DE1617451C2 - Antibiotika-Komplex aus Tenebrimycin I,I', II, III, IV, V und VI und ein Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen antibiotischen Tenebrlmycin-Komplex aus Tenebrimycin I, Γ, II, III, IV, V und VI mit der in Anspruch 1 angegebenen Kennzeichnung und ein Verfahren zu dessen Herstellung (Anspruch 2).

Der neuartige antibiotische Komplex umfaßt sieben einzelne Faktoren, von denen jeder antibiotische Aktivität aufweist. Der Komplex ist als freie Base in Wasser und in Dimethylsulfoxid löslich, langsam löslich in Methanol und unlöslich in Aceton, höheren Alkoholen, Dioxan, Äthylacetat, Diäthyläther, Acetonitril, Methyl-Isobutylketon und Kohlenwasserstoff-Lösungsmitteln. Der freie Basen-Komplex ist stabil bei Gefriertemperaturen, bei Zimmertemperatur und bei 37° C für die Dauer von wenigstens 8 Wochen Innerhalb eines pH-Bereiches von 1 bis 11.

Das Infrarotabsorptionsspektrum für den antibiotischen Komplex, das von einem Mineral-Mull desselben erhalten wird, geht aus Fl g. 1 hervor. Die unterscheidbaren Banden im Infrarotabsorptionsspektrum über einen Bereich von 2 bis 15 μίτι sind folgende: 3,02 (breit), 3,15, 5,82, 6,26, 7,43, 8,8 (breit) und 9,7 (sehr breit) μΐη.

In einer Reihe von chemischen Versuchen, die mit dem Komplex ausgeführt wurden, wurden positive Reaktionen bei den Ninhydrin-, Anthron- und Elson-Morgan-Tests erhalten. Der Lowry-Protein-Test ergab nur eine geringe positive Reaktion. Die Biuret- und Sakaguchl-Tests waren negativ.

Bei der hier angewandten Nomenklatur wird der Ausdruck Tenebrimycin verwendet, um den antibiotischen Komplex zu bezeichnen, während die verschiedenen Faktoren, die den Komplex bilden, als Tenebrimycin I, Tenebrimycin Γ, Tenebrimycin II, Tenebrimycin III,

ίο Tenebrimycin IV, Tenebrimycin V und Tenebrimycin VI bezeichnet werden. Bei dem Komplex, den man gewöhnlich erhält, kommt Tenebrimycin I, Tenebrimycin Γ und Tenebrimycin III in kleinen Mengen vor. Von den übrigen Tenebrimyclnen scheint das Tenebrimycin II weit zu überwiegen, das etwa 40 bis 50% des Komplexes, sowie Tenebrimycin V, das etwa 30% des Komplexes ausmacht. Tenebrimycin IV liegt zu etwa 15 bis 20% vor, Tenebrimycin VI macht nur etwa 10% des Komplexes aus. Die häufigeren Tenebrimycine wurden getrennt und bestimmt; In den folgenden Abschnitten werden ihre Eigenschaften beschrieben.

Tenebrimycin II ist eine weiße feste Substanz. Elektrometrische Titration in Wasser läßt titrierbare Gruppen mit pK'a-Werten von etwa 5,7, 6,7, 7,7 und 8,7 erkennen.

Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Tenebrimycin II als ein Mineralöl-Mull wird In Fig. 2 gezeigt. Die unterscheidbaren Banden im infraroten Absorptionsspektrum über den Bereich von 2 bis 15 um sind folgende:

3,02, 3,14, 6,05, 6,23, 7,4, 8,5, 8,75, 9,17, 9,65, 10,11, 11,15, 11,7 und 12,6 um.

Tenebrimycin II bildet eine Acetyl-Derivat, das eine spezifische Drehung [a] ² _D ^S von etwa +130° aufweist, wenn die Konzentration der Verbindung 1 Gew.-% auf das Öl, bezogen in wäßriger Lösung, beträgt. Das Derivat hat keine restlichen titrierbaren Gruppen. Die Elementar-Zusammensetzung zeigt, wie durch Mikroanalyse festgestellt wurde, daß 4 Acetylgruppen zur Struktur von Tenebrimycin II hinzugekommen sind.

Tenebrimycin IV ist eine basische Substanz mit titrierbaren Gruppen mit pK'a-Werten von etwa 5,3, 6,8, 7,8 und 9,0, wie die elektrometrische Titration in Wasser ergab. Die spezifische Drehung von Tenebrimycin IV, bestimmt für eine l%ige wäßrige Lösung bei 25° C, ist +114°.

Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Tenebrimycin IV als Mineralöl-Mull wird in Fig. 3 gezeigt.

Die unterscheidbaren Banden im Infrarotabsorptionsspektrum über den Bereich von 2 bis 15 um sind folgende: 3,05, 3,17, 5,85, 6,27, 7,46, 8,75, 9,7, 10,5, 11,1 und 12,85 um.

Das Tetraacetyl-Derivat von Tenebrimycin IV Ist ein

kristalliner Festkörper mit einem Schmelzpunkt von 265 bis 267⁰C. Die spezifische Drehung [α] ¹J ist +109°, wenn die Konzentration des Derivates 1% in wäßriger Lösung beträgt.

Die elektrometrische Titration von Tenebrimycin V zeigt titrierbare Gruppen mit pK'a-Werten von etwa 5,5, 7,0, 8,0 und 9,1. Die spezifische Drehung von Natrium D-Llcht durch eine l%lge wäßrige Lösung von dem Faktor, bei einer Temperatur von 25° C bestimmt, beträgt +118°.

Fig. 4 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum von Tenebrimycin V als Mineralöl-Mull mit unterscheidbaren Banden über den Bereich von 2 bis 15 um bei: 3,05, 3,19, 6,32, 7,45, 8,75, 9,7, 11,15 und 12,25 um.

