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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums
Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines neuen Antibiotikums durch mikrobiologische Fermentation oder durch Gärung mit Hilfe eines bisher noch nicht beschriebenen Vertreters des Genus
Streptomyces, Streptomyces ochrosporus n. s. (nova species) ; die Erfindung bezieht sich ferner auf die
Gewinnung und Anreicherung des neuen Antibiotikums aus Rohlösungen und seine Reinigung.
Unter"Antibiotikum"sind im Rahmen der Erfindung verdünnte Formen, Rohkonzentrate und reine kristalline Formen des Antibiotikums zu verstehen. Die neuen Produkte sind gegen eine grosse Zahl von
Mikroorganismen, darunter grampositive Bakterien, wirksam. Das neue Antibiotikum unterscheidet sich von den bereits beschriebenen Antibiotika durch seine Wirkungen auf bestimmte Mikroorganismen sowie durch seine chemischen und physikalischen Eigenschaften.
Das neue Antibiotikum, das im folgenden als RA-6950ss bezeichnet wird, bildet sich bei der Züchtung von Streptomyces ochrosporus n. s. unter gesteuerten Bedingungen. Die neue Species Streptomyces ochrosporus wurde aus einer aus Venezuela stammenden Bodenprobe isoliert. Eine lebensfähige Kultur des Organismus ist beim Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und wurde von dieser Stelle unter der Bezeichnung NRRL 3146 in die ständige Sammlung aufgenommen.
Im folgenden wird eine allgemeine Beschreibung von Streptomyces ochrosporus auf Grundlage der beobachteten diagnostischen Merkmale gegeben. Die mit der Anmerkung"-t)"versehenen Farbenbe- zeichnungen sind dem "Color Harmony Manual", Third Edition [1948] entnommen.
Wachstum : Auf den meisten Medien mässig bis gut ; auf Czapek-Lösung und Anorganische Salze- Stärke-Agars schwach.
Farbe des Luftmycels und/oder der Sporenmasse : Luftmycel weiss bis gelblich mit Sporenbildung in gelblichen Schattierungen von pergamentfarben (Parchment) (1 1/2 db) bis gelbgetönt (Yellow Tint) (1 ba) bis elfenbein (Ivory) (2 db). Sporenbildung schwach bis mässig auf verschiedenen Medien. Sehr schwache bis keine Sporenbildung auf Czapek-Lösung, Bennett-, Hickey- und Tresner-, Carvajal-Anorganische Salze-Stärke-und Haferflocken-Agar.
Lösliches Pigment : Auf den meisten Medien gelblich bis gelblich-braun bis bräunlich und in geringen bis mässigen Mengen.
Farbe der Unterseite : Auf den meisten Medien in gelblichen bis bräunlichen Schattierungen.
Verschiedene physiologische Reaktionen : Reduzierte Nitrate zu Nitriten ; mässige Gelatineverflüssi- gung ; chromogen auf Pepton- Eisenagar. Kohlenstoffquellenverwertung nach Pridham et al. (J. Bact. 56 [1948], S. 107 bis 114) ; gute bis mässige Verwertung von d-Fructose, d-Mannit, d-Trehalose, d-Xy-
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lose, Dextrose, Dextran, Lactose und Salicin ; schlechte bis keine Verwertung von Adonitol, 1-rabi- nose, i-Inosit, d-Melezitose, 1-Rhamnose, d-Melibiose und d-Raffinose.
Morphologie : Sporen in langen gekrümmten Ketten, Sporen elliptisch bis länglich, 0, 3 bis 0, 4 J. 1. X 0, 7 bis 0, 9J. 1. ; und glattwandig (durch Elektronenmikroskopie bestimmt).
Streptomyces ochrosporus ist ein Vertreter der gelbsporigen Streptomyceten nach Tresner und Backus ("System of Color Wheels for StreptomyceteTaxonomy", Appl. Microbiol. 11 [1963], S. 335 bis 338). Nach Pridham et al. ("A Guide for the Classification of Streptomycetes according to Selected Groups", Appl. Microbiol. 6 [1958], S. 52 bis 79) sind die Sporenketten vom Typ rectus-flexibilis (RF). Beim Vergleich des neuen Organismus nach diesen sowie andern beständigen und für die Taxonomie brauchbaren Merkmalen mit bekannten Species mit ähnlichen Eigenschaften stellte sich heraus, dass eine neue Species vorliegt.
In Übereinstimmung mit guten nomenklatorischen Gepflogenheiten wurde dafür das binomische Epithetum Streptomyces ochrosporus n. s. zur Beschreibung seiner gelblichen Sporenbildung gewählt.
Eine kritische Prüfung der Kultureigenschaften und der physiologischen und morphologischen Merkmale des Organismus wurde nach Züchtung auf verschiedenen Medien, darunter den von Pridham et al.
("A Selection of Media for Maintenance and Taxonomic Study of Streptomyces", Antibiotics Annual [1956 bis 1957], S. 947 bis 953) empfohlenen, durchgeführt. Die einzelnen Beobachtungen sind in den folgenden Tabellen 1, 2, 3 und 4 angegeben. Mit der Anmerkung"+)"versehene Farbbezeichnungen sind dem "Color Harmony Manual" entnommen.
