Verfahren zur Herstellung von Antibiotika
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neue Antibiotika enthaltenden Gemischs. Diese Antibiotika können durch Züchtung von Mikroorganismen erzeugt werden, die der Gattung Streptomyces angehören.
Der Organismus, der für die erfindungsgemäss herstellbaren neuen Antibiotika eingesetzt wurde, führt die Bezeichnung Streptomyces hazeliensis var. hazeliensis nov.
sp. Dieser Organismus wurde aus einer Bodenprobe, die in Matane, Gaspe, Canada gefunden wurde, isoliert. Der Einfachheit halber wird dieser Organismus als Streptomyces hazeliensis bezeichnet. Eine Kultur dieses Streptomyces hazeliensis wurde in der Mikroorganismensammlung des United States Department für Landwirtschaft, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, III. (USA) unter Nr. NRRL 2938 hinterlegt.
Die im erfindungsgemäss erhältlichen Gemisch enthaltenen Antibiotika werden als Sugordomycine bezeichnet.
Sie können durch die folgende allgemeine Formel dargestellt werden:
EMI1.1
worin R1 und R2 Wasserstoff, 2-Pyrroyl oder 5-Methyl-2pyrroyl darstellen, wobei nur einer der Reste Rr und R2 Wasserstoff bedeuten kann.
Besonders interessante, nach dem erfindungsgemässen Verfahren herstellbare Antibiotika werden durch die allgemeine Formel
EMI1.2
in der Substituenten R1 und R2 die oben angege bene Bedeutung haben, charakterisiert.
Das erfindungsgemässe Verfahren betrifft die Herstel- lung eines Verbindungen der Formel I enthaltenden anti biotischen Gemisches und ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Organismus Streptomyces hazeliensis in einer wässerigen Kulturflüssigkeit, die eine organische C und N-Quelle enthält, submers und aerob kultiviert und das gebildete antibiotische Gemisch aus der Gärlösung gewinnt.
Die erfindungsgemäss herstellbaren Salze werden durch Umsetzen mit geeigneten Basen erhalten Beispiele für solche Salze sind das Natriumsalz, Kaliumsalz, Ammo niumsalz oder andere pharmazeutisch geeignete Basenad ditionssalze.
Das Verfahrensprodukt kann die besonders bevorzug ten Verbindungen der Formeln I und 11 enthalten: a) N,N'-bis[4-Hydroxy-8-methyl-1-14-0-methy dimethyl-3-0(5'-methyl-2'-pyrrol)-α-L-]yxopyra- nosyloyl-2-oxo-2H-1-venzopyran-3-yl-3-methyl pyrroldicarboxamid (R, und R2 = 5-Methyl-2-pyrroyl).
Zu den weiteren Antibiotika der Formel 11, die durch das erfindungsgemässe Verfahren hergestellt werden können, gehören folgende: b) N-14-Hydroxy-8-methyl-7-[4-0-methyl]-5,5 dimethyl-3-0(2'-pyrroyl)-α-L]yxopyranosyloxyl- 2-oxo-2H-1-benzopyran-3-yl]-N4-[4-hydroxy-8-methyl7-[4-0-methyl-5,5-dimethyl-3-0(5'-methyl-2'-pyrrol) α-L-lyxopyranosyloxyl-2-oxo-2H-1-benzopyran-3-yl]-3- methyl-2,4-pyrroldicarboxamid (R1 = 2Pyrroyl und R2 = 5-Methyl-2-pyrroyl).
c)Nê-(4-Hydroxy-8-methyl-7-[4-0-methyl-5,5 dimethyl-3-0=(5'-methyl-2'-pyrroyl)-α-L-lyxopyranosyloxyl-2-oxo-2H-1-benzopyran-3-yll-N4-14- hydroxy-8-methyl-7-[4-0-methyl-5,5-dimethyl-3-0(2' pyrrol)-α-L-lyxopyranosyloxyl-2-oxo-2H-1-benzopyran- 3-yll-3-methyl-2,4-pyrroldicarboxamid (R1 = 5-Methyl-2-pyrroyl und R2 = 2-Pyrroyl).
d) N,N'-bis-[4-Hydroxy-8-methyl-7-[4-0-methy dimethyl-3-0-(2'-pyrroyl)-α-L-lyxopyranosyloxyl- 2-oxo-2H-1-benzopyran-3-yll-3-methyl-2,4pyrroldicarboxamid (Rl und R2 = 2-Pyrroyl).
e)Nê-[4-Hydroxy-8-methyl-7-[4-0-methyl-5,5 dimethyl-3-0(5'-methyl-2'-pyrrol)-α-L-lyxopyra- nosyloxyl-2-oxo-2H-1-benzopyran-3-yll-N4-14hydroxy-8-methyl-7-14-0-methyl-5,5-dimethyl α-L]yxopyranosyloxyl]-2-oxo-2H-1-benzopyran-3-yll-3-methyl 2,4-pyrroldicarboxamid (R1 = 5Methyl-2pyrroyl und R2 = Wasserstoff).
f) Nê-(4-Hydroxy-8-methyl-7-[4-0-methyll-5,5-dimethyl-α- L-lyxopyranosyloxyl]-2-oxo-2H-1-benzopyran-3-yll-N4-[4-hydroxy8-methyl-7-14-0-methyl-5,5-dimethyl-3-0(5'-methyl-2'-pyrroyl) α-L-lyxopyranosyloxyl-2-oxo-2H-1-benzopyran-3-yll-3-methyl 2,4-pyrroldicarboxamid (R1 = Wasserstoff und R2 = 5 Methyl-2-pyrroyl).
g) Nê-14-Hydroxy-8-methyl-7-[4-0-methyl-5,5-dimethyl-3 (2'-pyrroyl)-α-L-lyxopyranosyloxyl-2-oxo-2H-1-benzopyran 3-yll N4-[4-hydroxy-8-methyl-7-[4-0-methyl-5,5-dimethyl-α-L-lyxo- pyranosyloxyl-2-oxo-2H-2H-1-benzopyran-3-yll-3-methyl-2,4-pyrroldicarboxamid (R1 = 2Pyrroyl und R2 = Wasserstoff).
h) Nê-[4-Hydroxy-8-methyl-7-[4-0-methyl-5,5-dimethyl-α- L-lyxoparansyloxyl-2-oxo-2H-1-benzopyran-3-yll-N4-14-hydroxy 8-methyl-7-14-0-methyl-5,5-dimethyl-3-0-(2'-pyrroyl)-α-L-lyxo- pyranosyloxy-2-oxo-2H-1-benzopyran-3-yll-3-methyl-2,4-pyrrol-dicarboxamid (R, = Wasserstoff und R2 = 2-Pyrroyl).
