CH637160A5

CH637160A5 - Procede de fabrication de glucosides anthracyclines.

Info

Publication number: CH637160A5
Application number: CH1159577A
Authority: CH
Inventors: Hamao Umezawa; Tomio Takeuchi; Toshikazu Oki; Taiji Inui
Original assignee: Microbial Chem Res Found
Priority date: 1976-10-05
Filing date: 1977-09-22
Publication date: 1983-07-15
Also published as: LU78242A1; NO148959C; CA1100895A; ES471823A1; FI57444B; IE46236B1; FI772915A; YU40483B; NL7710380A; NO147953B; DK145200C; US4207313A; AU505971B2; DE2743654B2; NO147953C; US4245045A; NL176004C; DE2743654A1; IE46236L; SE7710972L

Description

L'invention se rapporte à un procédé de fabrication de glucosides anthracyclines à activité antitumorale. Elle se rapporte plus particulièrement à la fabrication de nouvelles substances antibiotiques antitumorales, désignées par MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -S2,

-U1, -U2 et -Y, par fermentation de souches productrices de MA144 appartenant au genre Streptomyces. Ces substances peuvent être utilisées comme agents chimiothérapiques pour l'inhibition de la croissance de tumeurs malignes et pour le traitement de maladies infec-5 tieuses causées par des bactéries Gram positives.

Différents types de glucosides anthracyclines ont été mis en évidence dans les bouillons de culture de micro-organismes et décrits dans la littérature. Parmi ceux-ci, la daunomycine et l'adriamycine ont déjà été appliquées cliniquement pour les cancers humains, celo pendant que l'aclacinomycine A, la carminomycine et la rubidazone comptent parmi les essais cliniques effectués avec le plus vif intérêt dans le domaine de la chimiothérapie du cancer.

A la suite de screening, ou sélection de propriétés antibiotiques, de cultures de Streptomyces pour des métabolites présentant une ac-15 tivité antitumorale, les inventeurs ont découvert de nouveaux composés et ont confirmé, après purification et caractérisation de leurs propriétés physico-chimiques, que les antibiotiques désormais appelés MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -Ul, -U2 et -Y, sont de nouveaux composés à activité antitumorale efficace et de faible toxicité 20 chez l'animal, et ont mis au point des processus de traitement et des méthodes pour leur préparation et leur purification.

La préparation de l'adriamycine par fermentation du S. neuceficus var. caesius est décrite dans le brevet américain N° 3590028. La transformation chimique de la daunomycine en adriamycine est in-25 diquée dans le brevet américain N° 3803124.

La daunomycine (produite par fermentation du S. neuceticus dans le brevet anglais N° 1003383) peut être la même que la R.P. N° 13057 de Rhône-Poulenc (anciennement appelée rubydomycine et, désormais, daunoribicine; voir brevets anglais Nos 985598, 30 1188262 et 1241750 et brevet américain N° 3616242) et est probablement identique à la danubomycine de Ciba, décrite dans le brevet américain N° 3092550 et le brevet anglais N° 901830. On se reportera également au brevet américain N° 3686163 sur la dihydro-daunomycine.

35 Les antibiotiques anthracyclines renfermant des fractions d'acla-vinone aglycone sont décrits comme suit:

a) Aclacinomycine A et B, dans le brevet américain N° 3988315 et par Oki et al. dans «J. Antibiotics», 28:830 (1975).

b) Aclavine, dans « J. Bacteriol.», 72:90 (1956).

40 Les antibiotiques anthracyclines renfermant des fractions s-pyrromycinone aglycone sont décrit comme suit dans la littérature:

c) Muséttamycine et marcellomycine du complexe acide bohémi-que, dans «J. Antibiotics», 30:525 (1977).

d) Pyrromycine, dans «Chem. Ber.», 92:1904 (1959).

45 e) Cinérubine A et B, dans le brevet anglais N° 846130 [voir également brevet américain N° 3864480, et Keller-Schierlein et al., «An-timicrobial Agents and Chemotherapy», p. 68 (1970)].

D'autres antibiotiques anthracyclines renfermant l'aglycone différent de l'aclavinone et s-pyrromycinone sont décrits dans la littéra-5° ture suivante:

f) Nogalamycine, dans «J. Amer. Chem. Soc.», 99:542 (1977).

g) Steffïmycine, dans «J. Antibiotics», 27:805, 809 (1974).

h) Carminomycine, dans «J. Antibiotics», 27:254 (1974), dans le brevet allemand N° 2362707 et dans «J. Amer. Chem. Soc.»,

55 97:5955(1975).

i) Trypanomycine, dans «Antimicrobial Agents and Chemotherapy», 1:385 (1972).

j) Requinomycine, dans «J. Antibiotics», 25:393 (1972)

k) Galiburine A et B, dans «Naturwiss.», 52:539 (1965), et dans «o «Chem. Abst.», 67:90573z (1967).

Pour d'autres descriptions explicatives des antibiotiques anthracyclines, on se reportera à l'«Index of Antibiotics from Actinomyce-tes», Hamao Umezawa, éditeur en chef, University Park Press, State College, Pensylvanie, U.S.A. (1967), aux pages suivantes:

65 _

Antibiotique Page

Aclavine 111

Cinérubine A 220

3

637 160

Antibiotique Page

Cinérubine B 221

Danubomycine 242

Daunomycine 243

Pyrromycine 524

Rhodorrrycine A, B 561

Rubidomycine 574

Le manuel des antibiotiques («Antibiotics»), vol. 1, «Mechanism of Action», édité par David Gottlieb et Paul D. Shaw, Springer-Verlag New York, Inc., N.Y. (1967), renferme, aux pages 190 à 210, un compte rendu de A. DiMarco, sous le titre «Daunomycin and Related Antibiotics». L'«Information Bulletin», N° 10, International Center of Information of Antibiotics, en collaboration avec WHO, décembre 1972, Belgique, passe en revue les anthracyclines et leurs dérivés.

L'invention se rapporte à un procédé de fabrication de nouveaux antibiotiques glucosides anthracyclines. Elle concerne plus particulièrement de nouveaux antibiotiques glucosides anthracyclines, dénommés MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 et -Y. Ces antibiotiques sont fabriqués par fermentation de souches productrices de MA144 appartenant au genre Streptomyces. Les MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 et -Y ainsi préparés peuvent être traités, séparés et purifiés par des méthodes conventionnelles utilisées pour isoler et purifier des antibiotiques insolubles dans l'eau, ces méthodes comprenant au moins un processus de traitement choisi dans le groupe des procédés d'extraction par solvants, de précipitation par solvants, de concentration, de filtration d'un gel, de partage à contre-courant, de chélation avec des ions métaux et de Chromatographie classique sur colonne.

L'invention permet donc d'obtenir les antibiotiques à activité antitumorale MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 et -Y, lesquels:

a) présentent des activités antimicrobiennes contre les bactéries Gram positives,

b) sont efficaces dans l'inhibition des tumeurs malignes chez les mammifères, et c) présentent une cytotoxicité élevée, inhibant de ce fait la croissance et la synthèse RNA des cellules tumorales mammifères dans les cultures.

