DK145200B

DK145200B - Fremgangsmaade til fremstilling af anthtacyclinglycosid-antibiotika

Info

Publication number: DK145200B
Application number: DK435577AA
Authority: DK
Inventors: H Umezawa; T Takeuchi; T Oki; T Inui
Original assignee: Microbial Chem Res Found
Priority date: 1976-10-05
Filing date: 1977-09-30
Publication date: 1982-10-04
Also published as: NO147953C; FI57444B; FR2403350B1; NO148959B; AU505971B2; CH637160A5; US4207313A; NL176004B; GB1589536A; IE46236L; HU181999B; LU78242A1; SE7710972L; NL176004C; DK145200C; SE425798B; YU235277A; YU40483B; GR63996B; DE2743654A1

Description

i 145200

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte anthracyclinglycosid-antibiotika betegnet MA144-G1, -G2, -L, - NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 og -Y med den almene formel R1 0 C00CH3 OH 0 OH 0 (I) 0 l/CH3 / \ N' 2

/CH, \ R

OH

R3 12 3 hvori R , R og R har følgende betydninger:

Antibiotikum MA144- R3, R3 R3 CH3 GI H CH3 1 0 g2 oh ch3 0=/ \ • · "<5) λ—0 NI Η CH- /2H- > _3 Ho\z/_

51 H CH3 H

52 OH CH3 H

2 145200

Fortsat:

Antibiotikum MA144- R^ R^ R^ U2 OH CHj Ηθ\_/

OH

λ-0 Y H CH3 Q=^/cH3 ^ eller ikke-toksiske syreadditionssalte deraf eller komplekser deraf med desoxyribohucleinsyre.

Det er kendt, at forskellige typer anthracyclinglycosider dannes ved dyrkning af mikroorganismer i et substrat. Blandt disse er dau-nomycin og adriamycin allerede anvendt klinisk til cancer hos mennesket, og aclacinomycin A, carminomycin og rubidazon er under klinisk undersøgelse og har stor interesse indenfor cancer-kemoterapien.

Fremstilling af adriamycin ved fermentation med Streptomyces peuceti-cus var. caesius er beskrevet i USA-patents'krift nr. 5*590.028. Kemisk omdannelse af daunomycin til adriamycin er beskrevet i USA-patentskrift nr. 3*803-124.

Daunomycin, fremstillet ved fermentation med Streptomyces peuceticus ifølge britisk patentskrift nr. 1.003*383/ er muligvis identisk med Bhone-Poulenc1 s 13-057 R*P. (tidligere rubidomycin og nu daunoribi-cin; se britiske patentskrifter nr. 985-598, 1.188.262 og 1.241.750 og DSA-patentskrift nr. 3*616.242) og muligvis identisk med Ciba's danubomycin, som er beskrevet i DSA-patentskrift nr. 3*092.550 og britisk patentskrift nr. 901.830. Se også DSA-patentskrift nr.

3.686.163 vedrørende dihydrodaunomycin.

Anthracyclinantibiotika, der indeholder en aklavinonaglycondel, er beskrevet som følger: a) aclacinomycin A og B i DSA-patentskrift nr. 3*988.315 og af Oki et al i J. Antibiotics 28, 830 (1975)· 145200 3 b) Aklavin i J. Bacteriol. 72? 90 (1956)·

Amthracyclinantibiotika, der indeholder en &-pyrromycinonaglycondel, er beskrevet i litteraturen som følger: c) Musettamycin og marcellomycin fra bøhmensyrekompleks i J. Antibiotics 30, 523 (1977)· d) Pyrromycin i Chem. Ber. 92, 1904 (1959)· e) Cinerubin A og B i britisk patentskrift nr. 846.130 (se også USA-patentskrift nr. 3.864.480 og Keller-Schierlein et al.?Antimicrobial Agents and Chemotherapy, side 68 (1970)).

Andre anthracyclinantibiotika, hvori aglyconen er forskellig fra aklavinon og e-pyrromycinon,er beskrevet i følgende litteratur: f) ETogalamycin i J. Aner. Chem. Soc. 99, 54-2 (1977)· g) Steffimycin i J. Antibiotics 27, 805,809 (1974·)· h) Carminomycin i J. Antibiotics 27, 274(1974), i tysk patentskrift nr. 2.362.707 og i J. Amer. Chem. Soc.97, 5955 (1975)· i) Trypanomycin i Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1, 385 (1972).

j) Requinomycin i J. Antibiotics 25, 393 (1972).

k) Galirubin A og B i Haturwiss.52, 539 (1965),og Chem. Abst. 67, 90573z (1967).

Bor yderligere illustrative og kortfattede beskrivelser af anthracyclinantibiotika se Index of Antibiotics from Actinomycetes,

Hamao Umezawa, chefredaktør, University Park Press, State College, Pennsylvania, U.S.A. (1967),som følger:

Antibiotikum Side

Aklavin 111

Cinerubin A 220

Cinerubin B 221 145200 4

Antibiotikum Side

Danubomycin 242

Daunomycin 243

Pyrromycin 524

Ehodbmycin Å, B 561

Rubidomycin 574- lærebogen Antibiotics, vol. 1, Mechanism of Action, udgivet af David Gottlieb og Paul D. Shaw, Springer-Yerlag New York, Inc., ΪΓ.Υ., N.Y. (1967), indeholder på siderne 190-210 en gennemgang af A. DiMarco med titlen Daunomycin and Related Antibiotics. Information Bulletin, nr. 10, International Center of Information of Antibiotics, i samarbejde med WHO, december 1972, Belgien, gennemgår anthracyc-liner og deres derivater.

Det har nu vist sig, at visse Streptomyces-stammer danner en række hidtil ukendte anthracyclinglycosid-antibiotika MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 og -Y, som a) har antimikrobielle aktiviteter mod gram-positive bakterier, b) er effektive til inhibering af væksten af maligne tumorer i pattedyr og c) har-en høj cytotoksicitet og således inhiberer væksten af og RNA-syntesen i pattedyrtumorceller i kultur, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at man dyrker en stamme valgt blandt Streptomy-ces sp. ME505-HE1 (FERM P-3667) ATCC 31273, Streptomyces galilaeus MAI44-Ml (FERM P-2455) ATCC 31133, Streptomyces galilaeus ATCC 14969, Streptomyces cinereoruber ATCC 19740, Streptomyces niveoruber ATCC 14971, Streptomyces antibioticus ATCC 8663 og Streptomyces pur-purascens ATCC 25489 i et næringsmedium under submerse aerobe betingelser og udvinder anthracyclinglycosiderne med formlen I fra dette dyrkningsmedium, om ønsket i form af ikke-toksiske syreadditionssalte eller desoxyribonucleinsyrekomplekser deraf.

På tegningen viser:

Pig. 1 absorptionsspektret for ultraviolet og synligt lys af MA144-G1 i 90% methanol.

Pig. 2 absorptionsspektret for ultraviolet og synligt lys af MA144-G2 i 90% methanol.

145200 5

Fig. 3 absorptionsspektret for ultraviolet og synligt lys af MA144-L i 90% methanol.

Fig. 4 absorptionsspektret for ultraviolet og synligt lys af MA.144-N1 i 90% methanol.

Fig. 5 absorptionsspektret for ultraviolet og synligt lys af Mål44-Sl i 90% methanol.

Fig. 6 absorptionsspektret for ultraviolet og synligt lys af M144-S2 i 90% methanol.

Fig. 7 absorptionsspektret for ultraviolet og synligt lys af MA144-U1 i 90% methanol.

Fig. 8 absorptionsspektret for ultraviolet og synligt lys af MA.144-U2 i 90% methanol.

Fig. 9 absorptionsspektret for ultraviolet og synligt lys af MA144-Y i 90% methanol.

Fig.10 absorptionsspektret for infrarødt lys af MA144-G1 i kaliumbromid.

