichungen beschrieben:

(f) Nogaiamycin in »J. Amer. Chem. Soc.« 99, 542 (1977),

(g) Steffimycin in »J. Antibiotics« 27,805,809 (1974),
(h) Carminomycin in »J. Antibiotics« 27, 254 (1974) sowie in der DE-PS 23 62 707 sowie in »J. Amer.

Chem. Soc.« 97,5955 (1975),
(i) Trypanomycin in »Antimicrobial Agents and

Chemotherapy« 1,385(1972),
(j) Requinomycin in »J. Antibiotics« 25,393 (1972),
(k) Galirubin A und B in »Naturwiss.« 52, 539 (1965) sowie »Chem. Abst.« 67,90573 ζ (1967).

Weitere Fundstellen für Anthracyclinantibiotika sind der »Index of Antibiotics form Actinomycetes«, Hamao Umezawa, University Park Press, State College, Pennsylvania, USA (1967), wobei auf den nachfolgend angegebenen Seiten die angegebenen Antibiotika erwähnt werden:

Antibiotikum	Seite
Aklavin	111
Cinerubin A	220
Cinerubin B	221
Danubomycin	242
Daunomycin	243
Pyrromycin	524
Rhodomycin A, B	561
Rubidomycin	574

In dem Buch »Antibiotics«, Band 1, Mechanism of Action, herausgegeben von David Gottlieb und Paul D. Shaw, Springer-Verlag, New York, Inc., N. Y., N. Y. (1967), ist auf den Seiten 190 bis 210 eine Zusammenfassung von A. DiMarco zu finden, die »Daunomycin and Related Antibiotics« überschrieben ist. In dem »Information Bulletin« Nr. 10 des International Center of Information of Antibiotics, in Zusammenarbeit mit WHO, Dezember 1972, Belgien, sind Anthracycline sowie ihre Derivate beschrieben.

Durch die Erfindung werden neue Anthracyclinglycosidc der Gruppe MA 144- gemäß Hauptanspruch zur Verfügung gestellt, Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen sowie diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen, entsprechend den Ansprüchen 2 bis 6. Die erfindungsgemäßen Anthracyclinglycoside sind zur Behandlung von bakteriellen Infektionen sowie zur Inhibierung von Säugetiertumoren geeignet

Die erfindungsgemäßen Anthracyclinglycoside werden ais Anthracyclinglycoside MA 144-G1, -G2, -L₁-Nl, -Sl, -S2, -U1, -U2 und -Y bezeichnet.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Anthracyclinglycoside MA 144- bestrht darin, daß man Streptomyces sp. ME505-HE1 (FERM P-3667)

ίο ATCC 31273, Streptomyces galilaeus MA 144-M1 (FERM P-2455) ATCC 31133, Streptomyces galilaeus ATCC 14969, Streptomyces cinereoruber ATCC 19740, Streptomyces niveoruber ATCC 14971, Streptomyces antibioticus ATCC 8663 oder Streptomyces purpurascens ATCC 25489 oder Mutanten davon unter aeroben Submersbedingungen in einem Nährmedium bei einer Temperatur zwischen 20 und 37° C sowie bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 züchtet, das gebildete Anthracyclinglycosid-Gemisch, jeweils in an sich bekannter Weise, aus dem Kulturmedium gewinnt und dazu den einzelnen Anthracyclinglycosiden gemäß Anspruch 1 fraktioniert und letztere gegebenenfalls in ein nicht-toxisches Säureadditionssalz überführt.

Die Gewinnung aus dem Kulturmedium sowie die

2^r> Fraktionierung zu den einzelnen Anthracyclinglycosiden können beispielsweise aus einer Lösungsmittelextraktion, einer Lösungsmittelausfällung, einer Konzentrierung, einer Gelfiltration, einer Gegenstromverteilung, einer Chelierung mit Metallionen sowie aus

in herkömmlichen Säulenchromatographiemethoden bestehen.

Die erfindungsgemäßen Anthracyclinglycoside der Gruppe MA 144- zeigen folgende Wirkungen:

π (a) antimikrobiell Aktivitäten gegenüber grampositiven Bakterien,

(b) Hemmung des Wachstums von bösartigen Tumoren in Säugetieren und

(c) eine hohe Cytotoxizität und damit eine Hemmung 4(i des Wachstums sowie einer RNA-Synthese von Säugetiertumorzellen in Kulturen.

Die Erfindung wird durch die Zeichnungen naher erläutert. Es zeigt

4·-, Fig. 1 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-GI in 90%igem Methanol;

Fig. 2 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-G2 in -,„ 9O°/oigem Methanol;

Fig. 3 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-L in 90⁰/oigem Methanol;

Fig. 4 ein UV-Absorptionsspekturm sowie ein γ, Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-N1 in 90%igem Methanol;

Fig. 5 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-S1 in 90%igem Methanol;

ho Fig. 6 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-S2 in 90%igem Methanol;

Fig. 7 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-U1 in h) 90%igem Methanol;

Fig. 8 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-U2 in 90%igem Methanol;

Fig. 9 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-Y in 90%igem Methanol;

Fig. 10 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-GI in Kaliumbromid;

Fig. 11 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-G2 in Kaliumbromid;

Fig. 12 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-Lin Kaliumbromid;

Fig. 13 ein Infrarotabsorptionsspektrum von 1» MA144-N1 in Kaliumbromid;

Fig. 14 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-S1 in Kaliumbromid;

Fig. 15 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-S2 in Kaliumbromid;

Fig. 16 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-U1 in Kaliumbromid;

Fig. 17 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-U2 in Kaliumbromid;

Fig. 18 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-Y in Kaliumbromid;

Fig. 19 das NMR-Spektrum von MA144-G1 in CDC!₃(60MHz)

Fig. 20 das NMR-Spektrum von MA144-G2 in CDCl₃(60MHz)

Fig. 21 das NMR-Spektrum von MA144-L in CDCI3 (60 MHz)

Fig.22 das NMR-Spektrum von MA144-N1 in CDCI₃(IOOMHz)

F i g. 23 das NMR-Spektrum von MA144-S1 in CDCl₃ m (60 MHz)

F i g. 24 das NMR-Spektrum von MA144-S2 in CDCh (60MHz)

Fig. 25 das NMR-Spektrum von MA144-U1 in CDCl₃(60MHz) r,

Fig. 26 das NMR-Spektrum von MA144-U2 in CDCl₃(60MHz)

Fig. 27 das NMR-Spektrum von MA144-Y in CDCl₃ (100 MHz)

F i g. 28 das UV-Absorptionsspektrum und das Absorptionsspektrjm in sichtbarem Licht des Methyldisaccharids. das aus MA144-Y in Methanol (0,04 g/l) erhalten worden ist;

F i g. 29 das Infrarotabsorptionsspektrum des Methyldisaccharids, das aus MA144-Y in Kaliumbromid 4-, erhalten worden ist,;

Fig. 30 das NMR-Spektrum des Methyldisaccharids,

COOCH.,

CH₂CH.,

OH

das aus MA144-Y in CDCI₃ (100 Mhz) erhalten worder ist.

Insbesondere zeigen die erfindungsgemäßen Verbin düngen eine Aktivität gegenüber grampositiven Bakte rien, hemmen das Wachstum von verschiedener Säugetiertumoren, wie L1210- und P388-Leukemien ir Mäusen, und besitzen eine niedrige Toxizität. Dahei eignen sie sich als antibakterielle Mittel sowie ah Antitumormittel.

Die Herstellung dieser Verbindungen erfolgt in dei vorstehend beschriebenen Weise in einem Nährmedi um, das bekannte Nahrungsmittelquellen für Strahlen pilze enthält, d.h. Quellen für Kohlenstoff, Stickstof sowie anorganische Salze. Vorzugsweise wird eint aerobe Submerskultur eingesetzt, wie sie auch für di< Herstellung anderer Antibiotika verwendet wird. Di< allgemeinen Methoden, die zur Züchtung anderei Strahlenpilze anwendbar sind, lassen sich auch auf da; erfindungsgemäße Züchtungsverfahren anwenden. Da; Medium enthält vorzugsweise im Handel erhältliche Kohlenstoffquellen, wie Glukose, Glycerin, Stärke Dextrin, Rohrzucker, Maltose, öle, Fette, und zwai entweder in gereinigter oder in roher Form, ferner irr Handel erhältliche Stickstoffquellen, wie Sojabohnen pulver, Hefeextrakt, Pepton, Baumwollsamenpulver getrocknete Hefe, Maiflüssigkeit oder anorganisch« Salze, wie Ammoniumsulfat, Natriumnitrat oder Ammo niumchlorid. Anorganische Salze, wie Natriumchlorid Kaliumchlorid oder Phosphate, werden vorzugsweise verwendet. Gegebenenfalls können auch Spuren ar Metallionen und Entschäumern zugesetzt werden. Die Fermentationstemperatur liegt vorzugsweise zwischer 25 und 30°C. Nach maximal 2 bis 7 Tagen ist die Hauptmenge der Anthracyclinglycoside angefallen.

