DE2651655A1 - Nocardicin e und f, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende pharmazeutische zubereitung - Google Patents

Description

50 605 - Dr.T

Anmelder: FUJISAWA PHARMACEUTICAL CO., LTD.

No. 3, 4-chome, Doshomachi, Higashi-ku Osaka-shi / Japan

Nocardicin E und P, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zubereitung

Die Erfindung "betrifft neue Verbindungen mit einer antibakteriellen Aktivität (Wirksamkeit); sie betrifft insbesondere neue Antibiotika, nämlich Nocardicin E und P, ein Verfahren zu ihrer Herstellung durch Fermentation und sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen.

Ein Ziel der Erfindung ist es, neue Antibiotika, nämlich Hocardicin E und P, zu entwickeln, die eine antibakterielle Aktivität (Wirksamkeit) gegenüber pathogenen Bakterien, insbesondere Pseudomonas aeruginosa, aufweisen, Ziel der Erfindung ist es ferner, ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotika Kocardicin E und P durch Fermentation eines Nocardicin E und/oder P bildenden Stammes, der zu dem Genus Nocardia gehört, in einem Nährmedium anzugeben.

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Die einen Gegenstand der Erfindung bildenden Antibiotika Nbcardicin E und P (nachfolgend als "Nocardicine" bezeichnet) sind gekennzeichnet durch die folgenden Formeln:

Nocardicin E

N-OH 0

C-NH

Nocardicin F

HO-N 0

ff \\ Il «

// XS c—C-NH

Bei dem erfindungsgemäß zu verwendenden Mikroorganismus handelt es sich um einen Stamm, der zu dem Genus Nocardia gehört, der Nocardicin E und/oder Έ bilden kann.

Ein bevorzugter Vertreter eines solchen Organismus ist Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis, von dem ein Stamm am 13. Juni 1972 bei der American Type Culture Collection (ATCC) in 12301 Parklawn Drive, Eockville, Maryland 20 852/USA, hinterlegt worden ist und der die ATCC-Nummer 21 806 hat. Dieser hinterlegte Mikroorganismus Nbcardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 ist heute für jedermann zugänglich und seine Details, d.h. die mikrobiologischen Eigenschaften und dgl., sind in der Literatur beschrieben, z.B. in der US-Patentschrift 3.923 977 und in der deutschen Offenlegungsschrift 2 24-2 699.

Selbstverständlich ist die vorliegende Erfindung bezüglich der Herstellung der einen Gegenstand dieser Erfindung bil-

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denden Nocardieine nicht auf die Verwendung des hier beschriebenen (spezifischen) Organismus beschränkt, der nur zur Erläuterung der Erfindung genannt wurde. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Verwendung von natürlichen Mutanten sowie von künstlichen Mutanten, die von dem hier beschriebenen Mikroorganismus auf übliche Weise abgeleitet werden können, wie z.B. durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder ultravioletten Strahlen, durch Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, 2-Aminopurin oder StickstoffIost oder dgl.

Die erfincLungsgemäßen Nocardicine werden hergestellt durch Kultivieren eines Noeardicin E und/oder F bildenden Stammes, der zu dem Genus Nocardia gehört, wie z.B. Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis, in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Submersbedingungen. Als Nährstoff des Mediums kann ferner jeder beliebige Nährstoff verwendet v/erden, der von diesem Mikroorganismus für die Bildung der erfindüngsgemäßen Nocardicine genutzt werden kann.

Die bevorzugten Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie Glukose, Saccharose, Maltose, Glycerin, Stärke und dgl. Die bevorzugten Stickstoffquellen sind organische Stickstoffquellen, wie Hefeextrakte, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl, Maismehl, getrocknete Hefe, Bindfleischextrakte, Caseinhydrolysat, Maisquellwasser, Harnstoff und dgl., sowie anorganische Stickstoffquellen, wie Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und dgl.) und dgl.

Gewünschten?alls können dem Medium Mineralsalze, wie Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Magnesiumchlorid oder -sulfat und dgl. als Nebenkomponente zugesetzt werden. Außerdem können dem Medium eine oder mehrere organische Verbindungen,

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wie Tyrosin, Glycin, Serin, Homoserin, p-Hydroxyphenylglycin, a-Aminobuttersäure, α,β-Diaminopropionsäure, N-Acetyltyrosin, H-Acetyltyrosinamid, p-Hydroxyphenylbrenztraubensäure, p-Hydroxyphenylglykolsäure, p-Hydroxyphenylglyoxalsäure, Shikiminsäure, 2-Amino-3-(4--hydroxyphenyl)propionhydroxamidsäure, 2-Acetamido-3-(4—hydroxyphenyl)propionhydrazid und dgl., zugesetzt werden. Diese organischen Verbindungen können als eine Art Vorläufer fungieren und sie können für die Erhöhung der Produktivität der erfindungsgemäßen Nocardicine günstig sein.