Streptomyces hazeliensis ist ein aerober, in der Luft sporulierender Vertreter der Ordnung Actinòmycetales und gehört zu der Gattung Streptomyces (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th edition, 1957). Obgleich dieser Organismus mit Streptomyces griseoflavus Stamm-Nr. l60, Streptomyces niveus NRRL 2446, Streptomyces sphaeroides NRRL 2449, Streptomyces Nr.
58383, Streptomyces spirogriseus NRRL 2590 und Streptomyces griseus ATCC 12 318 verwandt angesehen werden kann, gibt es zahlreiche Unterschiede zwischen den obigen Organismen und Streptomyces hazeliensis, die die eindeutige Feststellung erlauben, dass letzterer mit keiner der früheren Spezies identisch ist. Die Unterschiede in der Morphologie und in der Sporenfarbe sind genügend klar, um Streptomyces hazeliensis von allen Antibiotika produzierenden Streptomyces-Spezien zu unterscheiden, gemäss der Klassifizierung von T. G. Pridham, C. W. Hesseltine und R. G Benedict, Appl.
Microbiology 6: 52-79 (1958): A guide for the classification of Streptomyces according to selected groups.
Eine andere entscheidende Differenzierung besteht in der Verschiedenheit zwischen den aus Streptomyces hazeliensis hergestellten Antibiotika und dem aus den obengenannten Organismen hergestellten Novobiocin.
Kulturen von Streptomyces hazeliensis, die auf geeigneten Nährböden gezüchtet werden, wie Tomaten-Soya- ,.
Agar bei 28 C während 2-10 Tagen, bilden ein Luftmycel, das gewöhnlich weiss ist und sich bei der Sporulierung grau bis graubraun verfärbt. Auf verschiedenen Nährböden bildet sich ein farbloses bis gelbes Exudat. Sporophoren auf Bennett-Agar und auf Asparagin-Agar sind meistens gestreckt bis schlangenförmig, bisweilen in einem weiten Haken oder in einer Schlinge oder in losen, offenen charakteristisch weiten (Diameter 7 ,u) Spiralen mit I bis 5 Schlingen endend, wobei die Spiralen unregelmässig in Form und Abstand zwischen den Schlingen ausgebildet sind. Die Sporen sind oval bis zylindrisch und variieren in der Breite von I bis l,2 y, in der Länge von l,4 bis 2,4 ,u.
Gut geformte Spiralen konnten weder auf Czapek-Agar noch auf Hefe-Malz-Agar beobachtet werden, wohl aber kleine Haken oder primitive Spiralen. Bisweilen entstehen, ausgehend von einem Punkt, bis 5 Sporophoren in besen ähnlicher Form. Es sind keine ballähnlichen, dichten oder kompakten Spiralen, wie sie bei der Kultur von Streptomyces sphaeroides vorhanden sind. Obwohl einige Sporophoren gebüschelt auftreten, sind sie an ihrem Ende nicht, wie es für Streptomyces niveus charakteristisch ist, wie ein Korkenzieher gewindet. Im Gegenteil, die Sporophoren von Streptomyces hazeliensis sind an ihrem Ende grösser, weiter und lockerer und werden enger und dichter bei dem Ansatzpunkt der Hyphen.
Um Streptomyces hazeliensis mit bekannten Strepto- myces, die in klassischer Weise sowohl auf komplexen stickstoffhaltigen Nährböden, wie auch auf chemisch definierten Nährböden gezüchtet werden [Pridham und Gottlieb, J. Bact. 56, l07-ll5 (1948)1, vergleichen zu können, wurden diese beiden Nährbodentypen verwendet. Zur Methodik und den Nährböden siehe die oben beschriebene Literaturstelle von Pridham und Gottlieb sowie ferner Gottlieb D., Appl.
Microbiology 9: 55-65 (196l); A Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria von der Committee on Bacteriologic Technic of the Society of American Bacteriologists , 1948; und Waksman, The Actinomycetes (Chronica Botanica Co. I950).
Auf den von Bennett und Czapek verwendeten Agar- nährböden wuchsen alle Streptomyces-hazeliensis-Stämme lebhaft bei 22 , 28 und 35 C Bei den höheren Tempera turen wurde eine bessere Sporulierung beobachtet. Anderseits wuchsen Streptomyces niveus und Streptomyces sphaeroides gut bei den niederen Temperaturen aber überhaupt nicht bei 35 "C. Streptomyces Nr. 160 und Streptomyces sp. Nr. 58 383 wachsen ebenfalls nicht bei 35 "C.
Das Wachstum von Streptomyces hazeliensis auf verschiedenen Nährböden ist unten beschrieben. Die aufgeführten Farbtöne stimmen mit der im Color Harmony Manual 4th Edition, Container Corporation of America, Chicago, lllinois, 1958, vorhandenen Farbskala überein:
Saccharose-Nitrat-Agar (Czapek Saccharoseµ. Wachstum gut aber keine Sporulation; Farbe des Luftmycels creme (zwischen Farbton 2 cc und chm grau Massstab d).
Farbe der Unterseite creme-braun, Pigment creme (Farbton ca. 2).
Glukose-Asparagin-Agar: Wachstum lebhaft, leicht erhobene, glatte Oberfläche; Farbe des Luftmycels schwach grau, mit schwach grauen Sporen. Farbe der Unterseite blass creme; kein lösliches Pigment. Ein Stamm zeigt winzige klare Tropfen eines Exudats am Filamentende.
Glukose-Nähr-Agar: Wachstum mässig, flach, lederartig, mit starken Falten im Agar. Farbe des Luftmycels weiss, Farbe der Unterseite dunkel creme; lösliches Pigment bräunlich gefärbt (Farbton 4 ne). Streptomyces sphaeroides zeigt mässiges Wachstum mit keinem löslichen Pigment, während Streptomyces niveus gut wächst unter Bildung von löslichem Pigment. Streptomyces sp.
Nr. 58 383 zeigt lebhaftes Wachstum, aber kein lösliches Pigment.
Glukose-Glycerin-Agar: Lebhaftes Wachstum, sehr tiefe Falten im Agar; Oberfläche gerunzelt, mit Sprüngen.
Vegetatives Mycel schwach lohfarben, mit einigen ziemlich grossen Tropfen von schwach gelb gefärbtem Exudat.
Farbe des Luftmycels teilweise weiss bis grau-braun (chm.
nahe grau 5 dc), ca. 25 % sporuliert. Farbe der Unterseite kaffeebraun; lösliches Pigment schwach braun-gelb (Farbton 3 ie) bis braun gefärbt.