Wie Tenebrimycin IV bildet Tenebrimycin V ein kristallines Tetraacetyl-Derivat. Das Derivat schmilzt unter

Stoffzerfall bei etwa 260° C und gibt eine spezifische Drehung [a] ²o von ungefähr + 109°, wenn die Konzentration der Verbindung 0,4296 Im Wasser beträgt.

Tenebrimycin VI weist titrierbare Gruppen mit pK'a-Werten von etwa 5,6, 7,2, 8,2 und 9,'3 auf, wie durch elektrometrische Titration in Wasser festgestellt wurde.

Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Tenebrimycin VI wird in Fig. 5 gezeigt. Die unterscheidbaren Banden über einen Bereich von 2 bis 15 μίτι sind folgende: 3,05, 3,19, 6,35, 7,47, 8,75, 9,8, 12,3 und 12,95 μπι.

Eine l%ige wäßrige Lösung des Tetraacetyl-Derivats von Tenebrimycin VI hat eine spezifische Drehung von etwa +95°, wenn sie bei 25° C in einer l%igen wäßrigen Lösung bestimmt wird. Säure-Additionssalze des Tenebrimycln-Komplexes oder der einzelnen antibiotischen Komponenten können durch herkömmliche Verfahren zubereitet werden. Es können entweder organische oder anorganische Säuren zur Salzbildung verwendet werden. Ein bequemes Verfahren zur Herstellung solcher Salze besteht in der Hinzufügung einer Lösung der salzbildenden Säure zu einer wäßrigen Lösung des Antibiotikums. Im Falle von unlöslichen Säure-Additionssalzen scheidet sich das Salz aus der Lösung ab und läßt sich leicht trennen mittels der herkömmlichen Arbeitsweisen, wie Filtration oder Zentrifugieren.

Sollte es vorkommen, daß das erwünschte Additionssalz nicht ohne weiteres ausfällt, kann man die Ausfäl lung fördern, indem man entweder die Lösung auf kleineres Volumen konzentriert oder ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel zugibt, wie Aceton oder dergleichen. Das Säure-Addltionssalz kann bequem wieder zur freien Basenform des Antibiotikums umgewandelt werden, indem man eine wäßrige Lösung des Salzes über ein anionisches Austauscherharz im Hydroxylkreislauf führt.

Die verschiedenen Faktoren, die den Tenebrimycin-

Komplex bilden, können untereinander und von anderen Antibiotika mit ähnlichen Eigenschaften durch papierchromatographische Verfahren unterschieden werden, wie z. B. durch das folgende: Die Chromatographie wurde in der herkömmlichen absteigenden Weise durchgeführt bei 23° C ± Γ auf Whatman Nr. 1 Papier vom Format 190 χ 464 mm.

Die Ergebnisse werden in Tabelle I gezeigt. Die Wanderungskonstante für jedes der angeführten Antibiotika drückt man besser mit einer ^-Konstante aus, als durch den herkömmlichen A₇-Wert. Der Λ,,-Wert drückt das Verhältnis der Entfernung, die vom Antibiotikum durchmessen wurde, in bezug auf das Blattende und nicht auf die Lösungsmittelfront aus.

Dies Verfahren, die Konstante auszudrücken, wurde gewählt Im Hinblick auf die Tatsache, daß die Lösungsmittelfront über das Blattende hinaus, während des Zeitraumes, der für die meisten Lösungsmittelsysteme angewandt wurde, vorgedrungen war.

Tabelle I

Papier-Chromatographie der Tenebrimycine und bekannter Antibiotika mit ähnlichen Eigenschaften

	Lösungsmittel-System 1	B	C	und R(i	-Werte	F	G
	A	—	—	D	E	0	0
Tenebrimycin-Komplex	—	-	-	0,65	0,32	—	—
Tenebrimycin I	0,20	-	-	—	—	—	—
Tenebrimycin Γ	0,27	0,17	0,32	—	—	—	—
Tenebrimycin II	0,40	0,34	0,41	—	-	—	—
Tenebrimycin III	0,40	0,20	0,32	-	-	—	-
Tenebrimycin IV	0,49	0,22	0,35	-	—	—	—
Tenebrimycin V	0,55	0,31	0,38	—	—	—	—
Tenebrimycin VI	0,71	0,35	0,41	—	—	0	0
Kanamycin	0,35	0,26 0,51	0,32 0,39	0,65	0,42	0	0,05
Kanamycin B	0,57	0,75 0,95	0,62	0,70	0,29	0	0,1
Centamycin	0,83	0,25	0,34	—	0,51	0	0
Catenulin	0,44	0,12	0,19	0,65	0,35	0	0,05
Neomycin	0,60	—	—

Die angewandten Lösungsmittelsysteme und die Dauer der Chromatographie sind unten angegeben.

A = n-Butanol mit Wasser gesättigt, plus 2% p-Toluol-

sulfonsäure, für 40 Stunden
B = 80% wäßriges Äthanol, plus 1,596 Natriumchlorid, für 40 Stunden, auf Papier gepuffert, mit 0,95 m

Sulfatbisulfat
C = Propanol, Pyridln, Essigsäure und Wasser (15: 10:3: 12) für 40 Stunden

D = Wasser mit Methylisobutylketon gesättigt, plus 196 p-Toluolsulfonsäure für 6 Stunden

E = Propanol und Wasser (1 : 1) für 24 Stunden auf Papier gepuffert mit 0,75 m Phosphat, pH 4,0

F = Butanol mit Wasser gesättigt, für 18 Stunden

G = n-Butanol mit Wasser gesättigt, plus 296 p-Toluolsulfonsäure und 2% Piperidin, für 18 Stunden.