Fig. 11 " MA.144-G2

Fig. 12 " Mål44-L

Fig. 13 " MA144-N1

Fig. 14 " M144-S1

Fig. 15 " MA144-S2

Fig. 16 " MÅ.144—U1

Fig. 17 " M144-IJ2

Fig. 18 " MA.144-Y

Fig. 19 MR-spektret af MA.144-G1 i ODCl^ (60 MHz).

Fig. 20 " MA.144—G2 " "

Fig. 21 " MA.144-L " "

Fig. 22 " Mål44-Ml " (100 MHz).

Fig. 23 " MA.144-S1 " (60 MHz).

Fig. 24 " MA.144-S2 " "

Fig. 25 " MA.144-U1 " "

Fig. 26 " MÅ144—U2 '* "

Fig. 27 " MA144—Y " (100 MHz).

145200 6

Fig. 28 absorptionsspektret for ultraviolet og synligt lys af det methylerede dis ac char id, der opnås af MA144-Y i methanol (0,04- g/1).

Fig. 29 absorptionsspektret for infrarødt lys af det methylerede di-saccharid, der opnås af MA.144-Y i kaliumbromid.

Fig. 30 BMR-spektret af det methylerede disaccharid, der opnås af MA14A-Y i CDC15 (100 MHz).

Beskrivelse af stammen ME505-HE1.

Stamme ME505-HE1 isoleredes fra en jordprøve taget ved Institute of Microbial Chemistry, Tokyo, juli 1974. Stamme ME505-HE1 har følgende egenskaber.: 1. Morfologiske egenskaber:

Under mikroskop iagttages forholdsvis langeog rectiflexibilis luftmycelier fra forgrenede substratmycelier. Den modne sporekæde består af mere end to sporer, som måler 0,6-0,8 x 1,0-1,2 μ, og dens overflade er glat.

2. Egenskaber på forskellige medier:

Beskrivelsen i parentes følger farvestandarden "Color Harmony Manual" udgivet af Container Corporation of America, U.S.A..

(1) På saccharose-nitrat-agar inkuberet ved 27°C; farveløs til bleg purpurrød vækst (centrene af kolonierne er lyserøde til mat purpurrøde (9 ic til 9 lc, Raspberry Rose)). Intet eller sparsomt hvidt luftmycelium; intet opløseligt pigment. Ved tilsætning af en dråbe 1 U HC1 til et lille stykke af myceliet, der var skåret ud med et propbor efter 15 dages inkubation, ændres vækstens purpurrødlige farve til bleg lyserød.

(2) På glucose-asparagin-agar inkuberet ved 27°C; farveløs til mat rødlig orange (5 lc, Copper) til lys rødlig orange (6 ga, Lt Coral Rose) vækst; intet luftmycelium; intet opløseligt pigment.

(3) På glycerol-asparagin-agar (ISP medium nr. 5) inkuberet ved 27°C; farveløs til lys rødlig orange (5 lc, Copper) til gullig rød (6 ne, Redwood) til purpurrød (9 nc, Raspberry) vækst; intet luftmycelium eller partielt og tyndt hvidt til blegrødlig hvidt til bleg lyserødt 7 U5200 luftmycelium; intet opløseligt pigment. Ved tilsætning af en dråbe 1 N NaOH-opløsning til et lille stykke af myceliet, der var skåret ud med et propbor efter 15 dages inkubation, ændredes vækstens gullig røde farve til purpur.

(4) På uorgniske salte-stivelse-agar (ISP medium nr. 4) inkuberet ved 27°C; farveløs til grålig rødbrun (4 ni, Spice Brown til 5 lg, Cocoa Brom) vækst; hvidt til bleg lyserødt tyndt luftmycelium; svag brunt opløseligt pigment.

(5) På tyrosinagar (ISP medium nr. 7) inkuberet ved 27°C; farveløs til bleg brun til gullig brun til grålig rødbrun, endvidere ændredes farven efter ca. 15 dages inkubation til lys gullig brun (6 lc,Coral) til mat rød (6 ne, Redwood), eller mørk rødlig brun (7 pn,Dk Rose Brom til 7·? pi, Deep Maroon); intet eller sparsom hvidt luftmycelium observeredes efter 21 dages inkubation; svag rødlig brunt opløseligt pigment.

(6) På næringsagar inkuberet ved 27°C; bleg gullig brun til bleg brun vækst; intet eller sparsomt hvidt luftmycelium efter 15 dages inkubation; brunt opløseligt pigment.

(7) På gærekstrakt-maltekstrakt-agar (ISP medium nr. 2) inkuberet ved 27°C; farveløs til bleggul til blegbrun til mat rød til mørk purpurrød (7k ug, Old Wine til 7 i pg, Wine) vækst; tyndt hvidt til blegrødlig hvidt luftmycelium efter ca. 7 dages inkubation; meget svag brunligt opløseligt pigment efter 10 dages inkubation.

(8) På havremelagar (ISP medium nr. 3) inkuberet ved 27°C; farveløs til blegbrun til mat rødlig orange til rødlig brun (6 pi, Brom Mahogany) vækst; intet luftmycelium; meget svag mat orange opløseligt pigment.

(9) På glycerolnitratagar inkuberet ved 27°C; farveløs til bleg lyserød til grålig rød til mat rød til mørkerød (8 ne, Rose Wine) til mørk purpurrød (9 ne, Raspberry til 9 pg, Red Plum) til mørk purpurbrun vækst; intet eller sparsomt hvidt luftmycelium. Ved tilsætning af en dråbe 1 N NaOH-opløsning til et lille stykke af myceliet, der var skåret ud med et propbor efter 15 dages inkubation, ændredes vækstens mørkerøde farve til purpurrød; intet opløseligt pigment.

8 145200 (10) På stivelsesagar inkuberet ved 27°C; farveløs til bleg lyserød til bleg rødlig brun til mat rødligorange eller mat purpurrød (8 ne, Rose Wine) vækst; blegrødligt hvidt tyndt luftmycelium; intet opløseligt pigment.

(11) På calciummalatagar inkuberet ved 27°C; farveløs til bleg lyserød vækst; næsten intet luftmycelium eller sparsomt hvidt luftmycelium; intet opløseligt pigment.

(12) På celluloseagar inkuberet ved 27°C; farveløs til hlegbrun vækst; intet luftmycelium; intet opløseligt pigment.

(13) På gelatinestik: På almindeligt gelatinestik inkuberet ved 20°C; farveløs til bleg gullig brun til blegbrun vækst; intet luftmycelium; brunt opløseligt pigment.

På glucose-pepton-gelatinestik inkuberet ved 27°C; farveløs til bleg gullig brun til blegbrun vækst; intet luftmycelium; mørkebrunt opløseligt pigment.

(14) På skummetmælk inkuberet ved 30°C; farveløs til bleg gullig brun til gullig brun vækst; næsten intet eller sparsomt brunlig hvidt luftmycelium, brunt opløseligt pigment.

3. fysiologiske egenskaber: (1) Temperaturområdet for vækst:

Den optimale temperatur for vækst på gærekstrakt-stivelse-agar (opløselig stivelse 1,0$, gærekstrakt 0,2$, agar 3,4$, pH 7,0-7,2) undersøgtes ved 20, 24, 27, 30, 37 og 50°C. Vækst observeredes ved hver temperatur undtagen 37 og 50°C, og den optimale temperatur syntes at være ca. 27°C.

(2) Gelatinesmeltning (inkuberet ved 20°C på 15$ almindelig gelatine; ved 27°C på glucose-pepton-gelatine): ^ 145200 På almindeligt gelatinemedium begyndte smeltningen moderat efter ca.

3 dages inkubation. På glucose-pepton-gelatinemedium begyndte smeltningen moderat til stærkt efter ca. 3 dages inkubation.

(3) Hydrolyse af stivelse (inkuberet ved 27°C på uorganiske salte-stivelse-agar og stivelsesagar): Moderat til stærk hydrolytisk aktivitet observeredes efter 5 dages inkubation.

