AT267056B - Verfahren zur Gewinnung eines Gemisches neuer Antibiotika - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Gewinnung eines Gemisches neuer Antibiotika 
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Gemisches neuer Antibiotika. Diese Antibiotika können durch Züchtung von Mikroorganismen erzeugt werden, die der Gattung Streptomyces angehören. 



   Der Organismus, der für die erfindungsgemäss herstellbaren neuen Antibiotika eingesetzt wurde, führt die Bezeichnung Streptomyces hazeliensis var. hazeliensis nov. sp. Dieser Organismus wurde aus einer Bodenprobe, die in Matane, Gaspé, Canada, gefunden wurde, isoliert. Der Einfachheit halber wird dieser Organismus als Streptomyces hazeliensis bezeichnet. Eine Kultur dieses Streptomyces hazeliensis wurde in der Mikroorganismensammlung des United States Department für Landwirtschaft, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, III. (USA) unter Nr. NRRL 2938 hinterlegt. 



   Das Gemisch der neuen Antibiotika wird erfindungsgemäss dadurch erhalten, dass man den Organismus Streptomyces hazeliensis var. hazeliensis NRRL 2938 oder eine von dessen natürlichen bzw. künstlichen Mutanten in einer wässerigen Kulturflüssigkeit, die eine organische C- und N-Quelle enthält, submers und aerob kultiviert und das gebildete antibiotische Gemisch aus der Gärlösung gewinnt und gegebenenfalls in ein Salz überführt. 



   Die erfindungsgemäss herstellbaren Antibiotika werden als Sugordomycine bezeichnet. Sie können durch die folgende allgemeine Formel dargestellt werden : 
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 worin   R und R   Wasserstoff, 2-Pyrroyl oder   5-Methyl-2-pyrroyl   darstellen, wobei nur einer der Reste    Rl   und R2 Wasserstoff bedeuten kann. 



   Eine bevorzugte Gruppe von Antibiotika der Formel I werden durch die allgemeine Formel 

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 in der die Substituenten R1 und R2 die oben angegebene Bedeutung haben, charakterisiert. 



   Die erfindungsgemäss herstellbaren Salze werden durch Umsetzen mit geeigneten Basen erhalten. 



  Beispiele für solche Salze sind das Natriumsalz, Kaliumsalz, Ammoniumsalz oder andere pharmazeutisch geeignete Basenadditionssalze. 



   Ein besonders bevorzugtes Verfahrensprodukt der Formeln I und II ist   (III)   N, N'-bis-{4-Hydroxy- 
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 Diese Verbindung hat folgende Strukturformel 
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Zu den weiteren Antibiotika, die durch das erfindungsgemässe Verfahren hergestellt werden können, gehören folgende :

   
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 {4-Hydroxy-8-methyl-7- [4-0-methyl-5, 5-dinethyl-3-0- (2'-pyrroy7th edition,   [1957]).   Obgleich dieser Organismus mit Streptomyces griseoflavus   Stamm-Nr.   160, Streptomyces niveus NRRL 2446, Streptomyces spheroides NRRL 2449, Streptomyces Nr. 58383, Streptomyces spirogriseus NRRL 2590 und Streptomyces griseus ATCC 12318 verwandt angesehen werden kann, gibt es zahlreiche Unterschiede zwischen den obigen Organismen und Streptomyces hazeliensis, die die eindeutige Feststellung erlauben, dass letzterer mit keiner der früheren Spezies identisch ist. 



  Die Unterschiede in der Morphologie und in der Sporenfarbe sind genügend klar, um Streptomyces hazeliensis von allen Antibiotika produzierenden Streptomyces-Spezien zu unterscheiden, gemäss der Klassifizierung von T. G. Pridham, C. W. Hesseltine und R. G. Benedict, AppL Micorbiology   6 : [1958],   S. 52 bis 79   :"A   guide for the classification of Streptomyces according to selected groups". 



   Eine andere entscheidende Differenzierung besteht in der Verschiedenheit zwischen den aus Streptomyces hazeliensis hergestellten Antibiotika und dem aus den obengenannten Organismen hergestellten Novobiocin. 



   Kulturen von Streptomyces hazeliensis, die auf geeigneten Nährböden gezüchtet werden, wie Tomaten-Soya-Agar bei 280 C während 2 bis 10 Tagen, bilden ein Luftmycel, das gewöhnlich weiss ist und sich bei der Sporulierung grau bis graubraun verfärbt. Auf verschiedenen Nährböden bildet sich ein farbloses bis gelbes Exudat. Sporophoren auf Bennett-Agar und auf Asparagin-Agar sind meistens gestreckt bis schlangenförmig, bisweilen in einem weiten Haken oder in einer Schlinge oder in losen, offenen, charakteristisch weiten (Diameter 7   ti)   Spiralen mit 1 bis 5 Schlingen endend, wobei die Spiralen   unregelmässig   in Form und Abstand zwischen den Schlingen ausgebildet sind. Die Sporen sind oval 
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 phoren in besenähnlicher Form.

   Es sind keine ballähnlichen, dichten oder kompakten Spiralen, wie sie bei der Kultur von Streptomyces spheroides vorhanden sind. Obwohl einige Sporophoren gebüschelt auftreten, sind sie an ihrem Ende nicht, wie es für Streptomyces niveus charakteristisch ist, wie ein Korkenzieher gewindet. Im Gegenteil, die Sporophoren von Streptomyces hazeliensis sind an ihrem Ende grösser, weiter und lockerer und werden enger und dichter bei dem Ansatzpunkt der Hyphen. 



   Um Streptomyces hazeliensis mit bekannten Streptomyces, die in klassischer Weise sowohl auf komplexen stickstoffhaltigen Nährböden, wie auch auf chemisch definierten Nährböden gezüchtet werden (Pridham und Gottlieb, J. Bact. 56   [1948],   S. 107 bis 115) vergleichen zu können, wurden diese beiden Nährbodentypen verwendet. Zur Methodik und den Nährböden s. die oben beschriebene Literaturstelle von Pridham und Gottlieb sowie ferner Gottlieb D., AppL Microbiology   9 : [1961],   S. 55 bis 65 ; "A Manual of Methods for Pure Culture Study of   Bacteria"von der"Committee on Bacteriologic   Technic of the Society of American Bacteriologists"   [1948] ;   und Waksman,"The Actinomycetes" (Chronica Botanica Co   [1950]).   