Les propriétés physico-chimiques de ces composants MA144 sont les suivantes:

— MA144-G1 peut être isolé sous la forme d'une poudre amorphe jaune; présente un point de fusion de 141 à 145° C, et est optiquement actif, avec [a]^§+54° (c=0,33, CHC13); est une glucoside anthracycline faiblement basique D-cinérulosyl-2-déoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminylaclavinone, de formule empirique C42H53015N.

— MA144-G2 peut être isolé sous la forme d'une poudre amorphe rouge; présente un point de fusion de 152 à 156° C; est une glucoside anthracycline faiblement basique D-cinérulosyl-2-déoxy-L-fucosyi-L-rhodosaminyl-e-pyrromycinone, de formule empirique c«H53oI6N.

— MA144-L peut être isolé sous la forme d'une poudre amorphe jaune; présente un point de fusion de 134 à 136° C et est une glucoside anthracycline faiblement basique L-cinérulosyl-2-déoxy-L-fucosyl-N-monodéméthyl-L-rhodosaminylaclavinone, de formule empirique C41H51015N.

— MA144-N1 peut être isolé sous la forme d'une poudre amorphe jaune; présente un point de fusion de 146 à 147° C, et est optiquement actif, avec [a]^J+57,5° (c=0,4, CHC13); est une glucoside anthracycline faiblement basique L-rhodinosyl-2-déoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminylaclavinone, de formule empirique C42H55O1SN.

— MA144-S1 peut être isolé sous la forme d'une poudre amorphe jaune; présente un point de fusion de 144 à 147° C, et est optiquement actif, avec [a]^§+77° (c= 1,0 CHC13); est une glucoside anthracycline faiblement basique 2-déoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl-aclavinone, de formule empirique C36H450I3N.

— MA144-S2 peut être isolé sous la forme d'une poudre amorphe rouge; présente un point de fusion de 154 à 158" C; est une glucoside anthracycline faiblement basique 2-déoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl-e-pyrromycinone, de formule empirique c36h45o14n.

— M A144-U1 peut être isolé sous la forme d'une poudre amorphe jaune; présente un point de fusion de 152 à 155° C, et est optiquement actif, avec [app + 31 (c= 1,0, CHC13); est une glucoside anthracycline faiblement basique 2-déoxy-L-fucosyl-2-déoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminylaclavinone, de formule empirique C42H5sOI6N.

— MA144-U2 peut être isolé sous la forme d'une poudre amorphe rouge; présente un point de fusion de 160 à 164° C; est une glucoside anthracycline faiblement basique 2-déoxy-L-fucosyl-2-déoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl-s-pyrromycinone, de formule empirique

C11.2H55O1 ?N.

— MA144-Y peut être isolé sous la forme d'une poudre amorphe jaune; présente un point de fusion de 153 à 155° C, et est optiquement actif, avec [a] 66° (c= 1,0, CHC13); est une glucoside anthracycline faiblement basique L-aculosyl-2-déoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminylaclavinone, de formule empirique C42H51015N.

Sur le dessin annexé:

la fig. 1 est le spectre d'absorption, en ultraviolet et en lumière visible, de MA144-G1 dans le méthanol à 90%;

la fig. 2 est le spectre d'absorption, en ultraviolet et en lumière visible, de MA144-G2 dans le méthanol à 90% ;

la fig. 3 est le spectre d'absorption, en ultraviolet et en lumière visible, de MA144-L dans le méthanol à 90% ;

la fig. 4 est le spectre d'absorption, en ultraviolet et en lumière visible, de MA144-N1 dans le méthanol à 90%;

la fig. 5 est le spectre d'absorption, en ultraviolet et en lumière visible, de MA144-S1 dans le méthanol à 90%;

la fig. 6 est le spectre d'absorption, en ultraviolet et en lumière visible, de MA144-S2 dans le méthanol à 90% ;

la fig. 7 est le spectre d'absorption, en ultraviolet et en lumière visible, de MA144-U1 dans le méthanol à 90% ;

la fig. 8 est le spectre d'absorption, en ultraviolet et en lumière visible, de MA144-U2 dans le méthanol à 90% ;

la fig. 9 est le spectre d'absorption, en ultraviolet et en lumière visible de MA144-Y dans le méthanol à 90%;

la fig. 10 est le spectre d'absorption, en infrarouge, de MA144-G1 dans le bromure de potassium;

la fig. 11 est analogue à la fig. 10, mais pour MA144-G2;

la fig. 12 est analogue à la fig. 10, mais pour MA144-L;

la fig. 13 est analogue à la fig. 10, mais pour MA144-N1 ;

la fig. 14 est analogue à la fig. 10, mais pour MA144-S1 ;

la fig. 15 est analogue à la fig. 10, mais pour MA144-S2;

la fig. 16 est analogue à la fig. 10, mais pour MA144-U1 ;

la fig. 17 est analogue à la fig. 10, mais pour MA144-U2;

la fig. 18 est analogue à la fig. 10, mais pour MA144-Y;

la fig. 19 est le spectre NMR de MA144-G1 dans CDC13 (60 MHz);

La fig. 20 est le spectre NMR de MA144-G2 dans CDC13 (60 MHz);

La fig. 21 est le spectre NMR de MA144-L dans CDC13 (60 MHz);

La fig. 22 est le spectre NMR de MA144-N1 dans CDC13 (100 MHz);

La fig. 23 est le spectre NMR de MA144-S1 dans CDC13 (60 MHz);

La fig. 24 est le spectre NMR de MA144-S2 dans CDC13 (60 MHz);

La fig. 25 est le spectre NMR de MA144-U1 dans CDC13 (60 MHz);

La fig. 26 est le spectre NMR de MA144-U2 dans CDC13 (60 MHz);

La fig. 27 est le spectre NMR de MA144-Y dans CDC13 (100 MHz);

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

637 160

4

la fig. 28 est le spectre d'absorption, en ultraviolet et en lumière visible, du disaccharide méthylé obtenu à partir de MA144-Y dans le méthanol (0,04 g/1);

la fig. 29 est le spectre d'absorption, en infrarouge, du disaccharide méthylé obtenu à partir de MA144-Y dans le bromure de potas- s sium, et la fig. 30 est le spectre NMR du disaccharide méthylé obtenu à partir de MA144-Y dans CDC13 (100 MHz).