(4) Koagulation og peptonisering af skummetmælk (inkuberet ved 30°C på skummetmælk): Ingen forandring observeredes før efter 7 dages inkubation, koagulationen var fuldendt efter 10 dages inkubation, hvorefter peptoniseringen begyndte, og denne var fuldendt efter 3 ugers inkubation. Virkningen var moderat til stærk.

(5) Dannelse af melanoidt pigment (inkuberet Ved 27°C på trypton-gærekstrakt-bouillon, ISP medium nr.l; pepton-gærekstrakt-;}em-agar, ISP medium nr. 6; tyrosinagar, ISP medium nr. 7): Melanoidt pigment observeredes på pepton-gærekstrakt-j em-agar og tyrosinagar og ikke på trypton-gærekstrakt-bouillon.

(6) Udnyttelse af carbohydrater (inkuberet ved 27°C, Pridham-Gottlieb-basalagar, ISP medium nr. 9): God vækst med L-arabinose, D-xylose, D-glucose, D-fructose, inositol, L-rhamnose, raffinose og D-mannitol, men ingen vækst med saccharose.

(7) Calciummalatsmeltning (inkuberet ved 27°C på calciummalatagar): Smeltningen af calciummalat omkring væksten begyndte efter 5 dages inkubation med moderat til stærk aktivitet.

(8) Nitratreduktion (inkuberet ved 27°C på peptonvand indeholdende 1,0$ kaliumnitrat, ISP medium nr. 8): Negativ.

Resumé af de ovenstående egenskaber: Stammen ME505-HE1 tilhører slægten Streptomyces; luftmyceliet dannede ikke spiraler eller hvirvler, og sporeoverfladen var glat. Væksten på forskellige medier var blegbrun til mat rødlig orange til mat purpurrød til mørk purpurrød, og luftmycelium observeredes ikke eller var tyndt hvidt til blegrødlig hvidt til bleg lyserødt. Opløseligt pigment observeredes ikke på næsten alle medier, men i nogle tilfælde produceredes svag brunligt el- 10 145200 ler rødlig brunt opløseligt pigment. Desuden viste koloniens modsatte side en karakteristisk vinrød farve med pH-indikator-egenskaber. Produktionen af melanoidt pigment var positiv på pepton-gærekstrakt-jern-agar- og tyrosinagarmedier og negativ på trypton-gærekstrakt-bouillon. De hydrolytiske aktiviteter på protein og stivelse er begge moderate til stærke. Som en karakteristisk egenskab ved stammen var der ingen vækst ved 37°C. Ved sammenligning af kendte arter med de ovenstående karakteristika synes Streptomyces capoamus at være nær beslægtet med den foreliggende stamme (reference 1. Journal of Systematic Bacteriology, bind 22, 282, 1972). Ved sammenligning af stammen ME505-HE1 med standardstammen af Streptomyces capoamus var resultaterne som sammenfattet i den følgende tabel.

Som vist i tabellen var der først og fremmest forskel mellem stammen ME505-HE1 og Streptomyces capoamus i form af luftmyceliet, d.v.s. at Streptomyces capoamus danner terminale spiraler i luftmyceliet, medens stammen ME505-HE1 har ringe luftmycelium, og ved vore undersøgelser observeredes ingen spiraler. Dannelse af melanoidt pigment på ISP medium nr. 1, koagulation af mælk, gelatinesmeltning,udnyttelse af inositol og L-rhamnose hos de to stammer var forskellig, men andre egenskaber hos begge stammer var sammenfaldende. En kultur af stammen ME505-HE1 deponeredes hos Fermentation Eesearch Institute den 7. august 1976 under nummeret FEEM nr. 3667.

145200 ME505-HE1 Streptomyces capoamus ISP 5494

Luftmyceliets form Rectiflexibilis Terminale spiraler (Retinaculia perti)

Sporeoverflade Glat Glat

Luftmyceliets farve Brunlig hvid til Brunlig hvid til lyse- blegrødlig hvid rød til lysegrå til bleg lyserød Vækstens farve Mat purpurrød til Mat rødlig orange til mørk purpurrød rødlig brun til mørk purpurrød

Opløseligt pigment Brunlig eller rød- Brunlig eller lys rødlig brun lig orange

Dannelse af melanoidt pigment ISP medium nr. 1 - (+) ISP medium nr. 6 + + ISP medium nr. 7 + +

Hydrolyse af stivelse + +

Koagulation af mælk +

Peptonisering af mælk + +

Gelatinesmeltning - almindeligt gelatinestik + - glucose-pepton-gelatinestik +

Nitratreduktion - -

Udnyttelse af carbohydrat: D-glucose + + L-arabinose + + D-xylose + + D-fructose + + saccharose inositol + L-rhamnose + raffinose + + D-mannitol + + (+) = sandsynligvis + , + = svag positiv, - = næsten negativ.

145200 12

Fremstillingen af alle de omhandlede forbindelser gennemføres ved dyrkning af en af de ovennævnte streptomycesstammer i et konventionelt vandigt næringsmedium indeholdende kendte næringskilder for actinomyceter, d.v.s. carbon- og nitrogenkilder og uorganiske salte. De generelle fremgangsmåder, der anvendes til dyrkning af andre actinomyceter, er anvendelige til dyrkningen ifølge den foreliggende opfindelse. Mediet indeholder fortrinsvis kommercielt tilgængelige carbonkilder, såsom glucose, glycerol, stivelse, dextrin, saccharose, maltose, olier og fedtstoffer, enten i renset eller i rå tilstand, og kommercielt tilgængelige nitrogenkilder, såsom so-jabønnepulver, gærekstrakt, pepton, bomuldsfrøpulver, tørret gær, majsstøbevand, eller uorganiske salte, såsom ammoniumsulfat, natriumnitrat eller ammoniumchlorid. Uorganiske salte, såsom natri-umchlorid, kaliumchlorid eller phosphater, anvendes fortrinsvis, og der kan om nødvendigt også tilsættes spormetalioner og skumfjernende midler, såsom "Adekanol" eller silicone. Fermentationstemperaturen skal være i området fra 20-37°C, fortrinsvis ca.

25-30°C. pH-Værdien af mediet skal holdes indenfor området fra ca.

6 til 9. Dannelsen af MA144-komponenter i dyrkningsmediet når et maksimum efter 2 til 7 dage enten i rystekolbe eller ved submers aerob fermentation med gennemluftning og omrøring som i de nedenstående eksempler.

De omhandlede forbindelser kan udvindes fra dyrkningsmediet og adskilles fra hinanden ved de følgende fremgangsmåder.

MA144-Komponenter fremstillet ved fermentation findes intracellulært såvel som extracellulært, men findes hovedsagelig i myceliet. Til udvinding af MA144-komponenter fra dyrkningsmediet kan dette filtreres, og filtratet derefter ekstraheres med et med vand ikke blandbart organisk opløsningsmiddel, såsom chloroform, ethylacetat, toluen, benzen, butylacetat, n-butanol, methylpropylketon og methy-lenchlorid, i neutral til svagt sur tilstand. MAI44-Komponenterne i myceliet kan udvindes ved ekstraktion med et organisk opløsningsmiddel, såsom chloroform, acetone, n-butanol, methanol, ethanol, ethylacetat, eller en vandig opløsning af en organisk eller uorganisk syre, såsom saltsyre eller eddikesyre. Alternativt kan MA144-kompo-nenter ekstraheres direkte fra dyrkningsmediet ved de ovennævnte ekstraktionsprocedurer uden forudgående fraskillelse af myceliet. Ef- 13 145200 ter koncentration i vakuum kan M144—ekstrakterne reekstraheres med et med vand "blandbart organism opløsningsmiddel ved et pH på mellem 6 og 9> og efter koncentration under reduceret tryk blandes MA-koncen-traterne med fortyndet vandig syre med et pH på under 4, derefter reeks traller es ilA144-Komponenteme i denne vandige syreopløsning med et organism opløsningsmiddel efter indstilling til svagt basisk reaktion. Ved gentagelse af ovennævnte fremgangsmåde, om nødvendigt,kan MA144-momponenteme fremstilles i renset form. Som et alternativ til opløsningsmiddelekstraktionsudvindingsmetoden eller i kombination med en sådan metode kan MA144 udvindes fra dyrkningsmediet ved søjlekromatografi under anvendelse af adsorbenser, som aktivt kul, aluminiumoxid, silicagel eller en modificeret dextran, såsom den kommercielt tilgængelige "Sephadex^ojH-20", modstrømsfordeling eller væske-mromatografi under anvendelse af egnede organiske opløsningsmidler. Aktive ekstrakter opnået ved sådanne metoder koncentreres under reduceret tryk, og Ml4i(—komponenterne opnås som et rødt eller gult pulver.