Diese chromatographischen Daten zeigen folgendes: Während bei jedem einzelnen Lösungsmittelsystem

■ einige der Faktoren, die den Tenebrimycln-Komplex ausmachen, als untereinander identisch oder Identisch mit anderen bekannten Antibiotika erscheinen, beweist die Chromatographie mit einer Vielzahl von Lösungsmittelsystemen deutlich ihre Nicht-Identität.

Der Tenebrimycin-Komplex und die einzelnen Faktoren dieses Komplexes besitzen eine hemmende Wirkung auf das Wachstum von Mikroorganismen, die tierischem oder pflanzlichem Leben gegenüber pathogen sind. Die Hemm-Konzentrationen des Komplexes und der einzelnen Tenebrimycine gegen eine Anzahl von Organismen werden in der folgenden Tabelle gezeigt. Die Minimal-Hemm-Konzentrationen wurden durch das Agar-Ver-

Tabelle II

10 dünnungsverfahren bestimmt.

Der erfindungsgemäße Tenebrimycln-Komplex ist ein wirksames Breitspektrum-Antlblotikum und zeigt eine ausgezeichnete Aktivität gegen gram-negative Bakterien und Staphylococcen. Die akute und subakute Toxizität bei Ratten und Mäusen bei subkutaner, intraperltonealer und intravenöser Gabe ist geringer als die des Kanamycins und bedeutend geringer als die des Gentamycins und Neomycins.

Gegen zahlreiche Bakterien ist der Tenebrimycin-Komplex der Erfindung wirksamer als Kanamycin, was in günstigeren ED₅₀-Werten zum Ausdruck kommt.

Test-Organismus

minimale Hemmkonzentration (/ig/ml.)

Tenebrimycin- Tenebrimycin II Komplex^a) Tenebrimycin IV Tenebrimycin V Tenebrimycin VI

Staphylococcus aureus 3055 6,25

Bacillus subtilis < 1,56

Mycobacterium avium < 1,56

Streptococcus faecalis 6,25

Lactobacillus casei 25

Leuconostoc citrovorum 25

Escherichia coli No. 1 25

Escherichia coli No. 2 25

Proteus sp. No. 1 50

Proteus sp. No. 2 25

Pseudomonas sp. No. 2 25

Pseudomonas sp. No. 5 6,25

Klebsiella-Aerobacter No. 14 6,25

Klebsiella-Aerobacter No. 15 12,5

Salmonella sp. No. 1 25

Vibrio metschnikovii 12,5

Agrobacterium tumefaciens 50

Erwinia amylovora < 1,56

Pseudomonas solanacearum 25

Xanthomonas phaseoli 12,5

6,25	6,25
< 1,56	< 1,56
< 1,56 .	< 1,56
3,12	< 1,56
50	25
50	25
25	12,5
50	12,5
100	50
25	12,5
25	100
12,5	6,25
12,5	3,12
12,5	6,25
25	25
12,5	12,5
25	25
< 1,56	< 1,56
25	12,5
12,5	12,5

6,25

< 1,56

6,25

3,12
25
25
12,5
25
50
25
100

3,12
12,5
12,5
25

6,25
50

< 1,56
12,5

6,25

3,12

< 1,56

< 1,56

3,12 12,5 12,5 12,5 12,5 25 12,5

6,25

< 1,56 6,25 6,25

12,5 6,25 50

< 1,56 12,5

3,12

^a) Die minimale Hemmkonzentration für die einzelnen Tenebrimycine wurde bestimmt mit den freien Basen. Der Tenebrimycin-Komplex wurde als freies Sulfatsalz angewendet.

Die akute Toxizität des Tenebrimycln-Komplexes und der verhältnismäßig häufigeren Einzelbestandteile desselben wurde an Mäusen bestimmt.

Die LD₅₀-Werte für Tenebrlmyclnsulfat betragen ungefährt 300 mg/kg, wenn das Antibiotikum intravenös injlziert wird, und etwa 350 mg/kg, wenn die Droge intraperitonal verabreicht wird. Bei subkutanen Dosen von 750 mg/kg oder oralen Dosen von 5000 mg/kg überlebten alle Mäuse. Keine bemerkbare Reizung konnte beobachtet werden, wenn je das eine Auge von vier Kaninchen mit einem Tropfen einer 50%lgen wäßrigen Lösung von Tenebrimycinsulfat 3mal täglich 5 Tage lang behandelt wurde. Die LZ)₅₀-Werte, ausgedrückt In mg/kg der freien Base, für die einzelnen Tenebrimycine, die Mäusen Intravenös verabreicht wurden, sind folgende: Tenebrimycin II etwa 385, Tenebrimycin IV etwa 220, Tenebrimycin V etwa. 140 und Tenebrimycin VI etwa 120.

Der neuartige antibiotlsche Komplex der Erfindung wird hergestellt durch Züchtung von Streptomyces tenebrarlus ATCC 17 920 unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Züchtungsmedium, so lange bis dieses Medium wesentliche antlblotische Aktivität enthält. Das Tenebrimycin kann gewonnen werden durch Anwendung verschiedener Isollerungs- und Reinigungsmaßnahmen, die an sich aus dem Stand der Technik bekannt sind.

Der antlblotische Komplex kann als solcher angewandt, oder weiteren Reinigungsprozessen unterworfen werden, um seine verschiedenen Komponenten in höherem Reinheitsgrad zu Isolieren.