Amidex-Agar: Wachstum mässig bis gut, flach, Farbe des Luftmycels mittelgrau; Farbe der Unterseite cremebraun bis dunkel kaffeebraun. Lösliches Pigment rot-braun (Farbton 4 pe-pg).
Tomatenpaste-Hafermehl-Agar: Starkes Wachstum mit guter Sporenbildung; einige Tropfen Exudat. Farbe des Luftmycels grau bis graubraun (chm. nahe grau 5 fe).
Farbe der Unterseite dunkel bräunlich oliv mit schmutzigem olive-gefärbtem löslichem Pigment.
Magermilch-Agar: Substrat Wachstum gut, teigig, glatt, ohne Luftmycel. Starke Produktion von löslichem, dunkelbraunem Pigment, an den Fadenenden schwach braun gefärbt (Farbton 5 n-i und Farbton 3 ie).
Pepton-Eisen-Agar: Nur ein paar Kolonien; glatt teigig, regelmässig gefurchte Kegel mit hellweisser Oberfläche. Farbe des Luftmycels dunkelcreme, Oberfläche weiss gefärbt. Lösliches Pigment von dunkelbrauner Farbe (Farbton 4 pn).
Bennett's Agar: Wachstum lebhaft, Farbe des Luftmycels grau mit graubraunen (rötlichen) Sporen. Bildung von blass gelben Exudattropfen. Farbe der Unterseite gelbbraun; lösliches Pigment hellgelb-braun gefärbt (Farbton 3 pc). Ein zweiter Stamm zeigte kein Exudat. Ein dritter Stamm bildete ein sich verbreitendes gelbes Exudat, das die gesamte Wachstumsoberfläche benetzte.
Kartoffelstückchen: Wachstum nach zwei Wochen: mässig. Schwärzung der Kartoffeln bereits nach 4 Tagen.
Anderseits zeigten Streptomyces sphaeroides und Streptomyces niveus zunächst mässiges, dann langsam steigend gutes Wachstum mit gräulich weisser Sporenbildung unter bräunlicher Verfärbung der Kartoffeln. Streptomyces Nr.
160 zeigte ein lebhaftes, stark gerunzeltes Wachstum.
Karottenstückchen: Sehr gutes Substratwachstum von weisser Farbe, die bei der Sporenbildung rauchgrau bis blaugrau wird. Etwas klar gelbes Exudat. Streptomyces niveus zeigte mässiges Wachstum mit weissem Luftmycel, während bei Streptomyces sphaeroides kein Wachstum beobachtet wurde.
Proteolytische Aktivität a) Gelatine: Drei Röhrchen wurden mit Hilfe einer Nadel mit einer Sporensuspension beimpft. Vor der Beurteilung wurden die Röhrchen während einer Stunde bei 3 OC aufbewahrt und dann wieder auf Zimmertemperatur gebracht. Nach 7 Tagen: keine Verflüssigung, kleine weisse Kolonien an der Oberfläche mit dunkelbraunem, löslichem Pigment (Farbton 2 pi-pl) unmittelbar bei den Kolonien. Nach 14 Tagen: ca. 25 /0 Verflüssigung, ziemlich gutes Wachstum an der Oberfläche, ferner einige kugelige Kolonien submers in der verflüssigten Phase; dunkelbraunes lösliches Pigment. Nach 21 Tagen: lOO0Ioige Verflüssigung, Farbe der Gelatine braun-gelb (Farbton 2 pc) während die Farbe der Kontrollröhrchen einen Farbton von l-'L ca zeigte.
In der Literatur wird angegeben, dass Streptomyces niveus und Streptomyces sphaeroides gutes Wachstum auf Gelatine zeigen aber kein lösliches Pigment bilden. Die erstgenannte Spezies zeigt eine teilweise Verflüssigung, die letztgenannte eine schnelle (innerhalb von 3-10 Tagen eintretende) Verflüssigung. Streptomyces Nr. 160 verflüssigt sich schnell, bildet aber kein lösliches Pigment. Streptomyces sp. Nr. 58383 wächst auf Gelatine dürftig und verflüssigt sich nicht.
b) Milch: Alle fünf getesteten Streptomyces-hazeliensis Stämme bilden innerhalb 2 Tagen schwache, cremefar- bene Oberflächenwachstumshäutchen; keine Koagulierung oder Peptonisierung, pH (Glaselektrode) unverändert wie Kontrollröhrchen: 6,0 bis 6,2.
Nach 7 Tagen bilden alle Stämme gut geformte, feste, creme- bis leicht braunfarbene Oberflächenwachstumshäutchen, mit einem braunen Ring an der Röhrchenwand; Farbe des löslichen Pigments cremegelb bis leicht orange.
Ein Stamm zeigte leichte Peptonisierung; pH-Bereich 5,3-5,7 (Kontrolle pH 5,7-6,1).
Wachstum der Oberfläche nach 14 Tagen gut ohne Sporulierung; Luftmycel lederartig; Farbe rosa-creme bis schwach braun oder lila: keine Koagulierung aber schwache Peptonisierung. Farbe der nicht-peptonisierten Phase: creme-orange (Farbton 4 ca-en); pH 5,2-5,7 (Kontrolle pH 5,6).
Streptomyces Nr. 160 zeigte starke Koagulierung und starke Peptonisierung von Milch.
Nitrat-Reductase Aktivität a) Organische Lösung: Nach 14 Tagen: gutes Wachstum, dicke, weisse Häutchen; dunkelgelb gefärbtes, lösliches Pigment. Schwache Nitritbildung die sich nach 21 Tagen verstärkt; starkes Oberflächenwachstum mit beginnender Sporenbildung, Farbe leicht grau.
b) Anorganische Lösung: Leichtes Wachstum mit keiner Reduktion innerhalb 14 Tagen; gutes Oberflächenwachstum nach 21 Tagen, aber keine Nitritbildung, Nitrat noch anwesend. Smith et al., Streptonivicin, A New Antibiotic, Antib. and Chemother. 6,135-142 (1956), fanden, dass Streptomyces niveus keine Nitratreduktion weder in synthetischer noch in natürlicher Nitratlösung zeigt; Strep tomyces sphaeroides zeigt nur schwache Reduktion von Nitrat-Agar zu Nitrit in 4 Tagen, während bei Streptomyces sp. Nr. 58383 eine stark positive Nitritbildung beobach tet wurde.
Bildung von Schwefelwasserstoff: Nach 21 Stunden zeigten Schräg-Agar-Kulturen ein sehr schwaches Wachstum aber eine starke H2S-Entwicklung; nach 14 Tagen: Kolonien mit blanker Oberfläche unter Verfärbung des Nährbodens von dunkelblau bis dunkelbraun.