   Auf den von Bennett und Czapek verwendeten Agarnährböden wuchsen alle   Streptomyces-hazelien-   sis-Stämme lebhaft bei 22, 28 und 350 C. Bei den höheren Temperaturen wurde eine bessere Sporulierung beobachtet. Anderseits wuchsen Streptomyces niveus und Streptomyces spheroides gut bei den niederen Temperaturen, aber überhaupt nicht bei 350 C. Streptomyces   Nr. 160   und Streptomyces sp. 



  Nr. 58383 wachsen ebenfalls nicht bei 350 C. 



   Das Wachstum von Streptomyces hazeliensis auf verschiedenen Nährböden ist unten beschrieben. 



  Die aufgeführten Farbtöne stimmen mit der im Color Harmony Manual 4th Edition, Container Corpora-   tion of America,   Chicago, Illinois   [1958],   vorhandenen Farbskala überein :
Sucrose-Nitrat-Agar (Czapek Sucrose) : Wachstum gut, aber keine Sporulation ; Farbe des Luftmycels crème (zwischen Farbton 2 cc und chm grau Massstab d). Farbe der Unterseite crème-braun, Pigment crème (Farbton zirka 2). 



   Glukose-Asparagin-Agar : Wachstum lebhaft, leicht erhobene, glatte   Oberfläche ; Farbe   des Luftmycels schwach grau, mit schwach grauen Sparen. Farbe der Unterseite blass crème ; kein lösliches Pigment. Ein Stamm zeigt winzige klare Tropfen eines Exudats am Filamentende. 



     Glukose-Nähr-Agar :   Wachstum mässig, flach, lederartig, mit starken Falten im Agar. Farbe des Luftmycels weiss, Farbe der Unterseite dunkel crème ; lösliches Pigment bräunlich gefärbt (Farbton   t   ne). Streptomyces spheroides zeigt mässiges Wachstum mit keinem löslichen Pigment, während Streptomyces niveus gut wächst unter Bildung von löslichem Pigment. Streptomyces sp. Nr. 58383 zeigt 

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 lebhaftes Wachstum, aber kein lösliches Pigment. 



   Glukose-Glycerin-Agar : Lebhaftes Wachstum, sehr tiefe Falten im Agar ; Oberfläche gerunzelt, mit
Sprüngen. Vegetatives Mycel schwach lohfarben, mit einigen ziemlich grossen Tropfen von schwach gelb gefärbtem Exudat. Farbe des Luftmycels teilweise weiss bis grau-braun (chm. nahe grau 5   de),   zirka 25% sporuliert. Farbe der Unterseite   kaffeebraun ; lösliches   Pigment schwach braun-gelb (Farbton
3 ie) bis braun gefärbt. 



     Amidex-Agar :   Wachstum mässig bis gut, flach, Farbe des Luftmycels mittelgrau ; Farbe der Unterseite crème-braun bis dunkel kaffeebraun. Lösliches Pigment rot-braun (Farbton 4 pe-pg). 



     Tomatenpaste-Hafermehl-Agar : Starkes Wachstum   mit guter Sporenbildung ; einige Tropfen Exudat. 



  Farbe des Luftmycels grau bis graubraun   (chm.   nahe grau 5 fe). Farbe der Unterseite dunkel bräunlich oliv mit schmutzigem olive-gefärbtem löslichem Pigment. 



   Magermilch-Agar : Substrat Wachstum gut, teigig, glatt, ohne Luftmycel. Starke Produktion von löslichem, dunkelbraunem Pigment, an den Fadenenden schwach braun gefärbt (Farbton 5 n-i und Farbton 3 ie). 



   Pepton-Eisen-Agar : Nur ein paar Kolonien ; glatt teigig, regelmässig gefurchte Kegel mit hellwei- sser Oberfläche. Farbe des Luftmycels dunkelcrème, Oberfläche weiss gefärbt. Lösliches Pigment von dunkelbrauner Farbe (Farbton 4 pn). 



   Bennett's Agar : Wachstum lebhaft, Farbe des Luftmycels grau mit graubraunen (rötlichen) Sporen. 



  Bildung von blass gelben Exudattropfen. Farbe der Unterseite gelb-braun ; lösliches Pigment hellgelbbraun gefärbt (Farbton 3 pc). Ein zweiter Stamm zeigte kein Exudat. Ein dritter Stamm bildete ein sich verbreitendes gelbes Exudat, das die gesamte Wachstumsoberfläche benetzte. 



   Kartoffelstückchen : Wachstum nach 2 Wochen : mässig. Schwärzung der Kartoffeln bereits nach 4 Tagen. Anderseits zeigten Streptomyces spheroides und Streptomyces niveus zunächst mässiges, dann langsam steigend gutes Wachstum mit gräulich weisser Sporenbildung unter bräunlicher Verfärbung der Kartoffel. Streptomyces Nr. 160 zeigte ein lebhaftes, stark gerunzeltes Wachstum. 



     Karottenstückchen :   Sehr gutes Substratwachstum von weisser Farbe, die bei der Sporenbildung rauchgrau bis blaugrau wird. Etwas klar gelbes Exudat. Streptomyces niveus zeigte mässiges Wachstum mit weissem Luftmycel, während bei Streptomyces spheroides kein Wachstum beobachtet wurde. 



   Proteolytische Aktivität a) Gelatine : Drei Röhrchen wurden mit Hilfe einer Nadel mit einer Sporensuspension beimpft. Vor der Beurteilung wurden die Röhrchen während 1 h bei 30 C aufbewahrt und dann wieder auf Zimmertemperatur gebracht. Nach 7 Tagen : keine Verflüssigung, kleine weisse Kolonien an der Oberfläche mit dunkelbraunem, löslichem Pigment (Farbton 2 pi-pi unmittelbar bei den Kolonien. Nach 14 Tagen : zirka   2-55o   Verflüssigung, ziemlich gutes Wachstum an der Oberfläche, ferner einige kugelige Kolonien submers in der verflüssigten Phase ; dunkelbraunes lösliches Pigment. Nach 21   Tagen : 100' ige   Verflüssigung, Farbe der Gelatine braun-gelb (Farbton 2 pc),   während die Farbe der Kontrollröhrchen einen   Farbton von 1 bis 1/2 zirka zeigte.

