DE2946793C2

DE2946793C2 - 4-O-Desmethyl-11-desoxy-anthracyclinglycoside, Verfahren zu deren Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE2946793C2
Application number: DE2946793A
Authority: DE
Inventors: Giuseppe Voghera Pavia Cassinelli; Arpad Dr.agr. Mailand/Milano Grein; Sergio Bernareggio Mailand/Milano Merli; Giovanni Mailand/Milano Rivola
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1978-11-21
Filing date: 1979-11-20
Publication date: 1985-08-01
Also published as: CH648565A5; IT1196402B; IT7927158A0; FR2442242A1; FR2450801A1; DE2946793A1; JPS5576896A; FR2450801B1; FR2442242B1; JPS6332080B2; US4421851A; US4370474A

Description

und deren pharmakologisch annehmbare Salze.

35 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den

durch mutagene Behandlung von Streptomyces peucetius var. caesius mit N-Methyl-N'-niiro-N-nitrosoguanidin erhaltenen und bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nr. 1367 DSM hinterlegten Mutantenstamm unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, kultiviert

•»ο und die in Anspruch 1 genannten Anthracyclinglycoside gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei einer Temperatur von 25 bis 37° C 3 bis 7 Tage lang bei einem pH-Wert von ursprünglich 6,5 bis 7,0, und am Ende des Fermentationsverfahrens von 6,5 bis 8,0 durchführt.

4. Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eine oder mehrere Verbindungen nach Anspruch 1, 45 in Mischung mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger.

50 Die Erfindung betrifft 4-0-DesmethyI-ll-desoxy-anthracyclinglycoside gemäß dem Anspruch !,Verfahren zu deren Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen, weiche diese Verbindungen enthalten.

Die neuen Verbindungen sind Antibiotika, die als Antitumormittel und als antibakterielle Mittel wirksam sinu.

Der beim eifindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus wird durch mutagene Behandlung von 55 Streptomyces peucetius var. caesius (Arcamone et al., Biotechnol. Bioengeen., XI, 1969, UOl-1110) mit N-Methyl-N'-n:tro-N-nitrosoguandin erhalten. Dem so erhaltenen neuen Stamm wurde die Code-Nr. 416 F.I. der Farmitalia Sammlung von Mikroorganismen gegeben und er wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nr. 1367 DSM, bei der American Type Culture Collection unter der Nr. 31428 ATCC und beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Nr. 4622 F.R.I, hinterlegt.

M) Wie bei vielen Antibiotika bildenden Kulturen führt die Fermentation des Stammes 416 F.I. zur Bildung eines Gemisches von Komponenten. Vier bioaktive Anthracyclinkomponenten wurden aus dem durch den oben erwähnten Mikroorganismus gebildeten Gemisch abgetrennt. Vs wurde fcslpeslcllt. da« die Antibiotika W, X, Y und Z die folgende strukturelle Formel aufweisen:

ίο

15

,JW-

OH¹

,NH₂

I: Antibiotikum W R = -CO-CH₂-OH II: Antibiotikum XR= -CH(OH)-CHj

III: Antibiotikum YR- -CO-CH₃ IV: Antibiotikum Z R= —CH₂—CH₃

entsprechen 4-0-DesmethyI-ll-desoxy-doxorubicin fur das Antibiotikum W(I), 4-O-Desmethyl-l l-desoxy-13-dihydrodaunorubicin für das Antibiotikum X(II), 4-O-Desmethy!-l l-desoxydaunoaibicin für das Antibiotikum Y (III) und 4-0-Desmethyl-I I-defoxy-13-desoxodaunorubicin für das Antibiotikum Z (IV).

Wie gezeigt, sind alle obigen Komponenten Anthracyclinglycoside mit einem Gehalt an Daunosamin P-Amino^^.o-trideoxy-L-lyxohexose), der Aminozuckerkomponente von Daunomycin und Adriamycin (F. Arcamone, G. Cassinelli, P. Orezzi, G. Franceschi und R. Mondelli, J. Am. Chem. Soc. 86,5335,1964, und die eigene US-PS 3590028). Die Strukturen der Komponenten wurden durch Analyse ihrer IR-, UV-, siehtbaren, Massen-u: .d NMR-Spektren bestimmt und stimmen mit den im folgenden angegebenen chemischen und physikalischen Daten überein.