Tabelle 1
EMI2.1
<tb>
<tb> Kultureigenschaften <SEP> von <SEP> Streptomyces <SEP> ochrosporus <SEP> NRRL <SEP> 3146
<tb> Bebrütung <SEP> - <SEP> 14 <SEP> Tage
<tb> Temperatur <SEP> - <SEP> 280 <SEP> C
<tb> Medium <SEP> : <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> Luftmycel <SEP> lösliches <SEP> Farbe <SEP> der <SEP> Bemerund/oder <SEP> Pigment <SEP> : <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP> kungen <SEP> : <SEP>
<tb> Sporen <SEP> :
<SEP>
<tb> a) <SEP> b) <SEP> c) <SEP> d) <SEP> e) <SEP> f) <SEP>
<tb> Czapek-schwach <SEP> Luftmycel <SEP> keines <SEP> weisslich
<tb> Lösung <SEP> dünn <SEP> weiss,
<tb> Agar <SEP> Sporenbildung <SEP> sehr
<tb> schwach
<tb> Tomaten- <SEP> mässig <SEP> Luftmycel <SEP> gelblich, <SEP> honig-Sektomark- <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> schwach <SEP> gold <SEP> +) <SEP> renAgar <SEP> gelblich, <SEP> (2 <SEP> ic) <SEP> bildung
<tb> wird <SEP> pergamentfarben <SEP> +) <SEP>
<tb> (1 <SEP> 1/2 <SEP> db) <SEP> in
<tb> Sporulationsgebieten.
<tb>
Sporenbildung
<tb> mässig
<tb> Bennett- <SEP> mässig <SEP> Luftmycel <SEP> gelblich <SEP> ; <SEP> zimtfar-ZentralAgar <SEP> weisslich, <SEP> schwach <SEP> ben <SEP> +) <SEP> zonen
<tb> sehr <SEP> dünn, <SEP> (3 <SEP> le) <SEP> gefaltet
<tb> wird <SEP> gelblich <SEP> und <SEP> runin <SEP> Sporulati-zelig
<tb> onszonen.
<tb>
Sporulation
<tb> sehr <SEP> schwach.
<tb>
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Tabelle 1 Fortsetzung
EMI3.1
<tb>
<tb> Medium <SEP> : <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> Luftmycel <SEP> lösliches <SEP> Farbe <SEP> der <SEP> Bemerund/oder <SEP> Pigment <SEP> : <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP> kungen <SEP> : <SEP>
<tb> Sporen <SEP> : <SEP>
<tb> a) <SEP> b) <SEP> c) <SEP> d) <SEP> e) <SEP> f) <SEP>
<tb> Aspara- <SEP> mässig <SEP> Luftmycel <SEP> keines <SEP> hell-Sektogin-gelblich-braun <SEP> +) <SEP> ren- <SEP>
<tb> Dextrose <SEP> weiss, <SEP> wird <SEP> (4 <SEP> ng) <SEP> bildung
<tb> Agar <SEP> gelbgetöt+)
<tb> (1 <SEP> ba) <SEP> in
<tb> Sporulationszonen. <SEP> Sporulation
<tb> schwach
<tb> Hickey- <SEP> mässig <SEP> Luftmycel <SEP> gelblich- <SEP> zimtfar- <SEP> Zentralund <SEP> weisslich, <SEP> braun <SEP> ;
<SEP> ben <SEP> +) <SEP> zonen,
<tb> Tresner-Spuren <SEP> gelb-schwach <SEP> (3 <SEP> le) <SEP> gefaltet
<tb> Agar <SEP> licher <SEP> Spo- <SEP> und <SEP> runrulation <SEP> in <SEP> zelig
<tb> Randgebieten
<tb> Hafer-gut <SEP> Luftmycel <SEP> bräunlich, <SEP> tief-Oberflämehl- <SEP> sehr <SEP> spärlich <SEP> mässig <SEP> braun <SEP> +) <SEP> che <SEP> geAgar <SEP> weisslich. <SEP> (5 <SEP> pl) <SEP> faltet
<tb> Spuren <SEP> von <SEP> und <SEP> rungelblicher <SEP> zelig
<tb> Sporulation
<tb> in <SEP> Randgebieten
<tb> Kartof <SEP> mässig <SEP> Luftmycel <SEP> gelblich- <SEP> tief- <SEP> Sektofel-Dex- <SEP> gelblich- <SEP> braun <SEP> ; <SEP> braun <SEP> +) <SEP> ren- <SEP>
<tb> trose- <SEP> weiss, <SEP> wird <SEP> mässig <SEP> (5 <SEP> pl) <SEP> bildung
<tb> Agar <SEP> pergamentfarben <SEP> +) <SEP>
<tb> (1 <SEP> 1/2 <SEP> db)
<tb> in <SEP> Sporulationszonen.