Opløsningen, som indeholder ΜΆ144-komponenterne, kan også lyofili-seres alene eller sammen med mindst ét stof valgt blandt serum, serumalbumin, globulin, gelatine, glycerol, sukkerarter, aminosyrer, desoxyribonucleinsyre og organiske eller uorganiske syrer, såsom saltsyre, phosphorsyre, eddikesyre, ravsyre og patothensyre.

Til opnåelse af de individuelle MAI44-komponenter MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 og -Y kan yderligere rensning og adskillelse udføres ved anvendelse af standardadskillelsesteknikker, såsom søjlekromatografi under anvendelse af forskellige adsorbenser, såsom kiselsyre, modificerede dextraner, svagt sure ionbytterharpikser eller aktivt kul, modstrømsfordeling, væskekromatografi under anvendelse af egnede organiske opløsningsmidler, eller chelatisering med forskellige metalioner eller en kombination af to eller flere af de ovennævnte fremgangsmåder.

14 145200

Fysisk-kemiske egenskaber a£ MAl44-komponenter.

De fysisk-kemiske egenskaber af MA.144—GI, -G2, -L, -HL, -SI, -S2, -U1, -U2 og -Y er som følger: M144-__-GI__^G2_ [Diistand Svagt basisk amorft gult Svagt basisk amorft rødt pulver pulver

Elementæranalyse C Η ΪΓ 0 0ΞΪΓ0

Fundet 61,4-5 6,31 1,44 28,93 61,15 6,21 1,75 30,58

Beregnet 62,14- 6,58 1,73 29,56 60,93 6,45 1,69 30,92

Empirisk formel C42H53°151T σ42Ξ53°16ΙΓ

Molekylvægt 811,9 827,9

Smeltepunkt 141-145°0 152-156°C

Specifik Pn +54° drejning [a]^ (c=0,33, CHCl^)

Opløselig i fortyndet syre, methanol, ethanol, n-buta-nol, acetone, ethylacetat, chloroform, benzen, toluen, Opløselig- dimethylsulfoxid, methylcellosolve og dimethylform-hed amid. Tungtopløselig i vand, n-hexan, cyclohexan, di- ethylether og petroleum. Bydrochloridsaltet er opløseligt i vand, methanol, ethanol, men tungtopløseligt i chloroform, acetone og ethylacetat.

Rf-Værdier £ C:M = 20:1 0,38 0,38

En sur vandig og metha- En sur vandig opløsning er nolisk opløsning er gul rød og bliver blåviolet ved

Reaktion og bliver rødviolet ved indstilling til alkalisk indstilling til alkalisk reaktion og violet i kon-reaktion og rødbrun i centreret HpSO^-opløsning, koncentreret HpSO^-opløs-ning.

15 145200 MA144__-GI____-G2 . —-

Absorptions- Fig. 1 Fig. 2 weogrsyiligt 250 (557)’ 259 (330)’ 255 (580)’ 259 (295)’ lys og max. 290 (140), 4J2 (165) 292 (101), 492 (175) (Εϊο» ) 1

MeOH (fuldt optruxxet - linie) i 0,1 N HCl- 229,5 (610), 259 (372), 255 (627), 259 (300), (pSLteret 289 (l59)’ ^3° (169) 292 (104)’ 492 (178) linie) i 0,1 N 239 (521), 285 U5D, 242 ( 575), 565 ( 230), (!??T-lSie) 317 ( 96)’ 522 (1Z|4) 605 (198)

Infrarødt absorptions- Fig. 10 Fig. 11 spektrum.

(ÉBr ) NMR-Spektrum (HIE) Ks· 19 ris· 20 ^ C = chloroform, M = methanol ** TLC-betingelser: kise lsyr etyndt 1 ags'kromatografi eOF^^ (ved 27°C).

MA144__IL__4CT1____

Tilstand Svagt basisk amorft gult Svagt basisk amorft rødt pulver __pulver

Elementæranalyse CH H 0 C Ξ N 0

Fundet 61,39 6,31 1,54 30,13 61,43 6,71 1,71 29,22

Beregnet 61,72 6,44 1,76 30,08 61,97 6,82 1,72 29,48

Hnpirisk formel ^41^51^15^ ^42^55^15^

Molekylvægt 797,9 813,9

Smeltepunkt 134-136°C 146-147°C

Specific on +57,5° drejning [a]^ (c=0,4, CHCl^) 16 1Λ5200 ,ΜΑ.144__-L___

Opløselig- lied Som M144-G-1 Som NA144-G1

Rf-Yærdier ** *0:11 «20:1 0,31 0,21 Reaction Som MA144-G1 Som M144-G1 rør ^ : ^ DY og synligt 230 (480), 259 (298), 229,5 (482), 259 (298), maX* 290 (118), 433 (151) 290 (121), 433 (144)

Me OH (fuldt optrukket linie)

LohLN HC1” 230 (530)’ 259 C?24)’ 229,5 (4δ8)’ 259 (punkteret 290 (128), 433 (156) 290 (123), 433 (151) linie ) i 0,1 ir 238 (412), 287 (100), 239 (450), 287 (121),

DaOH-MeOH±e) 318s (68^ 525 (140) 318s (76), 525 (133)

Infrarødt .

absorptions- Fig. 12 Fig. 13 spektrum (KBr) MR-Spektrum (3EMR) Fig. 21 Fig. 22

MÅ144 =51 =sT

Udseende Svagt basisk amorft Svagt basisk amorft gult pulver__rødt pulver

Elementær- _ analyse C Η ΪΓ 0 0ΗΪΓ 0

Fundet 61,37 6,45 1,97 29,36 60,09 6,13 1,88 30,94

Beregnet 61,79 6,84 2,00 29,72 60,41 6,34 1,96 31,13

Empirisk formel σ36Η45°13ΙΓ C36H450l4ir

Molekylvægt 699,8 715,8

Smeltepunkt 144—147°C 154-158 C

17 145200 MA144__-SI_ ~ -S 2 ~~

Specifik pn +77° drejning [a]^ (c=l,0, CHCl^)

Opløselig- lied Som MA144-G1 Som MA144-G1

Rf-Værdier ** * C:M = 20:1 0,½ 0,½

Reaction Som MA144-G1 Som MA144-G2

Absorptions- Rig. 5 Vig. 6 spektre for 250 (638), 258,5 (371), 234,5 (607), 258,5 (306), i?s°?gSSxlgt 289’5 (160)’ 452 (177) 293 (110), 491 (189) ^lcm3 (fuldt optrukket linie) i 0,11 HC1- 229,5 (652), 258,5 (380), 234,5 (629), 258,5 (318), retHlini?fe~ 289’5 451 <192) 295 (114)’ 491 (197) i 0,UT 237,5 (553), 286 (141), 242 (606), 566 (244), (!^T-lSie) 520 (90)’ 524 C161) 606 (210)

Infrarødt absorptions- spektrum (EBr) Vig. 14 Vig. 15 MR-Spektrum (IME) Vigi 23 Vig. 24 MÅI44 ~