Le procédé selon l'invention permet, à titre d'exemples, la préparation de neuf nouveaux antibiotiques anthracyclines: MA144-G1, t° -G2, -L, -NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 et -Y, qui se sont révélés comme possédant des activités à la fois antibactériennes et antitumorales. Ces composés présentent une activité contre les bactéries Gram positives, inhibent la croissance des diverses tumeurs des mammifères telles que leucémies L1210 et P388 chez la souris, et sont d'une faible 15 toxicité. Les composés obtenus selon l'invention sont donc utilisés comme agents à activité antibactérienne et antitumorale. Tel qu'utilisé ici, le terme composants MA144 se réfère à un antibiotique comprenant au moins l'un des MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 et -Y. 20

Ces composés sont préparés en cultivant une souche de Streptomyces, productrice de MA144, dans une solution aqueuse d'hydrate de carbone renfermant des agents nutritifs azotés organiques, dans des conditions aérobies sous immersion. Les composés dans les bouillons de culture ainsi préparés peuvent être extraits et purifiés 25 par les méthodes habituelles utilisées pour l'extraction et la purification des antibiotiques insolubles dans l'eau. L'invention englobe la production de ces composants MA144 en tant que solides bruts,

solides purifiés qui peuvent former des sels, ainsi que des complexes DNA. 30

Pour la production par fermentation des composés selon l'invention, des souches productrices de MA144 appartenant au genre Streptomyces peuvent être utilisées, par exemple Streptomyces gali-laeus MA144-M1 (FERM P-2455, ATCC 31133 déposé le 14.3.75), Streptomyces galilaeus (ATCC 14969 déposé le 12.3.63), Streptomy- 35 ces cinereoruber (ATCC 19740 déposé le 12.2.66), Streptomyces ni-veoruber (ATCC 14971 déposé le 12.3.63), Streptomyces antibioticus (ATCC 8663 déposé le 13.6.42), Streptomycespurpurescens (ATCC 25489 déposé le 21.10.69), Streptomyces sp. ME505-HE1 (ATCC 31273 déposé le 2.3.77) et leurs mutants. 40

La production de tous les composés obtenus selon l'invention se fait en cultivant les souches précitées de Streptomyces dans un milieu nutritif aqueux conventionnel renfermant des sources nutritives connues pour des actinomycètes, c'est-à-dire des sources de carbone, d'azote et de sels minéraux. La culture aérobie en immersion est uti- 45 lisée de préférence pour la production de quantités importantes de MA144, exactement comme pour d'autres antibiotiques. Les méthodes générales utilisées pour la culture des autres actinomycètes sont applicables à la culture selon l'invention. Le milieu renferme de préférence des sources de carbone commercialement disponibles telles - 50 que glucose, glycérol, amidon, dextrine, sucrose, maltose, huiles, graisses et analogues, à l'état purifié ou brut, et des sources d'azote commercialement disponibles telles que poudre de soja, extrait de levure, peptone, poudre de graine de coton, levure séchée, liqueur macérée de maïs ou sels minéraux tels que sulfate d'ammonium, 55 nitrate de sodium ou chlorure d'ammonium. Des sels minéraux tels que le chlorure de sodium, le chlorure de potassium ou des phosphates sont utilisés de préférence, et l'on peut également ajouter, si nécessaire, des traces d'ions métaux et d'agents démoussants tels que l'Adekanol (marque de fabrique Asahi Denka Ind. Co.) ou des sili-cones (fabrique: Shinetsu Chem. Ind. Co.). La température de fermentation est de l'ordre de 20 à 37" C, de préférence d'environ 25 à 30" C. Le pH du milieu est maintenu dans la zone comprise entre 6 et 9. La production des composants MA144 dans le bouillon de culture atteint un maximum au bout de 2 à 7 d, soit en ballon agité, soit en fermentation aérobie en immersion, avec aération et agitation comme dans les exemples illustrés plus bas.

Séparation et isolation des composants de MA 144

Les composés de l'invention peuvent être récupérés à partir du bouillon de culture et séparés les uns des autres en opérant de la manière suivante.

Pour récupérer les composants de MA 144 à partir du bouillon de culture, ce dernier peut être filtré, et le filtrat est ensuite extrait avec un solvant organique non miscible à l'eau, tel que le chloroforme, l'acétate d'éthyle, le toluène, le benzène, l'acétate de butyle, le n-butanol, la méthylpropylcétone, le chlorure de méthylène, etc., en milieu neutre à faiblement acide. Les composants de MA144 peuvent être récupérés par extraction avec un solvant organique tel que le chloroforme, l'acétone, le n-butanol, le méthanol, l'éthanol, l'acétate d'éthyle ou une solution aqueuse d'un acide organique ou minéral tel que l'acide acétique ou l'acide chlorhydrique. Les composants de MA144 peuvent encore être extraits directement à partir du bouillon de culture, suivant les processus d'extraction précités, sans séparation préalable du mycélium. Après concentration sous vide, les extraits de MA144 peuvent être réextraits par un solvant organique non miscible à l'eau, à un pH compris entre 6 et 9 et,

après concentration sous pression réduite, les concentrats de MA sont mélangés avec une solution aqueuse acide de pH inférieur à 4, puis les composants de MA144 dans ladite solution aqueuse acide sont réextraits par un solvant organique après ajustement à un pH faiblement basique. En répétant, si nécessaire, les processus précités, les composants de MA144 peuvent être préparés sous une forme purifiée. En variante, en utilisant une méthode de récupération par extraction par solvant ou en combinant avec une telle méthode, MA144 peut être récupéré à partir du bouillon de culture par Chromatographie sur colonne, en utilisant des adsorbants, tels que charbon actif, alumine, acide silicique, ou une dextrane modifiée, telle que celles commercialement répandues sous la marque de fabrique Séphadex LH-20 (Pharmacia Fine Chem. Co., New York), par une répartition à contre-courant ou par Chromatographie liquide avec utilisation de solvants organiques appropriés. Les extraits actifs obtenus par de telles méthodes sont concentrés sous pression réduite et recueillis sous forme de poudre rouge ou jaune des composants de MA 144.

Pour obtenir les composants individuels de MA144, à savoir MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 et -Y, on peut procéder à une purification et à une séparation complémentaires en ayant recours à des techniques courantes de séparation, comme la Chromatographie sur colonne, avec emploi de divers adsorbants tels que l'acide silicique, les destranes modifiées, les résines échangeuses d'ions faiblement acides ou le charbon actif, la répartition à contre-courant, la Chromatographie en phase liquide avec emploi de solvants organiques appropriés ou la chélation avec différents ions métaux, ou encore une combinaison de l'une ou de plusieurs de ces méthodes.

Propriétés physico-chimiques des composants MA144 Les propriétés physico-chimiques de MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 et -Y sont les suivantes.

MA144

Gl

G2

Aspect

Poudre amorphe jaune faiblement basique

Poudre amorphe rouge faiblement basique

Analyse élémentaire Trouvé Calculé

C H N O 61,45 6,31 1,44 28;93 62,14 6,58 1,73 29,56

C H N O 61,15 6,21 1,75 30,58 60,93 6,45 1,69 30,92

5

637 160

MA144

Gl

G2

Aspect

Poudre amorphe jaune faiblement basique

Poudre amorphe rouge faiblement basique

Formule empirique

C42H 530 15N

C42H53016N

Poids moléculaire

811,9

827,9

Point de fusion ( C)

141-145

152-156

Pouvoir rotatoire spécifique

M D

+ 54° (c = 0,33, CHC13)

—

Solubilité

Soluble dans: eau acide, méthanol, éthanol, n-butanol, acétone, acétate d'éthyle, chloroforme,

benzène, toluène, diméthylsulfoxyde, solvant méthylcellulose, diméthylformamide.

Légèrement soluble dans: eau, n-hexane, cyclohexane, diéthyléther et pétrole.

Le chlorhydrate est soluble dans: eau, méthanol, éthanol, et légèrement soluble dans: chloroforme, acétone et acétate d'éthyle.

Rf** C: M = 20:1*

0,38

Réaction

Solution aqueuse acide et méthanol, jaune, virant au violacé rougeâtre en milieu alcalin, et au brun rougeâtre en solution H2S04 concentrée.