   In der Literatur wird angegeben, dass Streptomyces niveus und Streptomyces spheroides gutes Wachstum auf Gelatine zeigen, aber kein lösliches Pigment bilden. Die erstgenannte Spezies zeigt eine teilweise Verflüssigung, die letztgenannte eine schnelle (innerhalb von 3 bis 10 Tagen eintretende) Verflüssigung. Streptomyces Nr. 160 verflüssigt sich schnell, bildet aber kein lösliches Pigment. Streptomyces sp.   Nr. 58383   wächst auf Gelatine dürftig und verflüssigt sich nicht. 
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Nach 7 Tagen bilden alle Stämme gut geformte, feste, crème- bis leicht braunfarbene Oberflächenwachstumshäutchen, mit einem braunen Ring an der   Röhrchenwand : Farbe   des löslichen Pigments crèmegelb bis leicht orange.

   Ein Stamm zeigte leichte   Peptonisierung ; PH-Bereich 5, 3   bis 5, 7 (Kontrolle PR 5, 7 bis 6, 1). 
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   ; Luftmycel lederartig ; FarbeNitrat-Reductase Aktivität a) Organische Lösung : Nach 14 Tagen : gutes Wachstum, dicke, weisse   Häutchen ;   dunkelgelb gefärbtes, lösliches Pigment. Schwache Nitritbildung, die sich nach 21 Tagen   verstärkt ; starkes Oberflä-   

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 chenwachstum mit beginnender Sporenbildung, Farbe leicht grau. b) Anorganische   Lösung : Leichtes   Wachstum mit keiner Reduktion innerhalb 14 Tagen ; gutes Oberflächenwachstum nach 21 Tagen, aber keine Nitritbildung, Nitrat noch anwesend.

   Smith et al., Streptonivicin, A New Antibiotic, Antib. and Chemother. 6   [1956],   S. 135 bis 142, fanden, dass Streptomyces niveus keine Nitratreduktion weder in synthetischer noch in natürlicher Nitratlösung zeigt ; Streptomyces spheroides zeigt nur schwache Reduktion von Nitrat-Agar zu Nitrit in 4 Tagen, während bei
Streptomyces sp.   Nr. 58383   eine stark positive Nitritbildung beobachtet wurde. 



   Bildung von Schwefelwasserstoff : Nach 21 h zeigten Schräg-Agar-Kulturen ein sehr schwaches Wachstum, aber eine starke   HS-Entwicklung ;   nach 14 Tagen : Kolonien mit blanker Oberfläche unter Verfärbung des Nährbodens von dunkelblau bis dunkelbraun. 



   Tyrosin-Agar : Bei allen 5 Stämmen : Tyrosinase-Reaktion positiv. Leichtes Wachstum nach 14 Tagen. Farbe des Luftmycels weiss, Farbe der Unterseite weiss. Keine Pigmentbildung nach 7 Tagen. Farbe des Pigments nach 14   Tagen : beigegrau,   Farbton 3 ec-ge (Kontrolle Farbton 1 bis 1/2 db). 



   Verwertung von Kohlenstoff : Xylose, Arabinose, Rhamnose, Glucose, Fructose, Sucrose, Lactose, Raffinose   (fui),   Inositol, Cellobiose, Trehalose, Citrat, Maleat und Succinat werden verwertet. Nicht verwertet werden Inulin, Maltose, Mannitol, Sorbitol, Acetat, Formiat, Oxalat und Tartrat. 



   Es ist zu bemerken, dass Streptomyces niveus und Streptomyces spheroides Inulin, Maltose, Mannitol und Sorbitol verwerten im Gegensatz zu Streptomyces hazeliensis, wobei sie im Gegensatz zu letzteren in Parallelversuchen nicht auf   Citrat- oder Succinatnährböden wuchsen.   Streptomyces niveus verwertet Formiat, Oxalat, Tartrat und Natriumcitrat. 



   Verwertung von Stickstoff : L   (+)   Arginin wird verwertet. Nicht verwertet werden Methionin, Sarcosin, Creatin, Aminoisobuttersäure, Taurin und Betain. 



   Produktion von Antibiotika : Durch Züchtung von Streptomyces hazeliensis erhält man Sugordomyeine, aber auch unter den verschiedensten Bedingungen kein Novobiocin. Streptomyces spheroides und Streptomyces niveus produzieren dagegen beide Novobiocin, aber kein Sugordomycin Antibioticum, selbst auf Nährböden, auf denen Streptomyces hazeliensis nur Sugordomycin-Antibiotica bildet. 



   Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sich Streptomyces hazeliensis morphologisch sowohl von Streptomyces niveus als auch von Streptomyces spheroides unterscheidet, indem die Spitzen der Sporophoren keine korkenzieherartigen Schlingen bilden, wie es für Streptomyces niveus charakteristisch ist und indem die dichten, kompakten, ballähnlichen Spiralen fehlen, wie sie typisch sind bei Streptomyces spheroides. 



   Während Streptomyces niveus und Streptomyces spheroides den   Agar-Nährboden   sehr bald in charakteristischer Weise zerreissen und spalten, beobachtet man diese Erscheinung bei Streptomyces hazeliensis gewöhnlich nicht. Streptomyces niveus bildet ein lösliches Pigment auf verschiedenen AgarNährböden, während Streptomyces spheroides kein Pigment bildet. Anderseits bildet Streptomyces hazeliensis normalerweise ein Pigment,   u. zw.   stärker als Streptomyces niveus. 



   Man hat auch festgestellt, dass die Zusammensetzung der Nährböden, in denen Streptomyces hazeliensis gezüchtet wird, die folgenden Variablen massgebend beeinflusst : a) die Menge der gebildeten Antibiotika, b) die Geschwindigkeit der Bildung der Antibiotika und c) die Art des antibiotischen Gemisches in der Lösung. 



   Der Gehalt der vergorenen Lösungen in Flaschen oder Gärkesseln wird durch die   gewöhnliche"cup-   plate"-Agar-Diffusionsmethode, unter Verwendung von Staphylococcus aureus als Testorganismus, bestimmt (D. C. Grove and W. A. Randall, Assay Methods of Antibiotics. A Laboratory Manual, Medical Encyclopedia Inc., New York [1955], pages 7 bis 16). 



   Die Menge der Antibiotika, die in 1 ml wässerigem Puffer gelöst, eine Hemmungszone von 18 mm Durchmesser auf der Testplatte bildet, wird willkürlich als eine Aktivitätseinheit bezeichnet. Die Kolonien haben einen Durchmesser von 8 mm. Das reine Antibiotikum III hat eine Aktivität von   5 500   Einheiten pro mg. 