Tyrosin-Agar: Bei allen 5 Stämmen: Tyrosinase-Reaktion positiv. Leichtes Wachstum nach 14 Tagen. Farbe des Luftmycels weiss, Farbe der Unterseite weiss. Keine Pigmentbildung nach 7 Tagen. Farbe des Pigmentes nach 14 Tagen: beigegrau, Farbton 3 ec-ge (Kontrolle Farbton 1-'/2 db).
Verwertung von Kohlenstoff: Xylose, Arabinose, Rhamnose, Glucose, Fructose, Saccharose, Lactose, Raffinose (+), Inosit, Cellobiose, Trehalose, Citrat, Maleat und Succinat werden verwertet. Nicht verwertet werden Inulin, Maltose, Mannit, Sorbit, Acetat, Formiat, Oxalat und Tartrat.
Es ist zu bemerken, dass Streptomyces niveus und Streptomyces sphaeroides Inulin, Maltose, Mannit und Sorbit verwerten im Gegensatz zu Streptomyces hazeliensis, wobei sie im Gegensatz zu letzteren in Parallelversuchen nicht auf Citrat- oder Succinatnährböden wuchsen.
Streptomyces niveus verwertet Formiat, Oxalat, Tartrat und Natriumcitrat.
Verwertung von Stickstoff: L (+) Arginin wird verwertet. Nicht verwertet werden Methionin, Sarcosin, Creatin, Aminoisobuttersäure, Taurin und Betain.
Produktion von Antibiotika: Durch Züchtung von Streptomyces hazeliensis erhält man Sugordomycine, aber auch unter den verschiedensten Bedingungen kein Novobiocin. Streptomyces sphaeroides und Strepiomyces niveus produzieren dagegen beide Novobiocin aber kein Sugordomycin-Antibioticum, selbst auf Nährböden auf denen Streptomyces hazeliensis nur Sugordomycin-Antibiotica bildet.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sich Streptomyces hazeliensis morphologisch sowohl von Streptomyces niveus als auch von Streptomyces sphaeroides unterscheidet, indem die Spitzen der Sporophoren keine korkenzieherartigen Schlingen bilden, wie es für Streptomyces niveus charakteristisch ist und indem die dichteh, kompakten, ballähnlichen Spiralen fehlen, wie sie typisch sind bei Streptomyces sphaeroides.
Während Streptomyces niveus und Streptomyces sphaeroides den Agar-Nährboden sehr bald in charakteristischer Weise zerreissen und spalten, beobachtet man diese Erscheinung bei Streptomyces hazeliensis gewöhnlich nicht. Streptomyces niveus bildet ein lösliches Pigment auf verschiedenen Agar-Nährböden, während Streptomyces spheroides kein Pigment bildet. Anderseits bildet Streptomyces hazeliensis normalerweise ein Pigment, und zwar stärker als Streptomyces niveus.
Man hat auch festgestellt, dass die Zusammensetzung der Nährböden, in denen Streptomyces hazeliensis gezüchtet wird, die folgenden Variablen massgebend beeinflusst: (a) die Menge der gebildeten Antibiotika, (b) die Geschwindigkeit der Bildung der Antibiotika und (c) die Art des antibiotischen Gemisches in der Lösung.
Der Gehalt der vergorenen Lösungen in Flaschen oder Gärkesseln wird durch die gewöhnliche cup-plate Agar-Diffusionsmethode, unter Verwendung von Staphylococcus aureus als Testorganismus, bestimmt (D. C. Grove and W. A. Randall, Assay Methods of Antibiotics. A Laboratory Manual, Medical Encyclopedia Inc., New York 1955, pages 7-16).
Die Menge der Antibiotika, die in 1 ml wässrigem Puffer gelöst, eine Hemmungszone von 18 mm Durchmesser auf der Testplatte bildet, wird willkürlich als eine Aktivitätseinheit bezeichnet. Die Kolonien haben einen Durchmesser von 8 mm. Das reine Antibiotikum III hat eine Aktivität von 5500 Einheiten pro mg.
Als bevorzugte Stickstoffquelle für die Züchtung der Antibiotika wird grüner oder gelber Erbsenschrot eingesetzt. Auch mit Sojabohnenmehl, Mais Distillers Solubles (Körnertrockenrückstand und löslicher Anteil aus der Maisbrennung), Baumwollsamenmehl, Kokoseiweissmehl, Leinsamenmehl und Soluferm (auflösbare Trockenrückstände und Körner von der Maisvergärung) wurden mittlere bis gute Ausbeuten erzielt, die jedoch gewöhnlich unter den mit Erbsen erzielten Ausbeuten lagen. Ein Zusatz von kleinen Mengen Ferrosulfat, Knochenasche oder getrocknetem Rückstand von Maisquellwasser zu den Erbsen erhöhte die Ausbeute der Antibiotika nicht; hingegen stieg die Ausbeute nach Zugabe von Calciumcarbonat und Dikaliumphosphat.
Der Zusatz eines Kohlenhydrates zu den natürlichen Stickstoffquellen hatte verschiedene Auswirkungen. Bestimmte Kohlenhydrate beeinträchtigten die Bildung der Antibiotika. Andere Kohlenhydrate lieferten nur dann eine gute Ausbeute an Antibiotika, wenn das Verhältnis zwischen Kohlenstoff und Stickstoff in eine bestimmte Relation gesetzt wurde. Ein Zusatz zu einem gelben Erbsennährboden in Höhe von 0,25 /o eines Natriumsalzes organischer Säuren, hemmte die Bildung von Antibiotika vollständig. Bei diesem Experiment wurde ein Grundnährboden verwendet, der zu 3 % aus gelben Erbenschrot, 0,1 0/0 Calciumcarbonat und 0,1 /o Dikaliumphosphat bestand.
Der Effekt, der durch Beigabe von Kohlenhydraten an der Produktion der Antibiotika erzielt wurde, ist aus der nachstehenden Tabelle, in der der Grundnährboden 2 % gelben Erbsenschrot enthielt, ersichtlich:
Tabelle 1 Zusatz zum Grundnährboden S. aureus Einheiten pro ml
Gesamtlösung in 7 Tagen 1 /o Maisstärke (Kontrolle) 180 1 0/0 Mannit 120 1 % Glycerin 50 2 % Glycerin Spuren 1 /0 Maltose 55 1 % Arabinose 4 1 /0 Rhamnose 12 1 /0 Lactose 18 1 0/0 Inosit 3
In den folgenden Experimenten, die in Tabelle 2 zusammengestellt sind, wurde ein Grundnährboden aus gelbem Erbsenschrot mit 0,1 % Calciumcarbonat und 0,1 % Dikaliumphosphat verwendet.
