Verfahren zur Herstellung von Tenebrimycin
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des antibiotischen Tenebrimycins, das in die Komponenten Tenebrimycin I, I', II, III, IV, V, VI oder ihre Mischungen zerlegt werden kann. Tenebrimycin, dessen Komponenten sowie auch ihre Mischungen können in pharmazeutisch annehmbare Salze überführt werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man in Abwesenheit von sichtbarem Licht einen Tenebrimycin produzierenden Stamm eines Streptomyces tenebrarius Mikroorganismus in einem Züchtungsmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter aeroben Bedingungen submers züchtet, bis eine wesentliche Menge des gewünschten Antibiotikums durch den Mikroorganismus im Züchtungsmedium hergestellt worden ist.
Das neue antibiotische Tenebrimycin, hergestellt durch das erfindungsgemässe Verfahren, kann in wenig- stens sieben Faktoren, von denen jeder antibiotische Aktivität aufweist, zerlegt'werden. Das Tenebrimycin, als freie Base, ist in Wasser und in Dimethyl-Sulfoxid löslich, langsam löslich in Methanol und unlöslich in den meisten anderen organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, höheren Alkoholen, Dioxan, Äthylacetat, Diäthyläther, Acetonnitril, Methylisobutylketon und Kohlenwasserstoff-Lösungsmitteln. Die freie Base ist stabil bei Gefriertemperaturen, bei Zimmertemperatur und bei 37 "C für die Dauer von wenig stens 8 Wochen innerhalb eines pH-Bereiches von 1-11.
Das infrarote Absorptionsspektrum für das antibiotische Tenebrimycin, das von einem Mineralöl-Mull desselben erhalten wird, geht aus Fig. 1 hervor. Die unterscheidbaren Banden im Infrarot-Absorptionsspektrum über einen Bereich von 2-15 Mikron sind folgende:
3,02 (breit), 3,15, 5,82, 6,26, 7,43, 8,8 (breit) und 9,7 (sehr breit) Mikron.
In einer Reihe von chemischen Versuchen, die mit Tenebrimycin ausgeführt wurden, konnte man positive Reaktionen bei den Ninhydrin-, Anthron- und Elson-Morgan Tests erhalten. Der Lowry-Protein-Test ergab nur eine geringe positive Reaktion. Die Biuret- und Sakaguchi-Tests waren negativ.
Wie schon oben erwähnt, umfasst das antibiotische Tenebrimycin mindestens sieben ausgeprägte Faktoren.
Bei der hier angewandten Nomenklatur wird der Ausdruck Tenebrimycin verwendet, um einen antibiotischen Komplex zu bezeichnen, während verschiedene andere Faktoren, die den Komplex bilden, als Tenebrimycin I, Tenebrimycin 1', Tenebrimycin II, Tenebrimycin III, Tenebrimycin IV, Tenebrimycin V und Tenebrimycin VI bezeichnet werden. Bei dem Tenebrimycin, das man erfindungsgemäss erhält, kommen Tenebrimycin I, Tenebrimycin I' und Tenebrimycin III insbesondere in kleinen Mengen vor. Von den übrigen Tenebrimycinen scheint das Tenebrimycin II weit zu überwiegen, das etwa 40-50 0/0 des Tenebrimycins, sowie Tenebrimycin V, das etwa 30 % des Tenebrimycins ausmacht. Tenebrimycin IV liegt zu etwa 15-20 0/0 vor, Tenebrimycin VI macht nur etwa 10 0/0 des Tenebrimycins aus.
Die häufigeren Tenebrimycine konnten getrennt und bestimmt werden; in den folgenden Abschnitten werden ihre Eigenschaften beschrieben.
Tenebrimycin II ist eine weisse feste Substanz. Elektronische Titration in Wasser lässt das Vorkommen titrierbarer Gruppen mit pK'a-Werten von etwa 5,7, 6,7, 7,7 und 8,7 erkennen. Die spezifische Drehung von Natrium-D Licht bei einer Temperatur von 25 "C durch diesen Faktor beträgt 162,5 , wenn die Konzentration des Antibiotikums 1 Gew.-0/o, auf das Volumen bezogen, in wässeriger Lösung beträgt. Die Mikroanalyse zeigt an, dass die Zusammensetzung des Tenebrimycins II prozentual annähernd folgende ist: C 46,47, H 7,99, N 13,05, O 32,29 (direkt). Das scheinbare Molekulargewicht nach den Titrierdaten beträgt ungefähr 451. Die empirische Formel, die diesen Daten am besten entspricht, ist C21H43N4Ol.
Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Tenebrimycin II als ein Mineralöl-Mull wird in Fig. 2 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt. Die unterschiedlichen Banden im infraroten Absorptionsspektrum über den Bereich von 2-15 Mikron sind folgende: 3,02, 3,14, 6,05, 6,23, 7,4, 8,5, 8,75, 9,17, 9,65, 10,11, 11,15, 11,7 und 12,6 Mikron.
Tenebrimycin II bildet gewöhnlich ein Acetyl-Derivat, das eine spezifische Drehung Ial2D5von etwa +1300 aufweist, wenn die Konzentration der Verbindung 1 Gew.-0/o auf das Öl bezogen in wässeriger Lösung beträgt. Das Derivat hat keine restlichen titrierbaren Gruppen. Die Elementar-Zusammensetzung zeigt, wie durch Mikroanalyse festgestellt wurde, dass 4 Acetylgruppen zur Struktur von Tenebrimycin II hinzugekommen sind.
Tenebrimycin IV ist eine basische Substanz mit titrierbaren Gruppen mit pK'a-Werten von etwa 5,3, 6,8, 7,8 und 9,0, wie elektrometrische Titration in Wasser ergab. Die spezifische Drehung von Tenebrimycin IV, bestimmt für eine 10/obige wässerige Lösung bei 25 "C ist +1140. Die Mikroanalyse zeigt die folgende Prozentual-Zusammensetzung für Tenebrimycin IV: C 41,66, H 7,78, N 15,02, 0 34,93 (direkt). Das scheinbare Molekulargewicht, aus den Titrationsdaten bestimmt, beträgt etwa 478. Diese Daten legen für Tenebrimycin die empirische Formel C,6H,N,O,, nahe.
Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Tenebrimycin als Mineralöl-Mull wird in Fig. 3 der Zeichnungen gezeigt.
Die unterscheidbaren Banden im infraroten Absorptionsspektrum über den Bereich von 2-15 Mikron sind folgende: 3,05, 3,17, 5,85, 6,27, 7,46, 8,75, 9,7, 10,5, 11,1 und 12,85 Mikron.
Das Tetraacetyl-Derivat von Tenebrimycin IV ist ein kristalliner Festkörper mit einem Schmelzpunkt von 265-267 "C. Die spezifische DrehungIal2D5ist +109 ", wenn die Konzentration des Derivates 1 % in wässriger Lösung beträgt. Elektrometrische Titration von Tenebrimycin V zeigt titrierbare Gruppen mit pK'a-Werten von etwa 5,5 7,0, 8,0 und 9,1. Die spezifische Drehung von Natrium-D Licht durch eine 1 /Oige wässrige Lösung von dem Faktor, bei einer Temperatur von 25 "C bestimmt, beträgt +118 .
Die Elementarzusammensetzung, wie durch Mikroanalyse festgestellt, ist folgende: C 41,05; H 7,60; N 13,62; 0 36,76 (direkt). Die analytischen Daten und das scheinbare Molekulargewicht von 424 gemäss den Titrationsdaten legen eine empirische Formel für Tenebrimycin von Cl4H32N4Olo nahe.