Der neue Anthracyclinglycoside bilden sowohl mit Säuren als auch mit Basen Salze und somit fallen pharmazeutisch annehmbare Salze des Komplexes und der Komponenten unter den Rahmen der vorliegenden Erfindung. Beispiele derartiger pharmazeutisch verwendbarer Salze sind Salze mit Säuren, wie Salzsäure, Schwefel- säure, Salpetersäure und Phosphorsäure, und mit Metallkationen, z.B. Alkali- oder Erdalkalikationen, wie Natrium, Kalium, Kalzium und Magnesium, und auch mit anderen Kationen, wie dreiwertigen Eisenkationen. Die Herstellung der neuen Anthracyclinantibiotika der vorliegenden Erfindung wird im nachstehenden beschrieben.

40

Mikroskopische Eigenschaften des Stammes 416 F. I.

Das Substratmycel wird durch deutlich verzweigte Hyphen, 0,5 bis 0,9 μπι im Durchmesser, variabler Länge gebildet; das Luftmycel, das aus ersterem entsteht, wird von ziemlich langen, geraden bis gewundenen Hyphen, 1,1 bis 1,6 μΐη im Durchmesser, gebildet; von diesen führen durch Scheinachsenverzweigung in Büschel-Ibrmsporentragende Hyphen unterschiedlicher Länge weg, die in Haken oder Schleifen enden. Die Sporen sind sphärisch und im Durchmesser 1 bis 2 μπι, zuerst sind sie in Ketten angeordnet und dann frei. Unter dem Elektronenmikroskop scheinen die Sporen nahezu sphärisch mit unregelmäßigen Konturen und mit einer warzigen Oberfläche zu sein.

50

Makroskopische Eigenschaften des Stammes 416 F. I. Die Kultureigenschaften des Stammes 416 F. I. sind in Tabelle I angegeben.

Das Wachstum ist sowohl auf organischen als auch auf synthetischen Medien im allgemeinen gut. Das Wachstum auf den in Tabelle I angegebenen Medien wurde ab dem 5. Tag der Inkubation bei 28nC bis zum Ende desselben beobachtet.

Die biochemischen und physiologischen Eigenschaften des Stammes 416 F. I. sind in Tabelle II angegeben. Bei einer Temperatur über 4OnC wurde kein Wachstum festgestellt. Sklcroticnbildung wurde auf den in Tabelle I angegebenen Medien nicht festgestellt.

60

Tabelle I: Kuliureigenschaftcn des Stammes 416 F. I. Medium Subslralmycol Luflmycci lösliche

Pigmente t>5

IknneU's-Agar Wachstum reichlich, leicht lichenoid, stroh- bis zitronengelb keines zitroncn-

(Waksman, 19dl) gefärbt gelb

Fortsetzung

Medium

Substratmycel Luftmyccl lösliche Pigmente

gutes Wachstum, flach, kompakt, farblos

Wachstum reichlich, flach, kompakt, zitronengelb gefärbt

reichliches Wachstum, erhaben und starr, Kolonien manchmal keines kraterartig, zitronengelb-orange

Czapek's-Agar (Waksman, 1961)

Asparagin-Giucose-Agar (Waksman, 1961)

Glycin-Glycerin-Agar CWaksman, i961)

Emerson's-Agar

(Waksman, 1961)

Anorganische Salze-Stärke-Agar

(Pridham et al., 1957)

Kartoffel-Glucose-Agar (Waksman, 1961)

Asparagin-Glycerin-Agar (Waksman, 1961)

HefecNtrakt-Glu- Wachstum reichlich, erhaben und gefurcht, Kolonien cose-Agar kraterähnlich, strohgelb gefärbt

(Waksman, 1961)

Stärke-Kasein- Wachstum reichlich, flach, strohgelb gefärbt

Agar (Waksman, 1961)