Udseende Svagt basisk amorft Svagt basisk amorft gult pulver rødt pulver

Elementæranalyse C Η E 0 C H N O

Fundet 60,42 6,77 1,74 31,07 59,26 6,60 1,58 31,87

Beregnet 60,79 6,68 1,69 30,85 59,64 6,55 1,65 32,15

Empirisk formel ^42^55^16^ ^4-2^55^17^

Molekylvægt 829,9 845,9

Smeltepunkt 152-155°C 160-164°C

Specifik +31° drejning ra]^ (c= 1,0, 0HC1,) 18 165200 - MA144__-ui___TJ2_______

Opløseliglied Som MÅ.144-G1 Som MA.144-G1

Rf-Værdier ** * C:M = 20:1 0,07 0,07

Reaction Som MA144—G1 Som M144-G2

Absorptionsspektre for Vig. 7 Vig. 8

ZsV^lst 230 (53i)’259 (525)’ 235 (452)’259 (24?)’ (vL% , 290 (135), 432 (164) 292 (104), 492 (150) CElcm; χ MeOH (fuldt optrukket linie) i 0,1 ΕΓ HC1-

MeOH (punkte- 229,5 (602), 259 (365), 235 (465), 259 (250), ret linie) 289 (150), 430 (168) 292 (103), 4-92 (152)

i 0,1 ET

NaOH-MeOH 239 (520), 285 (143), 242 (448), 566 (200), (-.-.-linie) ^ (94) ^ 522 (144) 606 (164)

Infrarødt absorptions- spektrum (KBr) Vig. 16 Vig. 17 IMR-Spektrum QEMR) Vig. 25 Vig. 26 MA144 -y_

Tilstand Svagt basisk amorft gult pulver

Elementær- · _ analyse C H ^ 0

Vundet 61,98 6,3® 1,70 30,02

Beregnet 62,29 6,35 1,73 29,63

Empirist: Λ formel ^42^51^15^

Molekylvægt 810 _

Smeltepunkt 153-155 0 1Q 145200 iy MA144___

Specific on +66° drejning [a]Β (c _ i|0> qhci^)_

Opløselighed Som MA144-G1 Rf-Værdier ** *0:M=20:1 0,47

Reaktion Som MA144-G1

Absorptionsspektre for Rig· 9 W og synligt 229,5 (580), 259 (320), lys og max ’ ^ ^ w ’ , 1% , . 290 (126), 4J2 (158)

MeOH (fuldt optrukket linie) i 0,1 N HCl- 229,5 (590), 259 (334), retHlinS)te" 29°’5 (130)’ ^33 (160) i 0,1 H 239 (497), 287 (133),

HaOH-MeOHie) 320s(82), 524 (138)

Infrarødt absorptions- Rig. 18 spektrum (KBr) HMR-Spektrum (EMR) Rig. 27

Strukturbestemmelse.

Strukturen af MA144-G1, -G2, -L, -Hl, -SI, -S2, -Ul, -U2 og -Y fremstillet ifølge den foreliggende opfindelsen bestemmes som følger:

Ved sur hydrolyse medO^lN saltsyre i 30 minutter ved 85°C er de fysisk-kemiske egenskaber, såsom absorptionsspektrene for ultraviolet, synligt og infrarødt lys, massespektrene og de nuclearmagneti-ske resonansspektre, smeltepunkterne, e1ementæranalyseme og Rf-værdierne på kiselsyretyndtlagsplader, af aglycondelen opnået af MA144-Gl, -L, -Hl, -SI, -Ul og -Y i fuldstændig overensstemmelse med dem af 20 145200 aklavinon (Tetrahedron Lett. nr. 8, 28-34, I960), og dem af aglyconde len opnået af MA144-G2, -S2 og -TJ2 i fuldstændig overensstemmelse med dem af t-pyrromycinon (Chem. Ber. 92, 1880-1903, 1959)· På den anden side Bestemmes sukkerdelene, som findes i de vandopløselige fraktioner af de ovennævnte hydrolysater, ved kiselsyretyndtlags-kromatografi (GOBg^-kiselsyrepladei n-butanol:eddikesyre:vand = 4:1:1) efter neutralisation og koncentration, sammenligning af deres Ef-værdier med dem af de kendte sukkerarter opnået af aclacinomycin A (J. Antibiotics, 28, 830-834-, 1975) og streptolydizin (J. Amer. Chem. Soc. 86, 3592-3594·, 1972). Ef-Værdierne af sukkerdelene, der opnås fra MA144-komponenterne,er vist i den følgende tabel; der er tre slags slikker i MA144—GI, -G2, -L, -Y og -Bl og to slags sukker i MA144-S1, -S2, -01 og -U2.

Bf-Værdier af sukkerdelene i MA144—komponenterne.

Ef-værdier

Forbindelser 0,16 0,20 0,60 0,72 0,83 0.73 MA144-G1 + - + - + -G2 +- + - + - —L — + + — + — -Bl + - + + -- -SI + + -S2 +- + --- _U1 +- + --- -U2 + - + -Y +- + -- +

Ved sammenligning med Ef-værdier, forskellige farvereaktioner og optisk drejning af de kendte sukkerarter identificeres, en sukkerdel med Ef = 0,16 som L-rhodosamin, Ef = 0,60 som 2-desoxy-L-fucose, Ef = 0,72 som L-rhodinose og Ef = 0,83 som L-cinerulose,medens sukkerarter med Ef = 0,20 og 0,78 er ukendte.

Ved partiel methanolyse af MA144-komponenter i methanol indeholdende 0,01B saltsyre ved stuetemperatur giver MA144-G1, -Bl, -Si, -U1 og -Y 1-deeoxypyrrarrycin (L-rhodosaminyl-aklavinon, J. Antibiotics, 28, 83Ο-834, 1975), der identificeres på basis af dets fysisk-kemiske 21 145200 egenskaber, såsom Rf-værdi på kiseltyndtlagsplader, smeltepunkt, absorptionsspektre for IR, UV og synligt lys og NMR-spektrum, og de tilsvarende methylerede saccharider, MA144-G2, -S2 og -U2 giver pyrromycin (Chem. Ber. 92, 1880-1903, 1959) og de tilsvarende methylerede saccharider/ og MA14-4-L giver et ukendt anthr a cy c 1 ingly c o s i d og det tilsvarende methylerede disaccharid.

Den følgende generelle formel D-cinerulosyl-2-deoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl-aklavinon og - f-pyrromycinon for MA144—G1 og -G2 bestemmes ved NMR-, ^C-MR-og IR-spektrene af disse forbindelser og af det methylerede disaccharid deraf.

R 0 C00CH5 1 I Λ 1 .0HoCH, /VyVy 2 5

I I ^ OH

OH 0 OH 0

λ—°Λ MA144-G1: R = H

ffCH3 / MA.144-G2: R = OH

0°r^;

Xy.

OH, 0H

5

Lo0

‘O

MÅ.144-L består af aklavinon og tre sukkerdele: en ukendt aminosukker med en Rf-værdi på 0,20, 2-desoxy-L-fucose og L-cinerulose. Analyse af HMR- og 1 ^C-HMR-speictrene af aklavinonglycosidet og det methylerede disaccharid, der opnås af MA144-L ved methanolyse viser, at de er N-monodemethyl-L-rhodosaminylaklavinon henholdsvis methyl-cine-rulosyl-2-desoxy~L-fucosid, som opnås af aclacinomycin A.

Således bestemmes den kemiske struktur af MA144-L at være som følger: 22 145200 0 COOCH^

I I VOH

VVyV

OH O OH Ο 0 ο 1 Η : ο < fvv ^

I \ .1/ MA144-L

ο ° 0Η 0=<V)| M144-S1 og -S2 indeholder to slags suKKerdele, L-rHodosamin og 2-desoxy-L-fucose. Methyl-2-desoxy-L-fucosid og 1-desoxypyrromycin eller pyrromycin dannes ved methanolyse,og således vises 2-desoxy-L-fuco-syl-L-rh.o do s aminyl-aKlavinon- eller <f-pyrromycinonstruKturen for M144-S1 og -S2.