Fig. 4 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum von Tenebrimycin V als Mineralöl-Mull mit unterscheidbaren Banden über den Bereich von 2-15 Mikron, wie folgt: 3,05, 3,19, 6,32, 7,45, 8,75, 9,7, 11,15 und 12,25 Mikron.
Wie Tenebrimycin IV bildet Tenebrimycin V ein kri: stallines Tetraacetyl-Derivat. Das Derivat schmilzt unter Zersetzung bei etwa 260 "C und gibt eine spezifische Drehung lalD5 von ungefähr +109 , wenn die Konzentration der Verbindung 0,42 % im Wasser beträgt.
Tenebrimycin VI weist titrierbare Gruppen mit pK'a Werten von etwa 5,6 7,2 8,2 und 9,3 auf, wie durch elektrometrische Titration in Wasser festgestellt wurde. Die Titrationsdaten legen ein scheinbares Molekülgewicht von 467 nahe. Die spezifische Drehung von Natrium-D-Licht durch 10/obige wässrige Lösung von Tenebrimycin VI bei 25 "C ist +131". Die Mikroanalyse zeigt, dass die Zusammensetzung prozentual annähernd folgende ist: C 44,3; H 8,1; N 14,3; 0 32,8 (direkt). Die empirische Formel Cl8H37Nso9H2o steht mit obigen Daten im Einklang.
Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Tenebrimycin VI wird in Fig. 5 der Zeichnungen gezeigt. Die unterscheidbaren Banden über einen Bereich von 2-15 Mikron sind folgende: 3,05, 3,19, 6,35, 7,47, 8,75, 9,8, 12,3 und 12,95 Mikron.
Eine 10/oige wässrige Lösung des Tetraacetyl-Derivats von Tenebrimycin VI hat eine spezifische Drehung von etwa +95 , wenn sie bei 25 "C in einer 10/obigen wässrigen Lösung bestimmt wird.
Säure-Additionssalze von Tenebrimycin oder von dessen einzelnen antibiotischen Komponenten können durch herkömmliche Verfahren zubereitet werden. Es können entweder organische oder anorganische Säuren zur Salzbildung verwendet werden. Ein bequemes Verfahren zur Herstellung solcher Salze besteht insbesondere in der Hinzufügung einer Lösung der salzbildenden Säure zu einer wässrigen Lösung des Antibiotikums. Im Falle von unlöslichen Säure-Additionssalzen scheidet sich das Salz gewöhnlich aus der Lösung ab und lässt sich leicht trennen mittels der herkömmlichen Arbeitsweisen wie Filtration oder Zentrifugieren.
Sollte es vorkommen, dass das erwünschte Additionssalz nicht ohne weiteres ausfällt, kann man die Ausfällung fördern, indem man entweder die Lösung auf kleineres Volumen konzentriert oder ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel zugibt, wie z. B. Aceton oder dgl. Das Säure Additionssalz kann bequem wieder zur freien Basenform des Antibiotikums umgewandelt werden, indem man eine wässrige Lösung des Salzes über ein anionisches Austauscherharz in den Hydroxylkreislauf führt.
Die verschiedenen Faktoren, aus denen das Tenebrimycin zusammengesetzt ist, können untereinander und von anderen Antibiotika mit ähnlichen Eigenschaften durch papierchromatographische Verfahren unterschieden werden, wie z. B. durch das folgende: Die Chromatographie wurde in der herkömmlichen, absteigenden Weise durchgeführt bei 23 "C + 1" auf Whatman Nr. 1 Papier vom Format 190 x 464 mm.
Die Ergebnisse werden in nachfolgender Tabelle gezeigt.
Die Wanderungskonstante für jedes der angeführten Antibiotika drückt man besser mit einer Re-Konstante aus als durch den herkömmlichen Wert Der Re-Wert drückt das Verhältnis der Entfernung, die vom Antibiotikum durchmessen wurde, in bezug auf das Blattende und nicht auf die Lösungsmittelfront aus.
Dieses Verfahren, die Konstante auszudrücken, wurde im Hinblick auf die Tatsache gerichtet, dass die Lösungsmittelfront über das Blattende hinaus während des Zeitraumes, der für die meisten Lösungsmittelsysteme angewandt wurde, vorgedrungen war.
Tabelle I
Papier-Chromatographie der Tenebrimycine und bekannter Antibiotika mit ähnlichen Eigenschaften Lösungsmittel-System') und Re-Werte A B C D E F G Tenebrimycin - - - 0,65 0,32 0 0 Tenebrimycin I 0,20 - - - - - Tenebrimycin I 0,27 - - - - - Tenebrimycin II 0,40 0,17 0,32 - - - Tenebrimycin III 0,40 0,34 0,41 - - - Tenebrimycin IV 0,49 0,20 0,32 - - - Tenebrimycin V 0,55 0,22 0,35 - - - Tenebrimycin VI 0,71 0,31 0,38 - - - Kanamycin 0,35 0,35 0,41 0,65 0,42 0 0 Kanamycin B 0,57 0,26 0,32 0,70 0,29 0 0,05
0,51 0,39 Gentamycin 0,83 0,75 0,62 - 0,51 0 0,1
0,95 Catenulin 0,44 0,25 0,34 0,65 0,35 0 0 Neomycin 0,60 0,12 0,19 - - 0 0,05
1) Die angewandten Lösungsmittelsysteme und die Dauer der Chromatographie sind unten angegeben.
A = n-Butanol mit Wasser gesättigt, plus 2 0/0 p-Toluolsulfonsäure, 40 Stunden lang.
B = 80 % wässriges Athanol, plus 1,5 % Natriumchlorid, 40 Stunden lang, auf Papier mit 0,95 m Sulfat-Bisulfat gepuffert.
C = Propanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser (15:10:3:12) 40 Stunden lang.
D = Wasser mit Methylisobutylketon gesättigt, plus 1 /0 p-Toluolsulfonsäure, 6 Stunden lang.
E = Propanol und Wasser (1:1), 24 Stunden lang, auf Papier mit 0,75 m Phosphat, pH 4,0, gepuffert.
F = n-Butanol mit Wasser gesättigt, 18 Stunden lang.
G = n-Butanol mit Wasser gesättigt, plus 2 % p-Toluolsulfonsäure und 2 % Piperidin, 18 Stunden lang.
Diese chromatographischen Daten zeigen folgendes: Während bei jedem einzelnen Lösungsmittelsystem einige der Faktoren, aus denen sich das Tenebrimycin zusammensetzt, als untereinander identisch oder identisch mit anderen bekannten Antibiotika erscheinen, beweist die Chromatographie mit einer Vielzahl von Lösungsmittelsystemen deutlich ihre Nicht-Identität. Diese Ergebnisse, im Vergleich zu anderen Daten, wie physikalischer und physi kochemischer Eigenschaften, mikrobiologischer Aktivitäten, Toxizitäten u. ä. unterstützen die Schlussfolgerung, dass die einzelnen Faktoren, die das Tenebrimycin bilden, eine Reihe von bislang unbekannten antibiotischen Substanzen enthalten.
Das Tenebrimycin und die einzelnen Faktoren dieses Komplexes besitzen insbesondere eine hemmende Wirkung auf das Wachstum von Mikroorganismen, die tierischem oder pflanzlichem Leben gegenüber pathogen sind.
Die Hemm-Konzentrationen des Tenebrimycins und der einzelnen Tenebrimycine gegen eine Anzahl von Organismen werden in der folgenden Tabelle gezeigt. Die Minimal-Hemm-Konzentrationen wurden durch das Agar-Verdünnungsverfahren bestimmt.