MA 144-S1.-S2,-Nl oder ein Gemisch davon könner chemisch ausgehend von Aclacinomycin A, Cinerubin A Rhodirubin A, MA 144-M1, Ma 144-M2, MA 144-N1 MA 144-G1, MA 144-G2, MA144-U1, MA 144-U2 MA 144-Y oder einem Gemisch davon hergestell werden. Die Ausgangsmaterialien können in reine: Form, als Salze oder in unreiner Form verwende werden, beispielsweise in Form von Materialien, welchf die Anthracyclinsubstanz enthalten, beispielsweise ir Form von Fermentationsbrühen oder Rohextrakten au: derartigen Brühen.

Die chemische Umwandlung läßt sich durch da: folgende Reaktionsschema wiedergeben:

COOCH₃

CH₂CH.,

OH

CHj

I) Aclacinomycin A

Os

R¹H₁R¹O =<CH₃

Reduktion

MA 144-N 1

R¹ H, R³ ((CH₃
HO

2) Aclacinomycin A
MA 144-N I
MA 144-G 1
MA 144-UI
MA 144-Y
MA 144-M 1

HO
R¹H. R³' ^CH,

MA 144-G 2
MA 144-U2
Rhodirubin A

Hydrolyse

_{MA |4s}
(R¹H₁R³H)

R¹OH₁R³' (JOH₃

⁰N

HO

Cinerubin A

R¹OH₁R³O=CCH₃

MA 144-M 2
HO

Hydrolyse _MA|44._S2
' (R¹OH₁R³H)

MA 144-S1 und -Sl können durch eine Säurehydrolyse von Aclacinomycin A (DE-OS 25 32 586), MA 144-M1 (DE-OS 27 15255). MA 144-N1, MA 144-M2 (DE-OS 27 15 255), Cinerubin A, MA 144-G 1, MA 144-G2. MA 144-Ul₁ MA 144-U2, MA 144-Y oder Rhodirubin A (US-PS 41 27 714) hergestellt werden. Die Hydrolyse kann unter milden Bedingungen unter Verwendung einer Mineralsäure, wie HCl. H₂SO₄, durchgeführt werden. Die Reaktion kann entweder in einem die erfindungsgemäßen Verbindungen auflösenden Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch durchgeführt werden. Die Reaktionsbedingungen, wie die Temperatur, die Substratkonzentration, die Reaktionszeitspanne etc hängen von dem Lösungsmittelsystem, dem Ausgangsmaterial ab,

COOCH₃

CH₂CH.,

OH

Enzym

wobei diejenigen Bedingungen gewählt werden, bei deren Einhaltung die höchste Ausbeute oder die höchste Reaktionsgeschwindigkeit erzielt werden.

MA 144-N1, -Y oder Gemische davon können enzymatisch aus Aclacinomycin A, MA 144-N1 oder einem Gemisch davon hergestellt werden. Die Ausgangsmaterialien können in gereinigter Form, in Form von Salzen oder in unreiner Form eingesetzt werden, beispielsweise in Form von Materialien, welche die Anthracyclinsubstrate enthalten, beispielsweise in Form von Fermentationsbrühen oder Rohextrakten aus derartigen Brühen.

Die enzymatische Umwandlung läßt sich durch das folgende Reaktionsschema wiedergeben:

COOCH₃

CH₂CH₃

OH

Coenzym

CH₃

[ft
IS

I) AclacinomycinA

On

MA 144-N I

On

2) Aclacinomycin A MA I44-N I MA 144-Y

HO

MA 144-N1 kann aus Aclacinomycin A durch Enzyme hergestellt werden, die aus Säugetieren und Mikroorga- r, nismen gewonnen werden. Die zur Reduktion der Ketogruppe des Cinerulose Α-Anteils eingesetzen Enzymsysteme können in einer Mikrosom-Fraktion vorliegen und aus bestimmten Mikroorganismen erhalten werden, die zu dem Genus Streptomyces gehören, sowie aus verschiedenen Säugetiergeweben, beispielsweise Geweben von Affen, Hunden, Kaninchen, Hamstern, Ratten oder Mäusen. Im Fall der aus Mikroorganismen erzeugten Systeme können Stämme, die zu Streptomyces gehören, in Form von Kulturbrühen, Zellensuspension, in Form getrockneter Zellen, eines Zellenhomogenats, eines teilweise gereinigten Enzyms sowie eines immobilisierten Enzyms, verwendet werden. Im Falle der Säugetierenzyme können verschiedene Enzymquellen eingesetzt werden, beispielsweise 1« verschiedene Organe, Gewebestücke, Gewebehomogenate, daraus hergestellte getrocknete Zubereitungen sowie teilweise gereinigte Enzyme, die durch Aussalzen, Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, Gelfiltration oder Absorptionschromatographie erhalten r> werden. Immobilisierte Enzyme, die aus derartigen Säugetierquellen erhalten werden, sind ebenfalls zur Durchführung dieser Verfahrensvariante geeignet.

Eine besonders bevorzugte Methode zur Herstellung von Anthracyclinglycosid MA 144-N 1 durch Reduktion 4» von Aclacinomycin A besteht darin, daß man die Reduktion durch Einwirkung von

A) in Säugetierlebern enthaltenen Enzymsystemen und von Nicotinamidadenin-dinucleotidphosphat oder dessen reduzierter Form bei einer Temperatur '' zwischen 20 und 42° C und einem pH-Wert von 5,5 bis 10,5 oder von

Bei der Durchführung dieser Verfahrensvariante wird in optimaler Weise ein pH von 6 bis 8 eingehalten, wobei die Substratkonzentration unter 5% liegt. Die Reaktionszeitdauer beträgt vorzugsweise 20 bis 120 Minuten, ■wobei unter aeroben Bedingungen gearbeitet v/ird. Cu⁺+, Hg++, Fe++, Fe+ + +,p-Chlormercuribenzoesäure sowie N-Äthylmaleimid üben eine hemmende Wirkung auf die Enzymreaktion aus. i>o

MA144-Y kann aus Aclacinomycin A oder MA 144-N1 in Gegenwart von Enzymsystemen hergestellt werden, die aus der Kulturbrühe von Streptomyces galilaeus MA144-M1 (FERM P-2455, ATCC 31133); SL galilaeus ATCC 14969, St cmereoruber ATCC19740, SL _b5 niveoruber ATCC 14971, SL antibioticus ATCC 8633, Sl purpurascens ATCC 25489 oder Streptomyces sp. ME 505-HE1. ATCC 31273 sowie Mutanten davon erhalten

/ Λ ON,

r'o=<ch., ^y

worden sind. Diese Mikroorganismen können in Form der Kulturbrühe, einer Zellensuspension, in Form getrockneter Zellen, eines Zellenhomogenats, einer überstehenden Lösung, eines teilweise gereinigten sowie eines gereinigten Enzyms sowie eines immobilisierten daraus erhaltenen Enzyms verwendet werden.

Die Bedingungen der Enzymreaktion, wie der pH, die Temperatur, die Substratkonzentration, die Reaktionszeit, hängen von dem Zustand des Enzyms, dem eingesetzten Ausgangsmaterial ab (im allgemeinen ist es vorzuziehen, solche Bedingungen auszuwählen, welche die Enzymreaktion beschleunigen und nicht die Enzymreaktion inhibieren). Im allgemeinen sind eine Temperatur von 20 bis 50⁰C₁ ein pH von 4,0 bis 9,0, eine Substratkonzentration unter 5% sowie eine Reaktionszeitspanne von 10 Minuten bis 5 Stunden, und zwar je nach der Menge an gelöstem Sauerstoff, vorzuziehen. Die Enzymreaktion erfordert Sauerstoff, jedoch kein Coenzym.

Die Enzymaktivität in verschiedenen Streptomyces, die zur Durchführung der Erfindung eingesetzt werden, ist wie folgt:

Organismen	Enzymaktivität, Einheiten/ml	03 ml 0,25 ml 0,50 ml
Streptomyces galilaeus MA 144-M 1 (ATCC 31133)	100
St. galilaeus ATCC 14969	75
St. sp. ME 505-HE 1, ATCC 31273	25
St. cinereomber ATCC 19740	85
St. niveoruber ATCC 14971	35
St. antibioticus ATCC 8663	15
St. purpurascens ATCC 25489	20
Zusammensetzung der Enzymrekationsmischung (ImI)
I Aclacinomycin A als Substrat J (0,4 μΜοΙ/mI) ] 0,2 m Citratpuffer (pH 5,5) Enzymlösung

Die Reaktion wird während einer Zeitspanne von 30 Minuten bei 37° C durchgeführt, in einem Eisbad beendet, worauf 1 ml 0,2 m Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) zugesetzt wird. Die Reaktionsprodukte werden mit 0,25 ml Toluol extrahiert auf einer Kieselsäuredünnschicht entwickelt und unter Verwendung eines Dual-Wellenchromatoscanners bestimmL Eine Einheit der Enzymaktivität wird als die Menge Enzym definiert die 0,001 μΜοΙ MA 144-Y pro Minute bildet

Zur Reinigung der Enzymsysteme, die aus den

Kulturbrühen der vorstehend beschriebenen Strep.tomyces-Stämme erhalten worden sind, können herkömmliche Methoden zur Enzymreinigung angewendet werden.