Der Organismus, der den antibiotlschen Komplex erzeugt, 1st ein spiralförmiger, hitzeertragender, aerober bis mikroaerophiler Streptomyces mit länglichen glattwandlgen Sporen. Er 1st Insofern einmalig, als er durch verhältnismäßig niedrige Intensitäten künstlichen Lichts

gehemmt wird. Wegen dieser seiner Eigenschaft wurde der neue Gattungsname Streptomyces tenebrarius sp. n. für diesen Organismus gewählt.

Der Organismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, indem Teile der Bodenprobe in sterilem destilliertem Wasser suspendiert und die Suspensionen auf Nähr-Agar ausgestrichen wurden. Die Einsaat-Nähr-Agarplatten wurden bei 25 bis 35° inkubiert, bis Wachstum sichergestellt war. Am Ende der Inkubationszelt wurden Kolonien der Antlbiotlkum-produzierenden Organismen mit einer sterilen Impföse aus Platin auf Schrägagar übertragen. Der Schrägagar wurde dann inkubiert, um geeignete Impfmengen für die Herstellung des Antibiotikums zu erhalten. Der Stamm des Organismus, der für die Herstellung des antibiotischen Komplexes verwendet wurde, ist für bei der American Type Culture Collection in Washington, D.C. hinterlegt worden unter der Kultur-Nummer: ATCC 17920.

Die bei den taxonomischen Versuchen über S. tenebrarius ATCC 17 920 angewandten Verfahren sind die gleichen, wie sie gewöhnlich bei der Taxonomie von Actinomyceten gehandhabt werden. Züchtungsmerkmale wurden nach 14tägiger Inkubation beobachtet. Die Morphologie wurde bestimmt auf Czapek's-Peptonager und Bennett's-Agar während einer 2- bis 7tägigen Inkubation. Wirkung auf Milch und die Reduzierung von Nitrat wurde nach 7 und 14 Tagen beobachtet, Schwefelwasserstoffproduktion nach 24 bis 28 Stunden und Kohlenstoff-Verwertung nach 10 Tagen. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Züchtungen bei 37° C inkubiert. Kohlenstoff-Verwertungsuntersuchungen wurden durchgeführt gemäß dem Verfahren, das von Pridham und Gottlieb, J. Bact., 56, 107 (1948) beschrieben wurde.

Die Ergebnisse der taxonomischen Versuche sind in den folgenden Abschnitten zusammengefaßt. Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf die Farbblocks nach Maerz und Paul, »Dictionary of Color«, McGraw Book Company, (1950). Die Farben, welche durch die Farbblocks versinnbildlicht werden, sind in die ISCC-NBS Farbnamen übertragen worden, wie sie im »Circular 553«, U.S. Department of Commerce, National Bureau of Standards, 1955, enthalten sind.

Mikroskopische Morphologie, Züchtungscharakteristika und Physiologie von S. tenebrarius ATCC 17 920

Morphologie:

Auf Czapek's Peptonagar bilden sich verzweigte Sporenformen in unregelmäßigen Klümpchen auf dem Luftmycel. Isolierte Sporen sind selten. Das intakte Luftmycel kann leicht vom Substrat gelöst werden. Reife Sporenketten bilden gewöhnlich 5 bis 6 offene Spiralen. Die Sporen sind länglich bis cylindrisch. Unter dem Elektronenmikroskop betrachtet erscheinen die Sporen glatt und messen 0,7 bis 1,3 zu 2,0 bis 2,1 Mikron. ScIerotlen wurden auf Bennett's-Medium beobachtet.

Kolonie-Merkmale auf:

Czapek's-Agar: Wachstumsmenge gering, Luftmycel dürftig; blaß orange-gelb (11-A2) Sporulatlon gut; Rückseite blaß orange-gelb (11-A2); Lösbares Pigment leicht rosa (1-Bl)

Czapek's Pepton: Wachstum reichlich; Luftmycel reichlich; hellgelbllchbraun mit weißen Stellen (11-A4); Sporulation reichlich; Rückseite hell-graurot (4-Hl); Lösbares Pigment graurosa (4-Bl)

Calciummalat-Agar: Wachstum mäßig, Luftmycel mäßig, blaß orangegelb (11-A2). Sporulatlon mäßig; Rückseite grau-rosa (4-Dl); lösliches Pigment grau-rosa (4-Bl).

Tyrosin-Agar: Wachstum spärlich, Luftmycel spärlich; blaß orange-gelb (9-B2); Rückseite blaß rotgelb (10-B3); spärliche Sporulation. Kein lösliches Pigment.

Anorganische Salze-Stärke-Agar: Wachstum mäßig, Luftmycel mäßig bräunlich-rosa mit weißen Stellen (11-A4). Sporulation reichlich; Rückseite blaß gelb (11-B2); lösliches Pigment blaß gelb (11-B2).

Glucose-Asparagin-Agar: Wachstum mäßig, Luftmycel mäßig, blaß gelb (9-D2) mit weißen Stellen (10-Al), mäßige Sporulation; Rückseite blaß gelb (11-B2) kein lösliches Pigment.

Tomantenmark-Hafermehl: Wachstum reichlich, Luftmycel reichlich, hell-gelblichbraun (12-B5); reichliche Sporulatlon; Rückseite dunkel grau-rötlichbraun (48-J2); lösliches Pigment dunkel-purpurrot (47-H1).

Hefeextrakt: Reichliches Wachstum, reichliches Luftmycel, blaß orange-gelb (11-A2) mit weißen Stellen; reichliche Sporulation; Rückseite mäßig gelb (11-J6); kein lösliches Pigment.

Nähragar: Wachstum dürftig, dürftiges weißes (10-Al) Luftmycel; dürftige Sporulation; Rückseite grau-grünlich-gelb (12-12); kein lösliches Pigment.

Bennett's Agar: Wachstum mäßig; mäßig weißes ..(10-Al bis 10-Bl) Luftmycel; mäßige Sporulatlon; Rückseite blaß gelb (11-C2); kein lösliches Pigment.