Tabelle II
Minimale Hemmkonzentration in KLg/ml Test-Organismen Tenebrimycina Tenebrimycin II Tenebrimycin IV Tenebrimycin V Tenebrimycin VI Staphylococcus aureus 3055 6,25 6,25 6,25 6,25 3,12 Bacillus subtilis < 1,56 < 1,56 < 1,56 < 1,56 < 1,56 Mycobacterium avium < 1,56 < 1,56 < 1,56 6,25 < 1,56 Streptococcus faecalis 6,25 3,12 < 1,56 3,12 3,12 Lactobacillus casei 25 50 25 25 12,5 Leuconostoc citrovorum 25 50 25 25 12,5 Escherichia coli No. 1 25 25 12,5 12,5 12,5 Escherichia coli No. 2 25 50 12,5 25 12,5 Proteus sp. No. 1 50 100 50 50 25 Proteus sp. No. 2 25 25 12,5 25 12,5 Pseudomonas sp. No. 2 25 25 100 100 6,25 Pseudomonas sp. No. 5 6,25 12,5 6,25 3,12 < 1,56 Klebsiella-Aerobacter No. 14 6,25 12,5 3,12 12,5 6,25 Klebsiella-Aerobacter No. 15 12,5 12,5 6,25 12,5 6,25 Salmonella sp.
No. 1 25 25 25 25 12,5 Vibrio metschnikovii 12,5 12,5 12,5 6,25 6,25 Agrobacterium tumefaciens 50 25 25 50 50 Erwinia amylovora < 1,56 < 1,56 < 1,56 < 1,56 < 1,56 Pseudomonas solanacearum 25 25 12,5 12,5 12,5 Xanthomonas phaseoli 12,5 12,5 12,5 6,25 3,12 a Die minimale Hemmkonzentration für die einzelnen Tenebrimycine wurden mit den freien Basen bestimmt. Das
Tenebrimycin wurde als Sulfatsalz angewendet.
Die akute Toxizität von Tenebrimycin und der verhältnismässig häufigeren Einzelbestandteile desselben wurde an Mäusen bestimmt.
Die LDs0-Werte für Tenebrimycinsulfat betragen ungefähr 300 mg/kg, wenn das Antibiotikum intravenös inji- ziert wird, und etwa 350 mg/kg, wenn die Droge intraperitoneal verabreicht wird. Bei subkutanen Dosen von 750 mg/kg oder oralen Dosen von 5000 mg/kg überlebten alle Mäuse. Keine bemerkbare Reizung konnte beobachtet werden, wenn je das eine Auge von vier Kaninchen mit einem Tropfen einer 500/0igen wässrigen Lösung von Tenebrimycinsulfat 3mal täglich 5 Tage lang behandelt wurde.
Die LDs0-Werte, ausgedrückt in mg/kg der freien Base, für die einzelnen Tenebrimycine, die Mäusen intravenös verabreicht wurden, sind folgende: Tenebrimycin II etwa 385, Tenebrimycin IV etwa 220, Tenebrimycin V etwa 140 und Tenebrimycin VI etwa 120
Das neuartige, erfindungsgemäss hergestellte antibiotische Tenebrimycin wird insbesondere durch Züchtung eines geeigneten Stammes eines Actinomycet-Organismus unter aerobischen Bedingungen in einem geeigneten Züch tungsmedium, so lange bis dieses Medium wesentliche antibiotische Aktivität erreicht, erhalten. Das Tenebrimycin kann durch Anwendung verschiedener Isolierungs- und Reinigungsmassnahmen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, gewonnen werden.
Das antibiotische Tenebrimycin kann als solches angewandt oder weiteren Reinigungsprozessen unterworfen werden, um seine verschiedenen Komponenten in höherem Reinheitsgrad zu isolieren.
Wegen der Unsicherheit taxonomischer Untersuchungen bezüglich der Organismen-Gruppe Streptomyces, bleibt die Klassifizierung eines neuentdeckten Organismus immer zweifelhaft. Dennoch gleicht - soweit es bewiesen werden kann - der Organismus der den neuen antibiotischen Komplex herstellt, nicht zur Genüge irgendeiner Streptomyces-Gattungi die von Waksman in The Actinomycetes , Vol. II, The Williams and Wilkens Company (1961), beschrieben sind, um Kulturvergleiche zu garantieren. Der Organismus wird daher als neue Gattung be schrieben und gekennzeichnet.
Der Organismus, der das neue antibiotische Tenebrimycin erzeugt, ist ein spiralförmiger, hitzebeständiger, aerobisch bis mikroaerophiler Streptomyces mit länglichen glattwandigen Sporen. Er ist insofern einmalig, als er durch verhältnismässig niedrige Intensitäten künstlichen Lichts gehemmt wird. Wegen dieser Eigenschaft wurde der neue Gattungsname Streptomyces tenebrarius sp. n. für diesen Organismus gewählt.
Der Organismus konnte aus einer Bodenprobe isoliert werden, indem Teile der Bodenprobe in sterilem destillierten Wasser suspendiert und die Suspensionen auf Nähr Agar ausgestrichen wurden. Die Einsaat-Nähr-Agarplatten wurden gewöhnlich bei 25-35 inkubiert, bis das Wachstum sichergestellt war. Am Ende der Inkubationszeit wurden Kolonien der Antibiotikum produzierenden Organismen im allgemeinen mit einer sterilen Impföse aus Platin auf Schrägagar übertragen. Der Schrägagar konnte dann inkubiert werden, um geeignete Impfmengen für die Herstellung des Antibiotikums zu erhalten. Der Stamm des Organismus, der für die Herstellung des antibiotischen Tenebrimycins verwendet wurde, ist bei der American Type Culture Collection in Washington D.C. hinterlegt worden unter der Kultur-Nummer: ATCC 17920.
Der erwähnte Stamm erzeugt alle Faktoren des antibiotischen Komplexes, jedoch überwiegen, insbesondere unter den bevorzugten Fermentationsbedingungen, die Tenebrimycine II, IV, V und VI.
Die bei den taxonomischen Versuchen über S. tenebrarius ATCC 17920 angewandten Verfahren sind die gleichen, wie sie gewöhnlich bei der Taxonomie von Actinomyceten gehandhabt werden. Züchtungsmerkmale wurden nach 14tägiger Inkubation beobachtet. Die Morphologie wurde auf Czapek's-Peptonagar und Bennett's-Agar während einer 2-7tägigen Inkubation bestimmt. Wirkung auf Milch und die Reduzierung von Nitrat wurde nach 7 und
14 Tagen beobachtet, Schwefelwasserstoffproduktion nach 24-48 Stunden und Kohlenstoff-Verwertung nach 10 Tagen. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Kultu ren bei 37 "C inkubiert. Kohlenstoff-Verwertungsuntersu chungen konnten nach dem Verfahren von Pridham und
Gottlieb, J. Bact., 56, 107 (1948), durchgeführt werden.
Die Ergebnisse der taxonomischen Versuche sind in den folgenden Abschnitten zusammengefasst. Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf die Farbblocks nach
Maerz und Paul, Dictionary of Color , McGraw Book
Company (1950). Die Farben, welche durch die Farb blocks versinnbildlicht werden, sind in die ISCC-NBS
Farbnamen übertragen worden, wie sie im Circular 553 ,
U.S. Department of Commerce, National Bureau of Stan dards, 1955, enthalten sind.