<tb>
Sporulation
<tb> mässig
<tb> Tomaten- <SEP> mässig <SEP> Luftmycel <SEP> gelblich- <SEP> hell- <SEP>
<tb> mark-Ha- <SEP> gelblich- <SEP> braun <SEP> ; <SEP> braun <SEP> +)
<tb> fermehl- <SEP> weiss, <SEP> wird <SEP> mässig <SEP> (4 <SEP> ng)
<tb> Agar <SEP> elfenbeinfarben <SEP> +) <SEP>
<tb> (2 <SEP> db) <SEP> in
<tb> Sporulationszonen.
<tb>
Sporulation
<tb> mässig
<tb>
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Tabelle 1 Fortsetzung
EMI4.1
<tb>
<tb> Medium <SEP> : <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> Luftmycel <SEP> lösliches <SEP> Farbe <SEP> der <SEP> Bemerund/oder <SEP> Pigment <SEP> : <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP> kungen <SEP> : <SEP>
<tb> Sporen <SEP> : <SEP>
<tb> a) <SEP> b) <SEP> c) <SEP> d) <SEP> e) <SEP> f) <SEP>
<tb> Hefe- <SEP> mässig <SEP> Luftmycel <SEP> gelblich- <SEP> dunkel- <SEP> Sekto- <SEP>
<tb> extrakt- <SEP> weisslich, <SEP> brann <SEP> ; <SEP> lohfar- <SEP> renAgar <SEP> wird <SEP> elfen- <SEP> mässig <SEP> ben <SEP> +) <SEP> bildung
<tb> beinfarben <SEP> +) <SEP> (4 <SEP> pg)
<tb> (2 <SEP> db) <SEP> in
<tb> Sporulationszonen.
<tb>
Sporulation
<tb> mässig
<tb> Anorga- <SEP> schwach <SEP> Luftmycel <SEP> keines <SEP> gewürznische <SEP> sehr <SEP> spärlich, <SEP> braun <SEP> +)
<tb> Salze- <SEP> weisslich. <SEP> (3 <SEP> ni)
<tb> Stärke- <SEP> Keine <SEP> SpoAgar <SEP> rulation
<tb> Hafer- <SEP> gut <SEP> Luftmycel <SEP> bräun- <SEP> tiefflocken- <SEP> spärlich, <SEP> lich <SEP> ; <SEP> braun <SEP> +)
<tb> Agar <SEP> weisslich. <SEP> mässig <SEP> (5 <SEP> pl)
<tb> Keine
<tb> Sporulation.
<tb>
Tabelle 2
EMI4.2
<tb>
<tb> Mikromorphologie <SEP> von <SEP> Streptomyces <SEP> ochrosporus <SEP> n. <SEP> s. <SEP> NRRL <SEP> 3146
<tb> Medium <SEP> : <SEP> Luftmycel <SEP> und <SEP> Sporen- <SEP> Sporen- <SEP> Sporensporentragende <SEP> gestalt <SEP> : <SEP> grösse <SEP> : <SEP> oberStrukturen <SEP> : <SEP> fläche <SEP> :
<SEP>
<tb> Aspara- <SEP> Sporenträger <SEP> in <SEP> Sporen <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> bis <SEP> Sporengin-langen, <SEP> gekrümmten <SEP> ellip- <SEP> 0,4# <SEP> oberDextrose- <SEP> Ketten <SEP> tisch <SEP> bis <SEP> x <SEP> fläche
<tb> Agar <SEP> länglich <SEP> glatt(be-
<tb> 0, <SEP> 7 <SEP> bis <SEP> stimmt
<tb> 0.9# <SEP> durch
<tb> Elektronenmikroskop)
<tb>
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Tabelle 3
EMI5.1
<tb>
<tb> Verschiedene <SEP> physiologische <SEP> Reaktionen <SEP> von <SEP> Streptomyces <SEP> ochrosporus <SEP> NRRL <SEP> 3146
<tb> Temperatur <SEP> - <SEP> 280 <SEP> C <SEP>
<tb> Medium <SEP> : <SEP> Inkubations-Wachstum <SEP> : <SEP> Physiolo- <SEP>
<tb> dauer <SEP> (Be- <SEP> gische <SEP>
<tb> brütung) <SEP> : <SEP> Reaktion <SEP> :
<SEP>
<tb> Organische <SEP> 7 <SEP> Tage <SEP> stark <SEP> Nitrate <SEP> zu
<tb> Nitrat-Nitriten
<tb> brühe <SEP> reduziert
<tb> Organische <SEP> 14 <SEP> Tage <SEP> stark <SEP> Nitrate <SEP> zu
<tb> Nitrat-Nitriten
<tb> brühe <SEP> reduziert
<tb> Gelatine <SEP> 7 <SEP> Tage <SEP> schwach <SEP> schwache
<tb> Verflüssigung
<tb> Gelatine <SEP> 14 <SEP> Tage <SEP> mässig <SEP> mässige
<tb> Verflüssigung
<tb> Pepton- <SEP> 24h <SEP> mässig <SEP> Chromogen
<tb> EisenAgar
<tb>
Tabelle 4
EMI5.2
<tb>
<tb> Kohlenstoffquellen-Verwertungsbild <SEP> von <SEP> Streptomyces <SEP> ochrosporus <SEP> NRRL <SEP> 3146
<tb> Bebrütung <SEP> - <SEP> 10 <SEP> Tage
<tb> Temperatur <SEP> - <SEP> 280 <SEP> C
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> : <SEP> Verwertung <SEP> :
<SEP> x) <SEP>
<tb> Adonit <SEP> 1 <SEP>
<tb> 1-Arabinose <SEP> 1 <SEP>
<tb> Dextran <SEP> 2
<tb> d-Fructose <SEP> 3
<tb> i-Inosit <SEP> 1
<tb> Lactose <SEP> 2
<tb> d-Mannit <SEP> 3