Beispielsweise kann eine elektrophoretisch homogene Enzymzubereitung aus dem Kulturfiltrat durch Ausfällen aus einer Ammoniumsulfatlösung mit einer 50%igen Sättigung sowie durch Chromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex A -50 sowie Sephadex®G-75 erhalten werden. Die allgemeinen Eigenschaften des aus Streptomyces galilaeus MA144-M1 (ATCC 31133) erhaltenen gereinigten Enzyms sind wie folgt:

Molekulargewicht	72 000
!soeiektrischer Punkt	pH 5,9
Optimaler pH	5,5
pH-Stabilität	5,0 bis 8,0
Thermische Stabilität	unter 50⁰C (neutraler
	pH)
Reaktion	sauerstoffabhängig
Km	0,125 mM
Inhibitoren	Fe++, SOj--. S₂O₄- ,
	S₂O₅-", NaNj, Ascor
	binsäure, NADPH sowie
	Wasserstoffdonatoren.

Die Eigenschaften der Enzyme, die aus den vorstehend erwähnten sieben Streptomyces-Stämmen erhalten worden sind, sind mit denen unter Emsatz von Streptomyces galilaeus MA144-M1 erzielten identisch.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können aus der Kulturbrühe oder aus dem Reaktionsgemisch gewonnen und voneinander nach folgenden Methoden getrennt werden.

Die MA144-Komponenten, die durch Fermentation erzeugt werden, liegen sowohl intracellular als auch extracellular vor, werden jedoch hauptsächlich in dem Mycelium gefunden. Zur Gewinnung von MA144-Komponenten aus der Kulturbrühe kann die Brühe filtriert und das Filtrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Äthylacetat, Toluol, Benzol, Butylacetat, n-Butanol, Methylpropylketon, Methylenchlorid, in einem neutralen bis schwachsauren Zustand extrahiert werden. Die MA144-Komponenten in dem Mycelium können durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Aceton, n-Butanaol, Methanol, Äthanol, Äthylacetat oder einer wäßrigen Lösung einer organischen oder anorganischen Säure, wie Chlorwasserstoffsäure oder Essigsäure, gewonnen werden. Wahlweise können M A144-Komponenten direkt aus der Kulturbrühe unter Anwendung der vorstehend erwähnten Extraktionsmethoden ohne vorherige Abtrennung des Myceliums extrahiert werden. Nach einer Konzentration im Vakuum können die MA144-Extrakte mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel bei einem pH zwischen 6 und 9 reextrahiert werden. Nach einer Konzentration unter vermindertem Druck werden

^r> die MA-Konzentrate mit einer sauren wäßrigen Lösung mit einem pH von weniger als 4 vermischt. Dann werden die MA144-Komponenten in der sauren wäßrigen Lösung mit einem organischen Lösungsmittel nach einer Einstellung auf einen schwachbasischen pH

ίο reextrahiert. Durch Wiederholung der vorstehend beschriebenen Methoden, falls erforderlich, können MA144-Komponenten in gereinigter Form hergestellt werden. Als Alternative zu einer Lösungsmittelextraktionsgewinnungsmethode oder in Kombination mit

i"> einer derartigen Methode kann MA144 aus der Kulturbrühe durch Säulenchromatographie unter Einsatz von Adsorbentien, wie Aktivkohle, Aluminiumoxid, Kieselsäure oder eines modifizierten Dextrans, wie es im Handel unter dem Warenzeichen Sephadex® LH-20

.'(ι erhältlich ist, durch Gegenstromverteilung oder durch Flüssigkeitschromatographie unter Einsatz geeigneter organischer Lösungsmittel gewonnen werden. Die nach diesen Methoden erhaltenen aktiven Extrakte werden unter vermindertem Druck konzentriert und als rotes

:> oder gelbes Pulver von MA144-Komponenten erhalten.

Die MA144-Komponenten in den chemischen und

enzymatischen Gemischen werden bei einem Zusatz von Wasser extrahiert, gereinigt und in Form eines rohen Pulvers nach den vorstehend beschriebenen

jo Methoden erhalten. Die Lösung, welche die MA144-Komponenten enthält, kann ferner allein oder nach Zugabe einer organischen oder anorganischen Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure oder Pantothensäure, gefriergetrocknet

j) werden.

Zur Gewinnung der einzelnen M A144-Komponenten MA144-G1. -G2, -L, -Nl, -Sl, -S2, -Ul, -U2 sowie -Y kann eine weitere Reinigung und Abrennung unter Anwendung von Standardtrennmethoden durchgeführt

4(i werden, beispielsweise einer Säulenchromatographie, unter Einsatz verschiedener Adsorbentien, wie Kieselsäure, modifizierter Dextrane, schwachsaurer Ionenaustauscherharze oder Aktivkohle, ferner unter Anwendung einer Gegenstromverteilung. Flüssigkeitschroma-

·»■> tographie unter Einsatz geeigneter organischer Lösungsmittel, oder unter Anwendung einer Chelierung mit verschiedenen Metallionen. Ferner kann man eine Kombination aus einer oder mehrerer der vorstehend beschriebenen Methoden anwenden.

■in Es wurden folgende physikalisch-chemischen Eigenschaften der MA 144-Komponenten ermittelt:

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von MA144-G1, -G2, -L, -N1, -Sl, -S2, -U1, -U2 sowie -Y sind wie folgt:

MA 144	G 1	amorphes	gelbes	G2	amorphes	rotes Pulver
Aussehen	schwachbasisches			schwachbasisches
	Pulver	N	O		N	O
Elementaranalyse	C H	1,44	28,93	C H	1,75	30,58
gefunden:	61,45 6,31	1,73	29,56	61,15 6,21	1,69	30,92
berechnet	62,14 6,58			60,93 6,45
Empirische Formel	C₄₂H₅₃O₁₅N			C₄₂H₅₃O₁₆N
Molekulargewicht	811,9		827,9

Fortsetzung

13

14

MA 144

G 1

Schmelzpunkt, C Spezifische Drehung

Löslichkeit

R_rWe>te**)

*) C : M = 20 : 1

Reaktion

UV-Absorptionsspektrum sowie Absorptionsspektrum im Sichtbaren und max

141-145 152-156

+

(C= 0,33, CHCl₃)

Löslich in saurem Wasser, Methanol, Äthanol, n-Butanol, Aceton, Äthylacetat, Chloroform, Benzol, Toluol, Dimethylsulfoxid, Methylcellosolve, Dimethylformamid.

Leicht löslich in Wasser, η-Hexan, Cyclohexan, Diäthyläther und Petroleum.

Das Hydrochloridsalz ist löslich in Wasser, Methanol, Äthanol, jedoch gering löslich

in Chloroform, Aceton und Äthylacetat.

0,38

Die saure wäßrige Lösung und Methanollösung ist gelb und schlägt in rötlich-purpur in alkalischem Zustand um und nimmt eine rötlich-braune Farbe in konzentrierter H₂SO₄-Lösung an.

(ausgezogene Linie) in 0,ln HCl-MeOH (gestrichelte Linie) in O,ln NaOH-MeOH (-.-.- Linie)
Infrarotabsorptionsspektrum (KBr)
NMR-Spektrum (PMR)

Diese saure wäßrige Lösung ist rot und schlägt in purpur-blau in alkalischem Zustand um und nimmt eine Purpurfarbe in konzentrierter Schwefelsäurelösung an.

Fig. 1	(537),	259	(330),	Fig. 2	(580),	259	(295)
230	(140),	432	(165),	235	(101),	492	(175)
290			292

229,5 289

239 317

Fig. Fig.

(610), (159),

(521), ( 96),

259 430

285 522

(372), (169),

(151), (144),

235 292 242 605 Fig.

Fig.

(627),

(104),

(575), (198)

(300) (178)

(230)

*) C = Chloroform, M = Methanol
**) Dünnschichtchromatographiebedingungen: Kieselsäuredünnschicht 6OF₂₅₄ (Merck Co.) (bei 27 C").