Mikroskopische Morphologie, Züchtungscharakteri stika und Physiologie von S. tenebrarius ATCC 17920.
Morphologie:
Auf Czapek's Peptonagar bilden sich verzweigte Sporenformen in unregelmässigen Klümpchen auf dem Luftmycel. Isolierte Sporen sind selten. Das intakte Luftmycel kann leicht vom Substrat gelöst werden. Reife Sporenketten bilden gewöhnlich 5-6 offene Spiralen. Die Sporen sind länglich bis zylindrisch. Unter dem Elektronenmikroskop betrachtet erscheinen die Sporen glatt und messen 0,7-1,3 bis 2,0-2,1 Mikron. Sclerotien wurden auf Bennett's Medium beobachtet.
Kolonie-Merkmale auf:
Czapeks-Agar: Wachstumsmenge gering, Luftmycel dürftig; blass orange-gelb (1 1-A2); Sporulation gut; Rückseite blass-orangegelb (1 1-A2); Lösbares Pigment leicht rosa (1-B1).
Czapek's Pepton: Wachstum reichlich, Luftmycel reichlich; hell-gelblichbraun mit weissen Stellen (1 1-A4); Sporulation reichlich, Rückseite hell-graurot (4-H1). Lösbares Pigment graurosa (4-B1).
Calciummalat-Agar: Wachstum mässig, Luftmycel mässig, blass orangegelb (1 1-A2). Sporulation mässig; Rückseite grau-rosa (4-D1); lösliches Pigment graurosa (4-B1).
Tyrosin-Agar: Wachstum spärlich, Luftmycel spärlich; blass-orangegelb (9-B2); Rückseite blass-rotgelb (10-B3); spärliche Sporulation. Kein lösliches Pigment.
Anorganischer Salze-Stärke-Agar: Wachstum mässig, Luftmycel mässig, bräunlich-rosa mit weissen Stellen (1 1-A4); Sporulation reichlich; Rückseite blass-gelb (11-B2), lösliches Pigment blass-gelb (11-B2).
Glucose-Asparagin-Agar: Wachstum mässig, Luftmycel mässig, blassgelb (9-D2) mit weissen Stellen (10-A1), mässige Sporulation; Rückseite blassgelb (11 -B2), kein lösliches Pigment.
Tomatenmark-Haferrnehl: Wachstum reichlich, Luftmycel reichlich, hell-gelblichbraun (12-B5); reichliche Sporulation; Rückseite dunkelgrau-rötlichbraun (48-J2); lösliches Pigment dunkelpurpurrot (47-H1).
Hefeextrakt: Reichliches Wachstum, reichliches Luftmycel, blass-orangegelb (11-A2) mit weissen Stellen; reichliche Sporulation; Rückseite mässig gelb (11-J6); kein lösliches Pigment.
Nähragar: Wachstum dürftig, dürftiges weisses (10-A1) Luftmycel; dürftige Sporulation; Rückseite graugrünlichgelb (12-12), kein lösliches Pigment.
Bennett's Agar: Wachstum mässig; mässig weisses (10-A1 bis 10 B1) Luftmycel; mässige Sporulation, Rückseite blassgelb (11-C2); kein lösliches Pigment.
Wirkung auf Milch: dunkelgelber Wachstumsring an der Oberfläche; Koagulierung und Peptonisation beobachtet.
Nitratreduktion: Positiv.
H2S-Produktion: Negativ.
Nährgelatine - völlige Verflüssigung nach 14 Tagen.
Temperatur-Erfordernisse für Czapek's Peptonagar: 20 - kein Wachstum.
26 - gutes Wachstum, kein Luftmycel.
30 - Wachstum und Luftmycel mässig aber keine Sporulation.
37 - Wachstum, Luftmycel und Sporulation sehr reichlich.
43" - Wachstum, Luftmycel und Sporulation rehr reichlich.
50 - Wachstum, Luftmycel und Sporulation sehr reichlich.
55" - Spärliches Wachstum.
60 - Kein Wachstum.
Thermaler Totpunkt: Sporen von einer Sporen-Suspension auf 75 "C erhitzt bleiben 15 Minuten lang lebensfähig.
Wurde die Sporen-Suspension auf 100 "C 15 Minuten lang erhitzt, waren keine Sporen mehr lebensfähig.
Sauerstoffspannung: Wachstum entweder aerobisch oder mikroaerophil in Stichkulturen.
Eisenionen-Effekt: Ein rotes lösliches Pigment wird nur bei Vorhandensein von Eisen(III > ionen produziert, und die Intensität der Pigmentation ist proportional zur Konzentration der Eisen-(IIItionen in einem gegebenen Bereich.
Effekt der Wasserstoff-Ionenkonzentration, auf Czapek's-Peptonagar beobachtet: Kein Wachstum unter pH 5,0; von pH 5,0 bis 6,0 Wachtum und Luftmycel gut, Wachstum und Sporulation sind bei pH 7,0 reichlich; von pH 8,0 bis 8,6 sind Wachstum und Luftmycel gut. Das lösliche Pigment ist am intensivsten bei pH 5,0 bis 6,0 und ist gering bis nicht vorhanden von pH 6,5 bis 8,6.
Lichtreaktion, beobachtet auf Czapek's-Agar: Wachstum und Sporulation sind im Dunkel reichlich. Wenn Platten-Kulturen 38 cm entfernt von einer 15-Watt-Standard Fluoreszenz-Kaltlichtquelle inkubiert werden, ist das Wachstum spärlich und kein Luftmycel vorhanden. Wachstum und Luftmycel sind mässig, wenn die Kulturen 38 cm von einer gekühlten mattierten 60-Watt-Wolfram-Glüh lampe inkubiert werden.
In der Tabelle, welche die Ergebnisse der Kohlenstoff
Verwertungsversuche zusammenfasst, die mit S. tenebra rius ATCC 17920 durchgeführt wurden, haben die verwen deten Zeichen folgende Bedeutung: + = positiv (+)= wahrscheinlich (-)= fraglich - = keine (nichts)
Tabelle III
Kohlenstoffverwertung von S. tenebrarius Stamm
ATCC 17920
Kohlenstoffquelle Reaktion Kohlenstoffquelle Reaktion
L(+) Arabinose - D(+) Trehalose +
L(+) Rhamnose - L(+) Raffinose
D(-) Ribose + Cellulose
D(+) Xylose - Inulin (-)
D(-) Fructose + i-Inosit +
D(+) Mannose + Mannit
D(+) Glucose + d-Sorbit (-)
Lactose (-) Salicin (+)
Maltose + Kontrolle (-) (kein Kohlenstoff) Sucrose (+)
S. tenebrarius ATCC 17920 erzeugt zusätzlich zu Te nebrimycin das bekannte antifungale Antibiotikum Caeru lomycin, das auch von Streptomyces caeruleus [Can. J.
Microbiol. 5, 317 (1959)] erzeugt werden kann.
Untersu chung einer Züchtung des letztgenannten Organismus ergab, dass er kein Tenebrimycin erzeugt unter den Bedin gungen, die für seine Züchtung beschrieben wurden; auch unter veränderten Bedingungen kann er nicht dazu indu ziert werden.
Ein zweiter Stamm der neuen Gattung Streptomyces tenebrarius sp. n., der nur drei der Faktoren des antibioti schen Tenebrimycins erzeugt, konnte ebenfalls isoliert und charakterisiert werden. Dieser Stamm von S. tenebrarius, der gewöhnlich nur die Tenebrimycine I, I' und II erzeugt, erhielt die ATCC Nummer 17921. Stamm ATCC 17921 un terscheidet sich vom Stamm ATCC 17920 prinzipiell da durch, dass er kein Luftmycel oder Sporen erzeugt, und auf den meisten Medien auch kein lösliches Pigment. Die
Charakterisierungsdaten für diesen Stamm des Organis mus sind in den folgenden Abschnitten zusammengefasst.