   Als bevorzugte Stickstoffquelle für die Züchtung der Antibiotika wird grüner oder gelber Erbsenschrot eingesetzt. Auch mit Sojabohnenmehl,   Mais"Distillers Solubles"   (Körnertrockenrückstand und löslicher Anteil aus der Maisbrennung), Baumwollsamenmehl, Kokoseiweissmehl, Leinsamenmehl und   "Soluferm"   (auflösbare Trockenrückstände und Körner von der Maisvergärung) wurden mittlere bis gute Ausbeuten erzielt, die jedoch gewöhnlich unter den mit Erbsen erzielten Ausbeuten lagen. Ein Zusatz von kleinen Mengen Ferrosulfat, Knochenasche oder getrocknetem Rückstand von Maisquellwasser zu den Erbsen erhöhte die Ausbeute der Antibiotika nicht ; hingegen stieg die Ausbeute nach Zugabe von Calciumcarbonat und Dikaliumphosphat. 

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   Der Zusatz eines Kohlenhydrates zu den natürlichen Stickstoffquellen hatte verschiedene Auswirkungen. Bestimmte Kohlenhydrate beeinträchtigten die Bildung der Antibiotika. Andere Kohlenhydrate lieferten nur dann eine gute Ausbeute an Antibiotika, wenn das Verhältnis zwischen Kohlenstoff und Stickstoff in eine bestimmte Relation gesetzt wurde. Ein Zusatz zu einem gelben Erbsennährboden in Höhe von   0, 2510   eines Natriumsalzes organischer Säuren hemmte die Bildung von Antibiotika vollständig. Bei diesem Experiment wurde ein Grundnährboden verwendet, der zu   310   aus gelbem Erbsenschrot,   0, 110 Calciumcarbonat   und 0, 1% Dikaliumphosphat bestand. 



   Der Effekt, der durch Beigabe von Kohlenhydraten an der Produktion der Antibiotika erzielt wurde, ist aus der nachstehenden Tabelle, in der der Grundnährboden   210   gelben Erbsenschrot enthielt, ersichtlich : 
Tabelle 1 
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<tb> 
<tb> Zusatz <SEP> zum <SEP> Grundnährboden <SEP> S.

   <SEP> aureus <SEP> Einheiten <SEP> pro <SEP> ml
<tb> Gesamtlösung <SEP> in <SEP> 7 <SEP> Tagen
<tb> 1% <SEP> Maisstärke <SEP> (Kontrolle) <SEP> 180
<tb> 10/o <SEP> Mannitol <SEP> 120
<tb> 1% <SEP> Glycerin <SEP> 50
<tb> 20/0 <SEP> Glycerin <SEP> Spuren
<tb> 10/0 <SEP> Maltose <SEP> 55
<tb> 1% <SEP> Arabinose <SEP> 4
<tb> 1% <SEP> Rhamnose <SEP> 12
<tb> 10/0 <SEP> Lactose <SEP> 18
<tb> 1% <SEP> Inositol <SEP> 3 <SEP> 
<tb> 
 
In den folgenden Experimenten, die in Tabelle 2 zusammengestellt sind, wurde ein Grundnährboden aus gelbem Erbsenschrot mit 0,1% Calciumcarbonat und 0,1% Dikaliumphosphat verwendet. 



   Tabelle 2 
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<tb> 
<tb> Zusatz <SEP> zum <SEP> Grundnährboden <SEP> S. <SEP> aureus <SEP> Einheiten <SEP> Maximale <SEP> Ausbeute
<tb> pro <SEP> ml <SEP> Gesamtlösung <SEP> nach <SEP> Tagen
<tb> 1, <SEP> Olo <SEP> Maisstärke <SEP> (Kontrolle) <SEP> 590 <SEP> 7
<tb> 0, <SEP> 5% <SEP> Maisstärke <SEP> 310 <SEP> 6
<tb> 2, <SEP> 0% <SEP> Maisstärke <SEP> 400 <SEP> 7
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Glucose <SEP> 230 <SEP> 7
<tb> 2 <SEP> % <SEP> Glucose <SEP> 25 <SEP> 7
<tb> 1 <SEP> % <SEP> brauner <SEP> Zucker <SEP> 100 <SEP> 7
<tb> 2 <SEP> % <SEP> brauner <SEP> Zucker <SEP> 0 <SEP> 7
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Dextrin <SEP> 360 <SEP> 7
<tb> 2 <SEP> % <SEP> Dextrin <SEP> 290 <SEP> 5
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Xylose <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 
<tb> 
 
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 phat fehlen oder wenn die Konzentration von einem oder beiden Salzen auf 0, 5% erhöht werden,

   wird die Ausbeute an Antibiotika deutlich verschlechtert. 



   Gewöhnlich werden Antischaummittel eingesetzt, um das Schäumen, das bei grossen Gäransätzen auftritt, zu unterbinden. Es wurde gefunden, dass eine ganze Reihe von Pflanzenölen aus z. B. Safran, Baumwollsamen, Sesam, Kokosnuss, Sojabohnen oder von tierischen Ölen wie Schweineschmalz oder Oleinsäure usw. verwendet werden können, ohne die Ausbeute der Antibiotika zu vermindern. Auch Antischaummittel auf Silikonbasis senkte die Ausbeute der Antibiotika nicht. 



   In der folgenden Tabelle sind die Ausbeuten der Antibiotika verglichen, die auf den gleichen 

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 Nährböden durch Streptomyces hazeliensis, Streptomyces niveus und Streptomyces spheroides gebildet wurden. Es muss noch bemerkt werden, dass im Gegensatz zu Streptomyces hazeliensis, der deutliche, scharf umrandete Hemmzonen bildet, bei Streptomyces niveus und Streptomyces spheroides nur unscharfe und wenig ausgeprägte Hemmzonen auftreten. Es besteht demnach in der Bildung dieser Hemmzonen ein deutlicher Unterschied zwischen den Sugordomycinen und dem Novobiocin. 