Tabelle 2 Zusatz zum S aureus Einheiten Maximale Grundnährboden pro ml Gesamtlösung Ausbeute nach Tagen
1,0 0/0 Maisstärke 590 7 (Kontrolle) 0,5 % Maisstärke 310 6 2,0 0/0 Maisstärke 400 7 1 0/0 Glucose 230 7 2% 0/0 Glucose 25 7 1 0/0 brauner Zucker 100 7 2 0/0 brauner Zucker 0 7 Zusatz zum S.aureus Einheiten Maximale Grundnährboden pro ml Gesamtlösung Ausbcutc nach Tagen
1 0/0 Dextrin 360 7
2 0/0 Dextrin 290 5 i o/O Xylose 0 7
Es wurde bereits oben bemerkt,
dass ein Zusatz von
0,1 0/0 Calciumcarbonat und 0.1 0/0 Dikaliumphosphat die
Ausbeute der Antibiotika erhöht; Wenn sowohl Calcium carbonat als Dikaliumphosphat fehlen oder wenn die Kon zentration von einem oder beiden Salzen auf 0,5 % erhöht werden, wird die Ausbeute an Antibiotika deutlich ver schlechtert.
Gewöhnlich werden Antischaummittel eingesetzt, um das Schäumen, das bei grossen Gäransätzen auftritt, zu un terbinden. Es wurde gefunden, dass eine ganze Reihe von Pflanzenölen aus z. B. Safran, Baumwollsamen, Sesam, Kokosnuss, Sojabohnen oder von tierischen Ölen wie Schweineschmalz oder Oleinsäure, etc. verwendet werden können, ohne die Ausbeute der Antibiotika zu vermindern.
Auch Antischaummittel auf Silikonbasis senkte die Ausbeute der Antibiotika nicht.
In der folgenden Tabelle'sind die Ausbeuten der Antibiotika verglichen, die auf den gleichen Nährböden durch Streptomyces hazeliensis, Streptomyces niveus und Streptomyces sphaeroides gebildet wurden. Es muss noch bemerkt werden, dass im Gegensatz zu Streptomyces hazeliensis, der deutliche, scharf umrandete Hemmzonen bildet, bei Streptomyces niveus und Streptomyces sphaeroides nur unscharfe und wenig ausgeprägte Hemmzonen auftreten. Es besteht demnach in der Bildung dieser Hemmzonen ein deutlicher Unterschied zwischen den Sugordomycinen und dem Novobiocin.
Tabelle 3 Nährbodenbestandteile in % StaphSlococcus aureus Cup-plate -Einheitenlml
4 Tage 6 Tage
Strep. Strep. Strep. Strep. Strep. Strep.
hazeliensis niveus sphaeroides hazeliensis niveus sphaeroides Erbsenschrot: 2, Maisstärke: 1 69 50 47 320 53 5 CaCO3: 0,1, K2HPO4:0,1 Maisquellwasser: 4, Glucose: 5 0 0 0 0 Spuren 9 KH2PO4: 0,05, NaNO3: 0,3, MgSO4 7H2O: 0,1 Soyamehl: 2, brauner Zucker: 2 Spuren 0 0 13 0 0 Getrockneter Rückstand von Maisquellwasser: 0,25 K2HPO4: 0,1 Getrocknete Distillers Solubles 0 54 37 0 69 5 (Soludri): 2 Glucose: 2, K2HPO4: 0,1, CaCO3: 0,1 Pharmamedia ': 2,5, Glucose: 2,5 0 48 10 0 3 Spuren Fermamine 2 Typ III: 2, Stärke: 1 0 8 19 0 6 6 K2HPO4: 0,1, MgSO4:
0,05 1Pharmamedia ist ein 56 0/0 Protein und 24 0/0 Kohlenhydrat enthaltendes Material von Baumwollsamenmehl (Traders Oil Mill Col., Fort Worth, Texas) 2 Fermamine ist ein enzymatisches Proteinhydrolysat (Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.)
Wie ersichtlich, ist ein bevorzugtes Verfahren zur Erzeugung eines Gemisches von Sugordomycinen durch Züchtung von Streptomyces hazeliensis wie oben angegeben dadurch gekennzeichnet, dass man Erbsenschrot sowohl als Kohlenstoff- wie Stickstoffquelle verwendet. Eine vorteilhafte Arbeitsweise besteht darin, dass man die Züchtung in Anwesenheit von ca. 0,5-3 %, insbesondere ca. 0,1 % Dikaliumphosphat und ca. 0,1-3 %, insbesondere ca. 1-2 0/0 eines Kohlenhydrates z.
B. einer Stärke oder irgendeines oben unter Verwertung von Kohlenstoff genannten Zuckers vornimmt. Die Züchtung wird vorteilhafterweise während etwa 3-8 Tagen durchgeführt und bei einer Temperatur von ca. 20-35 "C mit einer Luftmenge von 15-300 Litern/Minute pro 200 Liter Nährbodenlösung belüftet. Das antibiotische Gemisch kann auf verschiedene Weise aus der Gärlösung isoliert werden:
Eine Methode besteht darin, dass man die Gärlösung, bevorzugt mit Phosphorsäure, auf einen pH-Wert von 2-7, insbesondere auf pH 4-4,5 einstellt, obgleich andere Mineralsäuren, z. B. Salzsäure und Schwefelsäure auch verwendet werden können. Falls erforderlich, wird eine Filterhilfe z. B. Diatomeenerde, zugemischt. Die angesäuerte Lösung wird filtriert, der erhaltene Filterkuchen wird in einem organischen Lösungsmittel, z.
B. in einem niederen Alkanol wie Methanol, Äthanol, Butanol, Isobutanol etc. oder auch in Aceton, Methylisobutylketon, Butylacetat oder in einer Mischung dieser Lösungsmittel z. B. Aceton/Methylenchlorid Methanol/Benzol etc., insbesondere in Butanol digeriert und anschliessend filtriert oder abzentrifugiert. Das klare Filtrat oder der Extrakt wird mit Alkali z. B. mit einer 500/obigen Natriumhydroxylösung auf einen pH-Wert von ca. 6-7 eingestellt. Das Lösungsmittel wird entfernt, z. B. durch Destillation unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 50 "C. Das gebildete Konzentrat von ungefähr 40 des Originalvolumens wird mit einem nicht-polaren Lösungsmittel z. B. mit Petroläther (Siedebereich 60-90 "C), Benzol, Hexan, Pentan, Diäthyläther etc.
versetzt, wobei das rohe antibiotische Gemisch als Natri umsalz oder als Gemisch des Natriumsalzes mit der freien
Form ausfällt, das durch Sedimentieren, Filtrieren oder
Zentrifugieren in einfacher Weise leicht abgetrennt werden kann.