Die Verfahren, die bei den taxonomischen Versuchen mit
S. tenebrarius ATCC 17921 angewendet wurden, sind die gleichen wie die vorstehend bei der Beschreibung der
Charakterisierung von S. tenebrarius ATCC 17920 erwähn ten; die angewandten Zeichen haben die gleiche Bedeu tung wie oben.
Mikroskopische Morphologie, Kulturcharakteristika und Physiologie von S. tenebrarius ATCC 17921.
Morphologie: Weder Luftmycel noch Sporen sind vorhanden; Vegetations-Mycelfragmente in geringer Menge.
Kolonie Charakteristika auf:
Czapek's-Agar: Vegetatives Wachstum gut, gelblich weiss (9-B1); kein Luftmycel; kein lösliches Pigment.
Czapek's-Pepton: Vegetatives Wachstum reichlich, graugelb (12-B3); kein Luftmycel; leicht bräunliches, lösliches Pigment.
Calciummalat-Agar: Vegetatives Wachstum mässig, graugelb (12-B2); kein Luftmycel; leicht graubraunes, lösliches Pigment.
Tyrosin-Agar: Vegetatives Wachstum mässig, graugelb (1 1-B2); weder Luftmycel noch lösliches Pigment.
Anorganischer Salze-Stärke-Agar: Vegetativmycel gut, hellgelbbraun (13-C6); kein Luftmycel; hellbraunes lösliches Pigment.
Glucose-Asparagin-Agar: Vegetativwachstum mässig, graugelb (1 1-D2); kein Luftmycel oder lösliches Pigment.
Tomatenmark-Hafermehl: Vegetativmycel mässig, blassgelb (10-B2); kein Luftmycel oder lösliches Pigment.
Hefe-Extrakt: Vegetativmycel mässig, hellgelbbraun (12-E5); kein Luftmycel oder lösliches Pigment.
Nähragar: Vegetativwachstum mässig, hellgelb (9-k4); kein Luftmycel oder lösliches Pigment.
Bennett's-Agar: Vegetativwachstum mässig, graugelb (12-E4); kein Luftmycel oder lösliches Pigment.
Wirkung auf Milch: Rötlichgelber Wachstumsring an der Oberfläche. Koagulierung und Peptonisation beobachtet.
Nitrat-Reduktion: positiv.
H2S-Produktion: negativ.
Nährgelatine: Völlige Verflüssigung innerhalb von 7 Tagen.
Sauerstoff-Spannung: Wachstum entweder aerobisch oder mikroaerophil in Stichkulturen.
Temperaturerfordernisse für Bennett's-Medium: Das Wachstum ist mässig bei 26, 30, 43, 49 und 55 "C, und sehr reichlich bei 37 "C. Das Vegetativmycel ist blassgelbbraun bei und unter 37 "C, und leicht rötlichbraun bei und über 43 "C. Weder Luftmycel noch lösliches Pigment wurden bei irgendeiner Temperatur beobachtet.
Tabelle IV
Kohlenstoff-Verwertung durch S. tenebrarius
Stamm ATCC 17921 Kohlenstoff- Reaktion Kohlenstoff- Reaktion quelle quelle L(+) Arabinose - Sucrose (-) L(+) Rhamnose - Trehalose (+) D(-) Ribose + Raffinose D(+ Xylose (-) Cellulose D(-) Fructose + i-Inosit + D(+) Mannose (+) Mannit (-) D(+) Glucose + d-Sorbit (-) Lactose - Salicin (-) Maltose + Kontrolle (-) (ohne Kohlenstoff)
Obwohl das erfindungsgemässe Verfahren unter besonderer Berücksichtigung der neugefundenen Organismen S. tenebrarius ATCC 17920 und ATCC 17921 genau beschrieben wird, liegt die Herstellung des Tenebrimycins oder der verschiedenen Faktoren, die das Tenebrimycin bilden, auch durch andere Stämme oder Mutanten der ge-.
sagten Organismen im Rahmen dieser Erfindung.
Die Mengenanteile der verschiedenen Tenebrimycinfaktoren, die von solchen anderen Stämmen oder Mutanten erzeugt werden können, müssen in der Regel nicht notwendigerweise die gleichen sein, wie hier angegeben ist. Solche andere Stämme oder Mutanten kann man auch nach bekannten Verfahren erhalten, z. B. indem man einen Tenebrimycin-erzeugenden Organismus Röntgenstrahlen oder ultravioletter Bestrahlung aussetzt, oder aber chemi schen Faktoren, wie z. B. den Stickstoff-Senfen.
Das für die Herstellung von Tenebrimycin verwendbare Züchtungsmedium kann irgend eines der verschiedenen Medien sein, wie aus den oben beschriebenen Verwer tungsversuchen hervorgeht, da die Tenebrimycin erzeugenden Organisnlen in der Lage sind, verschiedene Energiequellen auszuwerten. Dennoch sind aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion einer leichten Isolierung und um eine Höchstausbeute an Antibiotikum zu erhalten, gewisse Züchtungsmedien, die relativ einfache Nährquellen enthalten, vorzuziehen. Medien, die für die Produktion von Tenebrimycin brauchbar sind, enthalten eine assimi lierbare Quelle von Kohlenstoff, wie z. B. Glucose, Fruc tose, Mannose, Maltose, Stärke u. dgl. Eine besonders be vorzugte Kohlenstoffquelle ist Glucose. Ausserdem enthal ten die verwendbaren Medien eine assimilierbare Stick stoffquelle, wie z. B.
Peptone, hydrolysiertes Casein, Hefe,
Aminosäuren u. dgl. Im vorliegenden Falle werden als
Stickstoffquellen bevorzugt: Pepton, hydrolysiertes Casein und Glutamin.
Mineralsalze, d. h. anorganische Salze, wie z. B. diejeni gen, welche Calcium; Magnesium-, Natrium-, Kalium-, Chlorid-, Sulfat-, Phosphat- und Carbonat-Ionen liefern, müssen dem Medium ebenfalls einverleibt werden, wenn gleich ein Überschuss an Phosphat vermieden werden sollte, da es die Ausbeute an Antibiotikum herabzusetzen scheint. Eine Quelle von Wachstumsfaktoren, wie Hefe oder Hefeextrakt, kann ebenfalls mit guter Wirkung dem Medium zugefügt werden.
Wie es für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen nötig ist, sollten auch wichtige Spurenelemente dem Züchtungsmedium vorzugsweise zugesetzt werden, um das Wachstum der im erfindungsgemässen Verfahren angewendeten Organismen zu fördern. Solche Spurenelemente können meistens als Verunreinigungen vorhanden sein, nämlich als zufällige Begleitstoffe beim Zusatz der anderen Bestandteile des Mediums.
Für die Produktion von Tenebrimycin müssen submerse aerobische Bedingungen vorhanden sein. Für die Herstellung relativ kleiner Mengen, können Schüttelkolben und Oberflächenkulturen verwendet werden. Für die Herstellung grosser Mengen jedoch ist die submerse aerobische Züchtung in sterilen Behältern vorzuziehen. Das Medium im sterilen Behälter kann mit einer sporulierten Suspension beimpft werden, aber wegen der Wachstumsverzögerung, die man bei Verwendung einer sporulierten Suspension als Inoculum festgestellt hat, wird die vegetative Form der Kultur bevorzugt. So vermeidet man die Wachstumsverzögerung und erreicht eine wirkungsvollere Ausnutzung der Fermentationsvorrichtungen.