<tb> d- <SEP> Melezitose <SEP> 1 <SEP>
<tb> d-Melibiose <SEP> 0
<tb> d-Raffinose <SEP> 0
<tb> 1-Rhamnose <SEP> 1 <SEP>
<tb> Salicin <SEP> 2
<tb> Saccharose <SEP> 0
<tb> d-Trehalose <SEP> 3
<tb> d-Xylose <SEP> 3
<tb> Dextrose <SEP> 3
<tb> Blindprobe <SEP> 0
<tb>
4 3 = gute Verwertung
2 = mässige Verwertung
1 = schlechte Verwertung
0 = keine Verwertung
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Die Erzeugung des neuen Antibiotikums ist gemäss der Erfindung jedoch keineswegs auf die Verwendung dieses besonderen Organismus oder auf die Verwendung von Organismen beschränkt, die den beschriebenen,
nur der Erläuterung dienenden Wachstumsmerkmalen und mikroskopisch feststellbaren Eigenschaften vollkommen entsprechen. Vielmehr liegt auch die Verwendung von Varianten oder Mutanten, die aus dem beschriebenen Organismus durch verschiedene Massnahmen, beispielsweise Röntgenbestrahlung, UV-Bestrahlung, Stickstofflost und Einwirkung von Phagen erhalten werden, im Rahmen der Erfindung.
Fermentationsverfahren : Die Züchtung des Organismus S. ochrosporus kann in einer grossen Anzahl von flüssigen Kulturmedien durchgeführt werden. Medien, die zur Erzeugung des neuen Antibiotikums geeignet sind, enthalten eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, z. B. Stärke, Zucker, Melassen oder Glyzerin ; eine assimilierbare Stickstoffquelle, z. B. Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren oder Maisquellwasser ; und anorganische Anionen und Kationen, z. B. Kalium, Natrium, Kalzium, Sulfat, Phosphat oder Chlorid. Die Zufuhr von Spurenelementen, z. B. Bor, Molybdän, Kupfer, kann in Form von Verunreinigungen anderer Bestandteile der Medien erfolgen.
Die Belüftung in Tanks und Kolben geschieht unter Durchleiten steriler Luft durch das Fermentations- oder Gärmedium oder unter Darüberleiten von solcher Luft über die Oberfläche desselben. Für weiteres Bewegen oder Rühren in den Tanks wird durch einen mechanischen Rührer gesorgt. Bei Bedarf kann man einen Entschäumer, z. B. 10/0 Octadecanol in Specköl, zugeben.
EMI6.1
lich so durchgeführt, dass man 100 ml steriles flüssiges Medium in 500 ml-Kolben durch Abspülen einer Schrägagarkultur beimpft. Man kann folgendes Medium verwenden :
EMI6.2
<tb>
<tb> Melasse <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Bactopepton <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Die Kolben werden bei einer Temperatur von 25 bis 290 C, vorzugsweise von 280 C, bebrütet und auf einer hin-und hergehenden Schüttelvorrichtung 48 bis 72 h, gewöhnlich 72 h lang, intensiv bewegt. Diese 100 ml Impfkulturen werden zum Beimpfen von 1 1- Ansätzen des gleichen Mediums in 191Behältern verwendet. Nach geeignetem Bebrüten dieser Impfkulturansätze werden sie zum Beimpfen von Fermentationstanks verwendet.
Fermentation in kleinen Tanks : Zur Herstellung des Antibiotikums in Fermentationstanks kann man folgendes Nährmedium verwenden :
EMI6.3
<tb>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Proteinhältiger, <SEP> Zusatz <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Kalziumcarbonat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Jeder Tank wird mit etwa 3% von wie oben hergestellten Impfkulturen beimpft. Die Belüftung erfolgt mit einer Geschwindigkeit von 0. 7 I steriler Luft pro 1 Nährflüssigkeit/min, und die Gärmischung wird durch eine mit 750 bis 850 Umdr/min laufende Rührvorrichtung in Bewegung gehalten. Die Tem-
EMI6.4
Fermentation in grossen Tanks : Man verwendet das gleiche Fermentationsmedium wie oben. Jeder Tank wird mit etwa 30/0lmpfmaterial, wie es aus der Fermentation in dem kleinen Tank erhalten wird, beimpft. Die Belüftung erfolgt mit einer Geschwindigkeit von 0, 75 I steriler Luft/l Nährflüssigkeit/min.