Rouge en solution aqueuse acide, virant au bleu violacé en milieu alcalin, et au pourpre en solution H2S04 concentrée.

Spectres d'absorption UV et visible, et (E)0^) max. dans MeOH (trait plein)

Fig. 1 230 (537), 259 (330) 290 (140), 432 (165)

Fig. 2 235 (580), 259 (295) 292 (101), 492 (175)

Dans HCl - MeOH 0,1N (ligne pointillée)

229,5 (610), 259 (372) 289 (159), 430 (169)

235 (627), 259 (300) 292 (104), 492 (178)

Dans NaOH - MeOH 0,1N

(ligne -)

239 (521), 285(151) 317(96), 522(144)

242 (575), 565 (230) 605 (198)

Spectre d'absorption infrarouge (KBr)

Fig. 10

Fig. 11

Spectre NMR (PMR)

Fig. 19

Fig. 20

* C = chloroforme, M = méthanol

** Condition TLC: couche mince d'acide silicique 60F254 (Merck Co.) (à 27 °C)

MA144

L

NI

Aspect

Poudre amorphe jaune faiblement basique

Poudre amorphe rouge faiblement basique

Analyse élémentaire Trouvé Calculé

C H N O 61,39 6,31 1,54 30,13 61,72 6,44 1,76 30,08

C H N O 61,43 6,71 1,71 29,22 61,97 6,82 1,72 29,48

Formule empirique

C4iH51015N

C^HssOisN

Poids moléculaire

797,9

813,9

Point de fusion (°C)

134-136

146-147

Pouvoir rotatoire spécifique

[aft°

+ 57,5° (c = 0,4, CHCI3)

Solubilité

Comme pour MA144-G1

Comme pour MA144-G2

Rf** C:M = 20:1*

0,31

0,21

Réaction

Comme pour MA144-G1

637160 6

MA144

L

NI

Aspect

Poudre amorphe jaune faiblement basique

Poudre amorphe rouge faiblement basique

Spectre d'absorption UV et visible, et (Ej0^ max. dans MeOH (trait plein)

Fig. 3 230 (480), 259 (298) 290 (118), 433 (151)

Fig. 4 229,5 (482), 259 (298) 290 (121), 433 (144)

Dans HCl - MeOH 0,1N (ligne pointillée)

230 (530), 259 (324) 290 (128), 433 (156)

229,5 (488), 259 (304) 290(123), 433(151)

Dans NaOH - MeOH

0,1N ,

(ligne -•-•-•-)

238 (412), 287 (100) 318s (68), 525 (140)

239 (450), 287 (121) 318s (76), 525 (133)

Spectre d'absorption infrarouge (KBr)

Fig. 12

Fig. 13

Spectre NMR (PMR)

Fig. 21

Fig. 22

* C = chloroforme, M = méthanol

** Condition TLC: couche mince d'acide silicique 60F2S4 (Merck Co.) (à 27 °C)

MA144

SI

S2

Aspect

Poudre amorphe jaune faiblement basique

Poudre amorphe rouge faiblement basique

Analyse élémentaire Trouvé Calculé

C H N O 61,37 6,45 1,97 29,36 61,79 6,84 2,00 29,72

C H N O 60,09 6,13 1,88 30,94 60,41 6,34 1,96 31,13

Formule empirique

C36H45013N

C36H45Oi4N

Poids moléculaire

699,8

715,8

Point de fusion ( C)

144-147

154-158

Pouvoir rotatoire spécifique

+77° (c = 1,0, CHC13)

—

Solubilité

Comme pour MA144-G1

Rf** C:M = 20:1*

0,14

Réaction

Comme pour MA144-G1

Comme pour MA144-G2

Spectre d'absorption UV et visible, et (E }"{»„) max. dans MeOH (trait plein)

Fig. 5 230 (638), 258,5 (371) 289,5 (160), 432 (177)

Fig. 6 234,5(607), 258,5(306) 293 (110), 491 (189)

Dans HCl - MeOH 0,1N (ligne pointillée)

229,5 (652), 258,5 (380) 289,5(163), 431 (192)

234,5 (629), 258,5 (318) 293 (114), 491 (197)

Dans NaOH - MeOH 0,1N

(ligne -•-•-•-)

237,5 (553), 286 (141) 320 (90), 524 (161)

242 (606), 566 (244) 606 (210)

Spectre d'absorption infrarouge (KBr)

Fig. 14

Fig. 15

Spectre NMR (PMR)

Fig. 23

Fig. 24

* C = chloroforme, M — méthanol

** Condition TLC: couche mince d'acide silipique 60F2S4 (Merck Co.) (à 27 °C)

7

637 160

MA144

Ul

U2

Aspect

Poudre amorphe jaune faiblement basique

Poudre amorphe rouge faiblement basique

Analyse élémentaire Trouvé Calculé

c h n 0 60,42 6,77 1,74 31,07 60,79 6,68 1,69 30,85

c h n o 59,26 6,60 1,58 31,87 59,64 6,55 1,65 32,15

Formule empirique c42h 550i6n c42h55o17n

Poids moléculaire

829,9

845,9

Point de fusion ( C)

152-155

160-164

Pouvoir rotatoire spécifique

[a]2D°

+31° (c = 1,0, chc13)

—

Solubilité

Comme pour MA144-G1

Rr** C: M = 20:1*

0,07

Réaction

Comme pour MA144-G1

Comme pour MA144-G2

Spectre d'absorption UV et visible, et (Ej"^ max. dans MeOH (trait plein)

Fig. 7 230(531), 259 (325) 290(135), 432(164)

Fig. 8 235 (452), 259 (247) 292 (104), 492 (150)

Dans HCl - MeOH 0,1N (ligne pointillée)

229,5 (602), 259 (365) 289(150), 430(168)

235 (465), 259 (250) 292 (103), 492 (152)

Dans NaOH — MeOH

0,1N (ligne - — • —

239 (520), 285 (143) 317 (94), 522 (144)

242 (448), 566 (200) 606 (164)

Spectre d'absorption infrarouge (KBr)

Fig. 16

Fig. 17

Spectre NMR (PMR)

Fig. 25

Fig. 26

' C = chloroforme, M = méthanol

** Condition TLC: couche mince d'acide silicique 60F254 (Merck Co.) (à 27 °C)

MA144

y

Aspect

Poudre amorphe jaune faiblement basique

Analyse élémentaire Trouvé Calculé

C H n o 61,98 6,30 1,70 30,02 62,29 6,35 1,73 29,63

Formule empirique c42h51o15n

Poids moléculaire

810

Point de fusion (°C)

153-155

Pouvoir rotatoire spécifique

+66° (c = 1,0, CHCI3)

Solubilité

Comme pour MA144-G1

Rf** C:M = 20:1*

0,47

Réaction

Comme pour MA144-G1

Spectre d'absorption UV et visible, et (Ej0;^) max. dans MeOH (trait plein)

Fig. 9 229,5 (580), 259 (320) 290(126), 432(158)

MA 144

Y

Aspect

Poudre amorphe jaune faiblement basique

Dans HCl - MeOH 0,1N (ligne pointillée)

229,5 (590), 259 (334) 290,5 (130), 433 (160)

Dans NaOH - MeOH 0,1N

(ligne -•-•-■-)

239 (497), 287 (133) 320s (82), 524 (138)

Spectre d'absorption infrarouge (KBr)

Fig. 18

Spectre NMR (PMR)

Fig. 27

60 * C = chloroforme, M - méthanol ** Condition TLC : couche mince d'acide silicique 6ÔF2 54 (Merck Co.) (à 27 °C)

65

Détermination des structures

Les structures de MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 et -Y de l'invention sont déterminées comme suit.