SA-Agar *) reichlich, strohgelb grau

reichlich, zitronengrün-blaugelb bis grün icicht

grün

reichliches Wachstum, erhaben und gefurcht, kraterähnlich; honigfarben

reichliches Wachstum, flach, strohgelb gefärbt

Wachstum reichlich, leicht erhaben, hellorange gefärbt

Wachstum reichlich, erhaben und gefurcht, kraterähnliche Kolonien, zitronengelb gefärbt keines

zitronengelb- orange

gelb

reichiieh- strohgelb grau-grün

mäßig, grau zitronengelbocker

keines

grau

zitronengelb

gelb

strohgelb

Wachstum reichlich, erhaben und gefurcht, strohgelb gefärbt grau mit strohgelb

blaugrünen
Tönungen

*; Zusammensetzung siehe Aufrechterhaltungsnicdium in Beispiel I

Waksman S. A. »The Actinomycetes«, Bd. II, 1961, William Wilkins Co., Baltimore;

55 Pridham T. G., Anderson P., Foley C. Lindenfelser L. A., Hesseltine C. "*l. und Benedict R. G. »A selection of media for maintenance and taxonomic studies of Streptomyces Antibiotics« Ann. 1956/1957, 947-953.

Tabelle II:

Physiologische und biochemische Eigenschaften des Stammes 416 Y, I, *)

Verwertung von Glucose +

Verwertung von Saccharose

Verwertung von 1)-Xylosc +

Verwertung von Mannit

Verwertung von m-lnosit +

Forlsetzung

Verwertung von L-Arabinose +

Verwertung von D-Fructose + <;

Verwertung von Adonit

Verwertung von Lactose

Verwertung von d(+)-Mannose +

Verwertung von Maltose +

Verwertung von RafFinose

Verwertung von L-Rhamnose

Verwertung von α,α-Tiehalose +

Verwertung von Äskulin +

Verwertung von Glycerin +

Verwertung von Na-Citrat +

Verwertung von NH.t-Succinat +

Verwertung von Na-Acetat

Verwertung von NH4-Tartrat

Verwertung von Glykogen +

Verwertung von Paraffin -

negative Kontrolle

Verflüssigung von Gelatine +

Tyrosinzersetzung +

Melaniribildung -

Stärkehydrolyse +

H2S-Bildung +

Nitratreduktion +

Milch (Pepton und koag.) +

gebildete Antibiotika: neue Anthracycline

+ - positive Reaktion

- - negative Reaktion *> ' Das Pur den Kohlchydratverwerlungstest verwendete Medium ist das von R. D. Gordon und M. L. Smith: J. Bacteriology 69, 1955.

S. 147-150, beschriebene. Die für die anderen physiologischen Reaktionen verwendeten Medien sind jene, die von S. A. Waksman

»The Actinoniycetcs«. Bd. II. 1961, The Williams Wilkins Company. Baltimore, angegeben wurden.

Identifizierung und Klassifikation des Stammes 416 F. I.

Die vom Stamm 416 F. I. gezeigten Gesamteigenschaften entsprechen klar jenen, die für die Art Streptomyces Waksman et Ilcnrici angegeben wurden. Weiterhin entsprechen die morphologischen Kultur- und physiologischen Kigcnschaften des Stammes 416 F. I. jenen, die für die Species Streptomyces pcucctius var. cacsius beschrieben wurden (US-PS 3590028; Arcamone et al., Biotechnol. Bioengeen., Xl, 1969,1101-1110), von dem 5< > er sich aber trotzdem wegen seiner Fähigkeit unterscheidet, ein gelbes lösliches Pigment zu bilden, weil er m-Inosit L-Arabinose und Äskulin verwertet, während er Saccharose, Mannit und Raffinose nicht verwertet, und schließlich, weil er neue Anthracycltnantibiotika bildet.

Der Stamm 416 F. I. ist somit eine Varietät von Streptomyces peucetius var. caesius, der die Bezeichnung Streptomyces peucetius var. aureus gegeben wurde.

Fermentierungsverfahren

Die Produktion erfolgt in an sich bekannter Weise und umfaßt das Kultivieren des mutierten Mikroorganismus in einem vorher sterilisierten flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 37° C (vorzugsweise bei 28° C) während eines Zeitraumes von 3 bis 7 Tagen (vorzugsweise 5 Tagen) und bei einem pH-Wert von anfänglich 6,5 bis 7,0 und am Ende des Fermentierungsverfahrens von 6,5 bis 8,0. Das Kulturmedium enthält Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze.