Nach einer anderen Arbeitsweise wird das rohe Antibiotikum-Gemisch von der Gärlösung in der Weise isoliert, dass man das Mycel abfiltriert, das Filtrat mit einer
Mineralsäure auf einen pH-Wert von ca. 1-7 einstellt und anschliessend das angesäuerte Filtrat mit einem wasserunmischbaren Lösungsmittel wie Butanol, Butylacetat, Äthylacetat, Äther, Chloroform, Methylisobutylketon etc., ausschüttelt.
Die organische Phase wird von der wässrigen Schicht abgetrennt. Das rohe, antibiotische Gemisch kann entweder durch Abdampfen des Lösungsmittels erhalten oder an einem lonenaustauscher, wie z. B. Zeo-Karb H , Dowex-50 W , Amberlite IRC-50 , Amberlite IR-4 , Amberlite IR-100 , lonac A-300 , Dowex-1-Chlorid , Dowex-l-Base , Dowex-1-Format etc. oder an aktivierte Kohle adsorbiert und anschliessend durch Elution mit einem Lösungsmittel wie Methanol, isoliert werden. Das Mycel wird abfiltriert und mit einem organischen Lösungsmittel wie einem niederen Alkanol, z. B. Methanol, Äthanol, Butanol, Isobutanol etc.; oder auch mit Aceton,
Butylacetat, Acetomethylenchlorid, Methylisobutylketon,
Methanolbenzol etc. extrahiert.
Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittel zurückbleibende rohe antibiotische Ge misch kann hinterher mit dem aus dem Filtrat erhaltenen antibiotischen Gemisch vereinigt werden.
Man kann das rohe Natriumsalz des antibiotischen
Gemisches oder das rohe saure Antibiotikum dadurch rei nigen, indem man das antibiotische Gemisch in Aceton dispergiert, eine ausreichende Menge Mineralsäure, z. B.
Salzsäure, zusetzt, um ein saures pH, z. B. von ca. 2-6, be vorzugt ca. pH 4, zu erhalten, das unlösliche Material abfil- triert und den Filterkuchen mit einer kleinen Menge Aceton auswäscht. Das Filtrat wird mit der Waschlösung ver einigt und unter vermindertem Druck abgedampft. Das auf ungefähr 1/6 des ursprünglichen Volumens eingeengte
Konzentrat wird mit Wasser und Benzol versetzt. Die sich hier in beiden flüssigen Phasen bildende Feststoffsuspension besteht aus dem freien sauren antibiotischen Gemisch, das abfiltriert und in warmem Methanol digeriert wird. Die sich beim Abkühlen abscheidenden festen Anteile werden abgetrennt. Sie bestehen aus dem gereinigten, freien, sauren, antibiotischen Gemisch.
Das rohe antibiotische Gemisch kann auch dadurch gereinigt werden, dass man das Benzylaminsalz herstellt.
Hierzu wird das antibiotische Gemisch in einem organischen Lösungsmittel, z. B. in n-Butanol, n-Butylacetat, Äther, Äthylacetat etc., gelöst und mit einem Überschuss von Benzylamin behandelt. Das Benzylaminsalz der antibiotischen Mischung fällt aus, wobei zahlreiche Verunreinigungen, die in dem antibiotischen Gemisch vorhanden waren, in dem organischen Lösungsmittel zurückbleiben.
Das ausgefallene Benzylaminsalz wird abfiltriert. Die freien Antibiotika können aus dem Benzylaminsalz durch Behandeln mit einer wässrigen Mineralsäure, z. B. wässriger Salzsäure, erhalten werden. Das freie antibiotische Gemisch kann aus der wässrigen Phase mit Hilfe eines organischen, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren, Lösungsmittels, z. B. mit n-Butanol, n-Butylacetat, Äther, Äthylacetat etc., extrahiert werden. Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels zurückbleibende Gemisch wird z. B. aus einer warmen Mischung von Methanol/Benzol umgefällt.
Andere Amine, die versuchsweise bei der Reinigung des antibiotischen Gemisches verwendet wurden, haben sich nicht bewährt. Nur das Benzylaminsalz erwies sich als völlig befriedigend. Zu anderen Basen, die sich nicht als geeignet erwiesen, gehören Calciumhydroxyd, Prokain, Äthylendiamin, Diäthanolamin, Monoäthanolamin, N,N'-Dibenzyläthylendiamin, Dimethyläthanolamin, Hydroxyäthyläthyldiamin, Diisobutylamin und Furfurylamin.
Das rohe antibiotische Gemisch kann auch dadurch gereinigt werden, dass man das Rohgemisch zwischen einem organischen Lösungsmittel, z. B. Butylacetat, Äther oder Mischungen von Chloroform, Isopropanol etc. und einer wässrigen Pufferlösung mit einem pH von ca. 6,8-11, verteilt. Das antibiotische Gemisch kann aus der wässrigen Pufferlösung durch Ansäuern, z. B. mit einer Mineralsäure wie Salzsäure, Schwefelsäure, etc. bis zu einem pH von ca. 2-5 isoliert werden. Die entstehende Suspension kann mit einem organischen, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren, Lösungsmittel, z. B. mit n-Butanol, n-Butylacetat, Äther, Äthylacetat etc., extrahiert werden. Das gereinigte, saure, antibiotische Gemisch wird anschliessend, z. B. durch Abdampfen des organischen Lösungsmittels, isoliert.
Das nach einer der obigen Methoden gereinigte antibiotische Gemisch kann anschliessend mit Hilfe eines Gegenstromverteilungssystems, z. B. nach Craig, in seine Bestandteile aufgetrennt werden. Das hierbei verwendete organische Lösungsmittel ist mit Wasser unmischbar oder nur wenig mischbar, wie z. B. n-Butanol, N-Butylacetat, Äther, Äthylacetat, Chloroformisopropanol, etc. Die wässrige Phase wird auf einen pH-Wert von ca. 6-9, insbesondere ca. 8-8,9, eingestellt. Als Puffer können die üblicherweise für diesen Zweck gebräuchlichen Phosphate und Borate verwendet werden.
Die im erfindungsgemäss erhältlichen Gemisch enthaltenen Antibiotika sind dadurch charakterisiert, dass sie gegen Staphylococcus aureus hochaktiv sind. Ausserdem sind die Antibiotika gegen eine grosse Klasse von grampositiven und gram-negativen Bakterien, z. B. gegen Aerobacter aerogenes, Mycobacterium phlei, Proteus vulgaris, Sarcina lutea PCI-1001, etc. wirksam.