637 160

8

Par hydrolyse acide avec l'acide chlorhydrique 0,1N pendant 30 min à 85* C, les propriétés physico-chimiques, comme les spectres d'absorption en ultraviolet, en lumière visible et en infrarouge, la résonance de masse et nucléaire magnétique, le point de fusion, l'analyse élémentaire et le Rf, sur couches minces d'acide silicique, de la s fraction aglycone obtenue à partir de MA144-G1, -L, -NI, -SI, -Ul et -Y coïncident entièrement avec celles de l'aclavinone [«Tetrahe-dron Lett.», N° 8,28-34 (I960)], et celles de la fraction aglycone obtenue à partir de MA144-G2, -S2 et -U2 coïncident entièrement avec celles de s-pyrromycinone [«Chem. Ber.», 92, 1880-1903 io

(1959)]. De plus, des fractions de sucres existant dans la fraction soluble dans l'eau des hydrolysats précités sont dosées par Chromatographie en couches minces d'acide silicique (Merck Co. 60F2S4 plaque d'acide silicique, n-butanol/acide acétique/eau = 4/1/1),

après neutralisation et concentration, en comparant leurs Rf avec is ceux des sucres authentiques obtenus à partir de l'aclacinomycine A [«J. Antibiotics», 28, 830-834 (1975)] et de la streptolydizine [«J.

Amer. Chem. Soc.», 86, 3592-3594 (1972)]. Les Rf des fractions de sucres obtenues à partir des composants MA144 sont indiqués au tableau suivant, trois types de sucres existant dans MA144-G1, -G2, 20 -L, -Y et -NI, et deux types de sucres dans MA144-S1, S2, -Ul et -U2.

( Tableau en tête de la colonne suivante)

25

En comparant les Rf, les diverses réactions colorées et les pouvoirs rotatoires des sucres authentiques, une fraction de sucre correspondant à Rf=0,16 fut identifiée comme la L-rhodosamine et, correspondant à Rf=0,60, la 2-déoxy-L-fucose, à Rf=0,72, la L-rhodinose et, à Rf=0,83, la L-cinérulose, alors que les sucres de Rf=0,20 et 0,78 étaient inconnus.

Par méthanolyse partielle des composants MA144 dans le méthanol renfermant de l'acide chlorhydrique 0,01N, à température ambiante, MA144-G1, 6N1, -SI, -Ul et -Y ont fourni la 1-déoxy-pyrromycine [L-rhodosaminylaclavinone, «J. Antibiotics», 28, 830-834 (1975)], laquelle fut identifiée sur la base de ses propriétés physico-chimiques, comme le Rf sur couche mince d'acide silicique, le point de fusion, les spectres d'absorption IR, UV et en lumière visible et le spectre NMR, cependant que les saccharides méthylés correspondants, MA144-G2, -S2 et -U2 ont fourni la pyrromycine [«Chem. Ber.», 92, 1880-1903 (1959)] et les saccharides méthylés correspondants, et MA144-L fournissait une glucoside anthracycline inconnue et le disaccharide méthylé correspondant.

La formule générale suivante, la D-cinérulosyl-2-déoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminylaclavinone et -s-pyrromycinone de MA144- 4S Gl et -G2 furent déterminées par les spectres NMR, 13C-NMR et IR desdits composés et par ceux des disaccharides méthylés de ces composés.

50

Rf des fractions de sucres des composants MA144

Composés

Rf

0,16

0,20

0,60

0,72

0,83

0,78

MA144-G1

+

_

+

_

+

_

-G2

+

-

+

-

+

-

-L

-

+

-

+

-

-NI

+

-

+

-

-SI

+

—

+

-

-S2

+

-

+

-

-Ul

+

-

+

-

—

-

-U2

+

-

+

-

-Y

+

—

+

—

4-

MA144-L est formé d'aclavinone et de trois fractions de sucres: un sucre aminé inconnu, d'un Rf de 0,20, la 2-déoxy-L-fucose et L-cinérulose. L'analyse des spectres NMR et 13C-NMR de la glucoside-aclavinone et du disaccharide méthylé obtenu à partir de MA144-L par méthanolyse montre qu'il s'agit de la N-monodeméthyl-L-rhodosaminylaclavinone et du méthylcinérulosyl-2-déoxy-L-fucoside obtenu à partir de l'aclacinomycine, respectivement.

La structure chimique de MA144-L fut donc déterminée comme suit:

COOCH5

ch2ch5

MA144-L

MA144-S1 et -S2 renferment deux sortes de fractions de sucres: L-rhodosamine et 2-déoxy-L-fucose. Le méthyl-2-déoxy-L-fucoside et la 1-déoxypyrromycine ou la pyrromycine furent formés par méthanolyse, ce qui a permis de démontrer la structure suivante: 2-déoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminylaclavinone ou g-pyrromycinone, pour MA144-S1 et -S2.

ÇOOCHj

MA144-G1 : R=H MA144-G2: R=OH

/CHzCH5

noh

MA144-S1:R=H MA144-S2: R=OH

OH

9

637 160

MA144-N1 est formé d'aclavinone et de trois sortes de fractions de sucres: L-rhodosamine, 2-déoxy-L-fucose et L-rhodinose. En vue de déterminer la séquence des sucres, on a effectué une hydrolyse modérée dans l'acide chlorhydrique à 0,5%, à température ambiante, pendant 10 min, suivant la méthode de Biedermann et al. [«Pharmazie», 27,782-789 (1972)], avec libération de L-rhodinose et, simultanément, formation de MA144-S1. La structure chimique de MA144-N1 fut donc déterminée comme suit:

COOCHj OU

MA144-N1

O0H

HO

25

MA144-U1 et -U2 renferment deux sortes de fractions de sucres: L-rhodosamine et 2-déoxy-L-fucose. En outre, par méthanolyse, le méthyl-2-déoxy-L-fucosyl-2-déoxy-L-fucoside, lequel fut déterminé par les spectres NMR et 13C-NMR, et la 1-déoxypyrromycine ou la pyrromycine ont été formés, ce qui a permis de proposer la structure chimique suivante:

Poids moléculaire: 272 Point de fusion: 109-110° C Pouvoir rotatoire: [ct]^= —65 (c= 1,0, CHC13)

Spectres d'absorption en ultraviolet et en lumière visible, dans le méthanol:

àMcOH „m (e) = 209 (6726) (fig. 28)

Spectre d'absorption infrarouge dans KBr: Fig. 29 Spectre NMR dans CDC13: 100 MHz (fig. 30)

Comme on le voit aux fig. 28 et 29, le disaccharide méthylé de MA144-Y présente l'absorption à 1680 cm-1 et

XM|OH nm (s)=209 (6726), indiquant la présence du groupe cèto a,ß non saturé dans la structure.