In dem Fermentationsverfahren werden für die Herstellung der erfindungsgemäßen Mocardicine in sehr großer Menge vorzugsweise aerobe Submers-Kultivierungsbedingungen angewendet. !Für die Herstellung in begrenzten Mengen kann natürlich auch eine Schüttel- oder Oberflächenkultur in einem Kolben oder-in einer Flasche angewendet werden. Wenn das.Wachstum in großen Behältern durchgeführt wird, ist es ferner bevorzugt, die vegetative Form des Organismus für die Inokulierung in den Produktionsbehältern zu verwenden, um eine Wachstumsverzögerung in dem Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Hocardicine zu vermeiden. Es ist daher erwünscht, zuerst ein vegetatives Inokulum des Organismus herzustellen durch Inokulieren einer verhältnismäßig geringen Menge des Kulturmediums mit Sporen oder den Myzelen des Organismus und Kultivieren derselben und das kultivierte vegetative Inokulum aseptisch auf große Behälter zu übertragen. Das Medium, in dem das vegetative Inokulum (Impfstoff) gebildet wird, kann praktisch das gleiche sein oder verschieden sein von dem Medium, das für die Herstellung der erfindungsgemäßen Nocardicine verwendet wird.

Das Rühren (Bewegen) und Belüften der Kulturmischung kann auf die verschiedenste Weise erfolgen· Das Rühren (Bewegen) kann mittels eines Propellers oder einer ähnlichen mechanischen Rühreinrichtung, durch Drehen oder Schütteln der Fermentier-

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Vorrichtung, durch verschiedene Pumpeinrichtungen oder durch Durchleiten von·steriler Luft durch das Medium "bewirkt werden. Die Belüftung kann durch Durchleiten von steriler Luft durch die Fermentationsmischung bewirkt werden. Während des Verlaufs der Fermentation, insbesondere dann, wenn'das Kulturmedium beträchtlich schäumt, kann dem Medium ein Entschäumungsmittel, wie z.B. Pflanzenöle (wie Sojabohnenöl und dgl.), höhere Alkohole (wie Octadecanol, Tetradecanol und dgl.), Silicone und dgl., zugesetzt v/erden.

Die Fermentation wird in der Regel bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und etwa 40⁰C, vorzugsweise bei etwa 30⁰C, für einen Zeitraum von ^O Stunden bis 100 Stunden durchgeführt.

Die erfindungsgemäßen Nocardicine, die wie oben angegeben hergestellt worden sind, können auf übliche Weise, wie sie allgemein für die Gewinnung von Fermentationsprodukten angewendet wird, aus der Kulturbrühe gewonnen werden. Die erfindungsgemäßen Mbcardicine liegen in der Kulturbrühe in den Myzelen (intrazellulär) und/oder außerhalb der Myzele (extrazellulär) vor.

Als erste Stufe wird die Kulturbrühe durch Filtrieren oder Zentrifugieren in das Filtrat (die überstehende Flüssigkeit) und in den Filterkuchen aufgeteilt.

Die Extraktion der erfindungsgemäßen Nocardicine aus dem Filterkuchen wird durchgeführt durch Behandeln dieses Kuchens mit einem organischen Lösungsmittel, in dem die erfindungsgemäßen Nocardicine löslich sein können, wie z.B. Alkoholen (wie Methanol, Äthanol und dgl.), Ketonen(wie Aceton und dgl.), wäßrigen Alkoholen (wie wäßriges Methanol, wäßriges Äthanol und dgl.) und dgl.

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Aus dem dabei erhaltenen Eiltrat und/oder Extrakt können die erfindungsgemäßen Ifocardicine auf konventionelle Weise isoliert und gereinigt werden.

Beispiele für konventionelle Arbeitsweisen sind die Behandlung mit Adsorbentien (z.B. Aktivkohle, Kieselsäure, Silicagel, Aluminiumoxid und dgl.), anionischen oder kationischen Austauscherharzen oder makroporösen nicht-ionischen Adsorptionsharzen (wie Amberlite XAD-2, XAD-4-, XAD-7 und XAD-8 (Warennamen für Produkte der Firma Rohm & Haas Co.), Diaion HP1O, ΉΡ20, HP3O, ΞΡ4Ο und HP50 (Warennaiaen für Produkte der Firma Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) und dgl.); die Extraktion mit einem Lösungsmittel; die Konzentration unter vermindertem Druck; die Lyophilisierung, die pH-Yferteinsteilung; die Kristallisation; die UmkristalIisation und dgl. Diese Arbeitsweisen können vorzugsweise unabhängig voneinander oder in Kombination miteinander in beliebiger Reihenfolge oder wiederholt angewendet werden.