Wirkung auf Milch: dunkel-gelber Wachstumsring an der Oberfläche; Koagulierung und Peptonisation beobachtet.

Nitratreduktion: Positiv.
H₂-Produktion: Negativ.

Nährgelatine - völlige Verflüssigung nach 14 Tagen.

Temperatur-Erfordernisse für Czapek's Peptonagar:

20° C Kein Wachstum

26° C gutes Wachstum, kein Luftmycel

30° C Wachstum und Luftmycel mäßig, aber keine

Sporulation

37° C Wachstum, Luftmycel und Sporulation sehr reichlich

43° C Wachstum, Luftmycel und Sporulation sehr

reichlich
50° C Wachstum, Luftmycel und Sporulation sehr

reichlich

55° C Spärliches Wachstum
60° C Kein Wachstum

Thermaler Totpunkt: Sporen von einer Sporen-Suspension auf 75° C erhitzt bleiben 15 Min. lang lebensfähig. Wurde die Sporen-Suspension auf 100° C 15 Min. lang erhitzt, waren keine Sporen mehr lebensfähig.

Sauerstoff-Spannung: Wachstum entweder aeroblsch oder mikroaerophll In Stickkulturen.

Elsenionen-Effekt: Ein rotes lösliches Pigment wird nur bei Vorhandensein von Elsen(III)ionen produziert

und die Intensität der Pigmentation ist proportional zur Konzentration der Eisen(III)lonen in einem gegebenen Bereich.

Effekt der Wasserstpff-Ionenkonzentratlon auf Czapek's Peptonagar: Kein Wachstum unter pH 5,0; von pH

5,0 bis 6,0 Wachstum und Luftmycel gut; Wachstum und Sporulation sind bei pH 7,0 reichlich; von ph 8,0 bis 8,6 sind Wachstum und Luftmycel gut. Das lösliche Pigment ist am Intensivsten bei pH 5,0 bis 6,0 und ist gering bis nicht vorhanden von pH 6,5 bis 8,6.

Lichtreaktion, beobachtet auf Czapek's-Agar: Wachstum und Sporulatlon sind Im Dunkel reichlich. Wenn Platten-Züchtungen 38 cm entfernt von einer 15-Watt-Standard-Fluorescenz-Kaltlichtquelle inkubiert werden,

Ist das Wachstum spärlich und kein Luftmycel vorhanden. Wachstum und Luftmycel sind mäßig, wenn die Züchtungen 38 cm von einer gekühlten mattierten 60-Watt-Wolfram-Glühlampe inkubiert werden.

In der Tabelle, welche die Ergebnisse der Kohlenstoff-Verwertungs-Versuche zusammenfaßt, die mit S. tenebrarius ATCC 17 920 durchgeführt wurden, haben die verwendeten Zeichen folgende Bedeutung:

10

15

20

25

30

35

S. tenebrarius ATCC 17 920 erzeugt zusätzlich zu Tenebrimycin das bekannte antifungale Antibiotikum Caerulomycin, das auch erzeugt wird von Streptomyces caeruleus [Cand. J. Microbiol. 5, 317 (1959)]. Untersuchung einer Züchtung des letztgenannten Organismus ergab, daß er keine Tenebrimycin erzeugt unter den Bedingungen, die für seine Züchtung beschrieben wurden; auch unter veränderten Bedingungen kann er nicht dazu Induziert werden.

Zur Herstellung von Tenebrimycin dienen zweckmäßigerweise Züchtungsmedien, die relativ einfache Nährquellen enthalten. Zum Beispiel enthalten Medien, die für die Produktion von Tenebrimycin brauchbar sind, eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, wie Glucose, Fructose, Mannose, Maltose, Stärke und dergleichen. Eine besonders bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Glucose. Außerdem enthalten die verwendbaren Medien eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie Peptone, hydrolysiertes Casein, Hefe, Aminosäuren und dergleichen. Im vorliegenden Falle werden als Stickstoff quellen bevorzugt: Pepton, hydrolysiertes Casein und Glutamin.

Mineralsalze, z. B. diejenigen, welche Calcium-, Magnesium-, Natrium-, Kalium-, Chlorid-, Sulfat-, Phosphat- und Carbonat-Ionen liefern, können mit gutem Erfolg den Medien einverleibt werden, wenngleich ein Überschuß an Phosphat vermieden werden sollte, da er die Ausbeute an Antibiotikum herabzusetzen scheint. Eine Quelle von Wachstumsfaktoren, wie Hefe oder Hefeextrakt, kann ebenfalls mit guter Wirkung dem Medium zugefügt werden.

Wie es für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen nötig Ist, sollten auch wichtige Spu

+ = positiv (+) = wahrscheinlich (-) = fraglich - = keine (nichts)	S. tenebrarius Stamm
Tabelle III	Kohlenstoff- An quelle sprechen
Kohlenstoffverwertung von ATCC 17920	DH Trehalose +
Kohlenstoff- An quelle sprechen	L(+) Raffinose -
L(+) Arabinose —	Cellulose -
L(H-) Rhamnose -	Inulin (—)
DH Ribose +	i-Inosit +
D(+) Xylose -	Mannit —
D(-) Fructose +	d-Sorbit (-)
D(+) Mannose +	Salicin (+)
D(+) Glucose +	Kontrolle (—) (kein Kohlenstoff)
Lactose (—)
Maltose +
Saccharose (+)

renelemente dem Züchtungsmedium zugesetzt werden zur Förderung des Wachstums des erfindungsgemäß angewendeten Organismus. Solche Spurenelemente sind meistens als Verunreinigungen vorhanden, als zufällige Begleitstoffe beim Zusatz der anderen Bestandteile des Mediums.