Die Kohlenstofiquellc kann beispielsweise Stärke, Dextrin, Glucose, Glycerin, Mannit, Maltose, Getreideweiche, Trcbcrn, Spjabohnenö! oder Sojabohnenmeh! sein. Die StickstofFquelle kann außer den oben erwähn- ten Kohienstoffquellen, die Stickstoff enthalten, beispielsweise Trockenhefe, Fleischpepton oder Kasein sein. Gute Ergebnisse werden sogar durch Verwendung von Ammoniumsalzen, wie Ammoniumnitrat, AmmoniumsuITaten und Diammoniumphosphaten, erhalten. Die für die Produktion verwendbaren Mineralsalze können

je nach dem verwendeten Medium variieren. So erwies sich in einem Medium, das komplexe Substanzen, wie verschiedene Mehle und Fermentalionsrückstände enthält, der Zusatz von Kal/iumearbonal und Nalrium- oder Kaliuinphosphaten als zweckmäßig. In Medien, die Glucose oder Ammoniumsalze enthalten, sind höhere Mengen an Mineralsalzen von Kalium, Natrium oder Kalzium erforderlich und zusätzlich Mikromengen von Metallsalzen, wie Eisen-, Zink-, Kupier-. Magnesium- und Mangansalzen. Der Zusatz von schwefelhaltigen Verbindungen, wie Sulfanilamid, Sulfathiazol, Sulfapyridazin, Penthiobarbital und Äthionin kann ebenfalls iweckdienlich sein.

Die Fermentierung kann in Erlenmeyer-Kolben oder in Laboratoriums- oder Industrielermcntcrn mit verschiedenem Fassungsvermögen durchgeführt werden.

Analytische Methoden

Als Proben der Fermentationsbrühen und roher Zubereitungen unter Verwendung von Whatman Nr. 1-Papier, gepuffert mit M/15 Phosphatpuffer auf pH 5,4, der Papierchromatografie unterworfen wurden, wobei als

Eluierungsmittel eine Mischung von n-Propanol : Äthylacetat : Wasser (7:1:2) verwendet wurde, und der Papierstreifen gegen Bacillus subtilis bioautografiert wurde, wurde gefunden, daß vier Hauptkomponenten wiederkehren, und diese wurden als Antibiotikum W (Rf 0,45), Antibiotikum X (Rf 0,60). Antibiotikum Y (Rf 0,6-1) und Z (RfO,7O) bezeichne!. Auch ζ·.νε; geringere Komponenten kehrten wieder und diese wurden .ils Glycoside A und C (Rf 0,30 bzw. 0,55) identifiziert, wie in der eigenen GB-PS 2016005 B beschrieben.

Eine quantitative Bestimmung aller in den Fermentationsbrühen vorhandenen gelben Bestandteile kann nach folgender Methode durchgeführt werden. Zu einer Probe der Brühe, auf einen pH-Wert von 8,6 eingestellt, werden zwei Volumina Chloroform : Methanol (9 : 1) zugesetzt und die erhaltene Mischung 1 Min. bei Raumtemperatur mit Schall behandelt. Dann kann an einer Probe der organischen Phase, die mit saurem Methanol verdünnt ist, der Gesamtgehalt der gelben Anthracycline und ihrer Aglycone bei 430 nm spektrofotometrisch bestimmt werden. An einer Probe der organischen Phase, die unter vermindertem Druck konzentriert wurde, kann die quantitative Bestimmung der einzelnen Antibiotika durch präparierte Dünnschichtchromatografie unter Verwendung des oben angegebenen Systems erfolgen. Die verschiedenen gelbgefärbten Zonen werden abgekratzt und mit Methanol eluiert. Jeder Bestandteil wird spektrofotometrisch bei 430 nm bestimmt. Das Antibiotikum Y ist gewöhnlich der Hauptbestandteil in den Fermentationsbrühen.