Die im erfindungsgemäss erhältlichen Gemisch enthaltenen Antibiotika sind deshalb geeignet, bakterielle Infektionen, wie sie z. B. von Staphylococcus aureus ausgelöst werden, zu bekämpfen. Wahlweise kann auch das gereinigte antibiotische Gemisch als Therapeuticum verwendet werden.
Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel in Form pharmazeutischer Präparate Verwendung finden, welche sie oder ihre Salze in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen inerten Trägermaterial enthalten. Die pharmazeutischen Präparate können in fester Form oder in flüssiger Form vorliegen. Gegebenenfalls enthalten sie Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes oder Puf fer. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Beispiel A. Herstellung des antibiotischen Gemischs.
Streptomyces hazeliensis wird in Sporenform aufbewahrt und zwar entweder auf einem Tomaten-Hafermehl Agar in Medizinalflaschen oder in gefriergetrockneter Form, wobei die Sporen in 10 0/0 Rinderserum oder in 10 % Magermilch suspendiert sind. In eine 6-Liter Schüttel flasche mit 3 Liter wässriger Nährlösung, bestehend aus:
1 0/0 Erbsenschrot,
1 0/0 Maisstärke,
0,1 0/0 Calciumcarbonat,
0,1 0/0 Dikaliumphosphat, und
0,1 0/0 Schweineschmalz wird eine wässrige Sporensuspension zugesetzt und bei 28 "C 3 bis 5 Tage auf einer Schüttelmaschine bei 200
Umdrehungen pro Minute bebrütet, bis ein lebhaftes Wachstum eintritt.
Die Bebrütung wird in einem Gefäss durchgeführt, das für die Belüftung der Nährlösung geeig net ist, z. B. in der oben erwähnten Schüttelflasche oder in einer Gaswaschflasche. Mit der auf diese Weise erhaltenen Impflösung werden 250 Liter wässrige Nährlösung in einem 400-Liter Gärkessel beimpft. Die Nährlösung be steht aus:
3 /O Erbsenschrot,
0,1 % Calciumcarbonat,
0,1 % Dikaliumphosphat,
0,03 % Silikon-Paste (Dow-Corning Silikon A-Paste), und
0,1 0/0 Schweineschmalz.
Anstelle dieser Nährlösung können auch 250 Liter einer Nährlösung der erstgenannten Zusammensetzung eingesetzt werden. Der Gärkessel wird 3 bis 4 Tage bei einer Temperatur von 28 "C gehalten. Die Luftmenge be trägt 225 Liter/Minute. Während dieser Zeit steigt die Vis kosität deutlich an, während der pH-Wert auf etwa 6,6 bis
5,9 fällt Das auf diese Weise erhaltene Inoculum wird in einen 35 000-Liter Gärtank mit 23 000 Liter sterilisierter
Nährlösung übertragen. Die Nährlösung besteht aus:
3 0/0 gemahlenem Erbsenschrot
0,1 % Calciumcarbonat,
0,1 % Dikaliumphosphat und 0,03-0,05 % Dow-Corning Silikon A, suspendiert in
0,1 /o Soyabohnenöl.
Man lässt die Lösung 5-8 Tage bei 28 "C gären. Der Verlauf der Gärung wird mit Hilfe der in vitro Texte kon trolliert. Die Luftmenge wird während der ersten 24 Stunden auf 700 Liter/Minute eingestellt, dann während der folgenden 24-72 Stunden auf 2800 Liter/Minute und wäh- rend der weiteren 72-168 Stunden auf 4000 Liter/Minute erhöht Anschliessend wird der pH-Wert der Gärlösung durch Zusetzen einer sirupösen, 850/obigen Phosphorsäure auf pH 3,9 eingestellt Nach Zugabe von 750 kg Diatomeenerde wird die angesäuerte Lösung filtriert. Der Filterkuchen wird in 7500 Liter n-Butanol aufgeschlämmt und intensiv gerührt. Man lässt die Aufschlämmung über Nacht stehen ohne zu rühren.
Der durch Zentrifugieren erhaltene klare Butanolextrakt wird anschliessend mit 1482 ml 500/obiger NaOH-Lösung bis zu einem pH-Wert von ca. 7 neutralisiert und schonend unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 50 "C auf ein Volumen von 200 Liter eingeengt.
Dieses Konzentrat wird unter lebhaftem Rühren in 1000 Liter Petroläther (Siedebereich 60-90 "C) eingetragen. Das ausfallende rohe Natriumsalz des antibiotischen Gemisches besteht vermutlich aus einem Gemisch der sauren und teilweise neutralen Form der verschiedenen Komponenten des antibiotischen Gemisches. Das rohe Natriumsalz wird durch Zentrifugieren isoliert und anschliessend getrocknet.
B. Reinigung des rohen Natriumsalzes a) Durch Verteilen zwischen einem Lösungsmittel und einem Puffer
50 g des oben erhaltenen rohen Natriumsalzes werden in 1 Liter Methanol suspendiert und 30 Minuten gerührt.
Das unlösliche Material wird abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck bis zu einem dicken Sirup konzentriert. Dieser wird in 25 ml Methanol und 625 ml 0,1 n
Salzsäure suspendiert. Die Suspension wird 3 mal mit je
1,5 Liter Äther ausgeschüttelt. Die vereinigten Ätherextrakte (4,24 Liter) werden 2 mal mit je 1,1 Liter 15 M Phosphatpuffer pH 6,2, dann 2 mal mit je 1,1 Liter 15 M Phosphatpuffer pH 7,0 extrahiert. Bei dieser Behandlung geht nur wenig Aktivität verloren. Anschliessend wird die ätherische Lösung 2 mal mit je f,1 Liter 1 M Phosphatpuffer pH 7,8 extrahiert, worauf das antibiotische Gemisch in die wässrige Phase wandert. Die Suspension wird auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und mit n-Butanol extrahiert, wobei der Niederschlag in Lösung geht.
Das n-Butanol wird unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in tts M Phosphatpuffer pH 6,5 suspendiert. Das unlösliche, gereinigte antibiotische Gemisch wird abfiltriert und getrocknet.
b) Durch die Herstellung der Benzylaminsalze
100 g des rohen Natriumsalzes werden in 10 Liter / M Dinatriumphosphatpuffer pH 9,5 aufgelöst. Die unlöslichen Anteile werden in Gegenwart eines Filterhilfsmittels abfiltriert. Das dunkel gefärbte Filtrat wird mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt.