MA 144	L	H 6,31 ö,44	amorphes	gelbes	N 1	H 6,71 6,82	amorphes rotes Pulver
Aussehen		₅N	N 1,54 1,76	O 30,13 30,08			N () 1,71 29,22 1,72 29,48
Elementaranalyse gefunden: berechnet:	schwachbasisches Pulver				schwachbasisches
Empirische Formel	C 61,39 61,72				C 61,43 61,97
Molekulargewicht	C₄IH₅₁O,				C₄₂H₅₅O₁
Schmelzpunkt, C	797,9				813,9	CHCI₁)
Spezifische Drehung	134-136	144-G 1			146-147	144-G 1
IaI }','					+ 57,5°
Löslichkeit					(c = 0,4,
RpWerte**)	wie MA				wie ΜΛ
*) C : M - 20 : !	0,31		0,21

Fortsetzung

MA 144	L	144-G 1	H	259	(298),	N 1	144-G 1	H	259	(298),
Reaktion	wie MA		6,45	433	(151)	wie MA		6,13	433	(144)
UV-Absorptionsspek	Fig. 3	(480),	6,84			Fig. 4	(482),	6,34
trum sowie Absorp	230	(118),	I₃N			229,5	(121),	I₄N
tionsspektrum im Sicht	290					290
baren und max				259	(324),				259	(304),
(EX.) in MeOH				433	(156)				433	(151)
(ausgezogene Linie)		(530),	CHCl.,)	287	(100),		(488),		287	(121),
in 0,ln HCl-MeOH	230	(128),	144-G 1	525	(140)	229,5	(123),	144-G 1	525	(133)
(gestrichelte Linie)	290	(412),				290	(450),
in 0,InNaOH-MeOH,	238	( 68),				239	( 76),
(-.-.- Linie)	3I8s		144-G 1			3I8s		144-G 2
Infrarotabsorptions	Fig. 12					Fig. 13
spektrum (KBr)			(638),	amorphes	gelbes			(607),	amorphes	rotes Pulver
NMR-Spektrum (PMR)	Fig. 21		(160),			Fig. 22		(110).
MA 144	S 1	schwachbasisches		N	O	S2	schwachbasisches		N	O
Aussehen		Pulver		1,97	29,36				1,88	30,94
	C		2,00	29,72	C		1,96	31,13
Elementaranalyse	61,37	(652),			60,09	(629),
gefunden:	61,79	(163),			60,4 i	(114),
berechnet:	C₁₆H₄₅O	(553).			C₃₆H₄₅O	(606),
Empirische Formel	699,8	( 90),			715,8	(210)
Molekulargewicht	144-147				154-158
Schmelzpunkt, C	+ 77°
Spezifische Drehung	(<■= i,o.				-
IaI ΐϊ	wie MA				wie MA
Löslichkeit	0,14				0,14
Ri-Wcrte**)
*) C : M = 20 : I	wie MA	258,5	(371),	wie MA	258,5	(306),
Reaktion	Fig. 5	432	(177)	Fig. 6	491	(189)
UV-Absorptionsspek	230			234,5
trum sowie Absorp	289,5			293
tionsspektrum im Sich¹·
baren und max		258,5	(380),		258,5	(318),
(Λκΐ) in Methanol		431	(192)		491	(197)
(ausgezogene Linie)	229,5	286	(141),	234,5	566	(244),
inO,ln HCl-MeOH	289,5	524	(161)	293
(gestrichelte Linie)	237,5			242
ίηΟ,Ιη in NaOH-McOII	320			606
(-.-.- Linie)	Fig. 14			Fig. 15
Infrarolabsorptions-
spektrum (KBr)	Fig. 23		Fig. 24
NMR-Spektrum (PMR)

17

MA 144	U 1	H	CHCI₃)	amorphes	gelbes	U2	Y	H	N	O
Aussehen		6,77	144-G 1					6,60	1,58	31,87
	schwachbasisches	6,68		N	O		6,55	1,65	32,15
Elementaranalyse	Pulver	C₄₂H₅₅O₁₆N		1,74	31,07		17N
gefunden:	C	829,9	144-G 1	1,69	30,85	schwachbasisches arriurphes rotes Pulver
berechnet:	60,42	152-155
Empirische Formel	60,79	+ 31°	(531),			C
Molekulargewicht		(f= 1,0,	(135),			59,26
Schmelzpunkt, C	wie MA				59,64	!44-G 1
Spezifische Drehung	0,07				C₄₂H₅₅O
Mf					845,9
Löslichkeit	wie MA	(602),			160-164	144-G 2
RpWerte**)	Fig. 7	(150),
*) C : M = 20 : 1	230	(520),			-	(452),	259	(247),
Reaktion	290	( 94),			wie MA	(104),	492	(150)
UV-Absorptionsspek			259	(325),	0,07
trum sowie Absorp			432	(164)
tionsspektrum im Sicht					wie MA
baren und max	229,5				Fig. 8	(465),	259	(250),
(EW) in MeOH	289				235	(103),	492	(152)
(ausgezogene Linie)	239	259	(365),	292	(448),	566	(200),
in 0,InHCl-MeOH	317	430	(168)		(164)
(gestrichelte Linie)	Fig. 16	285	(143)
in 0,InNaOH-MeOH		522	(144)
(-.-.- Linie)	Fig. 25			235
Inl'rarotabsorptions-				292
spektrum (KBr)				242
NMR-Spektrum (PMR)				606
MA 144			Fig. 17

Fig. 26

Aussehen Elementaranalyse gefunden:

berechnet: Empirische Formel Molekulargewicht Schmelzpunkt, C Spezifische Drehung M ?,'

Löslichkeil Ki-Wertc**) ') C : M - 20 : 1 Reaktion

schwachbasisches amorphes gelbes Pulver

C Il N O

61,98 6,30 1,70 30,02

62,29 6,35 1,73 29,63

153-155

+ 66°

(C= 1,0, CIICI₁) wie MA 144-G 1

wie MA 144-G 1

Fortsetzung

MA 144

UV-Absorptionsspektrum sowie Absorptionsspektrum im Sichtbaren und max

(Eil) in MeOH

(ausgezogene Linie)

in 0,ln HCl-MeOH (gestrichelte Linie)

in 0,ln NaOH-MeOH (-.-.- Linie)

Infrarotabsorotionsspektrum (KBr) NMR-Spektrum (PMR)

Die Struktur der erfindungsgemäßen Substanzen MA144-G1, -G2, -L, -Nl, -Sl, -S2, -Ul, -U2 sowie -Y wird wie folgt bestimmt:

Bei der sauren Hydrolyse mit 0,1m Chlorwasserstoffsäure während einer Zeitspanne von 30 Minuten bei j 85° C werden physikalisch-chemische Eigenschaften ermittelt, wie die Absorptionsspektren im UV, im Sichtbaren und im Infraroten, die Massenresonan/. und die kernmagnetische Resonanz, der Schmelzpunkt, die Elementaranalyse und die Rt-Werte auf eine Kieselsäu- ji redünnschicht, des Aglyconteils, erhalten aus MA144-G1, -L, -Nl, -Sl, -Ul sowie -Y, die mit den physikalisch-chemischen Eigenschaften von Aklavinon (Tetrahedron Lett. Nr. 8, 28-34, 1960) zusammenfallen. Ferner fallen die Eigenschaften des Aglyconteils, der aus ι MA144-G2, -S2 und -U2 erhalten wird, vollständig mit denjenigen von ε-Pyrromycinon (Chem. Ber. 92.

Ri-Werte des Zuckeranteils von MA 144-Komponenten Fig. 9

229,5 (580),

290 (126),

259
432

(320) (158)

229,5	(590),	259	(334)
290,5	(130),	433	(160)
239	(497),	287	(133)
320s	( 82),	524	(138)
Fig. 18
Fig. 27

1880-1903, 1959) zusammen. Ferner werden die Zuckeranteile, die in der wasserlöslichen Fraktion der vorstehend beschriebenen Hydrolysate vorliegen, durch Kieselsäuredünnschichtchromatographie (Merck Co. 6OF254 Kieselsäureplatte, n-Butanol zu Essigsäure zu Wasser =4;1:1) nach einer Neutralisation und Konzentration bestimmt, wobei die Rr-Werte mit denjenigen der authentischen Zucker verglichen werden, die aus Aclacinomycin A (J. Antibiotics. 28. 830-834, 1975) und Streptolydizin (J. Amer. Chem. Soc. 86, 3592-3594, 1972) erhalten werden. Die Rf-Werte der Zuckeranteile, die aus MA144-Komponenten erhalten werden, sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Es liegen drei Arten von Zuckern in MA144-G1, -G2, -L, -Y und -Nl und zwei Anen von Zuckern in MA144-S1, -S2, -Ul und -U2 vor.