Isolierverfahren

Nach Beendigung der Fermentation sind die aktiven Verbindungen in den Mycelen und in den Fermentationsflüssigkeiten vorhanden. Diese Anthracyclinantibiotika können bei pH 8,5 bis 9,0 als freie Basen aus der Kulturbrühe »in toto« mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Butanol, Mcthylisobutylketon, Chloroform, Dichlormethylen und Äthylacetat, extrahiert werden. Vorzugsweise werden die Mycele und die Fermentationsflüisigkeiten durch Filtrieren bei pH 4 mit Hilfe von Diatomeenerde getrennt und dann separat extrahiert.

Der Filtrationskuchen wird mit einem wasserlöslichen Lösungsmittel, wie Aceton und nied. Alkoholen, vorzugsweise mit Methanol, extrahiert.

Die Mycelextrakte werden gesammelt und unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wird mit der filtrierten Brühe vereinigt, auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9 eingestellt und dann mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform oder n-Butanol, extrahiert. Die Extrakte werden unter vermindertem Druck konzentriert und die Anthracyclinanlibiotika können durch Zusetzen des fünffachen Volumens an η-Hexan ausgefällt werden. Die Bestandteile der rohen Mischung können fraktioniert und durch Säulenchromatografiemethoden gereinigt werden.

Reinigungsverfahren

Die weitere Reinigung sowie die Trennung in die vier Komponenten, nämlich die Antibiotika W, X, Y und Z, kann durch Säulenchromatografie auf Silicagel bewirkt werden. Das rohe orange-braune Pulver wird in Chloroform gelöst und die Lösung auf gepuffertem Silicagel mit einem Gradienten Chloroform : Methanol : Wasser chromatografie!!. Zuerst wird das Antibiotikum Z mit einer Mischung 94,8 :5:0,2 und dann das Antibiotikum Y mit einer Mischung 92,2 : 7,5 :0,3 eluiert; das Antibiotikum X wird mit einer Mischung 89,5 : 10 :0,5 und das Antibiotikum W mit einer Mischung 300 : 55 : 6 eluiert. Die Komponenten werden wie üblich getrennt, wie durch Papier- und Dünnschichtchromatografie gezeigt, und die Antibiotika W, Y und Z werden als Hydrochloride in kristalliner Form durch Zusetzen eines Äquivalents von methanolischem Chlorwasserstoff erhalten.

Chemische und physikalische Eigenschaften

Die Antibiotika W, X, Y und Z zeigen einige Eigenschaften, die bei bekannten Anthracyclinantibiotika üblich sind, doch können sie aufgrund ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften unterschieden werden.

Alle neuen Anthracycline weisen ähnliche Löslichkeit auf; als freie Basen sind sie in Chloroform, Methylendichlorid. Aceton, Methanol, Äthanol, wäßrigen Alkoholen, angesäuertem Wasser, Dioxan und Pyridin löslich, während sie in Diäthyläther, η-Hexan, Cyclohexan und Petroläther kaum löslich oder unlöslich sind.

Als Hydrochloride sind sie in Wasser, Methanol, Äthanol und wäßrigen Alkoholen löslich und in Aceton, Benzol, Chloroform, Diäthyläther und Petroläther unlöslich. Die neuen Verbindungen können als Indikatoren verwendet werden, wobei sie in neutralen und in sauren Lösungen orange-gelb sind, in weichen sie unter

UV-Licht auch grünlich-gelbe Fluoreszenz zeigen. Ihre alkalischen Lösungen sind rotbraun und, wenn sie mit alkoholischem Magnesiumacetat behandelt werden, ergeben sie oranger^e Lösungen. Alle diese F.igenschaltcn und die Absorptionsspektren in den UV- und sichtbaren Regionen zeigen, daß diese neuen Verbindungen der Gruppe der Anthracyclinantibiotika angehören.

Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der drei Hauptkompcnenten, nämlich der Antibiotika W, Y und Z, als Hydrochloride isoliert, sind in Tabelle III angegeben.