Das ITocardicin E und/oder das ITocardicin F können abgetrennt und isoliert werden durch Behandeln eines sie enthaltenden Rohmaterials mit einem Adsorbens, welches sie selektiv adsorbieren kann. Bevorzugte Adsorbentien sind z.B. Kieselsäure und dgl. Als Rohmaterial, das ITocardicin E und/oder F enthält, kann auch ein Filtrat verwendet werden, das durch Filtrieren der Kulturbrühe oder des teilweise gereinigten Materials davon (z.B. der Extrakte, Eluate und dgl.) und dgl. erhalten wurde. So werden beispielsweise ITocardicin E und/oder F dadurch isoliert, daß man das Rohmaterial einer Säulenchromatographie an Kieselsäure mit einem geeigneten Entwicklungslösungsmittel (z.B. einem Chloroform/lthylacetat (4/O-Gemisch, einem Chloroform/Methanol (1O/1)-G-emisch) unterwirft und die ITocardicin E und/oder F enthaltenden Fraktionen jeweils sammelt.

Sowohl das ITocardicin E als auch das Nocardicin F können aus jeder der oben erhaltenen Fraktionen auf konventionelle -

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Weise gereinigt werden.

Die in der Kulturbrühe gebildeten erfindungsgemäßen Hocardicine können in freier Form isoliert werden oder sie können gegebenenfalls in Form ihrer Alkalimetallsalze gewonnen werden durch Behandlung des die erfindungsgemäßen Nocardicine enthaltenden Rohmaterials mit einem Alkalimetallmaterial (z.B. Natrium- oder Kaliumhydroxid) während der Isolierungs- oder Reinigungsverfahren.

Die in ihrer freien Form erhaltenen erfindungsgemäßen Norcardicine'können auch mit einer anorganischen oder organischen Base (z.B. Kalium- oder Natriumhydroxid, Ä'thanolamin, Dicyclohexylamin und dgl.) auf konventionelle Weise in das Salz überführt werden.

Außerdem kann das anorganische oder organische Basensalz der erfindungsgemäßen Nocardicine leicht in ihre freie Form umgewandelt werden durch Behandlung dieses Salzes mit einer Säure, beispielsweise einer Mineralsäure (wie Chlorwasserstoffsäure und dgl.) auf konventionelle Weise.

Tabelle I
Physikalisch-chemische Eigenschaften von Nocardicin E und F

Hoc ar die in E

Nocardicin F

Aussehen

weiße Kristalle schwach sauer

weiße Kristalle schwach sauer

Elementaranalyse C56.95:H4.20 :N10.48 C56.84:H4.35:N10.23

£⁴

optische Drehung [a]£⁴=-192°(C=l, H₂O) [a]p⁴=-181° (C=I, Schmelzpunkt 228-231⁰C (Zers.) 230-231⁰C (Zers.)

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Nocardicin E Nocardicin F

UV-Spektrum

, 557), Xmax(E¹J_m)=224(516),

272(396)nm in CH₃OH 248(719), 298(324)nm in CH₃OH-IN aq. NaOH (9:1)

270(248)nm in CH₃OH, 247(720), 295(253)nm in CH₃OH-IN aq. NaOH (9:1)

V^j^ol=3380, 3280,2920,

2840,1745,1675,1645

1610,1595,1540,1515,

1510,1460,1435,1375

1360,1325,1310,1275,

1260,1220,1175,1140,

1115,1105-,1055,103O,

1005,945,935,910,855,

845,825,755,735,730,

700,685cm"¹

v^1Tuj*^ol=3420,3300 . 3280 , max ' *

2950,2920,1900,1745, 1680,1655,1610,1595, 1550,1515,1465,1450, 1410,1380,1360,1310, 1295,1280,1270,1250, 1220,1180,1140,1120, 1110,1060,1030,1010, 980,935,900,870,860, 840,820,780,740,720, 680cm"¹

Farbreaktion

löslichkeit

positiv: Eisen(IIl)-chlorid-Kaliumferricyanid-Re aktion negativ: Ehrlich-Test, irinhydr in-Re akt ion positiv: Eisen(IH)-chlorid-Kaliumferricyanid-Reaktion negativ: Ehrlicii-Test, Ninhydrin-Reakt ion

gut löslich: wäßrige gut löslich: wäßrige

alkalische Lösung (z.B. alkalische Lösung,

wäßrige Ammoniaklösung, Pyridin, Dimethylsulfwäßrige Natriumhydroxid- oxid

lösung), Pyridin, Dirne- schwerlöslich: CH₅OH, thylsulfoxid
schwerlöslich: CH₅OH,

7 09821/1046 C₂H₅OH

Nocardicin E

Nocardicin F

unlöslich: CH₃COCH₃, CH₃COOC₂H₅,

CHCl

unlöslich: CH₃COCH₃, CH₃COOC₂H₅, CHCl,

Tabelle II Dünnschichtchromatographie der Nocardicine E und F

Träger: Eastman Chromagram Sheet Cellulose Nr. 6065 (enthaltend ein Fluoreszenzmittel) (Warenname für ein Produkt der Firma Eastman Kodak Co.)