Verbindungen

Ri-W crt 0,16

0,20 0,60

0,72

0,83

MA 144-G 1 +

-G 2 +

-L +

-Nl + -

-Sl + -

-S 2 + -

-Ul + -

-U 2 +

Ein Vergleich mit den Ri-Wcrten, verschiedenen Farbreaktionen sowie der optischen Drehung der authentischen Zucker zeigt, daß ein Zuckeranteil entsprechend Rf = 0,16 als L-Rhodosamin identifiziert werden kann. Rf = 0,60 ist 2-Desoxy-L-fucose, Rf = 0,72 ist L-Rhodinose und R₍ = 0,83 ist L-Cinerulose. Demgegenüber sind die Zucker mit Ri = 0,20 und 0,78 unbekannt.

Eine partielle Methanolyse von MAI44-Komponenten in Methanol mit Zimmertemperatur, das 0,01 η Chlorwasscrstoffsäure enthält, liefern MAI44-G1, -Nl, -Sl, -Ul und -Y I-Desoxjpyrromycin (L-Rhodosaminvlakkwinon. I. Antibiotics. 28, 830-834, 1475), das auf der Grundlage seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften, wie seines Rf-Wertes bei der Durchführung einer Kieselsäuredünnschichtchromatographie, des Schmelzpunktes, der Absorptionsspektren im IR. UV und sichtbaren Licht sowie des NMR-Spektrums, identifiziert wird, und die entsprechenden Methylsaccharide MA144-G2, -S2 und -U2 ergeben Pyrromycin (Che.-i. Ber. 92, 1880-1903, 1959) sowie die entsprechenden Methylsaccharide, und MA144-L ein unbekanntes Anthracyclinglycosid sowie das entsprechende Methyldisacchiarid.

Die folgende allgemeine Formel beruht auf der Tatsache, daß D-Cinerulosyl-2-desoxy-L-fuxosyl-L-rho-

dosaminyl-aklavinon und -ε-pyrromycinon von MA144-G1 und -G2 anhand der NMR-Spektren, ¹³C-NIVIR-Spektren sowie IR-Spektren dieser Verbindungen sowie der Methyldisaccharide davon untersucht werden:

R O COOCH.,

CH₂CH₃

CH₃

MA144-S1 und -S2 enthalten zwei Arten von Zuckeranteilen, und zwar L-Rhodosamin und 2-Desoxy-L-fuccse. Methyl-2-desoxy-L-fucosid und 1-Desoxypyrromycin oder Pyrromycin werden durch Methanolyse gebildet. Auf diese Weise wird die folgende 2- Desoxy- L-fucosyl-L-rhodosaminyl-aklavinon- oder -f-pyrromycinonstruktur für MA144-S1 und -S2 ermittelt.

R O COOCH₃

CH₂CH₃

OH

HO

CH,

OH

MAI44-G1 :R = H MA144-G2:R = OH MA144-S1 :R = H
MA144-S2:R = O

MA144-L besteht aus Aklavinon und drei Zuckeranteilen, und zwar einem unbekannten Aminozucker mit einem Rf-Wert von 0,20, 2-Desoxy-L-fucose und L-Cinerulose. Eine Analyse der NMR- und ¹³C-NMR-Spektren von Aklavinonglycosid sowie dem Methyldisaccharid, das aus MA144-L durch Methanolyse erhalten wird, zeigt, daß es sich um N-Monodimethyl-L-rhodosaminylaklavinon sowie MethylcineruIosyl-2-desoxy-L-fucosid, jeweils erhalten aus Aclacinomycin A, handelt.

Die chemische Struktur von MA144-L wird wie folgt ermittelt:

COOCH₃

CH₁CH₃

MA144-N1 besteht aus Aklavinon und drei Arten von Zuckeranteilen, und zwar L-Rhodosamin, 2-Desoxy-L-fucose und L-rhodinosc. Zur Bestimmung der Zuckersequenz wird eine milde Hydrolyse in einer 0,5%igen Chlorwasserstoffsäure bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 10 Minuten nach der Methode von Biedermann et al. (Pharmazie, 27, 782-789, 1972) durchgeführt. L-Rhodinose wird freigeselzt. Gleichzeitig wird MA144-S1 gebildet. Daher !läßt sich die chemische Struktur von MA144-N1 wie folgt ermitteln:

O COOCH₃

J CH₂CH,

νγ_ΟΗ

CH,

CH,

MA144-L

MA144-NI

MA144-U1 und -U2 enthalten zwei Arten von Zuckeranteilen, und zwar L-Rhodosamin und 2-Desoxy-L-fucose. Bei der Methanolyse wird durch NMR- und ^l3C-NMR-Spektren MethyI-2-desoxy-L-fucosyl-2-desoxy-L-fucosid ermittelt. Ferner wird 1 -Desoxypyrromyein oder Pyrromycin gebildet, so daß folgende Struktur vorgeschlagen wird.

R O COOCH₃

CH₂CH₃ ίο

OH

15

20

OH

MA 144-Ul: R = H MA144-U2:R = OH

MA144-Y besteht aus Aklavinon und drei Arten von Zuckeranteilen, und zwar L-Rhodosamin, 2-Desoxy-L-fucose und einem unbekannten Zucker. Ferner werden 1-Desoxypyrromycin und ein unbekanntes Methyldisaccharid aus MA144-Y durch Methanolyse erhalten. Dieses Methyldisaccharid wird mit Äther extrahiert und durch Säulenchromatographie unter Einsatz von Kieselsäure und Sephadex LH-20 (Warenzeichen) gereinigt und dann in Form von weißen Nadeln aus Benzol auskristallisiert. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des methylierten Disaccharids sind wie folgt:

Elementaranalyse fürCi₃H2o06: gefunden: C57,77<>/o, H 7,31%

C 5734%, H 7,40% 272

109bisll0°C [«]? = 65°

berechnet:
Molekulargewicht:
Schmelzpunkt:
Optische Drehung:

Absorptionsspektren im
UV und sichtbaren Licht in Methanol:

Infrarotabsorptionsspektrum in KBr: NMR-Spektrum in CDCl₃:

(c= 1,0, CHCl₃)

Fig.28,Ai?_a ^e _s ^OH um (ε)=209 (6726)

Fig. 29

F ig. 30 (100 MHz)

55

60

Wie aus den Fig.28 und 29 hervorgeht, weist das Methyldisaccharid von MA144-Y eine Absorption bei 1680 cm-' auf. λί£°^Η nm (e) :209 (6726) woraus das Vorliegen einer «^-ungesättigten Ketogruppe in der Struktur hervorgeht

Gemäß dem Protonen-NMR in Fig.30 wird ein 3-Protondublett bei <51,26 (J = 6,8 Hz), ein 2-Protonen bei ö 1,9, ein doppeltes 1-Proton-Dublett bei δ 3,74 (J = 1 und 3Hz), ein 1-Protonen-Quartett bei 0 3,94 (J =6,8), ein 1-Proton bei 0 4,07 und 1-Proton bei (5 4,8 den 9 Protonen von 2-Desoxy-L-fucose und ein 3-Protonen-Dublett bei (5 1,4 (J = 6,8 Hz) und ein symmetrisches 1-Protonen-Quartett bei 0 4,73 (J =6,8 Hz), wobei die Abschirmung durch aas Äthersauerstoffatom beseitigt wird, und wobei eine Kupplung untereinander erfolgt, den Methylprotonen bei C-6' bzw. dem Proton bei C-5' zugeordnet. Spinnentkupplungsversuche zeigen, daß ein Dublett bei 6 6,86 (J = 3,5 und 10,0 Hz) und zwei Dubletts bei 0 6,11 (J = 10,0 Hz) und 0 5,26 (J =3,5 Hz) den Vinylprotonen des ABM-Systems entsprechend den Protonen bei C-2', C-3' bzw. C-Γ zugeordnet werden können. Auf diese Weise kann ein Zuckeranteil, der nicht aus 2-Desoxy-L-fucose in dem Methyldisaccharid besteht, als 2,3,6-Tridesoxyhex-2-enopyranos-4-ulose, die mit dem C-4 von 2-Desoxy-L-fucose verknüpft ist, identifiziert werden.