A partir du spectre NMR des protons de la fig. 30, un doublet à 3 protons à 5 1,26 (J = 6,8 Hz), un doublet à 2 protons à 8 1,9, et à 1 proton à 8 3,74 (J = 1 et 3 Hz), un quartet à 1 proton à 8 3,94 (J=6,8 Hz), à 1 proton à 8 4,07 et à 1 proton à 8 4,8, sont affectés à 9 protons formés par la 2-déoxy-L-fucose, et un doublet à 3 protons à 8 1,4 (J = 6,8 Hz) et un quartet symétrique à 1 proton à 8 4,73 (J=6,8 Hz) démasqué par l'atome d'oxygène éthéré sont accouplés l'un à l'autre et sont affectés, respectivement, aux protons méthylés en C-6' et au proton en C-5'. Par essais de découplage de spin, un doublet à 8 6,86 (J = 3,5 et 10,0 Hz) et 2 doublets à 8 6,11 (J = 10,0 Hz) et 8 5,26 (J = 3,5 Hz) sont affectés aux protons vinyles du système ABM, correspondant respectivement à C-2', C-3' et C-14. Ainsi, une fraction de sucre autre que la 2-déoxy-L-fucose dans le disaccharide méthylé fut identifiée comme étant la 2,3,6-tridéoxyhex-2-énopyranos-4-ulose qui est reliée au C-4 de la 2-déoxy-L-fucose.

A partir des résultats analysés ci-dessus, la structure du disaccharide méthylé fut reconnue comme étant celle d'un nouveau sucre:

OCHJ

MA144-U1 : R = H MA144-U2: R = OH

et le sucre final fut nommé aculose.

La structure chimique de MAI44-Y fut donc déterminée comme « suit:

COOCHj CH2.CH5 OH

OH

MA 144-Y est formé d'aclavinone et de trois sortes de fractions de sucres: L-rhodosamine, 2-déoxy-L-fucose et un sucre inconnu. En outre, de la 1-déoxypyrromycine et un disaccharide méthylé inconnu furent obtenus à partir de MA 144-Y par méthanolyse. Ce disaccharide méthylé fut extrait à l'éther et purifié par l'acide silicique et par Chromatographie sur colonne Séphadex LH-20 (marque de fabrique), puis cristallisé sous forme d'aiguilles cristallines blanches, dans le benzène. Les propriétés physico-chimiques de ce disaccharide méthylé sont les suivantes:

Analyse élémentaire pour C13H20O6:

Calculé: C 57,77 H 7,31%

Trouvé: C 7,31 H 7,40%

w

"CU N^i13 Kj; >Ch3

Tandis que plusieurs antibiotiques glucosides anthracyclines présentant des fractions aclavinone et -e-pyrromycinone aglycone sont 65 connus dans la technique, les composés MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 et - Y sont nettement différents de ceux-ci dans les propriétés telles que formules moléculaires, produits de dégradation par hydrolyse acide, spectres en ultraviolet, en lumière visible et en

637160

10

infrarouge, et spectres NMR et analogues, comme précédemment décrit. Parmi les glucosides anthracyclines connus, l'aclavine et la pyrromycine sont formées d'aclavinone ou de -s-pyrromycinone et d'un sucre, la L-rhodosamine, ce qui les distingue des composés de l'invention. L'aclacinomycine A et la cinérubine A sont formées de 5 trois fractions de sucres; le L-cinérulosyl-2-déoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl, MA144-M1 et -M2 (demande de brevet japonais Showa N° 51-39688) sont également formés de trois fractions de sucres; le L-amicétosyl-2-déoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl et la rho-dirubine B (demande de brevet japonais Showa N° 51-98113) sont io formés de L-rhodinosyl-L-rhodinosyl-L-rhodosaminyl, et ces trois antibiotiques connus se distinguent des composés de l'invention de par les fractions de sucres. La fraction de sucre de la rhodirubine A,

Comme on le voit ci-dessus, les composants MA144 possèdent une activité antimicrobienne, spécialement vis-à-vis des bactéries Gram positives, ce qui explique leur emploi thérapeutique dans le traitement des mammifères pour la diphthérie, la tuberculose, les pneumonies, le tétanos et autres maladies infectieuses causées par les 40 bactéries Gram positives.

formée de L-rhodinosyl-2-déoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl, est la même que celle de MA144-N1 dans l'invention, mais l'aglycone de MA144-N1 est l'aclavinone et se distingue de la -s-pyrromycinone de la rhodirubine A.

Ainsi se trouve vérifié que MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 et -Y de l'invention sont de nouvelles substances.

Activité antimicrobienne des composants MA144

MA144-G1, -G2, -L, -SI, -S2, -NI, -Ul, -U2 et -Y présentent des activités antimicrobiennes vis-à-vis de types variés de microorganismes. La concentration minimale inhibitoire des présents antibiotiques, déterminée par la méthode de dilution des bouillons, est indiquée sur le tableau ci-dessous.

animaux, et se révèlent ainsi thérapeutiquement utiles dans l'inhibition de la croissance des tumeurs chez les mammifères. En particulier, les composés de l'invention présentent des effets inhibiteurs marqués sur les leucémies L1210 de la souris. Par exemple, des souris BDF, d'un poids de 19 à 22 g sont inoculées par voie intrapé-ritonéale avec 1 x 106 de cellules L1210/souris; 24 h après l'inoculation, le composé est injecté par voie intrapéritonéale une fois par jour pendant 9 d consécutifs. Sur 30 d, le pourcentage de prolongation du temps de survivance par rapport à un témoin est indiqué sur le tableau suivant, avec les valeurs LD50 après injection unique intrapéritonéale aux souris dd.

Activité antitumorale et toxicité aiguë des composants MA144

Les composants MA 144 présentent une activité antitumorale 45 marquée et une faible toxicité lors d'expériences faites sur des

Prolongation du temps de survivance (% T/C)

Composés

MA 144-

G1

G2

L

NI

SI

S2

Ul

U2

Y

Activité anti-L1210

Dose (mg/kg/d)

20

—

65

10

—

135

108

98

—

90

—

143

5

187

90

128

200

140

85

127

86

127

2,5

215

130

114

184

168

110

165

86

115

1,25

145

164

95

137

133

145

157

112

—

0,6

130

140

—

123

114

130

129

135

—

0,3

118

108

—

110

96

118

114

129

—

0,15

101

97

—

97

—

110

—

Toxicité (souris)

LDS0

Administration intrapéritonéale

28,5

17,0

45,5

32,5

24,4

12,5

30,2

14,5

40-50

(mg/kg)

Spectre antimicrobien des composants MA144

Micro-organisme test

MIC (mcg/ml) MA144-

Gl

G2

L

NI

SI

S2

Ul

U2

Y

Staph. aureus (FDA 209P)

6,25

3,12

6,25

3,1

0,4

Staph. aureus Smith

1,56

0,78

3,1

0,78

3,1

0,78

0,2

Bac. subtilis (ATCC 6633)

3,12

1,56

3,1

0,2

Bac. cereus (ATCC 9634)

1,56

0,78

1,56

0,78

1,56

0,78

1,56

0,1

Bac. megaterium (NRRL B-938)

6,25

3,1

1,56

0,2

Bar. lutea (ATCC 9341)

0,78

1,56

0,2

Mic.flavus

0,2

0,4

1,56

0,78

1,56

0,78

0,1

Cory. bovis 1810

1,56

0,78

1,56

0,78

6,25

0,2

Ps.fluorescens (NIHJB-254)

100

>100

Pr. morganii

>100

Mycobact. smegmatis (ATCC 607)

3,12

3,1

>100

3,1

Can. albicans (IAM 4905)

100

>100

100

>100

Call, tropicalis (IAM 4942)

100

>100

100

>100

Efficacité thérapeutique vis-à-vis des leucémies L1210 de la souris et toxicité des composés MA144.