E O COOCH^

I I ^OH

WfV

OH 0 OH O

'Q\—S M144-S1: R = H

.—O L·03- 3 m.lMA~S2·· R = OH

HO [-/

OH

Hfi.l44^Hl "består af axlavinon og tre slags sutcerdele 1-rh.odosamin, 2-desoxy-L-fucose ogl-rliodinose. For at bestemme suKKerseKvensen ud- 23 145200 føres mild hydrolyse i 0,5%'s saltsyre ved stuetemperatur i 10 minutter ved metoden ifølge Biedermann et al. (Hxarmazie, 27, 782-789, 1972), der frigøres L-rhodinose og dannes samtidig MA144-S1. Således bestemmes den kemiske struktur af MA144—ΪΓ1 at være som følger: 0 COOCHj

. Jl « 1 / CHo0JtU

2 3 i Ji 1 J^°h OH 0 OH 0 0 0 0 \ΙΓ M144-N1

__0 0H

HO '-/ M144-U1 og -U2 indeholder to slags sukfcerdele L-rhodosamin og 2-desoxy-L-fucose. Endvidere dannes der ved methanolyse methyl-2-desoxy-Ir-fucosyl-2-desoxy—L-fucosid, som bestemmes ved MB- og spektrene, og 1-desoxypyrr omy c in eller pyrromycin, og således foreslås den følgende kemiske struktur: 24 145200 R O COOCHj gh2ch5

OH O OH O

,0

ryS

_0 0 OH MA.144-U1: R = Ξ

/CH^ \ MÅ144-U2: R = OH

HOp^

OH

MA144-Y består af aklavinon og tre slags sukkerdele L-rhodosamin, 2-desoxy-L-fucose og en ukendt sukkerart. Endvidere opnås 1-desoxypyrro-mycin og et ukendt me thyleret disaccharid af MA144-Y ved methanolyse. Dette methylerede disaccharid ekstraheres med ether og renses med kiselsyre- og ,rSephade2^bH-20"-sø3lekromatografi og krystalliseres derefter som hvide nåleformede krystaller i benzen. De fysisk-kemiske egenskaber af dette methylerede disaccharid er som følger:

Elementæranalyse for Ο^^ΕΗφΟ^:

Eundet: C 57,77% H 7,51%

Beregnet: C 57,3^% H 7,40%

Molekylvægt: 272

Smeltepunkt: 109-110°C

Optisk drejning [a]^ -65° (c = 1,0, CHCl^)

Absorptionsspektre for ultraviolet og synligt lys i methanol:

Eig. 28, λ nm (£) = 209 (6726)

Infrarødt absorptionsspektrum i KBr: Eig. 29 EMR-Spemtrum i CDCl^: Eig. 30 (100 MEz) 145200 25

Som vist i fig. 28 og 29 har methyl-disaccharidet af MAL44-Y absorption ved 1680 cm-1 og Λ 331111 (£)ί 209 (6726), hvilket viser til- luCUi stedevserelse af den α,β-umættede ketongruppe i strukturen.

1 proton-MR'et i fig. 30 tilskrives en tre-proton-dublet ved 1,26 (J =6,8 Hz), en to-proton-singlet ved 1,9, en én-proton-dublet af en dublet ved3,74 (J = 1 og 3 Hz), en én-proton-kvartet ved </*3,94 (J = 6,8 Hz), en én-proton-singlet ved (f4,07 og en én-proton-singlet ved 4,8, ni protoner i 2-desoxy-L-fucose og en tre-proton-dublet ved <fl,4 (J = 6,8 Hz), og en én-proton-symmetrisk-kvartet ved ^4,73 (J = 6,8 Hz), som er uskærmet på grund af det etherisme oxygenatom, er sammenkoblede og tilskrives metbylprotoneme på C-61 benboldsvis protonen på 0-5'. Ved spin-afsoblingsforsøg tilskrives en dublet ved S 6,86 (J = 3,5 og 10,0 Hz) og to dubletter ved <f6,ll (J = 10,0 Hz) °g (f5,26 (J = 3,5 Hz) vinylprotoneme i AM-sys ternet, svarende til protonerne på 0-2' benboldsvis C—3' °g C-1‘· Således identificeres en sukkerdel foruden 2-desoxy-L- fucose i metbyl-disaccbaridet som 2,3,6- tridescxyhex-2—enopyranose-4-ulose, som er forbundet til C-4 i 2 - desoxy-L-fucose.

Af de ovenfor analyserede resultater bestemmes det methylerede di-saccharid at være en ny sukkerart med strukturen: 0 °CH3

*—0 OH

og den terminale sukker kaldes aculose.

Således bestemmes den kemiske struktur af MA144-Y at være som følger: 26 145200 O COOCH5

I I ^0H

YrYr

OH O OH O

aA<ceI

ooV/ 5

Λ—\j OH

o=/ch5 y

Medens et antal anthra cyclinglyc o s i dan t ib i o t ima med aklavinon- og g -pyrromycinonaglyconbestanddele er Kendt af fagfolk, er forbindelserne MA144-G1, -G2, -L, -Hl, -SI, -S2, -U1, -U2 og -X Klart forske1-lige fra ethvert af disse i sådanne KaraKteristiKa som molekylformel, nedbrydningspr o duKter ved sin hydrolyse, ultraviolet, synligt-, infrarødt- og HMR-spektrum som beskrevet ovenfor. Af de Kendte anthra-cyclinglycosider består aKlavin og pyrromycin af aklavinon eller é-pyr-romycinon og en sukkerart, L-rhodosamin, til forskel fra de omhandlede forbindelser. Aclacinomycin A og cinerubin A består af tre sukkerdele, 1-c ine rul o syl-2-desoxy—1-fuc o syl-L-rho do s aminyl, MA144-M1 og -M2 (japansk patentansøgning Showa 51-39688) består også af tre sUfc-kerdele, L-amicetosyl-2-desoxy—1-fucosyl-L-rhodosaminyl og rhodirubin B,(japansk patentansøgning Showa 51-98113) består af 1-rhodinosyl-l-rhodinosyl-l-rhodosaminyl, og disse, tre kendte antibiotika adskiller sig fra de omhandlede forbindelser på basis af sukkerdelen. Sukker-delen i rhodirubin A består af L-rhodinosyl-2-desoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl, der er den samme som den i MA144-N1, men aglyconen i MA144-N1 er aklavinon og forskellig fra S-pyrromycinon i rhodirubin A.

Det er således verificeret, at MA144-G1, -G2, -L, -Hl, -SI, -S2, -Π1, —TJ2 og -X er nye stoffer.

i 27 145200 3 d ^ΛΙΛΙγΙΛΙΛΙγΙΛΙ η ran ’ooooooooooknqo ίι i) . CJ CJ vJ .