  Tabelle 3 
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<tb> 
<tb> Nährbodenbestandteile <SEP> in <SEP> % <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> "Cup-plate"-Einheiten/ml
<tb> 4 <SEP> Tage <SEP> 6 <SEP> Tage
<tb> Strep. <SEP> Strep. <SEP> Strep. <SEP> Strep. <SEP> Strep. <SEP> Strep.
<tb> hazeliensis <SEP> niveus <SEP> spheroides <SEP> hazeliensis <SEP> niveus <SEP> spheroides
<tb> Erbsenschrot: <SEP> 2, <SEP> Maisstärke <SEP> : <SEP> 1
<tb> CaCO3: <SEP> 0,1, <SEP> K2HPO4: <SEP> 0,1 <SEP> 69 <SEP> 50 <SEP> 47 <SEP> 320 <SEP> 53 <SEP> 5
<tb> Maisquellwasser <SEP> : <SEP> 4, <SEP> Glucose <SEP> : <SEP> 5
<tb> KH2PO4 <SEP> : <SEP> 0,05, <SEP> NaNO3: <SEP> 0,3,
<tb> MgSO4. <SEP> 7H2O: <SEP> 0,1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> Spuren <SEP> 9
<tb> Soyamehl <SEP> : <SEP> 2, <SEP> brauner <SEP> Zucker <SEP> : <SEP> 2
<tb> Getrockneter <SEP> Rückstand <SEP> von
<tb> Maisquellwasser <SEP> :0,25, <SEP> K2HPO4:

   <SEP> 0,1 <SEP> Spuren <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 13 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Getrocknete <SEP> "Distillers <SEP> Solubles" <SEP> 
<tb> (Soludri) <SEP> : <SEP> 2
<tb> Glucose <SEP> : <SEP> 2, <SEP> K2HPO4: <SEP> 0,1, <SEP> CaCO3: <SEP> 0,1 <SEP> 0 <SEP> 54 <SEP> 37 <SEP> 0 <SEP> 69 <SEP> 5
<tb> Pharmamedia1 <SEP> : <SEP> 2, <SEP> 5, <SEP> Glucose <SEP> : <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 48 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> Spuren
<tb> nFermamine"2 <SEP> Typ <SEP> III <SEP> : <SEP> 2, <SEP> Stärke <SEP> : <SEP> l <SEP> 
<tb> K2HPO4: <SEP> 0,1, <SEP> MgSO4: <SEP> 0,05 <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP> 19 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> 
 
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Mill   Col.,   Fort Worth, Texas) 2"Fermamine" ist ein enzymatisches Proteinhydrolysat (Sheffield Chemical Co., Norwich, N.

   Y.) 

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Wie ersichtlich, ist ein bevorzugtes Verfahren zur Erzeugung eines Gemisches von Sugordomycinen durch Züchtung von Streptomyces hazeliensis, wie oben angegeben, dadurch gekennzeichnet, dass man Erbsenschrot sowohl als Kohlenstoff- wie Stickstoffquelle verwendet. Eine vorteilhafte Arbeitsweise besteht darin, dass man die Züchtung in Anwesenheit von zirka 0, 5 bis   3%,   insbesondere zirka   0, ils   Di- 
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 biotische Gemisch kann auf verschiedene Weise aus der Gärlösung isoliert werden : Eine Methode besteht darin, dass man die Gärlösung, bevorzugt mit Phosphorsäure, auf einen PH-
Wert von 2 bis 7, insbesondere auf PH 4 bis 4, 5 einstellt, obgleich andere Mineralsäuren, z. B. Salz- säure und Schwefelsäure, auch verwendet werden können. Falls erforderlich, wird eine Filterhilfe, z.

   B.
Diatomeenerde, zugemischt. Die angesäuerte Lösung wird filtriert, der erhaltene Filterkuchen wird in einem organischen Lösungsmittel, z. B. in einem niederen Alkanol, wie Methanol, Äthanol, Butanol, Isobutanol uw. oder auch in Aceton, Methylisobutylketon, Butylacetat oder in einer Mischung dieser
Lösungsmittel, z. B.   Aceton/Methylenchlorid,   Methanol/Benzol usw., insbesondere in Butanol, digeriert und anschliessend filtriert oder abzentrifugiert. Das klare Filtrat oder der Extrakt wird mit Alkali, z. B. 
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 terhalb 50 C. Das gebildete Konzentrat von ungefähr 1/40 des Originalvolumens wird mit einem nichtpolaren Lösungsmittel,   z.

   B.   mit Petroläther (Siedebereich 60 bis 900   C),   Benzol, Hexan, Pentan, Di- äthyläther usw. versetzt, wobei das rohe antibiotische Gemisch als Natriumsalz oder als Gemisch des Natriumsalzes mit der freien Form ausfällt, das durch Sedimentieren, Filtrieren oder Zentrifugieren in einfacher Weise leicht abgetrennt werden kann. 



   Nach einer andern Arbeitsweise wird das rohe Antibiotikum von der Gärlösung in der Weise isoliert, dass man das Mycel abfiltriert, das Filtrat mit einer Mineralsäure auf einen pH-Wert von zirka 1 bis 7 einstellt und anschliessend das angesäuerte Filtrat mit einem wasserunmischbaren Lösungsmittel, wie Butanol, Butylacetat, Äthylacetat, Äther, Chloroform, Methylisobutylketon usw. ausschüttelt. 



   Die organische Phase wird von der wässerigen Schicht abgetrennt. Das rohe, antibiotische Gemisch kann entweder durch Abdampfen des Lösungsmittels erhalten oder an einem Ionenaustauscher, wie z. B. 
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 schliessend durch Elution mit einem Lösungsmittel wie Methanol, isoliert werden. Das Mycel wird abfiltriert und mit einem organischen Lösungsmittel, wie einem niederen Alkanol, z. B. Methanol, Äthanol, Butanol, Isobutanol usw. : oder auch mit Aceton, Butylacetat, Acetomethylenchlorid, Methylisobutylketon, Methanolbenzol usw. extrahiert. Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels zurückbleibende rohe antibiotische Gemisch kann hinterher mit dem aus dem Filtrat erhaltenen antibiotischen Gemisch vereinigt werden. 



   Man kann das rohe Natriumsalz des antibiotischen Gemisches oder das rohe saure Antibiotikum dadurch reinigen, indem man das antibiotische Gemisch in Aceton dispergiert, eine ausreichende Menge Mineralsäure, z. B. Salzsäure, zusetzt, um ein saures p, z. B. von zirka 2 bis 6, bevorzugt zirka    p   4, zu erhalten, das unlösliche Material abfiltriert und den Filterkuchen mit einer kleinen Menge Aceton auswäscht. Das Filtrat wird mit der Waschlösung vereinigt und unter vermindertem Druck abgedampft. 



  Das auf ungefähr 1/6 des ursprünglichen Volumens eingeengte Konzentrat wird mit Wasser und Benzol versetzt. Die sich hier in beiden flüssigen Phasen bildende Feststoffsuspension besteht aus dem freien sauren antibiotischen Gemisch, das abfiltriert und in warmem Methanol digeriert wird. Die sich beim Abkühlen abscheidenden festen Anteile werden abgetrennt. Sie bestehen aus dem gereinigten, freien, sauren, antibiotischen Gemisch. 