Submerse aerobe Züchtungsbedingungen sind für die Produktion von Tenebrimycin speziell bevorzugt. Für die Herstellung relativ kleiner Mengen können Schüttelkolben und Oberflächenkulturen verwendet werden. Für die Herstellung großer Mengen jedoch ist die submerse aerobe Züchtung In sterilen Behältern vorzuziehen. Das Medium im sterilen Behälter kann mit einer sporulierten Suspension beimpft werden, aber wegen der Wachstumsverzögerung, die man bei Verwendung einer sporulierten Suspension als Inoculum festgestellt hat, wird die vegetative Form der Kultur bevorzugt. So vermeidet man die Wachstumsverzögerung und erreicht eine wirkungsvolle Ausnutzung der Fermentationsvorrichtungen. Dementsprechend ist es ratsam, zuerst ein vegetatives Inoculum des Organismus durch Beimpfung einer verhältnismäßig geringen Menge des Züchtungsmediums mit der Sporenform des Organismus herzustellen, und dann, wenn ein junges aktives Vegetativ-lnoculum erhalten wurde, dieses vegetative Inoculum steril in den großen Behälter zu überführen. Zweckmäßig wird ein Bruchteil des vegetativen Inoculums, etwa 4% der Masse des Mediums, in das es eingeführt wird, verwendet. Das Fermentationsmedium, in dem das vegetative Inoculum hergestellt wird, kann entweder gleich oder verschieden von dem Medium sein, welches für die großtechnische Produktion von Tenebrimycin verwendet wurde.

Der Organismus wächst innerhalb eines relativ weiten Temperaturbereichs. Dennoch scheinen die Organismen am besten bei Temperaturen zwischen 30 und 50° C zu wachsen. Eine optimale Produktion von Tenebrimycin erfolgt bei Temperaturen zwischen 37 und 43° C. Der Organismus, der Tenebrimycin erzeugt, Ist lichtempfindlich und wächst bei dessen Vorhandensein nur schlecht.

Somit sind Fermentationen, bei welchen dieser Organismus verwendet wird, möglichst ohne sichtbares Licht auszuführen.

Übereinstimmend mit der bei submersen Züchtungsvorgängen gebräuchlichen Praxis wird sterile Luft durch das Züchtungsmedium geleitet. Zu einem wirkungsvollen Wachstum der Organismen und Tenebrimyclnherstellung beträgt das Luftvolumen bei der Tank-Produktion von Tenebrimycin über 0,1 Volumen Luft pro Minute pro Volumen des Züchtungsmediums, liegt aber vorzugsweise wesentlich höher. Wirkungsvolles Wachstum der Organismen und optimale Ausbeuten an Tenebrimycin erhält man, wenn die verwendete Luftmenge wenigstens ein Volumen Luft pro Minute pro Volumen Züchtungsmedium beträgt.

Die Konzentration von Tenebrimycln-Aktivltät im Fermentationsmedium kann bequem verfolgt werden während des Ablaufs der Fermentation, indem man Proben des Züchtungsmediums auf Ihre hemmende Aktivität gegenüber dem Wachstum von Organismen hin prüft, die dafür bekannt sind, daß sie In Gegenwart von Tenebrimycin gehemmt werden. Zwei der Organismen, die so bei der Verfolgung der Produktion von Tenebrimycin angewandt wurden, sind Klebslella pneumoniae und Mycobacterium butyricum.

Der erstere Organismus wird hauptsächlich bei der wohlbekannten Trübungsmessung verwandt, während der letztere beim Schalen-Platten-Verfahren verwertet wird.

Im allgemeinen tritt Maximalproduktion des Antibiotikums innerhalb von 4 bis 7 Tagen nach der Beimpfung des Züchtungsmediums ein, wenn submerse aerobe Züchtung oder Schüttelkolben-Züchtung angewandt wird, und nach einer etwas längeren Zelt, wenn wie selbstverständlich auch möglich, Oberflächenkulturen benutzt wurden.

Das Mycel und unaufgelöste Rückstände werden von der Fermentationsflüssigkeit durch herkömmliche Mittel, wie Filtration oder Zentrifugierung entfernt. Die antiblotlsche Aktivität ist in der gefilterten Flüssigkeit enthalten und kann daraus gewonnen werden durch Anwendung von Adsorptionsverfahren. Die Adsorptionsmittel sind die Kationen-Austauscherharze vom Typ IRC-50 (schwach saures Polymethacrylat-carbonsäure-Harz).

Im allgemeinen 1st das Verfahren zur Gewinnung des Tenebrimycins aus der Fermentationsflüssigkeit folgendes: Die gesamte Flüssigkeit wird filtriert mit einem Filterhilfsmittel, nachdem der pH-Wert der Mischung auf etwa pH 2 gesenkt wurde durch Zusatz einer Säure, wie Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoff und dergleichen. Der pH-Wert des Filtrats wird auf einen Wert von etwa 5,5 eingestellt durch Zusatz einer konzentrierten Base, und dann wird die Mischung noch einmal filtriert. Das Filtrat wird durch eine Ionenaustauschersäule geführt, die mit IRC-50 im Ammonium-Kreislauf gepackt ist. Die Säule wird dann mit destilliertem Wasser gewaschen und die antibiotische Aktivität mit verdünnter Säure eluiert. Die Fraktionen, welche die antibiotische Aktivität enthalten, werden vereinigt und auf ungefähr Y₂O des ursprünglichen Volumens konzentriert. Der pH-Wert des Konzentrats wird erhöht auf etwa 11 durch Zusatz von konzentrierter Base, und das basische Konzentrat wird dann in etwa 6 Volumen Aceton gegossen, gut gemischt und gekühlt. Der mikrobiologisch Inaktive Niederschlag, der sich abtrennt, wird durch Filtration entfernt. Der pH-Wert des Filtrats wird auf etwa 3,5 gesenkt durch Zusatz von 20%iger Schwefelsäure unter gründlichem Mischen. Der Tenebrimycin-Komplex fällt aus in Form des Sulfatsalzes, während das Caerulomycin als Nebenprodukt der Fermentation in der überstehenden Schicht zurückbleibt, die verworfen wird. Das Tenebrimycinsulfat wird in einer möglichst kleinen Wassermenge aufgelöst und die wäßrige Lösung durch eine Dowex 1 χ 1 Säule geschickt (Dowex 1 χ 1 ist ein Styrol-Divinylbenzol [1%]-Polymeres mit quaternären Ammoniumgruppen). Der wäßrigen Lösung von Tenebrimyclnsulfat auf der Säule folgt destilliertes Wasser, und der Abfluß aus der Säule wird in Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegeben, zu einem schweren Syrup konzentriert und schließlich getrocknet, wobei sich die freie Basenform des Tenebrimycins ergibt.