Ο Ο Η Η Η Η

«η η 00 ιϋ Φ Ιβ C0 ΙΛ Α Λ Λ A

-Ρ r^j ι—[ OJ I—1 ι—I LA i—1 LA LA OJ

/1% rj to

_p m LX) ΚΛ ΚΛ i—I fA i—li—I^OOOOO

•H S) O O O O O

£ §D Η Η i—1 Η H

•ri ·Η \ ί\ Λ ^ A

"y Φ lp, φ (D Φ Φ 00

ctf & Oi C\i E>- r—} O- H lA CN tN

λ rf)

φ ft VDOI^OKSHO.OOOOOO

._i o o o o o

,—I φ · Η Η Η Η H

•3*3 UN νθωθ>00ΛΛΑ*Λ ,φ ft ,α γΙΛΙΗγΙιληιλλιν h a -p ri m υΓ JO ^ H Η H o* o o o. o o m ri pi 2 2 2 2 2

^3ddH Λ Λ Λ Λ Λ -PdS φ <d UN CO 00 00 , 00

d p »ri d S Ht\IINHI>H[>-4lN

rrf jj _p O jrS*·«·*·.·.··.«·»·

d ri ft ^VOOKNONNOOOQQQOO

d φ d ÉT O O O O O

cQritJW λαΛΑ^ •ri O Φ Λ ' ► M s s Κ&ΗίΚΚΪ£«,ίΚ

• ^ M -H 5 ^ uT H r-Γ >D O O H O O O O

φ ώ-ps 2222

dbD-HCQ HiHHH

.pOJ-P O^ftHLAlAO-ftCNftlS H

Η *—) ,—I Cj Ci N. γΗ^ν****#*#'*·«*·'· *“

ΦΙΡΦ β HttJKNHHOtflOOOOONNOO

0 - ’.d ri -p ft ft ft ft

Si Oft HftLTvr—IlfNftCNft UN H

ri-saraft HH HH

Η I H &D © Λ ^ ri ri ft ^ ft S 'ri o .9 ft 02 _ ri ri oo ^ ri I ri P, Μ s r-, rvi © -p η ^ φ .p «. q P p! ro, i , O -ir Φ ft o -h n ^ . m i, g u\ on

ii r-n , CU p p4 U) η W <j O <T

1 ύ m Η H O 53 CA Z -P S H

Ml HH O ri 3 3 3 ri 3 w 3 o g o h m g, h m rajo ©ft eh ri o co ri Soh ft oj bo ,o a - °2 ^ T1 5 H ® , 2 2 d © h p on tn m h P 3 onariri

HiO'd h driften© g on o H o ri o p o© ri ©©Hri-Pdri-Hori - o ft ο*·Ρί> ri riri-p©ri©p>riri · H ft SHW &0 ririPribDHriogtiD-PPp

«3 η -p p riririoorift^ririgHP

η i d a o . . m o a ft ft Hgriri-P

a ri- © i o rifl H ri- © -P -Pri ft ft ···,·· r* -PHboen on y ririoooPop» *priri d-aJH© ©ft P Ψ ri ri 5 ti 'H O to f) W (D ® EHØ cocQfriWftaaSoftft^oo 28 145200

Som vist ovenfor har MAI44-komponenterne antimikrobiel aktivitet, især mod gram-positive bakterier, og de er således terapeutisk nyttige i behandlingen af pattedyr for difteri, tuberkulose, lungebetændelse, tetanus og andre infektionssygdomme forårsaget af grampositive bakterier.

Antitumoraktivitet og akut toksicitet af MAI44-komponenterne.

MAI44-Komponenterne viser en tydelig antitumoraktivitet med lav toksicitet ved eksperimentelle dyreforsøg og er således terapeutisk nyttige til inhibering af pattedyrstumorvækst. Især viser de omhandlede forbindelser tydelige inhibitoriske virkninger på leukæmi L1210 hos mus. P.eks. inokuleres BDF,-mus, som vejer 6 19-22 g intraperitonealt med 1 x 10 L1210-celler/mus, og 24 timer efter inokulation injiceres forbindelsen intraperitonealt én gang dagligt i 9 dage i træk. På 30.dagen opføres den procentuelle forøgelse af overlevelsestiden i forhold til kontrolforsøg i den følgende tabel som LD^-værdier efter en enkelt intraperi-toneal injektion i mus.

Terapeutisk effektivitet mod leukemi L1210 hos mus og toksicitet af MA144—κ omp onente rne.

forlængelse af overlevelsestiden (% T/C)

forbindelse MÅ.144-G-1 -G2 -h -EL -SI -B2 -Π1 -U2 -Y

Anti-L1210-aktivi-tet (mg/kg/dag) 20 ------- - 65 10 - - 135 108 98 90 14-3 5 187 90 128 200 140 85 127 86 127 2,5 215 130 114 184 168 110 165 86 115 1,25 145 164 95 137 133 145 157 H2 0,6 130 140 - 123 114 130 129 135 0,3 118 108 - 110 96 118 114 129 0,15 101 97 - 97 - 110

Toksicitet (mus)

Intraperitoneal administration 28,5 17*0 45,5 32,5 24,4 12,5 30,2 14,5 40-50 (mg/kg) _ 29 145200

Cytotoksicitet af MAI44-komponenterne mod dyrkede L12l0-celler.

MA144-Komponenterne inhibierer væksten af pattedyrtumorceller i kulturer, især ved lav koncentration, og inhiberer RNA-syntesen fuldstændigt. I dette forsøg isoleres Ll210~celler i RPMI 1640-medium (Nissui, Rosewell Park Memorial Institute 1640) indeholdende 20% kalveserum og dyrkes ved 37°C i 3 dage i en CC^-inkubator, og de omhandlede forbindelser sættes til en koncentration på 0,1 yg/ml på l.dag. I ^C-inkorporationsforsøget sættes de omhandlede forbindelser til en koncentration på 0,5 yg/ml for RNA- syntesen og på 1,0 yg/ml for DNA-syntesen, og der sættes også 14 o C-thymidin eller -uridin til mediet i 60 minutter ved 37 C* Virkningerne på væksten og syntesen af DNA og RNA vises ved inhiberings—. procenten i forhold til kontrolforsøg, som vist i den følgende tabel. Af resultaterne ses, at MAl44-komponenterne tydeligt inhiberer væksten og RNA-syntesen af dyrkede L1210-celler ved den lave koncentration. Disse resultater understøtter den terapeutiske effektivitet på eksperimentelle dyretumorer.

Virkning af MAI44-komponenterne på væksten og makromolekylsyntesen i dyrkede Ll210-celler.

Forbindelse . % Inhibering VæKSt Syntese af _(på 2.dag)_BKå Må.__

Aclacinomycin 89,7 81,6 69,6 MA144-G1 80,7 65,6 40,9 -G2 82,1 57,8 39,4 -L 27,4 39,7 11,3 -NI 79,2 74,4 57,4- -S1 86,0 74,1 76,5 -S2 88,1 65,6 48,8 -U1 78,5 67,2 27,7 -U2 80,5 71,5 30,5 -I 90,2 93,9 99,6 30 145200

Terapeutisk anvendelse af MA144-komponenterne.

Som nævnt ovenfor er komponenterne MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, —S2, -U1, —U2 og -Y nye antibiotika, som er nyttige både i humanmedicinen og veterinærmedicinen, og som har tydelig inhibitorisk virkning mod maligne pattedyrtumorer og mod gram-positive bakterier.

Farmaceutiske præparater kan fremstilles i enhver farmaceutisk form, som egner sig til administrationsvejen. Eksempler på sådanne præparater er bl.a. faste præparater til oral administration, såsom tabletter, kapsler, piller, pulvere og granulater, flydende præparater til oral administration, såsom opløsninger, suspensioner, sirupper og eliksirer, og præparater til parenteral administration, såsom sterile opløsninger, suspensioner eller emulsioner.

De omhandlede forbindelser danner ikke-toksiske syreadditionssalte med forskellige organiske og uorganiske saltdannende reagenser og danner ikke-toksiske komplekser med desoxyribonucleinsyre. Således kan syreadditionssalte dannet med sådanne farmaceutisk acceptable syrer som svovl-, phosphor-, salt-, eddike-, propion-, olein-, pal-mitin-, citron-, rav-, vin-, glutamin- og pantothensyre, og ikke-toksiske komplekser med desoxyribonucleinsyre anvendes på samme måde som MAI44-komponenterne per se.

De foretrukne mængder af de anvendte omhandlede forbindelser vil variere efter den anvendte forbindelse, formuleringen af præparatet, applikationsmåden og situs, vært og sygdom, som skal behandles. I almindelighed injiceres MAI44-komponenterne intraperitonealt, intravenøst, subcutant eller lokalt eller administreres oralt til dyr og intravenøst, intraperitonealt, lokalt eller oralt til mennesker. Mange faktorer, som modificerer virkningen af lægemidlet, skal tages i betragtning, f.eks. alder, legemsvægt, køn, kost, administrationstidspunkt, administrationsvej, ekskretionshastig-hed, patientens tilstand, lægemiddelkombinationer, overfølsomhedsreaktioner og sværhedsgraden af sygdommen. Administrationen kan udføres kontinuerligt eller periodisk indenfor den maksimalt tålte dosis. Den optimale applikationsfrekvens for et givet sæt betingelser kan fastslås af fagfolk ved konventionelle doseringsbestemmelsestests efter de ovenstående retningslinier.