Aus den vorstehenden Analyseergebnissen geht hervor, daß das Methyldisaccharid ein neuer Zucker der folgenden Struktur ist:

OCH₃

25

30

35 Der endständige Zucker wird als Aculose bezeichnet. Die chemische Struktur von Mal44-Y gemäß vorliegender Erfindung wird wie folgt ermittelt:

O COOCH₃

CH₂CH₃

OH

45

50

Einige Anthracyclinglycosidantibiotika mit Aklavinon- und ε-Pyrromycinonaglyconanteflen sind bekannt Der Verbindungen MA144-G1, -G2, -L, -Nl, -Sl, -S2, -Ul, -U2 und -Y unterscheiden sich deutlich von allen diesen Verbindungen im Hinblick auf die Formel des Moleküls, die Abbauprodukte bei der Säurehydrolyse,

die Spektren im UV, sichtbaren und Infrarotbereich od. dgl., wie vorstehend erläutert worden ist. Von den bekannten Anthracyclinglycosiden bestehen Aklavin und Pyrromycin aus Alkavinon oder ε-Pyrromycinon und einem Zucker, und zwar L-Rhodosamin, wodurch sie sich von den erfindungsgemäßen Verbindungen unterscheiden. Aclacinomycin A und Cinerubin A bestehen aus drei Zuckeranteilen, und zwar L-Cinerulosyl-2-desoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl. MA144-M1 und -M2 (DE-OS 27 15 255) bestehen ebenfalls aus drei Zuckeranteilen, und zwar L-Amicetosyl-2-desoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl, während Rhodirubin B (US-PS 41 27 714) aus L-Rhodinosyl-L-rhodinosyl-L-rhodosaminyl) besteht. Diese drei bekannten Antibiotika unterscheiden sich von den erfindungsgemäßen Verbindüngen auf der Grundlage des Zuckeranteils. Der

Antimikrobielles Spektrum der MA 144-Komponenten

Zuckeranteil von Rhodirubin A besteht aus L-Rhodinosyl-2-desoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl wie im Falle des Zuckeranteils von MA144-N1 gemäß vorliegender Erfindung, das Aglycon von MA144-N1 besteht jedoch aus Aklavinon und unterscheidet sich von dem ε-Pyrromycinon von Rhodirubin A.

Daraus geht hervor, daß die Verbindung MA144-G1, -G2, -L, -Nl, -Sl, -S2, -Ul, -U2 und -Y gemäß vorliegender Erfindung neue Substanzen sind.

MA144-G1, -G2, -L, -Sl, -S2, -Nl, -Ul, -U2 und -Y zeigen antimikrobielle Aktivitäten gegenüber verschiedenen Arten von Mikroorganismen. Die minimale inhibierende Konzentration der erfindungsgemäßen Antibiotika, ermittelt nach der Methode der Verdünnung der Brühe, gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

Testmikroorganismus

Minimal inhibierende Konzentration, mcg/ml

MA 144-

Gl G2 L Nl Sl

S2

U 1

U2

Staph. aureus FDA 209 P	6,25	0,78	3,12	6,25	6,25	6,25	6,25	6,25	3,1	0,4
Staph. aureus, Smith	1,56	0,2	1,56	1,56	0,78	3,1	0,78	3,1	0,78	0,2
Bac. subtilis ATCC 6633	3,12	1,56	1,56	3,1	3,1	3,1	3,1	3,1	3,1	0,2
Bac. cereus ATCC 9634	1,56	100	0,78	1,56	0,78	1,56	0,78	1,56	1,56	0,1
Bac. megaterium NRRL B-938 6,25	>100	6,25	6,25	3,1	3,1	3,1	3,1	1,56	0,2
Sar. lutea ATCC 9341	3,12	0,78	0,78	0,78	1,56	1,56	1,56	1,56	0,2
Mic. flavus		0,2	0,2	0,4	1,56	0,78	1,56	0,78	0,1
Cory, bovis 1810	100	0,78	1,56	0,78	0,78	0,78	6,25	6,25	0,2
Ps. fluorescens NIHJB-254	100	100	100	>100	>100	>100	>100	>100	>100
Pr. morganii	>100	>100	>100	>100	>100	>100	>100	>100
MycobacL smegmatis	3,12	3,1	>100	>100	>100	>100	>100	3,1
ATCC 607
Can. albicans IAM 4905	>100	100	>100	>100	>100	>100	>100	>100
Can. tropicalis IAM 4942	>100	100	>100	>100	>100	>100	>100	>100

Wie aus der vorstehenden Tabelle hervorgeht besitzen die MA144-Komponenten gemäß vorliegender Erfindung eine antimikrobielle Aktivität, insbesondere gegenüber grampositiven Bakterien. Sie sind daher therapeutisch geeignet zur Behandlung von Säugetieren, und zwar zur Behandlung von Diphtherie, Tuberkulose, Lungenentzündung, Tetanus sowie anderen Infektionskrankheiten, die durch grampositive Bakterien verursacht werden.

Die erfindungsgemäßen MA144-Komponenten zeigen eine ausgeprägte Antitumoraktivität bei geringer Toxizität bei der Durchführung von Tiertests. Sie sind daher therapeutisch wertvoll zur Inhibierung des Wachstums von Säugetiertumoren. Insbesondere besitzen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine ausge-

Verlängerung der Überlebenszeit (% T/C)

prägt inhibierende Wirkung auf die Mäuseleukämie L1210. So wurden BDFi-Mäuse mit einem Gewicht von

19 bis 22 g intraperitoneal mit 1 χ ΙΟ⁶ L^lO-Zellen/ Maus beimpft 24 Stunden nach der Beimpfung wird die jeweilige Verbindung intraperitoneal einrnd täglich während 9 aufeinanderfolgenden Tage eingespritzt Am 30. Tag wird der Prozentsatz der Verlängerung der

Überlebenszeit gegenüber Vergleichstieren ermittelt. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor, und zwar zusammen mit den LD50-Werten nach einer einfachen intraperitonealen Injektion.

Die therapeutische Wirkung gegenüber Mäuselcukä-

mie L1210 sowie die Toxizität der MA144-Komponenten sind nachfolgend aufgeführt

Verbindungen

MA 144-Gl G2

Sl

S2

U2

Anti-L 1210-Aktivitätsdosis,
mg/kg/Tag

20
10

135 108

98

65

143

	Fortsetzung	MA 144-	27 43	654	S 1	S2	28	U 2	Y
27	Verbindungen	G 1

Anti-L 1210-Aktivitätsdosis,				140	85	U 1	86	127
mg/kg/Tag	187	G2 L	N 1	168	110		86	115
5	215			133	145		112	-
2,5	145			114	130	127	135	-
1,25	130	90 128	200	96	118	165	129	-
0,6	118	130 114	184	--	97	157	110	-
0,3	101	164 95	137			129
0,15	LD₅₀	140	123	24,4	12,5	114	4,5	40-50
Toxizität (Maus)	28,5	108	110			-
Intraperitoneale Verabreichung,		97	-
mg/kg				30,2
	17,0 45,5	32,5

Die erfindungsgemäßen MA144-Komponenten inhibieren das Wachstum von Säugetiertumorzellen in Kultur, insbesondere bei geringer Konzentration, und inhibieren vollständig eine RNA-Synthese. Zur Durchführung dieses Experiments werden L12tO-Zellen auf ein RPMl 1640-Medium (Nissui, Rosewell Park Memorial Institute 1640) aufgeimpft, das 20% Kalbsserum enthält. Das Züchten erfolgt bei 37° C während einer Zeitspanne von 3 Tagen in einem CC^-Inkubator. In einer Konzentration von 0,1 μg/ml werden die erfindungsgemäßen Verbindungen am Tag 1 zugesetzt. Bei der Durchführung des ¹⁴C-Inkorporationsversuchs werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von 0,5 μg/ml zur Durchführung einer RNA-Synthese und l,0μg/ml zur Durchführung einer DNA-Synthese zugesetzt, ferner wird ¹⁴C-Thymidin oder -Uridin dem Medium während einer Zeitspanne von 60 Minuten bei 37⁰C zugegeben. Die Wirkungen auf das Wachstum sowie die Synthese von DNA und RNA gehen aus dem Prozentsatz der Inhibierung im Vergleich zu einer Vergleichsprobe hervor. Die diesbezüglichen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Aus den Ergebnissen ist zu ersehen, daß MA144-Komponenten merklich das Wachstum und die RNA-Synthese von gezüchteten L1210-Zellen bei geringer Konzentration inhibieren. Diese Ergebnisse untermauern die therapeutische Wirksamkeit, die bei der Behandlung von Tiertumoren festgestellt worden ist.

Wirkungen von MA144-Komponenten auf das Wachstum und die makromolekulare Synthese von gezüchteten L1210-Zellen

Verbindungen	% Inhibierung	Synthese von	DNA
	Wachstum	RNA	69,6
	(am Tag 2)	81,6	40,9
Aclacinomycin	89,7	65,6	39,4
MA 144-G 1	80,7	57,8	11,3
-G 2	82,1	39,7	57,4
-L	27,4	74,4	76,5
-N 1	79,2	74,1	48,8
-S 1	86,0	65,6	27,7
-S 2	88,1	67,2	30,5
-U 1	78,5	71,5	99,6
-U 2	80,5	93,9
-Y	90,2

Wie vorstehend erwähnt, sind die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen MA144-G1, -G2, -L, -Nl, -Sl, -S2, -Ul, -U2 sowie -Y neue Antibiotika, die sich als wertvolle Substanzen in der Human- und Veterinärmedizin einsetzen lassen und auch eine ausgeprägte inhibierende Wirkung gegenüber bösartigen Saugetiertumoren sowie gegenüber grampositiven Bakterien zeigen.