   Das rohe antibiotische Gemisch kann auch dadurch gereinigt werden, dass man das Benzylaminsalz herstellt. Hiezu wird das antibiotische Gemisch in einem organischen Lösungsmittel,   z. B.   in   n-Butanol,   n-Butylacetat, Äther, Äthylacetat usw. gelöst und mit einem Überschuss von Benzylamin behandelt. 



  Das Benzylaminsalz der antibiotischen Mischung fällt aus, wobei zahlreiche Verunreinigungen, die in dem antibiotischen Gemisch vorhanden waren, in dem organischen Lösungsmittel   zurückbleiben,   Das ausgefallene Benzylaminsalz wird abfiltriert. Die freien Antibiotika können aus dem Benzylaminsalz durch Behandeln mit einer wässerigen Mineralsäure,   z. B.   wässeriger Salzsäure, erhalten werden. Das freie antibiotische Gemisch kann aus der wässerigen Phase mit Hilfe eines organischen, mit Wasser 

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 nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmittels, z. B. mit n-Butanol, n-Butylacetat, Äther, Äthylacetat usw. extrahiert werden. Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels zurückbleibende Gemisch wird z. B. aus einer warmen Mischung von Methanol/Benzol umgefällt. 



   Andere Amine, die versuchsweise bei der Reinigung des antibiotischen Gemisches verwendet wurden, haben sich nicht bewährt. Nur das Benzylaminsalz erwies sich als völlig befriedigend. Zu andern Basen, die sich nicht als geeignet erwiesen, gehören Calciumhydroxyd, Prokain, Äthylendiamin, Di- äthanolamin, Monoäthanolamin,   N, N'-Dibenzyläthylendiamin,   Dimethyläthanolamin, Hydroxyäthyl- äthyldiamin, Diisobutylamin und Furfurylamin. 



   Das rohe antibiotische Gemisch kann auch dadurch gereinigt werden, dass man das Rohgemisch zwischen einem organischen Lösungsmittel, z. B. Butylacetat, Äther oder Mischungen von Chloroform, 
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 tibiotische Gemisch kann aus der wässerigen Pufferlösung durch Ansäuern, z. B. mit einer Mineralsäure wie Salzsäure, Schwefelsäure usw. bis zu einem PH von zirka 2 bis 5 isoliert werden. Die entstehende Suspension kann mit einem organischen, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmittel,   z. B.   mit n-Butanol, n-Butylacetat, Äther,   Äthylacetat usw. extrahiert werden. Das gereinigte,   saure, antibiotische Gemisch wird anschliessend, z. B. durch Abdampfen des organischen Lösungsmittels, isoliert. 



   Das nach einer der obigen Methoden gereinigte antibiotische Gemisch kann anschliessend mit Hilfe eines   Gegenstromverteilungssystems,   z. B. nach Craig, in seine Bestandteile aufgetrennt werden. Das hiebei verwendete organische Lösungsmittel ist mit Wasser unmischbar oder nur wenig mischbar, wie   z. B.   n-Butanol, N-Butylacetat, Äther, Äthylacetat,   Chloroformisopropanol usw.   Die wässerige Phase wird auf einen PH-Wert von zirka 6 bis 9, insbesondere zirka 8 bis 8, 9, eingestellt. Als Puffer können die üblicherweise für diesen Zweck gebräuchlichen Phosphate und Borate verwendet werden. 



   Die erfindungsgemäss erhältlichen Antibiotika sind dadurch charakterisiert, dass sie gegen Staphylococcus aureus hochaktiv sind. Ausserdem sind die Antibiotika gegen eine grosse Klasse von gramm-positiven und gramm-negativen Bakterien,   z. B.   gegen Aerobacter aerogenes, Mycobacterium phlei, Proteus vulgaris, Sarcina lutea PCI-1001 usw. wirksam. 



   Die erfindungsgemäss erhältlichen Antibiotika sind deshalb geeignet, bakterielle Infektionen, wie sie z. B. von Staphylococcus aureus ausgelöst werden, zu bekämpfen. Wahlweise kann auch das gereinigte antibiotische Gemisch als Therapeuticum verwendet werden. 



   Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden, welche sie oder ihre Salze in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen inerten Trägermaterial, wie z. B. 



  Wasser, Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline usw. enthalten. Die pharmazeutischen Präparate können in fester Form, z. B. als Tabletten, Dragées, Suppositorien, Kapseln oder in flüssiger Form,   z. B.   als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes oder Puffer. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

   Beispiele pharmazeutischer Präparate sind : Tabletten zu 320 mg enthaltend 100   mg N, W-bis- {4-Hydroxy-8-me-   
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 157 mg Maisstärke und 3 mg Magnesiumstearat, des weiteren Trockenampullen, enthaltend 500 mg von Wirkstoff A, ferner Kapseln zu 310 mg, enthaltend 100 g von Wirkstoff A, 200 mg Maisstärke und 10 mg Talk. 



     Beispiel l :   Eine Subkultur von Streptomyces hazeliensis NRRL 2938 wird in Sporenform aufbewahrt,   u. zw.   entweder auf einem Tomaten-Hafermehl-Agar in Medizinalflaschen oder in gefriergetrockneter Form, wobei die Sporen in   101o   Rinderserum oder in   10%   Magermilch suspendiert sind. In 
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<tb> 
<tb> :1 <SEP> % <SEP> Erbsenschrot,
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Maisstärke, <SEP> 
<tb> 0,1% <SEP> Calciumcarbonat, <SEP> 
<tb> 0, <SEP> ils <SEP> Dikaliumphosphat <SEP> und
<tb> 0, <SEP> ils <SEP> Schweineschmalz
<tb> 
 

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 wird eine wässerige Sporensuspension zugesetzt und bei 280 C 3 bis 5 Tage auf einer Schüttelmaschine bei 200 Umdr/min pro min bebrütet, bis ein lebhaftes Wachstum eintritt.