31 145200

Til anvendelse som antibakterielt middel administreres MAl44-kom-ponenterne i almindelighed således, at koncentrationen af den aktive bestanddel er større end den minimale inhibitoriske koncentration for den pågældende organisme, som behandles.

De følgende eksempler skal yderligere belyse fremgangsmåde ifølge opfindelsen. j

Eksempel 1.

Der blev fremstillet et næringernedium med følgende sammensætning:

Glucose 2%

Kartoffelstivelse 2% "Meat" (sojabønnepulver) 2% k2hpo4 0,1%

MgS04.7H20 0,1%

NaCl 0,3%

MnCl2.4H20 0,0008%

CuSO^.THgO 0,0007%

EeS0v7H20 0,0001%

ZnS04.7H20 0,0002%, pH 7,2 30 ml af dette medium steriliseres ved 120°C i 15 minutter i en 500 ml kolbe og inokuleres med 1 ml af en frossen kultur af Streptomyces galilaeus M4144-M1 (FEHM P-2455) ATCC 3H33 og inkuberes ved 30°C i 4-8 timer på en roterende rystemaskine. 10 liter af det forinden steriliserede medium i en 20 liters rustfri stålfermentor ' inokuleres aseptisk med 200 ml af den ovennævnte podningskultur. Fermentationen gennemføres ved 28°C i 18 timer under omrøring (300 omdr./min.) og gennemluftning (5 Ι/min.). Derefter overføres 10 liter af denne kultur til 600 liter af det forinden steriliserede medium i en 2000 liters rustfri ståltank og dyrkes ved 28°C i 36 timer under omrøring (180 omdr./min.) og gennemluftning (300 1/min.).

32 145200

Den opnåede dyrkede "bouillon (580 1) indstilles til pH-værdi 5,0 med svovlsyre og filtreres gennem diatoméjord. Den resulterende fil-terkage (56 mg) suspenderes i 50 liter acetone og filtreres efter en times omrøring. Remanensen reemstraileres med 50 liter acetone. Begge emstramter Koncentreres til 25 liter under reduceret trym, sættes til 20 liter ethylacetat og omrøres. Efter frasmillelse af ethyl-acetatlaget Koncentreres det til 1 liter under reduceret trym, og der udfældes rå MA.144-blanding ved tilsætning af 15 liter n-hexan til Koncentratet, hvorefter der opnås 36 g af et rødt pulver efter to ganges vasm med n-h,exan.

Det ovenfor opnåede kulturfiltrat indstilles på pH-værdien 6,8 med natriumhydroxid og ekstraheres med 100 liter toluen. Ekstrakten koncentreres til 10 liter under reduceret tryk og reekstraheres med 10 liter acetatpuffer ved pH-værdien 3,5. Det opnåede vandige lag indstilles til pH-værdi 6,8, ekstraheres med 4 liter toluen og koncentreres derefter til 30 ml under reduceret tryk. En rå MA144-blanding udfældes ved tilsætning af 300 ml n-hexan til koncentratet, og der opnås derefter 2,5 g af et rødt pulver, EKsempel 2.

Den rå pulverformede MA.144—blanding, som opnås af filterKagen i emsempel 1 (10 g)i opløses i 100 ml toluen og underkastes Kromatografi på en 5 x 40 cm's søjle fyldt med 300 g Kiselsyre, og efter at det første eluat med toluen indeholdende 1,5% methanol er Kasseret, elueres M.144—GI, -G2- og -L-fraktionerne successivt med toluen indeholdende 2% methanol. Derefter elueres MA.144-lTl-fraKtionen med toluen indeholdende 3% methanol i og MA.144-S1- og -S2-f rektionerne og Mål44-Ul- og -tT2-frdKtionerne elueres successivt med toluen indeholdende 5% methanol. Efter Koncentration af hver af de ovenfor opnåede fraKtioner opnås rå orangerøde pulvere af 210 mg MA144-G1- og -G2-blanding, 190 mg Hål44-I·, 570 mg M144-N1- og rhodirubin A-blan-ding, 360 mg MA.144-S1- og -S2-blanding, 270 mg MA.144-U1- og —112— blanding ved tilsætning af n-hexan.

EKsempel 3.

2,5 g af den rå pulverformede MA144-blanding, som opnås af Kultur- 33 145200 filtratet i eksempel 1, opløses i 6 ml toluen og underkastes kromatografi på en søjle fyldt med 100 g Kiselsyre, hvorefter MA144-Y-fraktionen elueres med toluen indeholdende 1,7% methanol ved 5°c·

Den resulterende fraktion koncentreres til tørhed under reduceret tryk, og der opnås 400 mg råt MA144-Y som et orangerødt pulver.

Eesempel 4.

210 mg af MA144-G1- og -G2-blandingen, som opnås i eksempel 2, opløses i en mindre mængde ethylacetat og underkastes kromatografi på en søjle fyldt med 30 g "Colrnim-Lite" (kiselsyre) og elueres med en ethylacetat-methanol-blanding (1:1). Den gule fraktion koncentreres til tørhed under reduceret tryk, og den opnåede remanens opløses i 50 ml chloroform og omrystes med 50 ml 0,01 M phosphatpuffer indeholdende 10' EDTA til fjernelse af de resterende metalioner, og chloroformlaget vaskes to gange med vand, tørres med vandfrit natrium-sulfat og koncentreres derefter til tørhed under reduceret tryk. Der opnås 110 mg M144-G1 som et gult pulver.

Den ovennævnte "Column-Lite"-søjle behandles efter eluering af de gule fraktioner med en 10”% EDTA-holdig 30%'s methanoIblanding, og det resulterende røde eluat inddampes til tørhed og opløses i en mindre mængde chloroform; de resterende metalioner fjernes ved den ovennævnte metode, og der opnås 22 mg MA144-G2 som et rødt pulver.

(EDTA = Ethylendiamintetraeddikesyre).

Det rå pulverformede MA144-L fra eksempel 2 behandles på samme måde som beskrevet ovenfor for MA144-G1, og der opnås 115 mg MA144-L som et gult pulver. Yed den samme rensningsmetode som beskrevet ovenfor for M144-G1 og -G2 opnås rensede pulvere af 260 mg MA144-IT1, 150 mg MA144-S1, 88 mg MA144-S2, 128 mg MA144-U1, 54 mg MA144-U2 og 114 mg MA.144-Y.

Eksempel 5»

Yed den generelle fremgangsmåde i eksemplerne 1, 2 og 4 opnås de følgende omhandlede forbindelser under anvendelse af de angivne streptomycesstammer:

Claims

34 145200 MA144 som opnås (mg) Stamme GI G2 L Ml SI S2 Dl U2 Y Streptomyces galilaeus ATCC 14969 42 68 55 126 65 145 115 63 43 Streptomyces sp. ME505-HE1 (FEEM P-3667) A1CG 31273 - - - - 143 89 97 101 Streptomyces cinereoruber ÅTCG 19740 25 37 38 76 88 79 27 83 16 Streptomyces. niveoruber ATCC 14971 - 56 - 43 54 38 - 64 12 Streptomyces antibioticus ATGC 8663 28 - - 18 32 Streptomyces purpurascens ATCG 25489 - 13 -- - 9 — 14- — Fremgangsmåde til fremstilling af anthracyclinglycosid-anti-biotika betegnet MA144-G1, -G2, -L, -NI, -Sl,-S2, -Ul,-U2 og -Y med den almene formel K1 0 GOOCHj Il ^0H VWV OH 0 OH 0 (I) ir7 I OH