Dementsprechend ist es insbesondere vorzuziehen, zuerst ein vegetatives Inoculum des Organismus durch Beimpfung einer verhältnismässig geringen Menge des Züchtungsmediums mit der Sporenform des Organismus herzustellen, und dann, wenn ein junges aktives Vegetativ-Inoculum erhalten wurde, dieses vegetative Inoculum steril in den grossen Behälter zu überführen. Zweckmässig wird ein Bruchteil des vegetativen Inoculums, etwa 4 % der Masse des Mediums, in das es eingeführt wird, verwendet. Das Fermentationsmedium, in dem das vegetative Inoculum hergestellt wird, kann entweder gleich oder verschieden von dem Medium sein, welches für die grosstechnische Produktion von Tenebrimycin verwendet wurde.
Wie aus den oben angegebenen detaillierten Temperaturbedürfnissen des Organismus ersichtlich, wächst der Organismus gewöhnlich innerhalb eines relativ weiten Temperaturbereichs. Dennoch scheinen die Organismen am besten bei Temperaturen zwischen 30 und 50 "C zu wachsen. Optimale Produktion von Tenebrimycin scheint bei Temperaturen zwischen 37 und 43 "C einzutreten. Die Organismen, die Tenebrimycin erzeugen, sind vor allem lichtempfindlich und wachsen bei Anwesenheit von Licht gewöhnlich nur schlecht.
Somit sind Fermentationen, bei welchen diese Organismen verwendet werden, bei Abwesenheit von sichtbarem Licht auszuführen.
Übereinstimmend mit der bei submersen Züchtungsvorgängen gebräuchlichen Praxis kann sterile Luft durch das Züchtungsmedium geleitet werden. Zu einem wirkungsvollen Wachstum der Organismen und Tenebrimycinherstellung beträgt das Luftvolumen bei der Tank-Produktion von Tenebrimycin vorzugsweise mehr als 0,1 Volumen Luft pro Minute pro Volumen des Züchtungsmediums, liegt aber gewöhnlich wesentlich höher. Wirkungsvol les Wachstum der Organismen und optimale Ausbeutung an Tenebrimycin erhält man gewöhnlich, wenn die verwendete Luftmenge wenigstens ein Volumen Luft pro Mi nute pro Volumen Züchtungsmedium beträgt.
Die Konzentration der Tenebrimycin-Aktivität im
Fermentationsmedium kann bequem während des Ablaufs der Fermentation verfolgt werden, indem man vor allem
Proben des Züchtungsmediums auf ihre hemmende Aktivität gegenüber dem Wachstum von Organismen hin prüft, die dafür bekannt sind, dass sie in Gegenwart von Tenebrimycin gehemmt werden. Zwei der Organismen die auf diese Weise bei der Produktion von Tenebrimycin angewandt wurden, sind Klebsiella pneumoniae und Mycobac terium butyricum.
Der erstere Organismus wird hauptsächlich bei der wohlbekannten Trübungsmessung verwandt, während der letztere beim Schalen-Platten-Verfahren Anwendung fin den kann.
Im allgemeinen tritt eine Maximalproduktion des Anti biotikums innerhalb von 4-7 Tagen nach der Beimpfung des Züchtungsmediums ein, wenn submerse aerobische
Züchtung oder Schüttelkolben-Züchtung angewandt wird, und nach einer etwas längeren Zeit, wenn Oberflächenkul turen benutzt wurden.
Das Mycel und unaufgelöste Rückstände können von der Fermentationsflüssigkeit durch herkömmliche Mittel, wie Filtration oder Zentrifugierung entfernt werden. Die antibiotische Aktivität ist insbesondere in der gefilterten
Flüssigkeit enthalten und kann daraus durch Anwendung von Adsorptionsverfahren gewonnen werden. Die Adsorp tionsmittel, die am vorteilhaftesten angewendet werden, sind die Kationen-Austauscherharze, z. B. vom Typ, der unter der Bezeichnung IRC-50 vertrieben wird.
Im allgemeinen ist das Verfahren zur Gewinnung des Tenebrimycins aus der Fermentationsflüssigkeit folgendes:
Die gesamte Flüssigkeit wird mit einem Filterhilfsmittel fil triert, nachdem der pH-Wert der Mischung durch Zusatz einer Säure, wie z. B. Schwefelsäure, Phosphorsäure,
Chlorwasserstoff u. dgl. auf etwa 2 gesenkt wurde. Der pH-Wert des Filtrats wird gewöhnlich auf einen Wert von etwa 5,5 durch Zusatz einer konzentrierten Base einge stellt, und dann wird die Mischung noch einmal filtriert.
Das Filtrat wird durch eine Ionenaustauschersäule ge führt, die mit einem Harz wie IRC-50 im Ammonium
Kreislauf gepackt ist. Die Säule wird dann mit destillier tem Wasser gewaschen und die antibiotische Aktivität mit verdünnter Säure eluiert. Die Fraktionen, welche die anti biotische Aktivität enthalten, werden vereinigt und auf un gefähr lIio des ursprünglichen Volumens konzentriert. Der pH-Wert des Konzentrats wird auf etwa 11 durch Zusatz von konzentrierter Base erhöht, und das basische Konzen trat wird dann in etwa 6 Volumen Aceton gegossen, gut gemischt und gekühlt. Der mikrobiologisch inaktive Niederschlag, der sich abtrennt, wird durch Filtration entfernt. Der pH-Wert des Filtrats wird auf etwa 3,5 durch Zusatz von 200/obiger Schwefelsäure unter gründlichem Mischen gesenkt.
Der Tenebrimycin-Komplex fällt in Form des Sulfatsalzes aus, während das Caerulomycin als Nebenprodukt der Fermentation in der überstehenden Schicht, die verworfen wird, zurückbleibt. Das Tenebrimycinsulfat wird in einer möglichst kleinen Wasermenge auf gelöst und die wässrige Lösung durch eine Dowex 1 x 1
Säule geschickt. Der wässrigen Lösung von Tenebrimy cinsulfat auf der Säule folgt destilliertes Wasser, und der
Abfluss aus der Säule wird in Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegeben, zu einen schweren Sirup konzentriert und schliesslich getrocknet, wobei sich die freie Basenform des Tenebrimycins ergibt.
Die Hauptfaktoren, die das Tenebrimycin bilden, kön nen, falls gewünscht, als einzelne Antibiotika durch wei tere Fraktionierung des Tenebrimycins auf Ionaustau schersäulen gewonnen werden, wie weiter oben beschrie ben wurde. Für die Fraktionierung wird das Tenebrimycin als ein Säure-Additionssalz verwendet, vorzugsweise in der Form des Sulfates. Eine Lösung des Tenebrimycin-Sul fats erhält man im allgemeinen bequem, indem man eine 200/obige wässrige Lösung von Tenebrimycin herstellt und den pH-Wert der Lösung auf etwa 4,5 durch Zufügung von Schwefelsäure einstellt. Gefärbte Verunreinigungen können entfernt werden, indem man die so hergestellte
Lösung mit etwa 5 % (Gewicht/Volumen) Aktivkohle, wie z. B. Darco G-60 verrührt. Wirksame Entfärbung erhält man gewöhnlich, indem man die Mischung, welche die
Kohle enthält, ungefähr eine Stunde lang rührt.