Tabelle III:

Chemische und physikalische Eigenschaften der Antibiotika W, Y, Z und X

liigenschafl	Antibiotikum >	nm	Antibiotikum 1	nm	Antibiotikum /	nm	Antibiotikum X HCI
Fp.	.V· IICI		i ■ HCI		'. ■ I ICl		2OO-205°C (Zers.)
K/°(c=0,l	208-210°C(Zers.)		195-196°C(Zers.)		2OO-2O1°C (Zers.)		+ 110°
in MeOH)	+ 130°		+ 150°		+ 134°
UV sichtbares
SnR Ic trum		1180		1162		1158
^r,"'		1155		1118		1115	228, 258. 430 nm
E¹· ^Π\| cm	228, 258, 430	1115	228, 258, 430	1085	228, 258, 430	1085	640. 425. 205
^(1.Ol nNjOII	650,435,217	1070	670, 440, 208	1015	660,430,216	1010
	520 nm	1010	520 nm	985	520 nm	985
IR-Spektrcn	152	985	150	945	150	838
(KBr) · cm-'		970		840		820	3700-2550
	3700-2600	935	3700-2600	900	3650-2500	752	1660
	1720	840	1710	820	1665	435	1620
	1670	750	1667	780	1620		1470
	1615	440	1620	755	1470		1450
	1470		1518	450	1450		1415
	1450	HCl	1475	HCI	1420	HCl
	1415		1420		1385
	1385		1450		1290
	1285		1380		1215
	1245	1230
	1215	1215
Empirische Formel				C₂₆H₂₉NO, · HCl
Mol-Gewicht durch	C₂₄H₂₇NO₁₀	C₂₆H₂₇NO,-	C₂₆H₃₉NO, ·	500
Massenspektro	504	548	534
skopie bestätigt

Biologische Aktivitätsdaten

a) Antibakterielle Wirksamkeit

Die minimalen Hemmungskonzentrationen (MlC) der Antibiotika X, W, Y und Z als Hydrochloride in vitro, bestimmt für einige Mikroorganismen unter Verwendung der Standardrohrverdünnungsmethode, sind in Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV	MIC in g/ml	Antibiotikum Y	Antibiotikum Z	Antibiotikum X
Testorganismus	Antibiotikum W	25	100	100
	25	3,12	6,25	25
Staphylococcus aureus 209 P	12,5	12,5	25	50
Sarcina Lutea ATCC 9341	50	6,25	25	25
Bacillus subtiüs ATCC 6633	12,5
Eschcrichia coii B

b) Antitumorwirksamkeit

Die neuen Antibiotika X, W, Y und Z wurden gegen HeLa-Zellen in vitro (Zeit, während der sie den Heilmitteln ausgesetzt waren: 24 h) ur.d an L 1210 und P 388-Leukämic an Mausen im Vergleich mil Daunorubicin (Daunomycin) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V angegeben.

Tabelle V

Verbindung	Effekt auf HeLa Zellen (a)	Dosis	L-1210 (b)	toxische	P-388	(b)	toxische
	Entwicklungsfähigkeit		T/C	Todesfälle	T/C	Todesfälle
	in vitro IDv»			(O		(C)
	ng/ml	mg/kg	%		¹I¹Ii	2/8
Daunorubicin · HCI	7,5	2,9	144-150	1/20	170	6/8
(Daunomycin)		4.4	140-162	3/1')	175	7/8
		6,6	144-162		160	0/8
Antibiotikum X · HCl	13,0	1,0			140	0/8
		2,0		0/8	140
		2,9	125			7/8
		4,0		2/10	100
		4,4	131	5/10
		6,6	137			0/10
Antibiotikum W · HCl	8,8	1,0			159	0/20
(IMI-103)		1,5			172	0/20
		2,25			163	0/10
		3,4			190	1/9
		5,0			204
Antibiotikum Y · HCI	9,6	0,8	111
(IMI-86)		1,2	128		145
		1,9	122	8/10	159
		2,9	111
Antibiotikum Z ■ HCI	15,0	1,0			140
(IMI-87)		2,0			140
		2,9	1 £.J	2/10		7/8
		4,4	131	5/iO	100
		6,6	137

(a) HeLa-Zellen waren den Heilmitteln 24 h lang ausgesetzt, dann wurden sie plattiert.