11

637 160

Cytotoxìcitè vis-à-vis de cellules cultivées L12J0 des composants M A144

Les composants MA144 inhibent la croissance des cellules tumorales mammifères dans les cultures, notamment à de faibles concentrations, et inhibent complètement la synthèse de RNA. Dans ces essais, des cellules L1210 furent inoculées en milieu RPMI1640 (Nissui, Rosewell Park Memorial Institute 1640) renfermant 20% de sérum de veau et cultivées à 37° C pendant 3 d dans un incubateur à C02; on ajouta, à une concentration de 0,1 ng/ml, les composés de l'invention au bout d'une journée. Dans l'essai d'incorporation de 14C, les composés de l'invention furent ajoutés à une concentration de 0,5 ng/ml pour la synthèse RNA, et de 1,0 ng/ml pour la synthèse DNA, et également de la 14C-thymidine ou -uridine fut ajoutée au milieu pendant 60 min à 37° C. Les effets sur la croissance et la synthèse de DNA et RNA furent indiqués par l'inhibition, en pour-cent, par rapport au témoin, comme représenté sur le tableau ci-dessous. Il ressort de ces résultats que les composants MA 144 inhibent de façon notable la croissance et la synthèse RNA des cellules L1210 cultivées à faible concentration. Ces résultats confirment l'activité thérapeutique sur les tumeurs expérimentales animales.

Effets des composants M A144 sur la croissance et la synthèse macro-moléculaire dans les cellules L1210 cultivées

Composés

Inhibition (%)

Croissance (au 2e jour)

RNA

Synthèse de DNA

Aclacinomycine

89,7

81,6

69,6

MA144-G1

80,7

65,6

40,9

-G2

82,1

57,8

39,4

-L

27,4

39,7

11,3

-NI

79,2

74,4

57,4

-SI

86,0

74,1

76,5

-S2

88,1

65,6

48,8

-Ul

78,5

67,2

27,7

-U2

80,5

71,5

30,5

-Y

90,2

93,9

99,6

Utilisation thérapeutique des composants MA144

Comme précédemment mentionné, les composants MA144-G1, -G2, -L, -NI, -SI, -S2, -Ul, -U2 et -Y obtenus par le procédé selon l'invention sont de nouveaux antibiotiques, utilisables en médecine humaine et vétérinaire, présentant également une action inhibitrice marquée contre les tumeurs malignes des mammifères et contre les bactéries Gram positives.

Ces composants obtenus par le procédé selon l'invention peuvent être transformés en compositions pharmaceutiques renfermant au moins l'un des composés antibiotiques précités, avec un agent porteur compatible pharmacologiquement acceptable. Les compositions peuvent être préparées sous toute forme pharmaceutique appropriée en vue de l'administration. Des exemples de telles compositions comprennent des compositions solides pour l'administration orale, telles que comprimés, capsules, pilules, poudres et granules, des compositions liquides pour administration orale, telles que solutions, suspensions, sirops et élixirs, et des préparations pour administration parentérale, telles que solutions stériles, suspensions ou émulsions.

Les composés obtenus par le procédé selon l'invention peuvent former des sels non toxiques d'addition d'acides avec une variété de réactifs organiques et minéraux générateurs de sels, et former des complexes non toxiques avec l'acide désoxyribonucléique. Les sels d'addition d'acides formés avec des acides pharmacologiquement acceptables, comme les acides sulfurique, phosphorique, chlorhydrique, acétique, propionique, oléique, palmitique, citrique, succinique, tartrique, glutamique, pantothénique, etc., et les complexes non toxiques formés avec l'acide désoxyribonucléique peuvent donc être employés de la même manière que les composants MA 144 eux-mêmes.

Les quantités mises en œuvre varient en fonction du composé particulier à utiliser, de la composition particulière formulée, du mode d'application et des sites particuliers, de l'hôte et de la maladie à traiter. En général, les composants MA144 sont injectés par voie intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée, localement, ou administrés oralement, chez l'animal, ou par voie intraveineuse, intrapéritonéale, localement, ou oralement chez l'homme. Certains facteurs modifiant l'action de la drogue seront pris en considération par l'homme de métier, par exemple, âge, poids vif, sexe, régime alimentaire, durée d'administration, méthode d'administration, fréquence d'excrétion, état du patient, combinaisons de médicaments, sensibilités de réaction et gravité de la maladie. L'administration peut être effectuée de façon continue ou périodique, en respectant la dose maximale tolérée. Des fréquences d'application optimales pour un nombre donné de conditions peuvent être vérifiées par l'homme de métier, à l'aide d'essais conventionnels de dosage en tenant compte des directives précitées.

Utilisés comme agents antibactériens, les composants MA144 sont en général administrés de façon que la concentration en ingrédient actif soit plus grande que la concentration minimale inhibitrice pour l'organisme particulier à traiter.

L'invention sera maintenant décrite en se référant aux exemples suivants, donnés sans aucun caractère limitatif.

Exemple 1:

On prépare un milieu nutritif ayant la composition suivante:

Glucose 2%

Amidon de pomme de terre 2%

Meat (poudre de soja, Ajinomoto Co.) 2%

K2HP04 0,1%

MgS04-7H20 0,1%

NaCl 0,3%

MnCl2-4H20 0,0008%

CuS04-7H20 0,0007%

FeS04-7H20 0,0001%

ZnS04-7H20 0,0002% pH 7,2

50 ml de ce milieu sont stérilisés à 120" C pendant 15 min dans un ballon de 500 ml, que l'on inocule avec 1 ml d'une culture congelée de Streptomyces galilaeus MA144-M1 (FERM P-2455, ATCC 31133) et incube à 30 C pendant 48 h sur un secoueur rotatif. 101 du milieu préalablement stérilisé, dans un fermenteur en forme de jarre de 201 en acier inoxydable, sont inoculés aseptiquement avec 200 ml de la culture ensemencée précitée. La fermentation est effectuée à 28 C pendant 18 h sous agitation (300 tr/min) et aération (51/min). 10 1 de cette culture sont ensuite transférés dans 6001 du milieu préalablement stérilisé, dans un réservoir en acier inoxydable de 2 kl, et cultivés à 28 C pendant 36 h (180 tr/min) et aération (300 1/min).