Die Mischung wird durch einen Rührer mit etwa 100 Umdr/min in Bewegung gehalten. Die Temperatur wird wie oben eingehalten und die Fermentation 20 bis 30 h lang durchgeführt. Dann wird die Masse aufgearbeitet.
Bei einigen Kulturen wurde gefunden, dass der Zeitpunkt der Aufarbeitung genau einzuhalten ist, z. B. 24 bis 36 h, da die Ausbeute abnimmt, wenn man die Fermentation länger weitergehen lässt.
Reinigung : Nachdem die Fermentation beendet ist, wird die das erfindungsgemäss erhältliche Anti-
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biotikum enthaltende Gärmaische abfiltriert, vorzugsweise bei etwa PH 7, 0, um das Mycel zu entfernen. Man kann Diatomeenerde oder eine beliebige andere übliche Filtrierhilfe verwenden, um die Filtration zu erleichtern. Gewöhnlich wird der Mycelkuchen mit Wasser gewaschen und das Waschwasser mit dem Filtrat vereinigt. Danach kann man das Antibiotikum nach üblichen Methoden gewinnen.
Man kann das Antibiotikum aus dem Filtrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, z. B. Äthylacetat, bei einem PH- Wert von etwa 7, 0 extrahieren. Der Extrakt wird gewöhnlich im Vakuum auf etwa 10/0 des ursprünglichen Volumens eingeengt. Man filtriert das Konzentrat langsam in eine geeignete Menge Petroläther und erhält einen gummiartigen Niederschlag, der beim Verdampfen
EMI7.1
zur Hälfte ihres Gewichts mit der unteren Phase des gleichen Lösungsmittelsystems befeuchtet ist. Die Säule wird dann mit der oberen Phase entwickelt, um die gewünschten antibiotischen Aktivitäten ssA und 8B zu eluieren.
Eluate zwischen dem 1, 0-und 3, Ofachen des Aufnahmevolumens (Säulenkapazität) (ssA) und zwischen dem 3, 8-bis 7, 6fachen des Aufnahmevolumens (8W werden in getrennten Gefässen gesammelt. Dann engt man die Eluate jeweils im Vakuum ein und löst die erhaltenen Rückstände getrennt in einem Mindestvolumen Diäthyläther. Die Komponente BA kristallisiert aus dieser Lösung nach mehrstündigem Stehen bei Zimmertemperatur aus und wird durch Filtration gewonnen. Die Komponente BB kann durch Zugabe der Diäthylätherlösung zu Petroläther (30 bis 750 C) gefällt werden.
BB kann weiter gereinigt werden, indem man es durch eine Säule mit säuregewaschener Diatomeenerde schickt, die bis zur Hälfte ihres Gewichts mit der unteren Phase eines aus Äthylacetat, Petroläther, Aceton und Wasser in den Volumenverhältnissen 0, 05 : 3 : 2 : 1 bestehenden Lösungsmittelsystems befeuchtet ist. Die Säule wird mit der oberen Phase des gleichen Systems entwickelt, wobei das Eluat zwischen dem 14, 0- bis 20, Ofachen des Aufnahmevolumens der Säule aufgefangen wird. Diese Fraktion wird im Vakuum eingeengt und der erhaltene Rückstand in Diäthyläther gelöst, woraus die reine Komponente 8B auskristallisiert werden kann. Die reine Komponente BB ist eng mit der Komponente ssA verwandt, unterscheidet sich aber von dieser in mehreren Eigenschaften.
Das erfindungsgemäss erhältliche neue Antibiotikum enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff,
EMI7.2
EMI7.3
<tb>
<tb>
-0/0)ssA-Komponente <SEP> : <SEP> ssB-Komponente:
<tb> Kohlenstoff <SEP> 49, <SEP> 76 <SEP> 49, <SEP> 36 <SEP>
<tb> Wasserstoff <SEP> 5,38 <SEP> 5, <SEP> 73 <SEP>
<tb> Sauerstoff <SEP> 35, <SEP> 44 <SEP> 34, <SEP> 74 <SEP>
<tb> Stickstoff <SEP> 3, <SEP> 80 <SEP> 3, <SEP> 73 <SEP>
<tb> Schwefel <SEP> 4,52 <SEP> 4,44
<tb>
Im folgenden werden verschiedene physikalische Eigenschaften der Komponente 0A angegeben :
EMI7.4
<tb>
<tb> Berechnetes <SEP> Molekulargewicht <SEP> 687 <SEP> - <SEP> 715 <SEP>
<tb> Schmelzpunkt <SEP> 122 <SEP> - <SEP> 1240 <SEP> C <SEP>
<tb>
An Sauerstoff gebundene Methylgruppen in %:2,42 (als CH3); an Kohlenstoff gebundene Methylgruppen in 0/0 : 6, 86 (als CH3). Es sind keine Methylgruppen an ein Stickstoffatom gebunden.