In den Rahmen der Erfindung fallen daher auch pharmazeutische Zubereitungen, die wenigstens eines der Anthracydinglycoside gemäß Anspruch 1 mit einem verträglichen pharmazeutischen Träger enthalten. Die Zubereitungen können in jeder pharmazeutischen Form hergestellt werden, die der jeweiligen Verabreichung angepaßt ist Beispiele für derartige Zubereitungen sind feste Zubereitungen Fir eine orale Verabreichung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver und Granulate, flüssige Zubereitungen für eine orale Verabreichung, wie Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Elixiere sowie Zubereitungen für eine parenterale Verabreichung, wie sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen.
Die erflndungsgemäßen Verbindungen bilden nicht-

toxische Säureadditionssalze mit einer Vielzahl von anorganischen und organischen Säuren. Daher können Säureadditionssalze, die mit derartigen pharmazeutisch verträglichen Säuren gebildet werden, wie Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure, Propionsäure, ölsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Glutaminsäure, Pantothensäure in der gleichen Weise wie die MA144-Verbindungen per se eingesetzt werden.

Die bevorzugten Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen hängen von der jeweils eingesetzten Verbindung, der jeweils formulierten Zubereitung, der Verabreichungsart sowie der jeweiligen Stelle, dem Krankheitsträger und der zu behandelnden Krankheit ab. Im allgemeinen werden die MA144-Verbindungen intraperitoneal, intravenös, subkutan oder lokal eingespritzt oder oral an Tiere verabreicht Ferner ist eine intravenöse, intraperitoneale, lokale oder orale Verabreichung an Menschen möglich. Viele Faktoren, welche die Wirkung des Wirkstoffes modifizieren, sind zu berücksichtigen, beispielsweise das Alter, das Körpergewicht, das Geschlecht, die aufgenommene Nahrung, die Verabreichungszeit, der Verabreichungsweg, die Ausscheidungsmenge, der Zustand des Patienten, Arzneimittelkombinationen, Reaktionsempfindlichkeit sowie die Schwere der Krankheit. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch unter Berücksichtigung der maximal tolerierten Dosis durchgeführt werden. Die optimalen Verabreichungsmengen für bestimmte Zustände lassen sich unter Anwendung herkömmlicher Dosierungsermittlungstests ermitteln.

Bei einer Verwendung als antibakterielle Mittel werden die MA144-Verbindungen im allgemeinen in der Weise verabreicht, daß die Konzentration des Wirkstoffs größer ist als die minimal inhibierende Konzentration für den jeweils zu behandelnden Organismus.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

A) Ein Nährmittelmedium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt:

Glukose . 2%

Kartoffelstärke 2%

Sojabohnenpulver 2%

K₂HPO₄ 0,1%

MgSO₄ · 7 H₂O 0,1%

NaCl 0,3%

MnCI₂ · 4 H₂O 0,0008%

CuSO₄ · 7 H₂O 0,0007%

FeSO₄-7 H₂O 0,0001%

ZnSO₄ · 7 H₂O 0,0002%

pH 7,2

50 ml dieses Mediums werden bei 120° C während einer Zeitspanne von 15 Minuten in einem 500-ml-Kolben sterilisiert, der mit 1 ml einer gefrorenen Kultur von Streptomyces galilaeus MA144-M1 (FERM P-2455) ATCC 31133 beimpft worden ist. Die Bebrütung erfolgt während einer Zeitspanne von 48 Stunden bei 30° C auf einem Rotationsschüttler. 101 des in der vorstehend beschriebenen Weise sterilisierten Mediums in einem 20-1-Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl werden aseptisch mit 200 ml der vorstehend beschriebenen Impfkultur beimpft. Die Fermentation wird bei 28° C während einer Zeitspanne von 18 Stunden unter Rühren (300 UpM) und Belüftung (5 l/min) durchgeführt. Dann werden 101 dieser Kultur zu 6001 des vorstehend beschriebenen sterilisierten Mediums in einem Stahltank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 20001 gegeben und bei 28° C während einer Zeitspanne von 36 Stunden unter Rühren (180UpM) und Belüftung (300 l/min) gezüchtet

5801 der erhaltenen Kulturbrühe werden auf einen pH von 5,0 mit Schwefelsäure eingestellt und unter Einsatz von Diatomeenerde filtriert Der erhaltene Filterkuchen (56 kg) wird in 501 Aceton suspendiert und nach einem Rühren während einer Zeitspanne von 1

ίο Stunde filtriert Der Rückstand wird mit 501 Aceton reextrahiert Beide Extrakte werden auf 251 unter vermindertem Druck konzentriert und zu 201 Äthylacetat gegeben und gerührt Nach einem Abtrennen der Äthylacetatschicht und einem Einengen auf 1 1 unter vermindertem Druck wird ein rohes MA144-Gemisch durch Zugabe von 15 1 η-Hexan zu dem Konzentrat ausgefällt, worauf 36 g eines roten Pulvers nach einem zweimaligen Waschen mit η-Hexan erhalten werden. Das vorstehend beschriebene Kulturfiltrat wird auf einen pH von 6,8 mit Natriumhydroxid eingestellt und mit 1001 Toluol extrahiert. Der Extrakt wird auf 101 unter vermindertem Druck konzentriert und mit 101 Acetatpuffer mi einem pH von 3,5 reextrahiert. Die erhaltene wäßrige Schicht wird auf einen pH von 6,8 eingestellt erneut mit 4 1 Toluol extrahiert und dann unter vermindertem Druck auf 30 ml konzentriert. Ein rohes MA144-Gemisch wird durch Zugabe von 300 ml η-Hexan zu dem Konzentrat ausgefällt. Man erhält 2,5 g eines roten Pulvers.

B) 10 g des roten MA144-Gemisches, das aus dem Filterkuchen gemäß Verfahrensstufe A) erhalten worden ist, werden in 100 ml Toluol aufgelöst und einer Säulenchromatographie in einer Säule mit einer Größe von 5 χ 40 cm unterzogen, die mit 300 g Kieselsäure gefüllt ist Nach dem Verwerfen des anfänglichen Eluats, das unter Einsatz von 1,5% Methanol enthaltendem Toluol gewonnen worden ist, werden MA144-G1-, -G2- und -L-Fraktionen nacheinanderfolgend mit 2% methanolenthaltendem Toluol eluiert. Dann wird die MA144-Nl-Fraktion mit 3% methanolenthaltendem Toluol sowie MA144-S1- und -S2-Fraktionen sowie MA144-U1- und -U2-Fraktionen mit 5% methanolenthaltendem Toluol nacheinanderfolgend eluiert. Nach einem Konzentrieren einer jeden vorstehend erhaltenen Fraktion werden rohe orangerote Pulver aus einem Gemisch aus MA144-G1- und -G2 in einer Menge von 210 g, einem Gemisch aus 190 mg MAl-M-L, 570 mg MA144-N1 und Rhodirubin A, 360 mg eines Gemisches aus MA144-S1 und -S2 sowie 270 mg eines Gemisches

so aus MA144-U1 und -U2 durch die Zugabe von n-Hexan erhalten.

C) 2,5 g des aus dem Kulturfiltrat wie in Verfahrensstufe A erhaltenen MA144-Rohpulvergemisches werden in 6 ml Toluol gelöst und einer Säulenchromatographie unter Einsatz einer Säule unterzogen, die mit 100 g Kieselsäure gefüllt ist. Dann wird die MA144-Y-Fraktion mit 1,7% methanolenthaltendem Toluol bei 5° C eluiert. Die erhaltene Fraktion wird zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft. 400 mg MA144-Y werden in Form eines orangeroten Pulvers erhalten.

D) 210 mg eines gemäß Verfahrensstufe B) erhaltenen Gemisches aus MA144-G1 und -G2 werden in einer kleinen Menge Äthylacetat aufgelöst und einer Säulenchromatographie unter Verwendung einer Säule unterzogen, die mit 30 g Column-Lite® (Warenzeichen, Fuji Chem. Co. für Kieselsäure) gefüllt ist. Dann erfolgt eine Eluierung mit einem Gemisch aus Äthylacetat und Methanol (1 :1). Die gelbe Fraktion wird zur Trockne

unter vermindertem Druck konzentriert Der erhaltene Rückstand wird in 50 ml Chloroform aufgelöst und mit 50 ml einer 0,01 m Phosphatpufferlösung, die 10~³ Mol EDTA enthält, zur Entfernung der restlichen Metallionen geschüttelt Die Chloroformschicht wird zweimal mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft Man erhält 110 mg eines gelben Pulvers aus MA144-G1.