Beispiel

a) Herstellung des Tenebrimycin-Komplexes
■ durch Fermentation von S. tenebrarlus ATCC 17 920

Eine sporullerte Kultur von S. tenebrarius ATCC 17 920 wird erzeugt, indem man den Organismus auf einem modifizierten Bennett's-Schräg-Agar-Medium wachsen läßt, das die folgende Zusammensetzung hat:

Dextrin 10
Hefe-Extrakt 1

hydrolisiertes Casein 2

Fleischextrakt 1

CoCl₂ · 6H₂O 0,01 g

g
g
g
g

ausgewaschener Agar 20 g

deionisiertes Wasser, auf 1000 ml

Der pH-Wert des Mediums wird vor dem Autoklavieren auf pH 7 eingestellt. Der Schrägagar wird beimpft mit Sporen von S. tenebrarius ATCC 17 920 und fünf Tage lang bei 37° C und ohne sichtbares Licht inkubiert. Das Wachstum auf dem Schrägagar wird mit Wasser bedeckt und vorsichtig abgeschabt, um die Sporen zu entfernen

to und eine wäßrige Sporensuspension zu erhalten.

Die so erzielte Sporensuspension wird zur Beimpfung von 800 ml eines Mediums verwendet, das folgende Zusammensetzung hat:

Dextrose 0,05 %

is Nährmehl

(enthält 35-45 %

dirspergierbares Protein) 1,5 % Dextrin 700
(Kartoffeldextrin mit
niedrigem Chlorgehalt) 1 % Kaliumchlorid 0,1 %

hydrolysiertes Casein 0,3 % KH₂PO₄ 0,05 %

MgSO₄ · 7H₂O 0,5 %

CaCl₂ - 2H₂O 0,025 %

deionisiertes Wasser

Das beimpfte vegetative Medium wird bei 37° C 16 Stunden lang auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung inkubiert, die mit 250 U.p.M. arbeitet und einen Hub von 63,5 mm hat.

Ein 50 ml-Anteil der vegetativen Züchtung wird verwendet, um einen 44 1 Einsaatbehälter zu beimpfen, der ein wäßriges Medium der folgenden Zusammensetzung enthält:

Dextrose 1 %

Sojabohnenkömer 1,5 %

KH₂PO₄ 0,05 %

MgSO₄ 0,5 %

KCl 0,1 %

CaCl₂ · 2H₂O 0,025 %

Antischaummittel 0,025 %

Das Medium des Einsaatbehälters wird bei 120° C etwa 30 Minuten lang sterilisiert. Das Rühren mit einer Geschwindigkeit von 370 U.p.M. beginnt man unmittelbar nach der Beimpfung, und eine Belüftung mit einem Durchsatz von 0,0226 m³ pro Minute wird während der ganzen Inkubationszelt aufrechterhalten. Nach Beendlgung der Inkubationsperlode wird der Inhalt des Einsaatbehälters dazu verwendet, einen 1130-Llter-Fermenter zu beimpfen, der ein Medium folgender Zusammensetzung enthält:

Dextrose 4,0 %

raffiniertes Sojabohnenöl 3,0 %

Sojamehl 3,0 %

NH₄Cl 0,5 %

CaCI₂ 0,3%

MgSO₄ 0,2 %

NH₄NO₃ 0,1 %

hydrolysiertes Casein 0,5 % Antischaummittel 0,2 %

deionisiertes Wasser

Vor der Beimpfung wird das Fermentationsmedium 30 Minuten lang bei 12O⁰C sterilisiert. Die Fermentation wird durchgeführt bei 37° C unter Belüftung mit einem Durchsatz von 0,48 m³ pro Minute während der gesam-

ten Zeit von der Beimpfung an bis zur Ernte. Das Rühren wird mit 125 U.p.M. begonnen und bis zu 180 U.p.M. nach 12 Stunden gesteigert. Die Fermentation wird 5 Tage lang fortgesetzt. Die fermentierte Züchtungsflüssigkeit wird abfiltriert, um das Mycel und andere unaufgelöste Feststoffe zu entfernen. Die filtrierte Flüssigkeit enthält Tenebrimycin in einer Konzentration von 680 Einheiten pro ml.

b) Isolierung des Tenebrlmycln-Komplexes

10

Der pH-Wert von 880 Litern antibiotischer Fermentationsflüssigkeit, wie vorstehend beschrieben gewonnen, wird auf etwa pH 2 gesenkt durch Zusatz von ungefähr 10 bis 20 Litern 2O96Iger wäßriger Schwefelsäure.