An Sauerstoff gebundene Acetylgruppen in % : 11, 20.
EMI7.5
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: I :1% 322 imi (E, = 130) cm in Äthanol.
Ein Infrarot-Absorptionsspektrum der Komponente BA in einem KBr-Pressling wird auf übliche Weise hergestellt. Es zeigt charakteristische Absorptionen im Infrarotgebiet des Spektrums bei folgenden
EMI8.1
Infrarotabsorptionskurve ist in Fig. 1 der Zeichnungen dargestellt.
Nachstehend werden verschiedene physikalische Eigenschaften der Komponente BB angeführt : An Sauerstoff gebundene Methylgruppen in %. : 2, 42 (als CHJ : an Kohlenstoff gebundene Methylgruppen in % : 7, 03 (als CH3); an Sauerstoff gebundene Acetylgruppen in tub : 11, 46.
Der Schmelzpunkt von RA-6950ssB ist nicht scharf. Das Produkt erweicht bei 1250 C und scheint sich bei etwa 1450 C zu zersetzen.
EMI8.2
in Äthanol.
Ein Infrarotabsorptionsspektrum der Komponente BB in einem KBr-Pressling wurde auf übliche Weise hergestellt. Es zeigt charakteristische Absorptionen im Infrarotgebiet des Spektrums bei folgenden
EMI8.3
wobei Bacillus subtilis bei PH 6,0 als Detektororganismus verwendet wurde.
EMI8.4
<tb>
<tb>
Rf-Wert <SEP> : <SEP> Lösungsmittelsystem <SEP> : <SEP>
<tb> 0, <SEP> 20 <SEP> n-Heptan <SEP> 200 <SEP> Teile
<tb> Tetrahydrofuran <SEP> 50 <SEP> Teile
<tb> n-Amylacetat <SEP> 50 <SEP> Teile
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> m <SEP> Essigsäure <SEP> 200 <SEP> Teile
<tb> 0, <SEP> 89 <SEP> n-Amylacetat <SEP> 100 <SEP> Teile
<tb> Dibutyläther <SEP> 30 <SEP> Teile
<tb> Essigsäure <SEP> 5 <SEP> Teile
<tb> Wasser <SEP> 50 <SEP> Teile
<tb>
Die Löslichkeit des RA-6950ss-Komplexes nimmt im allgemeinen mit steigender Polarität des Lösungsmittels zu. Die Antibiotika sind unlöslich in Hexan und Wasser; mässig löslich in Äthern, z. B.
Diäthyl-oder Diisopropyläther; und sind leicht löslich in den meisten üblichen organischen Lösungsmitteln, z. B. Methanol, Aceton, Dimethylsulfoxyd, Chloroform, Methylenchlorid, Dimethylformamid, Eisessig, Benzol und Äthylacetat. Die Komponenten des RA-6950ss-Komplexes reduzieren Tetrazoliumsalze, entfärben wässeriges Permanganat und setzen aus dem Natriumazid-Jodreagens Stickstoff frei.
Die magnetischen Protonenresonanzspektren der erfindungsgemäss erhältlichen Antibiotika werden mit einem Varian A-60-Spektrometer bei 60 MHz in üblicher Weise durch Auflösen in Deutero-Chloroform, das Tetramethylsilan als inneren Standard enthält, hergestellt. Die Verbindung ss A zeigt ein
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charakteristisches komplexes Absorptionsbild, für das die bei folgenden Frequenzen, ausgedrückt in CPS (Zyklen/sec)-Einheiten, auftretenden Hauptabsorptionen kennzeichnend sind : 829, 595, 455, 406,
EMI9.1
nanzspektrum von RA-6950ssA ist in Fig. 2 der Zeichnungen dargestellt. Der obere Teil der Darstellung schliesst an der mit"x"bezeichneten Schnittlinie an der ebenfalls mit"x"bezeichneten Schnittlinie des unteren Teiles der Darstellung an.
Die Komponente BB zeigt ein charakteristisches komplexes Absorptionsbild, für das die bei den folgenden Frequenzen, ausgedrückt in CPS-Einheiten (Zyklen/sec), auftretenden Hauptabsorptionen
EMI9.2
gestellt. Der obere Teil der Darstellung schliesst an der mit"y"bezeichneten Schnittlinie an der eben- falls mit"y"bezeichneten Schnittlinie des unteren Teils der Darstellung an.
Beide Komponenten ssA und 8B sind von andern Antibiotika durch die oben angegebenen charakte- ristischen Werte und durch ihre antimikrobielle Aktivität deutlich verschieden. Die antimikrobielle Aktivität der beiden Komponenten in vitro ist in den nachstehenden Tabellen angeführt, die die mini- male Hemmkonzentration angeben, die zur Hemmung des Wachstums repräsentativer Mikroorganismen auf einem Nährmedium erforderlich ist.