(b) Mäuse wurden am 1. Tag nach der Tumorzelieninokulation i.p. behandelt. (O Aufgrund makroskopischer Ergebnisse berechnet.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1

Eine Kultur von Streptomyces peucetius var. aureus Stamm 416 F. I. wurde 14 Tage lang bei 28nC auf Agarschräghängen des Mediums SA folgender Zusammensetzung gezüchtet: Glucose 3%, Brauerei-Trockenhefe 1,2%, Natriumchlorid 0,1%, Monokaliumdihydrogenorthophosphat0,05%, Kaliumcarbonat 0,1%, Magnesiumsulfat 0,005%, Eisen(II)suIfatheptahydrat 0,0005%, Zinksulfatpentahydrat 0,0005%, Kupfersulfatpentahydrat 0,0005%, Agar 2%, Leitungswasser auf 100 ml, pH 6,7. Die Sterilisierung erfolgte durch Erhitzen in einem Auioklaven auf 115nC während 20 Min.

Die Sporen derso erhaltenen Kultur wurden gesammelt und in 3 ml sterilem destillierten Wasser suspendiert; die so erhaltene Suspension wurde in 300-ml-Erlenmeyer-Kolben mit einem Gehalt an 60 ml des folgenden flüssigen Wachstumsmediums angeimpft: Brauerei-Trockenhefe 0,3%, Pepton 0,5%, Kalziumnitrattetrahydrat 0,05%, Leitungswasser auf 1000 ml. Die Sterilisierung erfolgte durch Erhitzen in einem Autoklaven auf 12OnC während 20 Min. Der pH-Wert dieses Mediums nach Sterilisierung betrug 6,8 bis 7,0.

Die angeimpflen Kolben wurden 2 Tage bei einer Temperatur von 28nCaufeinem Rotationsschütticr, der mit 250 UpM betrieben wurde und einen Umkreis von 7 cm im Durchmesser beschrieb, geschüttelt. 1,5 mljedcrdcr oben gezüchteten Kulturen wurden in 300-ml-Erlenmeyer-Koiben mit einem Gehalt an 50 ml des folgenden Produktionsmediums angeimpft: Glucose 6%, Brauerei-Trockenhefe 3%, Natriumchlorid 0,2%, Monokaliumdihydrogenorthophosphat 0,1%, Kaliumcarbonat 0,2%, Magnesiumsulfat 0,01%, Eisen(II)sulfatheptahydrat 0,001%, Zinksulfatheptahydrat 0,001%, Kupfersulfatpentahydrat 0,001%, Leitungswasser auf 100 ml, pH 6,7. Die Sterilisierung erfolgte durch Erhitzen in einem Autoklaven auf 115nC während 20 Min. Die so angeimpften Kolben wurden 7 Tage lang bei 28nC unter identischen Bedingungen, wie sie oben tür die Samenphase angegeben sind, bebrütet.

In der 24. Fennentationsstunde wurde ein Zusatz von Sulfanilamid in einer Konzentration von 0,5 g/l zu jedem Kolben vorgenommen. In der 48. Fermentationsstunde erfolgte ein weiterer Zusatz dieser Substanz in einer Konzentration von 1 g/l zu jedem Kolben.

Die maximale Konzentration der aktiven Verbindungen wurde zwischen dem 6. und 7. Tag der Fermentation mit einer Produktion von 70 mcg/ml erzielt

Beispiel 2

Die Kultur des Stammes 416 F. I. wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Die Sporen der drei Schräghänge wurden zusammengegeben und in 10 ml sterilem destillierten Wasser gesammelt; die so erhaltene Suspension wurde in einem 2-l-Kolben mit rundem Boden, der mit Scheidewänden versehen war und 500 ml des in Beispiel 1 beschriebenen Samenmediums enthielt, angeimpft. Der Kolben wurde 48 h auf einem Rotationsschüttler, der mit 120 UpM betrieben wurde und einen Umkreis von 70 mm im Durchmesser beschrieb, bei einer Temperatur von 28° C bebrütet.