Nachdem 45 kg eines handelsüblichen Filtrierhilfsmittels der angesäuerten Flüssigkeit zugesetzt wurden, wird gründlich durchgemischt und filtriert. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen und die Waschlösung dem Filtrat zugesetzt.

Der pH-Wert des Filtrats wird auf pH 5,5 eingestellt durch Zusatz von 50%igem wäßrigen Natriumhydroxid. Etwa 4 kg eines handelsüblichen Filtrierhilfsmittels wird zugesetzt und die Mischung gründlich gerührt und filtriert. Das Filtrat wird durch eine IRC-50-Säule mit den Abmessungen von 10,2 cm zu 1,83 m geschickt. Die Säule wird mit dem Harz im Ammonium-Kreislauf bis zu einer Betthöhe von 112 bis 114 mm gepackt. Nachdem das gesamte Filtrat die Säule durchlaufen hat, wird diese mit etwa 200 Litern destillierten Wassers gewaschen. Die antibiotische Aktivität wird dann während eines Zeitraums von 12 bis 15 Stunden mit etwa 150 bis 175 Litern 0,1 η Schwefelsäure eluiert und das Eluat in 10-Liter-Fraktionen abgenommen. Antibiotische Aktivität ist im Eluat erkennbar, wenn dessen pH-Wert auf etwa pH 4 oder wenig darunter absinkt.

Während die Elution fortschreitet, fällt der pH-Wert des Eluats weiter, bis er einen Wert von etwa pH 1,5 erreicht. Die Fraktionen, welche antibiotische Aktivität enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa '/20 des Originalvolumens konzentriert.

Der pH-Wert des konzentrierten Eluats wird auf pH 11 eingestellt durch Zusatz von 50%igem wäßrigen Natriumhydroxid, und das basische Konzentrat wird dann zu 6 Volumeneinheiten Aceton hinzugefügt. Die Mischung wird gekühlt und abgestellt, damit sich der Niederschlag ohne antibiotische Aktivität abtrennt. Die Mischung wird filtriert und der Filterkuchen, der inaktiven Niederschlag enthält, wird mit Wasser gewaschen und verworfen.

Der pH-Wert des Filtrats wird auf pH 3,5 unter gründlicher Vermischung des Zusatzes von 20%iger wäßriger Schwefelsäure eingestellt. Der Tenebrimycin-Komplex scheidet sich als Sulfat während der Behandlung aus und wird praktisch völlig abgeschieden, wenn der pH-Wert der Lösungen 4 oder einen geringfügig darunger liegenden Wert erreicht. Die Mischung wird filtriert und das Filtrat, das Caerulomycin als Nebenprodukt der Fermentation enthält, wird verworfen. Der Filterkuchen, der das Tenebrimycinsulfat enthält, wird in einer möglichst geringen Menge Wasser gelöst und gekühlt. Alle Festbestandteile, die sich nicht leicht auflösen, werden verworfen, wie z. B. sämtliche Feststoffe, die während des Abkühlens ausfallen oder auskristallisieren. Die klare Lösung des Tenebrimycinsulfats wird über ein Dowex 1 χ 1-Harz-Bett von 10,2 cm zu 2,13 m im basischen Kreislauf geführt. Die antibiotische Lösung wird auf die Säule gegeben und nachfolgend 40 bis 50 Liter destillierten Wassers. Der Abfluß wird in 10-Liter-Fraktionen abgenommen, die aktiven Fraktionen werden zusammengegeben und unter Vakuum zu einem dicken Syrup konzentriert, der getrocknet wird und das trockene Tenebrimycin, d. h. den erfindungsgemäßen Tenebrimycin-Komplex ergibt.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Antibiotika-Komplex aus Tenebrimycin I, I', II, III, IV, V und VI, gekennzeichnet durch folgende Parameter: löslich als freie Base in Wasser und Dimethylsulfoxid, langsam löslich in Methanol und unlöslich in Aceton, höheren Alkoholen, Dioxan, Äthylacetat, Diäthyläther, Acetonitril, Methylisobutylketon und Kohlenwasserstoff-Lösungsmitteln, als freie Base stabil bei Gefriertemperaturen, bei Zimmertemperatur und bei 37° C für die Dauer von wenigstens 8 Wochen innerhalb eines pH-Bereichs von 1 bis 11, die unterscheidbaren Banden im Infrarot-Absorptionsspektrum über einen Bereich von 2 bis 15 um sind folgende: 3,02 (breit), 3,15, 5,82, 6,26, 7,43, 8,8 (breit) und 9,7 (sehr breit) um, positive Reaktion bei den Ninhydrin-, Anthron- und Elson-Morgan-Tests, beim Lowry-Protein-Test geringe positive Reaktion und negative Reaktion beim Biuret- und Sakaguchi-Test.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotika-Komplexes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces tenebrarius ATCC 17 920 in einem Medium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter aeroben Bedingungen submers züchtet, dann die auf pH 2 eingestellte Fermentationsflüssigkeit mit einem Filterhilfsmittel filtriert, das auf pH 5,5 eingestellte Filtrat nach einer Filtration durch eine Ionenaustauschersäule führt, die mit IRC-50 im Ammonium-Kreislauf gepackt ist, dann mit verdünnter Säure eluiert, die die antibiotische Aktivität enthaltenden Fraktionen vereinigt und konzentriert, den pH-Wert des Konzentrats auf 11 einstellt und das basische Konzentrat in Aceton gießt und kühlt, den entstandenen inaktiven Niederschlag durch Filtration ehtfernt'und den pH-Wert des Filtratsi auf '3,5·■ senkt" 'durch Zusatz von 20%iger Schwefelsäure zur Ausfällung des Antibiotika-Komplexes als Sulfatsalz.