Tabelle 5
EMI9.3
<tb>
<tb> Mikroorganismus <SEP> : <SEP> Minimale <SEP> Hemmkonzentrationen
<tb> (jug/ml)
<tb> RA-6950B <SEP> A <SEP> RA-6950BB <SEP>
<tb> PH <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> smegmatis
<tb> ATCC <SEP> 607 <SEP> 0,2 <SEP> 6,2
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb> ATCC <SEP> 6538P <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis
<tb> ATCC <SEP> 8043 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0,8
<tb> Escherichia <SEP> coli
<tb> ATCC <SEP> 9637 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Proteus <SEP> vulgaris
<tb> ATCC <SEP> 9484 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa
<tb> ATCC <SEP> 10145 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Salmonella <SEP> gallinarum
<tb> Led. <SEP> An. <SEP> Ind. <SEP> 604 <SEP> 50 <SEP> 50
<tb>
Tabelle 6
EMI9.4
<tb>
<tb> Mikroorganismus <SEP> :
<SEP> RA-6950ssA <SEP> RA-6950ssA <SEP> RA-6950ssB <SEP> RA-6950B
<tb> PH <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 9 <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis
<tb> ATCC <SEP> 8043 <SEP> 0,39 <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> > 25
<tb> Streptococcus <SEP> sp.
<tb> nichthämolytisch, <SEP> Nr. <SEP> 11 <SEP> 0,39 <SEP> 12,5 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 25
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
Tabelle 6 Fortsetzung
EMI10.1
<tb>
<tb> Mikroorganismus <SEP> : <SEP> RA-6950ssA <SEP> RA-6950A <SEP> RA-6950A <SEP> RA-6950A
<tb> PH <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> PH <SEP> 'S <SEP> PH <SEP> . <SEP> 0 <SEP> PH <SEP> '9
<tb> Streptococcus <SEP> sp.
<tb>
ss-hämolytisch, <SEP> Nr. <SEP> 80 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 12,5
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes
<tb> Kirby-Isolat <SEP> Nr. <SEP> 154 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes
<tb> Kirby-Isolat <SEP> Nr. <SEP> 15 <SEP> 8 <SEP> > 25 <SEP> 25
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes
<tb> NY-5 <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea
<tb> ATCC <SEP> 9341 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 6,2
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb> 4050B122-3 <SEP> 0,2 <SEP> 6,2 <SEP> 0,39 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb> 4050B122-7 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 6,2 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb> 4050B122-9 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 0,39 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb> 4050B122-10 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 12,
<SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> > 25 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb> 4050B122-11 <SEP> 0,2 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 0,39 <SEP> > 25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb> 4050B122-13 <SEP> 0,39 <SEP> 6,2 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb> 4050B122-14 <SEP> 0,2 <SEP> 6,2 <SEP> 0,39 <SEP> 25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb> Rose, <SEP> ATCC <SEP> 14154 <SEP> 0,2 <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 0,39 <SEP> 25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb> Smith, <SEP> ATCC <SEP> 13709 <SEP> 0,2 <SEP> 3,1 <SEP> 0,39 <SEP> 6,2
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb> Nr. <SEP> 69 <SEP> 0,2 <SEP> 3,1 <SEP> 0,39 <SEP> 6,2
<tb>
Die Komponenten ss, und ssB sind gegen zahlreiche grampositive Mikroorganismen, z. B. Staphylokokken und Streptokokken, wirksam.
Die neuen Antibiotika sind daher als therapeutische Mittel zur Behandlung von durch solche Mikroorganismen verursachte Bakterieninfektionen bei Menschen und Tieren geeignet. Die neuen Antibiotika können zur Bekämpfung solcher Infektionen durch lokale Anwendung oder parenterale Verabreichung verwendet werden.
Die Eignung dieser Antibiotika lässt sich durch ihre Fähigkeit zur Bekämpfung von letalen Systeminfektionen bei Mäusen nachweisen. RA-6950ss A zeigt eine hohe antibakterielle Wirksamkeit in vivo bei Mäusen gegen Staphylococcus aureus, Stamm Smith, Staphylococcus aureus, Stamm Rose, und Streptococcus pyogenes, C-203, wenn es als Einzeldosis an Gruppen von weiblichen Mäusen (Carworth Farms CF-1) mit einem Gewicht von etwa 20 g verabreicht wird, die intraperitoneal mit einer letalen Dosis dieser Bakterien in 10-2-, 10-3- und 10-5-Verdünnungen in Trypticase-Soja-Brühe (TSP) einer 5stündigen TSP-Blutkultur infiziert wurden.
Die Bedingungen, unter denen die Wirkung gegen für Menschen pathogene Organismen bei Mäusen geprüft wurden, indizieren eine ausreichende Aktivität für
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Menschen.
Die folgende Tabelle 7 veranschaulicht die antibakterielle Wirksamkeit in vivo der Komponenten RA-6950ssA und RA-6950ssB.