Dann wird die Mischung gewöhnlich filtriert und mit dem Filtrat, wel ches das Tenebrimycinsulfat enthält, kann eine Säule, ge packt mit IRC-50 im Ammoniumkreislauf, beladen wer den. Die Säule wird in der Regel mit Wasser gewaschen und die einzelnen Antibiotika, die das Tenebrimycin bil den, können nach und nach mit 0,1 n Ammoniumhydroxyd eluiert werden. Allgemein geht die Elution äusserst lang sam vor sich, und eine sehr grosse Anzahl von Fraktionen ist gewöhnlich nötig, um die Fraktionierung des Komple xes zu bewerkstelligen. So erfordert z. B. die vollständige
Fraktionierung von etwa 250 g Tenebrimycin etwa 700
Fraktionen, von denen jede etwa 900 ml des Eluats aus macht. Die ersten aktiven Fraktionen, die man erhält, ent halten vor allem die Tenebrimycine I, I' und II.
Darauf folgt eine Reihe aktiver Fraktionen, in denen Tenebrimy cin II das einzige Antibiotikum ist. Eine Anzahl von inaktiven Fraktionen folgt gewöhnlich der Elution von Tenebri mycin II, ehe die Fraktionen, welche Tenebrimycin IV ent halten, eluiert werden. Die ersten Fraktionen die Tenebri mycin IV enthalten, scheinen auch Spuren von Tenebrimycin III aufzuweisen. Tenebrimycin V gewinnt man in der Regel aus der Säule in den aktiven Fraktionen, die auf Tenebrimycin IV folgen. Um Tenebrimycin VI zu erhalten, kann die Säule weiterhin mit einer konzentrierteren Ammoniumhydroxyd-Lösung eluiert werden, nachdem das gesamte Tenebrimycin aus der Säule gewonnen wurde. Ein geeignetes Elutionsmittel zur Entfernung von Tenebrimycin VI ist insbesondere 0,3 n Ammoniumhydroxyd.
Beispiel 1
Herstellung von Tenebrimycin
Eine sporulierte Kultur von S. tenebrarius ATCC 17920 wird erzeugt, indem man den Organismus auf einem modifizierten Bennett's-SchrägAgar-Medium wachsen lässt, das die folgende Zusammensetzung hat: Dextrin 10 g Hefe-Extrakt ( Difco ) 1 g hydrolysiertes Casein ( NZ-Amine A , von Sheffield Farms) 2 g Fleischextrakt ( Difco ) 1 g COCl2. 6H2O 0,01 g ausgewaschener Agar 20 g entionisiertes Wasser, auf 1000 ml
Der pH-Wert des Mediums wird vor dem Einbringen in den Autoklaven auf pH-Wert von 7 eingestellt. Der Schrägagar wird mit Sporen von S. tenebrarius ATCC 17920 beimpft und fünf Tage lang bei 37 "C und ohne sichtbares Licht inkubiert.
Das Wachstum auf dem Schrägagar wird mit Wasser bedeckt und vorsichtig abgeschabt, um die Sporen zu entfernen und eine wässrige Sporensuspension zu erhalten.
Die so erzielte Sporensuspension wird zur Beimpfung von 800 ml eines Mediums verwendet, das folgende Zusammensetzung hat:
Dextrose 0,05 % Nährmehl (Archer-Daniels-Midland Company enthält 35-45 % dispergierbares Protein) 1,5 0/0 Dextrin 700 (Kartoffeldextrin mit niedrigem Chlorgehalt, Morningstar-Paisley Company) 1 0/0
Kalimchlorid 0,1 % NZ-Amine A 0,3 /o
KH2PO4 0,05 % MgS04 7H2O 0,5 0/0 CaCl' 2H2O 0,025 /o entionisiertes Wasser
Das beimpfte vegetative Medium wird bei 37 "C 16 Sunden lang auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung inkubiert, die mit 250 U/min arbeitet und einen Hub von 63,5 mm hat.
Eine 50 ml-Anteil der vegetativen Kultur wird verwendet, um einen Einsaatbehälter von 44 Liter Inhalt zu beimpfen, der ein wässriges Medium der folgenden Zusammensetzung enthält: Dextrose 1% Sojabohnenkörner 1,5 % KH2PO4 0,05 % MgSO4 0,5 % KC1 0,1 0/0 CaCl2 2H2O 0,025 % Antischaummittel 0,025 %
Das Medium des Einsaatbehälters wird bei 120 "C etwa 30 Minuten lang sterilisiert. Das Rühren mit einer Geschwindigkeit von 370 U/min beginnt man unmittelbar nach der Beimpfung, und eine Belüftung mit einem Durchsatz von 0,0226 m3 pro Minute wird während der ganzen Inkubationszeit aufrechterhalten.
Nach Beendigung der Inkubationsperiode wird der Inhalt des Einsaatbehälters dazu verwendet, einen 1130-Liter-Fermenter zu beimpfen, der ein Medium folgender Zusammensetzung, enthält: Dextrose 4% raffiniertes Sojabohnenöl 3 /o Sojamehl 3% NH4Cl 0,5 /o CaCl2 0,3 / MgSO4 0,20/0 NH4NO3 0,1 0/0 NZ-Amine A 0,50/0
Antischaummittel 0,2 0/0 entionisiertes Wasser
Vor der Beimpfung wird das Fermentationsmedium 30 Minuten lang bei 120 "C sterilisiert.
Die Fermentation wird bei 37 C unter Belüftung mit einem Durchsatz von 0,48 m3pro Minute durchgeführt, und zwar während der gesamten Zeit von der Beimpfung an bis zur Ernte. Das Rühren wird mit 125 U/min begonnen und bis zu 180 U/min nach 12 Stunden gesteigert. Die Fermentation wird 5 Tage lang fortgesetzt.
Die fermentierte Kulturbrühe wird abfiltriert, um das Mycel und andere unaufgelöste Feststoffe zu entfernen.
Die filtrierte Flüssigkeit enthält Tenebrimycin in einer Konzentration von 680 Einheiten pro ml.
Beispiel 2:
Herstellung von Tenebrimycin I, I' und II
Nach der Arbeitsweise von Beispiel 1 wird S. tenebrarius ATCC 17921 als Antibiotikum erzeugender Organismus benutzt.
Die abfiltrierte Fermentationsflüssigkeit, die man gewinnt, enthält vorwiegend Tenebrimycin II mit geringeren Anteilen der Tenebrimycine I und I:
Beispiel 3:
Isolierung des Tenebrimycins
Der pH-Wert von 880 Litern antibiotischer Fermentationsrlüssigkeit, gewonnen, wie in Beispiel 1 beschrieben, wird auf einen pH-Wertvon etwa 2 gesenkt, durch Zusatz von ungefähr 10-20 Litern 200/0iger wässriger Schwefelsäure.
Nachdem 45 kg eines handelsüblichen Filtrierhilfsmittels der angesäuerten Flüssigkeit zugesetzt wurden, wird gründlich durchgemischt und filtriert. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen und die Waschlösung dem Fil trat zugesetzt.
Der pH-Wert des Filtrats wird auf 5,5 durch Zusatz von 500/0igen wässrigen Natriumhydroxyds eingestellt.
Etwa 4 kg eines handelsüblichen Filtrierhilfsmittels wird zugesetzt und die Mischung gründlich gerührt und filtriert.