Dergesamte Samen wurde in einem rostfreien 80-1-Stahlfermenter mit einem Gehalt an 50 ml des in Beispiel 1 beschriebenen Produktionsmediums angeimpft, wobei durch Erhitzen auf 120° C während 30 Min. sterilisiert wurde. In der 24. Fermentationsstunde erfolgte ein Zusatz von Sulfanilamid in einer Konzentration von 0,5 g/i. In der 48. Fermentationsstunde erfolgte ein weiterer Zusatz dieser Substanz in einer Konzentration von 1 g/l. Die Fermentation wurde bei 28° C unter Rühren bei 230 UpM durchgeführt und es wurde mit einem Luftstrom von 0,7 I/I Medium/Min, belüftet.

Die maximale Konzentration der aktiven Verbindungen wurde zwischen dem 6. und 7. Tag der Fermentation erreicht; Produktion 50 mcg/ml.

Beispiel 3

Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei jedoch keine Sulfanilamidzusätzs erfolgten. Die maximale Konzentration der aktiven Verbindungen wurde zwischen dem 6. und 7. Tag der Fermentation mit einer Produktion von 5 ir<:g/ml erzielt.

Beispiel 4

Die gesamte Brühe (30 I) von einer gemäß Beispiel 2 erzielten Fermentation wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert von etwa 4 eingestellt und unter Verwendung von 3%iger Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert, wobei ein Kuchen und ein Filtrat erhalten wurden, die getrennt extrahiert wurden.

Der nasse Filterkuchen wurde mit etwa 15 ml Methanol extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt und dann mit der filtrierten Brühe vereinigt. Die Mischung wurde auf einen pH-Wert von etwa 8,5 bis 9,0 eingestellt und dann zweimal mit einem halben Volumen Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Durch Zusetzen von 11 η-Hexan fiel die rohe glycosidische Fraktion als gelbbraunes Pulver (1,5 g) aus.

Beispiel 5

Eine Chloroformlösung der rohen Glycoside in Form der freien Basen (1,5 g in 30 ml) wurde auf eine mit M/15 Phosphatpuffer auf pH 7 gepufferte Silicagelsäule, hergestellt in Chloroform, aufgebracht. Die Säule *urde mit Chloroform gewaschen und mit einem Gradienten einer Chloroform-Methanol-Wassermischung eluiert.

Unter Verwendung einer 92,2 : 3,5 : 0,2-Mischung wurden einige gelbgefärbte Aglycone und danach das Antibiotikum Z eluiert. Die Eluierung mit einer 92,2 : 7,5 :0,3-Mischung ergab das Antibiotikum Y, die Eluierung mit einer 89,5 :10:0,5-Mischungdas Antibiotikum X, worauf das Antibiotikum W unter Verwendung einer 300 : 55 : 6-Mischung eluiert wurde. Die die reinen Komponenten enthaltenden Fraktionen wurden auf kleine Volumina eingeengt, mit Wasser verdünnt, auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9,0 eingestellt und dann mit Chloroform extrahiert. Nach Waschen mit Wasser wurden die organischen Extrakte auf Natriumsulfat getrocknet und dann auf ein kleines Volumen eingeengt. Der Zusatz eines Äquivalents an methanolischem Chlorwasserstoff ergab praktisch reine Hydrochloride des Antibiotikums Z (0,04 g), des Antibiotikums Y (0,2 g), des Antibiotikums X(0,02g) und des Antibiotikums W(0,03g)als mikrokristalline Pulver. Durch Umkristallisierender Antibiotika W, Y und Z aus Methanol : n-Butanol wurden die entsprechenden reinen Hydrochloride als gelborangefarbene Kristalle erhalten, Fp. 208 bis 210° C (Zers.) für das Antibiotikum W, Fp. 195 bis 196° C (Zers.) Tür das Antibiotikum Y und Fp. 200 bis 201° C (Zers.) für das Antibiotikum Z.

Claims

Patentansprüche: 1. 4-O-DesmeihyI-ll-desoxy-anthracyclingIycoside der allgemeinen Formel

mit nachstehend angegebenen Bedeutungen von R in Zuordnung zu den Verbindungen:

25

4-O-Desmethyl-I1-desoxy R

-doxorubicin —CO — CH₂—OH

-13-dihydrodaunorubicin —CH(OH)—CH₃

-daunorubicin —CO — CH3

-13-desoxodaunorubicin —CH₂—CH₃