Tabelle 7
EMI11.1
<tb>
<tb> Antibakterielle <SEP> Aktivität <SEP> von <SEP> RA- <SEP> 6950B <SEP> A <SEP> in <SEP> vivo
<tb> Prüfsystem <SEP> : <SEP> Dosierung <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> Gesamtmg/kg <SEP> Kör <SEP> Überle- <SEP> zahl
<tb> pergewicht <SEP> : <SEP> benden/S. <SEP> S. <SEP> c. <SEP>
<tb>
S. <SEP> O. <SEP> D. <SEP> x) <SEP> : <SEP> xx) <SEP> : <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> 640 <SEP> 20/20
<tb> aureus, <SEP> 320 <SEP> 14/20
<tb> Stamm <SEP> Smith <SEP> 160 <SEP> 9/20
<tb> 80 <SEP> 0/10 <SEP> 18/20
<tb> 40 <SEP> 26/30
<tb> 20 <SEP> 25/30
<tb> 10 <SEP> 16/30
<tb> 5 <SEP> 16/30
<tb> 2,5 <SEP> 5/30
<tb> 1,25 <SEP> 0/10
<tb> Staphylococcus <SEP> 80 <SEP> 7/10
<tb> aureus, <SEP> 40 <SEP> 9/10
<tb> Stamm <SEP> Rose <SEP> 20 <SEP> 9/10
<tb> 10 <SEP> 2/10
<tb> Streptococcus <SEP> 80 <SEP> 8/10
<tb> pyogenes, <SEP> 40 <SEP> 7/10
<tb> C-203 <SEP> 20 <SEP> 1/10
<tb> Antibakterielle <SEP> Aktivität <SEP> von <SEP> RA-6950ssB <SEP> in <SEP> vivo
<tb> Staphylococcus <SEP> 80 <SEP> inaktiv <SEP> 10/10
<tb> aureus, <SEP> 40 <SEP> 3/10
<tb> Stamm <SEP> Smith <SEP> 20 <SEP> 1/10
<tb> 10 <SEP> 1/10
<tb>
x) S. O. D. = Einzeldosis oral xx) S. S.
C. = Einzeldosis subcutan.
Sämtliche infizierten, nicht behandelten Kontrolltiere starben innerhalb eines Tages.
Beispiel l : Impfmaterialherstellung.
Ein typisches, zur erfindungsgemässen mikrobiologischen Gärung verwendetes Medium ist folgendes :
EMI11.2
<tb>
<tb> Melasse <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Bactopepton <SEP> 5g
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Eine Agarschrägkultur von S. ochrosporus NRRL 3146 wurde abgespült. Die dabei ablaufende Flüssigkeit wurde zum Beimpfen von 100 ml des oben genannten Mediums in einem 500 ml-Kolben verwendet. Der Kolben wurde auf eine hin-und hergehende Schüttelvorrichtung gebracht und 72 h bei 280 C kräftig geschüttelt. Die erhaltene Kolbenimpfkultur wurde in einen 19 l Fermentationsbehälter aus Glas, der 1 l steriles Medium enthielt, übergeführt. Während der etwa 48 h lang durchgeführten Züchtung wurde der Fermentationsbehälter mit steriler Luft belüftet. Dann wurde der Inhalt zum Beimpfen des Fermentationstanks verwendet.
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Beispiel 2 : Fermentation.
Ein Gärmedium wurde nach folgender Formel hergestellt :
EMI12.1
<tb>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Proteinhältiger <SEP> Zusatz <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Kalziumcarbonat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Das Fermentationsmedium wurde 45 bis 60 min bei 1200 C mit Dampf von 1, 05 at (25 lbs) Druck sterilisiert. Der PH-Wert des Mediums vor und nach dem Sterilisieren lag zwischen 7,0 und 7,5. 30 1 steriles Medium in einem 40 l-Fermentationstank wurden mit 11 Impfmaterial, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, beimpft, und die Fermentation wurde 48 h lang bei 280 C durchgeführt. Die Belüftung erfolgte bei einer Geschwindigkeit von 0,7 steriler Luft pro 1 Medium/min. Das Medium wurde durch eine mit einer Drehzahl von etwa 800 Umdr/min betriebenen Rührvorrichtung bewegt. Am Ende dieses Zeitabschnittes wurden die 30 1 Gärmaische zum Beimpfen von 1000 1 des beschriebenen Mediums in einem 1500 l-Fermentationsbehälter verwendet. Die Fermentation wurde 25 h bei 280 C weitergeführt.
Das Medium wurde durch eine mit einer Drehzahl von 100 Umdr/min betriebene Rührvorrichtung bewegt und die Belüftung erfolgte mit einer Geschwindigkeit von 0,75 1 steriler Luft/l Brühe/min. Nach
EMI12.2
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und seine andern chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften wurden bereits oben beschrieben.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, dadurch gekennzeichnet, dass man in ein wässeriges Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlehydrat, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen Streptomyces ochrosporus NRRL 3146 oder eine von dessen Mutanten oder Varianten inokuliert und darin züchtet, bis das Medium eine we- sentliche antibiotische Aktivität durch Bildung eines Antibiotikums (RA-69500) vom Schmelzpunkt 122 bis 1240 C und den in der Beschreibung angegebenen Analysenwerten und/oder eines Antibiotikums
EMI13.1