Die erhaltene Suspension wird anschliessend mit der gleichen Menge Butylacetat extrahiert, wobei das ausgefallene Antibiotikum in Lösung geht. Die Butylacetatlösung wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 1800 ml konzentriert. Nach Abtrennen einer geringen Menge unlöslichen Materials wird das Filtrat mit einer Lösung von 100 ml Benzylamin in 100 ml Butylacetat versetzt. Das sich in Form eines feinen Niederschlages abset zende Benzylaminsalz der Antibiotika wird abfiltriert, mit wenig Butylacetat und anschliessend mit wasserfreiem Äther gewaschen.
20 g dieses Benzylaminsalzes der Antibiotika wird in
140 ml Methanol aufgelöst und nach Zugabe von 190 ml
Wasser mit Hilfe von Salzsäure auf einen pH-Wert von
2,5 eingestellt. Um die Viskosität der Suspension zu er niedrigen, werden weitere 300 ml Wasser zugesetzt. Die
Mischung wird darauf 2 mal mit je 400 ml Butylacetat ex extrahiert Die vereinigten Butylacetatextrakte werden auf ungefähr 800 ml konzentriert. Die bei dieser Konzentra tion ausfallende, rohe Säure wird abfiltriert und mit kal tem Methanol gewaschen. Durch Lösen in einer Mischung von heissem Methanol und Benzol kann dieses Produkt umgefällt werden. Die sich hierbei in fein verteilter Form abscheidenden Antibiotika schmelzen nach dem Trocknen bei 228-230 "C.
c) Durch Extraktion mit Aceton
50 g des rohen Natriumsalzes werden in 600 ml Aceton suspendiert und nach Zugabe von 30 ml einer 1 00/eigen wässrigen Salzsäure 12 Stunden gerührt. Die unlöslichen Anteile werden abfiltriert und mit wenig Aceton gewaschen. Das mit dem Waschaceton vereinigte Filtrat wird unter vermindertem Druck bis auf ungefähr 100 ml abgedampft. Zu diesem Konzentrat werden 500 ml Wasser und 200 ml Benzol zugegeben wobei eine Suspension von festem Material in 2 flüssigen Phasen entsteht Der Niederschlag dieser Suspension besteht aus dem rohen, sauren, antibiotischen Gemisch. Er wird in 100 ml Methanol bei 40-50 "C dispergiert, dann auf Zimmertemperatur abgekühlt und 12 Stunden in der Kälte stehen gelassen.
Der sich abscheidende Feststoff besteht aus dem gereinigten antibiotischen Gemisch.
C. Nachweis von Wirkstoffkomponenten im antibiotischen Gemisch
5 g des durch den Reinigungsprozess mit Aceton erhal tenen gereinigten, antibiotischen Gemisches werden in einen 200-Röhrchen Craig Gegenstromverteilungsapparat zwischen einer oberen wässrigen Phase von IsK2HPO4 Puffer (pH 8,2) und einer unteren organischen Phase bestehend aus gleichen Teilen Isopropylalkohol und Chloroform verteilt. Nachdem sich das Gleichgewicht zwischen dem Puffer und der organischen Phase eingestellt hat, wird die Verteilung in gewöhnlicher Weise über die 200 Röhrchen, von denen jedes 40 ml von jeder Phase enthält, durchgeführt. Die Verteilung liefert ein Gemisch der Antibiotika III, IV, V und VI in den Röhrchen 1-140 und ein Gemisch der Antibiotika VII, Vlll, IX und X in den Röhrchen 141-200.
Diese Verfahrensweise wird anschliessend in 200 zusätzlichen Röhrchen mit einem Puffer pH 8,9 wiederholt.
In der oberen Phase (total 400 Röhrchen) befindet sich das Antibiotikum III in den Röhrchen 120-152. Die Antibiotika IV und V befinden sich in den Röhrchen 161-170. Die Antibiotika V und VI befinden sich in den Röhrchen 185-195. Es ist nicht mit Sicherheit festgestellt worden, ob in den Röhrchen 161-170 das Antibiotikum der Formel IV oder V vorhanden ist und welches Antibiotikum in den Röhrchen 185-195 anwesend ist. Die Röhrchen 153-160 enthalten entweder ein Gemisch der Antibiotika III und IV oder III und V und die Röhrchen 171-184 enthalten ein Gemisch der Antibiotika IV und V.
In der unteren Phase enthalten die Röhrchen dieselbe antibiotischen Verteilung wie in der oberen Phase.
Die Antibiotika werden aus der Lösungsmittelphase durch Zusammengiessen von Röhrchen gleichen Inhalts isoliert. Das Antibiotikum III wird z. B. durch Zusammengiessen der Röhrchen 120-152 und durch Abdampfen der gesammelten Lösungsmittel bis zur Trockene erhalten.
Die Pufferphase der oben angegebenen Gruppen von Röhrchen wird auf einen pH-Wert von 2,5 angesäuert.
Das Antibiotikum wird in Butanol oder in einer Mischung von Chloroform/lsopropylalkohol (1:1) extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt wird zur Trockene eingedampft, wobei das Antibiotikum sich als Rückstand abscheidet.
Das durch die oben beschriebene Gegenstromverteilung erhaltene Antibiotikum III, wird anschliessend durch weitere 200 Röhrchen geschleust. Es werden 3 Isomere erhalten: und zwar in den Röhrchen 90-100, in dem Röhrchen 120 und in dem Röhrchen 140. Dies weist auf die Anwesenheit verschiedener naher verwandter Isomeren hin, von denen die absolute Struktur zur Zeit nicht bekannt ist. Alle diese Isomere sind bioaktiv, d. h. sie haben eine hohe Aktivität gegen Staphylococcus aureus. Das oben isolierte Gemisch der Antibiotika VII, VIII, IX und X wird mit Hilfe der Gegenstromverteilung nach Craig mit 200 Röhrchen in ein Gemisch der Antibiotika VII und VIII und in ein Gemisch der Antibiotika IX und X aufgetrennt.
Das verwendete Lösungsmittelsystem besteht aus den gleichen Teilen derselben organischen Phase, wie sie oben verwendet wurde, d. h. eine volumengleiche Mischung von Isopropylalkohol und Chloroform, während die wässrige Phase aus einem l/,5 M Dikaliumphosphatpuffer pH 7,0 besteht. Nachdem sich das Gleichgewicht zwischen dem Lösungsmittel und dem Puffer eingestellt hat, wird das obige antibiotische Gemisch VII-X in den Apparat eingefüllt und durch die 200 Röhrchen geschleust. Das Gemisch der Antibiotika VII und VIII liegt bei dem Röhrchen 110 und das Gemisch der Antibiotika IX und X bei dem Röhrchen 170.