   Die Bebrütung wird in einem Gefäss durchgeführt, das für die Belüftung der Nährlösung geeignet ist, z. B. in der oben erwähnten   Schüttelflasche   oder in einer Gaswaschflasche. Mit der auf diese Weise erhaltenen   Impflösung   werden 250 1 wässerige Nährlösung in einem 400 1-Gärkessel beimpft. Die Nährlösung besteht aus : 
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<tb> 
<tb> 3 <SEP> % <SEP> Erbsenschrot,
<tb> 0,1 <SEP> % <SEP> Calciumcarbonat,
<tb> 0,1 <SEP> % <SEP> Dikaliumphosphat,
<tb> 0, <SEP> 03% <SEP> Silikon-Paste <SEP> (Dow-Corning
<tb> Silikon <SEP> A-Paste), <SEP> und
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Schweineschmalz.
<tb> 
 



   An Stelle dieser Nährlösung können auch 250 1 einer Nährlösung der erstgenannten Zusammensetzung eingesetzt werden. Der Gärkessel wird 3 bis 4 Tage bei einer Temperatur von 280 C gehalten. Die Luftmenge beträgt 225   l/min.   Während dieser Zeit steigt die Viskosität deutlich an, während der 
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<tb> 
<tb> 3 <SEP> % <SEP> gemahlenem <SEP> Erbsenschrot,
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Calciumcarbonat,
<tb> 0, <SEP> l <SEP> % <SEP> Dikaliumphosphat <SEP> und <SEP> 
<tb> 0, <SEP> 03-0, <SEP> 05% <SEP> Dow-Corning <SEP> Silikon <SEP> A, <SEP> suspendiert <SEP> in
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Soyabohnenöl. <SEP> 
<tb> 
 



    Man lässt die Lösung 5 bis 8 Tage bei 280 C gären. Der Verlauf der Gärung wird mit Hilfe der in vitro Teste kontrolliert. Die Luftmenge wird während der ersten 24 h auf 700 l/min eingestellt, dann während der folgenden 24 bis 72 h auf 2800 I/min und während der weiteren 72 bis 168 h auf 4000 l/ min erhöht. Anschliessend wird der pH-Wert der Gärlösung durch Zusetzen einer sirupösen, 85% eigen Phosphorsäure auf PH 3, 9 eingestellt. Nach Zugabe von 750 kg Diatomeenerde wird die angesäuerte Lösung filtriert. Der Filterkuchen wird in 7 500 1 n-Butanol aufgeschlämmt und intensiv gerührt. Man lässt die Aufschlämmung über Nacht stehen, ohne zu rühren.

   Der durch Zentrifugieren erhaltene klare Butanolextrakt wird anschliessend mit 1482 ml 50% iger NaOH-Lösung bis zu einem pH-Wert von zirka 7 neutralisiert und schonend unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 500 C auf ein Volumen von 200 1 eingeengt. 



  Dieses Konzentrat wird unter lebhaftem Rühren in 1000 1 Petroläther (Siedebereich 60 bis 900 C) eingetragen. Das ausfallende rohe Natriumsalz des antibiotischen Gemisches besteht vermutlich aus einem Gemisch der sauren und teilweise neutralen Form der verschiedenen Komponenten des antibiotischen Gemisches. Das rohe Natriumsalz wird durch Zentrifugieren isoliert und anschliessend getrocknet. 



  Beispiel 2 : Reinigung des rohen Natriumsalzes a) Durch Verteilen zwischen einem Lösungsmittel und einem Puffer 50 g des oben erhaltenen rohen Natriumsalzes werden in 1 1 Methanol suspendiert und 30 min gerührt. Das unlösliche Material wird abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck bis zu einem dicken Sirup konzentriert. Dieser wird in 25 ml Methanol und 625 ml 0, In-Salzsäure suspendiert. Die   
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    5 1sche   Lösung 2 mal mit je 1, 111/15 M Phosphatpuffer PH 7, 8 extrahiert, worauf das antibiotische Gemisch in die wässerige Phase wandert. Die Suspension wird auf einen pH-Wert von 7, 0 eingestellt und mit n-Butanol extrahiert, wobei der Niederschlag in Lösung geht. Das n-Butanol wird unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in 1/15 M Phosphatpuffer PH 6, 5 suspendiert.

   Das unlösliche, gereinigte, antibiotische Gemisch wird abfiltriert und getrocknet. b) Durch die Herstellung der Benzylaminsalze
100 g des rohen Natriumsalzes werden in 10 11/15 M Dinatriumphosphatpuffer pi 9, 5 aufgelöst. 

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Die unlöslichen Anteile werden in Gegenwart eines Filterhilfsmittels abfiltriert. Das dunkel gefärbte
Filtrat wird mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 2, 5 eingestellt. Die erhaltene Suspen- sion wird anschliessend mit der gleichen Menge Butylacetat extrahiert, wobei das ausgefallene Antibio- tikum in Lösung geht. Die Butylacetat-Lösung wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von
1800 ml konzentriert. Nach Abtrennen einer geringen Menge unlöslichen Materials wird das Filtrat mit einer Lösung von 100 ml Benzylamin in 100 ml Butylacetat versetzt.

   Das sich in Form eines feinen
Niederschlages absetzende Benzylaminsalz der Antibiotika wird abfiltriert, mit wenig Butylacetat und anschliessend mit wasserfreiem Äther gewaschen. 



   20 g dieses Benzylaminsalzes der Antibiotika werden in 140 ml Methanol aufgelöst und nach Zuga- be von 190 ml Wasser mit Hilfe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 2, 5 eingestellt. Um die Viskosi- tät der Suspension zu erniedrigen, werden weitere 300 ml Wasser zugesetzt. Die Mischung wird darauf
2 mal mit je 400   ml   Butylacetat extrahiert. Die vereinigten Butylacetatextrakte werden auf ungefähr
800 ml konzentriert. Die bei dieser Konzentration ausfallende, rohe Säure wird abfiltriert und mit kal- tem Methanol gewaschen. Durch Lösen in einer Mischung von heissem Methanol und Benzol kann dieses
Produkt umgefällt werden.

   Die sich hiebei in fein verteilter Form abscheidenden Antibiotika schmelzen nach dem Trocknen bei 228 bis 2300 C. c) Durch Extraktion mit Aceton
50 g des rohen Natriumsalzes werden in 600 ml Aceton suspendiert und nach Zugabe von 30 ml einer   10%igen   wässerigen Salzsäure 12 h gerührt. Die unlöslichen Anteile werden abfiltriert und mit wenig Aceton gewaschen. Das mit dem Waschaceton vereinigte Filtrat wird unter vermindertem Druck bis auf ungefähr 100 ml abgedampft. Zu diesem Konzentrat werden 500 ml Wasser und 200 ml Benzol zugegeben, wobei eine Suspension von festem Material in zwei flüssigen Phasen entsteht. Der Nieder- schlag dieser Suspension besteht aus dem rohen, sauren, antibiotischen Gemisch. Er wird in 100 ml
Methanol bei 40 bis 500 C dispergiert, dann auf Zimmertemperatur abgekühlt und 12 h in der Kälte stehen gelassen.