Die vorstehend beschriebene, mit Column-Lite® gefüllte Säule wird nach der Eluierung der gelben Fraktionen mit eine 10-³MoI EDTA-enthaltenden 3C°/oigen Methanolgemisch behandelt Das erhaltene rote Eluat wird zur Trockne eingedampft und in einer kleinen Menge Chloroform aufgelöst Restliche Metallionen werden nach der vorstehend beschriebenen Methode entfernt Man erhält 22 mg MA144-G2 in

15 Form eines roten Pulvers (EDTA=Äthylendiamintetraessigsäure).

Rohes MA144-L-Pulver gemäß Verfahrensstufe B) wird in der gleichen Weise, wie sie vorstehend für MA144-G1 beschrieben worden ist, behandelt, wobei man 150 mg eines gelben MA144-L-Pulvers erhält Nach der vorstehend zur Reinigung von MA144-G1 und -G2 beschriebenen Reinigungsmethode erhält man 260 mg gereinigtes MA144-Nl-Pulver, 150 mg MA144-S1,88 mg MA144-S2,128 mg MA144-U1,54 mg MA144-U2 und 114 mg MA144-Y.

Beispiel 2

Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in der nachfolgend beschriebenen Weise unter Einsatz der angegebenen Streptomyces-Stämme erhalten.

Stämme

Erhaltenes MA 144, mg Gl G 2 L

N 1

S 1

S2

U 1

U2

S. galilaeus ATCC 14969 42

S. sp. ME 505-HE 1

(FERM P-3667), ATCC 31273

S. cinereoruber ATCC 19740 25

S. niveoruber ATCC 14971

S. antibioticus ATCC 8663

S. purpurascens ATCC 25489

S. = Streptomyces

Beispiel 3

Ein Gemisch aus Lebern, die aus fünf männlichen, 500 g wiegenden Meerschweinchen isoliert worden sind, und 10 Volumina 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer (pH 7,8), enthaltend 1OmM Magnesiumchlorid und 0,25 Mol Rohrzucker, wird unter Verwendung einer Teflon®-Homogenisierungsvorrichtung homogenisiert und bei 10 000 UpM während einer Zeitspanne von 20 Minuten zentrifugiert. 400 ml der überstehenden Flüssigkeit werden mit 50 ml 4 mg/ml Aclacinomycin A und 50 ml 6 mg/ml NADP (Nicotinamide.denindinucleotidphosphat) vermischt, worauf jeweils 50 ml in 500-ml-Kolben verteilt und bei 4O⁰C während einer Zeitspanne von 1 Stunde in einem Rotationsschüttler bebrütet werden. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 2 Volumina eines kalten Gemisches aus Chloroform und Methanol (1 :1) beendet. Diese Lösung wird gut vermischt und von der Chloroformschicht abgetrennt. Die zurückbleibende aktive Fraktion in der wäßrigen Schicht wird mit einem gleichen Volumen Chloroform reextrahiert. Beide Chloroformschichten werden vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert, auf Kieselsäuredünnschichtplatten aufgebracht und mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol (10:1) entwickelt. Nach der Chromatographie wird das MA144-N1 entsprechende Band abgekratzt, worauf MA144-N1 mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (10:1) extrahiert und unter vermindertem Druck konzentriert wird. Man erhält 62,3 mg eines gelben Pulvers aus MA144-N1. F. 146° C [«] ? + 57,5° (c= 0,4, CHCl₃).

60

65

Beispiel 4

1 g Aclacinomycin A wird in 40 ml Äthylacetat gelöst, mit 40 ml Wasser, das 100 mg Natriumborhydrid enthält, vermischt und kräftig während einer Zeitspanne von 20 Minuten bei Zimmertemperatur in einem Scheidetrichter geschüttelt Man läßt die Reaktionsmischung stehen, worauf die Äthylacetatschicht abgetrennt wird. Der Extrakt wird mit der NaCl-gesättigten Lösung gewaschen, die ΙΟ-³ Mol EDTA enthält, zweimal mit Wasser gewaschen und dann nach einer Dehydratisierung mit wasserfreiem Natriumsulfat konzentriert. Nach einer Kieselsäuresäulenchromatographie (3 χ 20 cm Säule) unter Verwendung eines Gemisches aus Toluol und Methanol (100:3), werden die aktiven Fraktionen, die MA144-N1 enthalten, zusammengeschüttet, konzentriert und zu η-Hexan gegeben. Man erhält 250 mg MA144-N1 in Form eines gelben Pulvers. F. 147° C [λ] ? + 57,5° (c= 0,4, CHCl₃).

Beispiel 5

400 mg des gemäß Beispiel 4 erhaltenen MA144-M1 werden in 100 ml einer 0,5%igen Chlorwasserstoffsäure aufgelöst und bei 20° C während einer Zeitspanne von 15 Minuten hydrolysiert. Nach einer Neutralisation mit verdünntem Alkali auf einen pH von 7,0 wird MA144-S1 zweimal mit 200 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformschichten werden zusammengegossen und unter vermindertem Druck konzentriert. Aktive Fraktionen, die MA144-S1 enthalten, werden durch eine Kieselsäurechromatographie (3 χ 25-cm-Säule) unter Verwendung eines Gemisches aus Methanol und Toluol (5 :100)

68	55	126	63	145	115	63	43	I
-	-	-	143	89	97	101	-	i'.' Ei
37	38	76	88	79	27	83	16
56	-	43	54	38	-	64	12
28	-	-	-	18	-	32	-
13	_	_	_	9	_	14	_	U

erhalten, zusammengegossen, konzentriert und zu η-Hexan gegeben. Man erhält 237 mg eines gelben MA144-S1-Pulvers. F. 145°C [α]?+77°C (c=l,O, CHCl₃).

Beispiel 6

Ein Nährmedium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt:

Lösliche Stärke	1%
Sojabohnenpulver	2%
Hefeextrakt	03%
K₂HPOh	0,1%
MgSO₄ · 7 H₂O	0,1%
MnCl₂ · 4 H₂O	0,0005%
FeSO₄ · 7 H₂O	0,0005%
pH	7,7

50 ml dieses Mediums werden bei 120° C während einer Zeitspanne von 15 Minuten in einem 500-mJ-Kolben sterilisiert, der mit Streptomyces galilaeus MA144-M1 (ATCC 31133) beimpft worden ist und bei 28° C während einer Zeitspanne von 3 Tagen auf einem Rotationsschüttler bebrütet

Die erhaltene Kulturbrühe wird zentrifugiert und auf einen pH von 7,2 unter Verwendung von 1 η Natriumhydroxid eingestellt Der überstehenden Lösung wird Ammoniumsulfat bis zu einer 50%igen Sättigung zugesetzt, worauf man das Gemisch über Nacht bei 8°C stehenläßt. Nach einem Zentrifugieren wird der erhaltene Niederschlag in 300 ml eines 0,01 m Tris-HCl-Puffers (pH 7,2) aufgelöst und gegen das 40fache Volumen des vorstehend beschriebenen Puffers über Nacht bei 8° C in einem Collodiumbeulel dialysiert Ungefähr 1000 Einheiten/ml einer rohen Enzymzubereitung werden erhalten.

Die Enzymreaktion zur Gewinnung von MA144-Y wird in der folgenden Weise durchgeführt: 1 g Aclacinomycin A wird in 20 ml Methanol aufgelöst worauf 10 ml 0,05 η HCl, gemischt mit 200 ml 1 m Citratpuffer (pH 5,5), 80 ml der vorstehend hergestellten rohen Enzymlösung und 4000 ml destilliertes Wasser zugesetzt werden. Jeweils 100 ml der Reaktionsmischung werden in 500-ml-Kolben verteilt und während einer Zeitspanne von 5 Stunden bei 28° C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt Die Reaktionsmischung wird auf einen pH von 6,8 mit 1 n-Natriumhydroxid eingestellt mit 11 Toluol extrahiert und unter vermindertem Druck auf 30 ml konzentriert. Der durch die Zugabe von 300 ml η-Hexan zu dem Konzentrat erhaltene Niederschlag besteht aus 0,95 g eines zu 90% reinen Pulvers von MA144-Y. Dieses rohe MA144-Y-Pulver wird in dem 5fachen Volumen Toluol aufgelöst und einer Kieselsäuresäulenchromatographie (Wako Gel® C-200, 100 g) unterzogen, wobei mit 1,7% Methanol enthaltendem Toluol bei 5^CC Chromatographien wird. Die erhaltenen aktiven Fraktionen werden zur Trockne konzentriert. Man erhält 0,82 g reines MA144-Y in Form eines gelben Pulvers.

Hierzu 30 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Anthracyclinglycoside der Gruppe MA 144- der allgemeinen Formel

R¹ O

COOCH₃

CH₂CH₃