Le bouillon de culture obtenu (580 1) est ajusté à pH 5,0 par l'acide sulfurique et filtré sur terre de diatomées. Le gâteau filtrant formé (56 kg) est mis en suspension dans 50 1 d'acétone et filtré après agitation pendant 1 h. Le résidu est réextrait par 50 1 d'acétone. Les deux extraits sont concentrés à 251 sous pression réduite, additionnés à 201 d'acétate d'éthyle et agités. Après séparation de la couche d'acétate d'éthyle, concentration a 1 1 sous pression réduite, le mélange brut de MA 144 est précipité par addition de 15 1 de n-hexane au concentrât, ce qui permet d'obtenir 36 g de poudre rouge, après lavage deux fois au n-hexane. De plus, le filtrat de culture obtenu ci-dessus est ajusté à pH 6,8 avec de l'hydroxyde de sodium et extrait avec 100 1 de toluène. L'extrait est concentré à 10 1 sous pression réduite, puis réextrait avec 101 de tampon acétate à pH 3,5. La couche aqueuse obtenue est ajustée à pH 6,8, de nouveau extraite avec 4 1 de toluène, puis concentrée à 30 ml sous pression réduite. Le

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

637160

12

mélange brut de MA144 est précipité par addition de 300 mi de n-hexane au concentrât, ce qui permet d'obtenir 2,5 g d'une poudre rouge.

5

Exemple 2:

La poudre brute du mélange de MA144 obtenu à partir du gâteau de filtre, comme dans l'exemple 1 (10 g), est dissoute dans 100 ml de toluène et soumise à un traitement sur colonne (5 x 40 cm) remplie de 300 g d'acide silicique et, après séparation de l'éluat 10 initial avec du toluène renfermant 1,5% de méthanol, les fractions MA144-G1, -G2 et -L sont éluées successivement avec du toluène à 2% de méthanol. Puis la fraction MA144-N1 est éluée avec du toluène à 3% de méthanol, cependant que les fractions MA133-S1 et -S2 et MA144-U1 et -U2 sont éluées successivement avec du toluène 15 à 5% de méthanol. Après concentration de chacune des fractions ainsi obtenues, on obtient, par addition de n-hexane, des poudres brutes rouge orangées de 210 mg d'un mélange de MA144-G1 et -G2,190 mg de MA144-L, 570 mg d'un mélange de MA144-N1 et de rhodirubine A, 360 mg d'un mélange de MA144-S1 et -S2, et 270 20 mg d'un mélange de MA144-U1 et -U2.

Exemple 3:

On dissout dans 6 ml de toluène, 2,5 g de la poudre brute du mélange MA 144 provenant du filtrat de la culture obtenu comme dans l'exemple 1 puis on soumet la solution à un traitement sur colonne remplie de 100 g d'acide silicique, et la fraction MA144-Y est éluée avec du toluène à 1,7% de méthanol à 5° C. La fraction obtenue est concentrée à sec sous pression réduite; on obtient 400 mg de MA144-Y brut, sous la forme d'une poudre rouge orangée.

Exemple 4:

On dissout 210 mg du mélange de MA144-C1 et -C2 obtenu dans l'exemple 2 dans une petite quantité d'acétate d'éthyle, et l'on soumet la solution à un traitement sur colonne remplie de 30 g de Column-Lite (marque de fabrique Fuji Cem. Co., pour l'acide silicique), avec élution avec un mélange acétate d'éthyle/méthanol 1/1. La fraction jaune est concentrée à sec sous pression réduite, et le résidu obtenu est dissous dans 50 ml de chloroforme, secoué avec 50 ml de tampon au phosphate 0,01M renfermant 10_3M EDTA pour éliminer les ions métaux résiduels, puis la couche de chloroforme est lavée deux fois à l'eau, séchée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée à sec sous pression réduite. On obtient 110 mg d'une poudre jaune de MA144-G1.

La colonne précitée garnie de Column-Lite, après élution des fractions jaunes, est traitée avec un mélange à 30% de méthanol renfermant 10_3M EDTA, et l'éluat rouge résultant est évaporé à sec, dissous dans une petite quantité de chloroforme, et débarrassé des ions métaux résiduels, suivant la méthode précitée, ce qui fournit 22 mg de MA144-G2 sous la forme d'une poudre rouge. (EDTA=acide éthylènediaminetétraacétique).

La poudre brute de MA144-L dans l'exemple 2 est traitée de la même manière que décrit pour MA144-G1, ce qui fournit 115 mg d'une poudre jaune de MA144-L. Par le même procédé de purification de MA144-G1 et -G2 que précédemment décrit, on obtient une poudre purifiée de 260 mg de MA144-N1,150 mg de MA144-S1, 88 mg de MA144-S2, 128 mg de MA144-U1, 54 mg de MA144-U2 et 114 mg de MA144-Y.

Exemple 5:

Conformément à la méthode générale des exemples 1, 2 et 4, les composés de l'invention sont obtenus comme suit, en utilisant les souches indiquées de Streptomyces:

Souches

MA144 obtenus (mg)

Gl

G2

L

NI

SI

S2

Ul

U2

Y

Streptomyces sp. galilaeus (ATCC 14969)

42

68

55

126

63

145

115

63

43

Streptomyces sp. ME505-HEI

—

143

89

97

101

—

(FERM P-3667, ATCC 31273)

Streptomyces cinereoruber (ATCC 19740)

25

37

38

76

88

79

27

83

16

Streptomyces niveoruber (ATCC 14971)

—

56

—

43

54

38

—

64

12

Streptomyces antibioticus (ATCC 8663)

—

28

—

18

—

32

—

Streptomyces purpurescens (ATCC 25489)

—

13

—

9

—

14

—

R

15 feuilles dessins

Claims

637 160 2 REVENDICATIONS

1. Procédé de fabrication de glucosides anthracyclines MA144 de formule générale (I):

Ri O

COOCH5

(I)

dans laquelle R, est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle, R2 est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle,

et R3 est un atome d'hydrogène, ou 0 —\

■ /ch3 n

E0\

L

OU

0=

ou d'un sel d'addition d'acide non toxique de celles-ci ou d'un complexe de celles-ci avec l'acide désoxyribonucléique, caractérisé en ce qu'on effectue la culture d'une souche productrice de MA144 appartenant au genre Streptomyces, dans des conditions aérobies en immersion, dans un milieu nutritif renfermant une source de carbone, un milieu nutritif azoté, des sels minéraux et des traces de métaux, jusqu'à ce qu'une quantité substantielle de glucosides anthracyclines de formule (I) soit produite par ledit organisme dans ledit milieu nutritif, puis isolé et éventuellement transformé en un sel d'addition non toxique ou d'un complexe avec l'acide désoxyribonucléique.

2. Procédé selon la revendicaiton 1 pour la fabrication de glucosides anthracyclines de formule (I), caractérisé en ce que la souche productrice de MA 144, choisie dans le genre Streptomyces, est sp. ME505-HE1 (FERM P-3667, ATCC 31273), Streptomyces gali-laeus MA144-M1 (FERM P-2455, ATCC 31133), Streptomyces gali-laetis (ATCC 14969), Streptomyces cinereoruber (ATCC 19740), Streptomyces niveoruber (ATCC 14971), Streptomyces antibioticus (ATCC 8663) ou Streptomyces purpurescens (ATCC 25489).