   Der sich abscheidende Feststoff besteht aus dem gereinigten antibiotischen Gemisch. 



   Beispiel 3 : Trennung des gereinigten antibiotischen Gemisches in seine Komponenten
5 g des durch den Reinigungsprozess mit Aceton erhaltenen gereinigten, antibiotischen Gemisches werden in einen 200-Röhrchen Craig Gegenstromverteilungsapparat zwischen einer oberen wässerigen Phase von 1/15   KHPO   Puffer   (pj.   8, 2) und einer unteren organischen Phase, bestehend aus gleichen Teilen Isopropylalkohol und Chloroform, verteilt. Nachdem sich das Gleichgewicht zwischen dem Puffer und der organischen Phase eingestellt hat, wird die Verteilung in gewöhnlicher Weise über die 200 Röhrchen, von denen jedes 40 ml von jeder Phase enthält, durchgeführt. Die Verteilung liefert ein Gemisch der Antibiotika III, IV, V und VI in den Röhrchen 1 bis 140 und ein Gemisch der Antibiotika VII, VIII, IX und X in den Röhrchen 141 bis 200. 



   Dieses Verfahren wird anschliessend in 200 zusätzlichen Röhrchen mit einem Puffer PH 8, 9 wiederholt. 



   In der oberen Phase des wiederholten Verfahrens (total 400 Röhrchen) befindet sich das Antibiotikum III in den Röhrchen 120 bis 152. Die Antibiotika IV und V befinden sich in den Röhrchen 161 bis 170. Die Antibiotika V und VI befinden sich in den Röhrchen 185 bis 195. Es ist nicht mit Sicherheit festgestellt worden, ob in den Röhrchen 161 bis 170 das Antibiotikum der Formel IV oder V vorhanden ist und welches Antibiotikum in den Röhrchen 185 bis 195 anwesend ist. Die Röhrchen 153 bis 160 enthalten entweder ein Gemisch der Antibiotika III und IV oder III und V und die Röhrchen 171 bis 184 enthalten ein Gemisch der Antibiotika IV und V. 



   In der unteren Phase enthalten die Röhrchen dieselbe antibiotische Verteilung wie in der oberen Phase. 



   Die Antibiotika werden aus der Lösungsmittelphase durch Zusammengiessen von Röhrchen gleichen Inhalts isoliert. Das Antibiotikum III wird z. B. durch Zusammengiessen der Röhrchen 120 bis 152 und durch Abdampfen der gesammelten Lösungsmittel bis zur Trockene erhalten. Die Pufferphase der oben   angegebenen Gruppen von Röhrchen wird auf einen pH-Wert von 2, 5 angesäuert. Das Antibiotikum wird in Butanol oder in einer Mischung von Chloroform {Isopropylalkohol (1 : 1) extrahiert. Der Lösungsmit-   telextrakt wird zur Trockene eingedampft, wobei das Antibiotikum sich als Rückstand abscheidet. 



   Das durch die oben beschriebene Gegenstromverteilung erhaltene Antibiotikum III wird anschlie- ssend durch weitere 200 Röhrchen geschleust. Es werden 3 Isomere erhalten, u. zw. in den Röhrchen 90 bis 100, in dem Röhrchen 120 und in dem Röhrchen 140. Dies weist auf die Anwesenheit verschiedener naher verwandter Isomeren hin, von denen die absolute Struktur zur Zeit nicht bekannt ist. Alle diese Isomere sind bioaktiv,   d.   h. sie haben eine hohe Aktivität gegen Staphylococcus aureus. 

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   Das oben isolierte Gemisch der Antibiotika VH, VIII, IX und X wird mit Hilfe der Gegenstromver- teilung nach Craig mit 200 Röhrchen in ein Gemisch der Antibiotika VII und VIII und in ein Gemisch der Antibiotika IX und X aufgetrennt. Das verwendete Lösungsmittelsystem besteht aus den gleichen
Teilen derselben organischen Phase, wie sie oben verwendet wurde, d. h. eine volumengleiche Mii schung vonisopropylalkohol und Chloroform, während die wässerige Phase aus einem 1/15 M Dikalium- phosphatpuffer PH 7, 0 besteht. Nachdem sich das Gleichgewicht zwischen dem Lösungsmittel und dem
Puffer eingestellt hat, wird das obige antibiotische Gemisch   vn   bis X in den Apparat eingefüllt und durch die 200 Röhrchen geschleust. Das Gemisch der Antibiotika VII und VIII liegt bei dem Röhr- chen 110 und das Gemisch der Antibiotika IX und X bei dem Röhrchen 170. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Gewinnung eines Gemisches neuer Antibiotika, dadurch gekennzeichnet, dass man den Organismus Streptomyces hazeliensis var. hazeliensis, NRRL 2938, oder eine von dessen natürlichen bzw. künstlichen Mutanten in einer wässerigen Kulturflüssigkeit, die eine organische C- und N-Quelle enthält, submers und aerob kultiviert und das gebildete antibiotische Gemisch aus der
Gärlösung gewinnt und gegebenenfalls in ein Salz überführt.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als C- und N-Quelle Erbsenschrot verwendet und das antibiotische Gemisch durch Extrahieren der geklärten Lösung und des Mycels mit Hilfe eines Lösungsmittels gewinnt.

   3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man der Kul- turflüssigkeit zusätzlich anorganische Salze beifügt und den Organismus zirka 2 bis 6 Tage kultiviert, bis das Medium stark antimikrobiell wirksam geworden ist, wonach man das gebildete antibiotische Gemisch, das Verbindungen der allgemeinen Formel EMI14.1 worin R und R Wasserstoff, 2-Pyrroyl oder 5-Methyl-2-pyrroyl darstellen, wobei nur einer der Reste R und R Wasserstoff bedeuten kann, enthält, aus der Gärlösung gewinnt und anschliessend ein Antibiotikum der Formel EMI14.2 <Desc/Clms Page number 15> durch Gegenstromverteilung über multiple Lösungsmittelsysteme isoliert, die aus einer organischen Phase, die nur beschränkt mit Wasser mischbar ist und einer wässerigen Phase,

   die auf einen pH-Bereich von zirka 6 bis 9 eingestellt ist, bestehen.