Das Filtrat wird durch eine IRC-50- Säule mit den Abmessungen 10,2 cm x 1,83 m geschickt. Die Säule wird mit dem Harz im Ammonium-Kreislauf bis zu einer Betthöhe von 112-114 mm gepackt. Nachdem das gesamte Filtrat die Säule durchlaufen hat, wird diese mit etwa 200 Litern destillierten Wassers gewaschen. Die antibiotische Aktivität wird dann während eines Zeitraumes von 12-15 Stunden mit etwa 150-175 Litern 0,1 n Schwefelsäure eluiert und das Eluat in 10-Liter-Fraktionen abgenommen. Die antibiotische Aktivität ist im Eluat erkennbar, wenn dessen pH-Wert auf etwa 4 oder wenig darunter absinkt.
Während die Elution fortschreitet, fällt der pH-Wert des Eluats weiter, bis er einen Wert von etwa 1,5 erreicht.
Die Fraktionen, welche antibiotische Aktivität enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa 'L des ursprünglichen Volumens konzentriert.
Der pH-Wert des konzentrierten Eluats wird auf 11 durch Zusatz von 500/0igem wässrigem Natriumhydroxyd eingestellt, und das basische Konzentrat wird dann zu 6 Volumeneinheiten Aceton hinzugefügt. Die Mischung wird gekühlt und abgestellt, damit sich der Niederschlag ohne antibiotische Aktivität abtrennt. Die Mischung wird filtriert und der Filterkuchen, der inaktiven Niederschlag enthält, wird mit Wasser gewaschen und verworfen.
Der pH-Wert des Filtrats wird auf 3,5 unter gründlicher Vermischung, durch Zusatz von 200/obiger wässriger Schwefelsäure, eingestellt. Der Tenebrimycin-Komplex scheidet sich als Sulfat während der Behandlung aus und wird praktisch völlig abgeschieden, wenn der pH-Wert der Lösungen 4 oder einen geringfügig darunter liegenden Wert erreicht. Die Mischung wird filtriert und das Filtrat, das Caerulomycin als Nebenprodukt der Fermentation enthält, wird verworfen. Der Filterkuchen, der das Tenebrimycinsulfat enthält, wird in einer möglichst geringen Menge Wasser gelöst und gekühlt. Alle Festbestandteile, die sich nicht leicht auflösen, werden verworfen, wie z. B.
sämtliche Feststoffe, die während des Abkühlens ausfallen oder auskristallisieren. Die klare Lösung des Tenebrimycinsulfats wird über ein Dowex 1 x l -Harz-Bett von 10,2 cm x 2,13 m im basischen Kreislauf geführt. Die antibiotische Lösung wird auf die Säule gegeben und nachfolgend 40-50 Liter destillierten Wassers. Der Abfluss wird in 10-Liter-Fraktionen abgenommen, die aktiven Fraktionen werden zusammengegeben und unter Vakuum zu einem dicken Sirup konzentriert, der getrocknet wird und das trockene Tenebrimycin ergibt.
Beispiel 4:
Abtrennung der Tenebrimycin-Faktoren
Tenebrimycinsulfat wird durch Einstellen des pH-Wertes auf 4,5 einer 200/0gen wässrigen Lösung erhalten, die 258 g Tenebrimycin in freier Basenform enthält, indem man konzentrierte Schwefelsäure hinzusetzt. Die Lösung des so hergestellten Tenebrimycinsulfats wird durch etwa einstündiges Rühren mit 50/0indem (Gew.-Volumen) Darco G-60 entfärbt. Die Lösung wird filtriert und das Filtrat durch eine Säule von 9 x 105 cm geschickt, die mit etwa 7 Liter IRC-50 -Harz im Ammonium-Kreislauf gepackt worden ist. Nachdem das Filtrat, das das antibiotische Salz enthält, die Säule durchlaufen hat, wird diese mit etwa 17 Litern entionisiertem Wasser ausgewaschen.
Die Elution der auf der Säule zurückgehaltenen antibiotischen Aktivität beginnt mittels 0,1 n Ammoniumhydroxydlösung bei einer Fliessgeschwindigkeit von etwa 20 ml pro Minute. Das Eluat wird in Fraktionen von etwa 900 ml aufgefangen, und jede Fraktion wird hinsichtlich ihrer mikrobiologischen Aktivität geprüft. Die den gleichen antibiotischen Faktor enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert, um die einzelnen getrockneten Tenebrimycine zu erhalten.
Die einzelnen Tenebrimycine verteilen sich unter den aktiven Fraktionen wie folgt: Fraktionen vorliegendes Antibiotikum
1- 34 inaktiv
35- 53 Tenebrimycin I, F und II
54- 77 Tenebrimycin II
78-153 inaktiv
154-172 Tenebrimycin IV mit einer
Spur von Tenebrimycin III
173-249 Tenebrimycin IV 250-256 inaktiv 257-634 Tenebrimycin V 635-668' inaktiv 669-698 Tenebrimycin VI
An diesem Punkt wechselt das Eluat zu 0,3 n Ammoniumhydroxyd über.
Beispiel 5
Herstellung von Helianthaten der Tenebrimycine
Die Herstellung von Helianthaten der einzelnen Tenebrimycine wird durch nachfolgende Arbeitsweise zur Her stellung von Tenebrimycin II-Helianthat erläutert.
Eine Lösung von 2 g von Tenebrimycin II in 22 ml Wasser wird hergestellt und durch Zusatz von 50 % Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 5 eingestellt. Eine heisse, 1 00/0ige wässrige Lösung von Methylorange wird dann der antibiotischen Lösung zugesetzt. Das Helianthat von Tenebrimycin II trennt sich als Niederschlag ab und wird durch Filtration entfernt. Das feste Salz wird gründlich mit heissem Wasser gewaschen, unter Vakuum getrocknet und ergibt 3,5 g Tenebrimycin II-Helianthat.
Beispiel 6:
Die Endreinigung der einzelnen Tenebrimycin-Faktoren wird durch nachfolgende Arbeitsweise zur Reinigung von
Tenebrimycin VI erläutert. Das Helianthat von Tenebri mycin VI wird analog Beispiel 5 hergestellt. 4 g des so er haltenen Salzes werden mit etwa 200 ml, unter Zusatz von
Schwefelsäure auf pH 2 eingestelltem Wasser aufge schlämmt. Die Mischung wird ungefähr 4 Stunden lang gerührt und durch einen Sinterglastrichter mittlerer Porosi tät filtriert, um die Helianth-Säure zu entfernen. Das Filtrat wird entfärbt, indem man es durch eine dünne Schicht von Aktivkohle und dann über eine Säule von 1 x 32 cm, gepackt mit Dowex 1 x 2 -Harz, im Hydroxylkreislauf führt. Nach dem Filtrat wird dann destilliertes Wasser auf die Säule gegeben, um die Elution der antibiotischen Aktivität vollständig durchzuführen.
Der Abfluss wird in Fraktionen aufgefangen, die aktiven Fraktionen werden vereinigt sowie lyophilisiert und ergeben einen trockenen Rückstand, der das Antibiotikum enthält. Der Rückstand wird in etwa 15 ml Wasser aufgelöst und dann über eine Säule von 1 x 25 cm, gepackt mit Bio Rad Harz-AG1 1A8 , geführt. (Dies ist ein Retardion -Harztyp, hergestellt durch Polymerisation von Acrylsäure in einem Dowex l -Harz, und vertrieben durch die Bio Rad Laboratories, Richmond, Californien.) Die antibiotische Aktivität wird aus der Säule mit destilliertem Wasser eluiert, die aktiven Fraktionen werden vereint sowie lyophilisiert und ergeben etwa 700 mg an hochreinem Tenebrimycin VI.