Nachweis: "UV-Absorptionsmethode

Entwicklungslösungsmittel	.Ef-Wert	Nocardicin F
n-Butanol/Essigsäure/— Wasser (4-/1/2) n-Butanol, gesättigt mit Wasser n-Propanol/Wasser (7/3)	ETo c ar die in E	0,89 0,41 0,74
0,84· 0,29 0,67

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!Tabelle III

HMR-Sp ektrum von Fo cardie in E und

Nocardicin	E	F
Lösungsmittel	DMSO-d, U	DMSO-d, O
Interner Standard	TMS	TMS
δρρπι	3.12 (IH,m) 3.79 (lH,t,J=5Hz) 4.98 (IH,m) 5.33 (IH,s) 6.78 (4H,d,J=8Hz.) 7.16 (2H,d,J=8Hz) 7.30 (2H,d,J=8Hz) 9.06 (lH,d,J=8Hz) 9.70 (3H, breit s) 11.14 (IH,s)	3.14 (IH,m) 3.74 (lH,t,J=5Hz) 4.94 (IH,ra) 5.31 (IH,s) 6.78 (4H,d,J=8Hz) 7.17 (2H,d,J=8Hz) 7.39 (2H,d,J«8Hz) 8.82 (lH,d,J=8Hz) 11.60 (IH, breit s)

Als Ergebnis weiterer Untersuchungen wurden die chemischen Strukturen der erfindungsgemäßen Focardicine mit den oben angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften identifiziert und wie oben angegeben festgelegt.

Die erfindungsgemäßen Nocardicine und ihre Salze weisen spezifische antibiotische Spektren auf, die eine Aktivität .(Wirksamkeit) gegenüber pathogenen Bakterien bei einer geringen Toxizität besitzen· Daher können die erfindungsgemäßen

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Nocardicine und ihre Salze für die Behandlung von durch solche Bakterien bei Säugetieren hervorgerufenen Infektionserkrankungen verwendet werden. Die pharmakologischen Tests, die mit den erfindungsgemäßen Efocardicinen durchgeführt wurden, d.h. die antimikrobiellen und Toxizitäts-Tests werden nachfolgend "beschrieben.

Minimale Hemmkonzentration (M.I.C.)

Der M.I.C.-Test wurde unter Anwendung einer üblichen Eeihen-Agar-Verdünnungsmethode durchgeführt unter Verwendung von Mueller Hinton-Agar (Inokulum 10 Zellen/ml), das 20 Stunden lang bei ;37°C inkubiert wurde. Der M.I.C.-Wert ist ausgedrückt al&^Sinimale Konzentration von Hocardicin E oder F (mcg/ml), welche das Wachstum des Mikroorganismus hemmt (inhibiert). Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XV angegeben.

Tabelle IV
Minimale Hemmkonzentration (M.I.C.)

• Test-Mikroorganismus	M. I. JC.	(mcg/ml)
Staphylococcus aureus 209P	Nocardiein E	Nocardicin F
Bacillus subtilis ATCC6633	>400	>400
Escherichia coli NIHJ JC-2	>400	>400
Pseudomonas aeruginosa NCTC1049	>400	>400
) 12.5	100

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Akute Toxizität

Jede wäßrige Fatriumhydroxidlösung (pH 7,4-) von Nocardicin E oder F wurde subkutan jeder von 5 Mäusen des Stammes ICE mit einem. Gewicht von 18 bis 22 g injiziert (Dosis 500 mg/kg) und die Beobachtung wurde 1 Woche lang nach dieser Verabreichung fortgesetzt mit dem Ergebnis, daß alle getesteten Mäuse während dieses Zeitraumes normal waren.

Die erfindungsgemäßen Focardicine und ihre pharmazeutisch verträglichen Salze können für die Verabreichung auf jede zweckmäßige Weise analog wie die bekannten Antibiotika durch Mischung imit einem pharmazeutischen Träger formuliert werden.

Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Salze der erfindungsgemäßen Hbeardicine sind die Salze mit einer anorganischen oder organischen Base, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Ammoniak, Äthanolamin, Triäthylamin, Dicyclohexylamin und dgl.

Die antimikrobielle Zubereitung kann in Form eines pharmazeutischen Präparats, beispielsweise in fester, halbfester oder flüssiger Form, verwendet werden, das die aktive erfindungsgemäße Verbindung in Mischung mit einem organischen oder anorganischen pharmazeutischen Träger oder Hilfsstoff enthält, der für die externale, enterale oder parenterale Applikation geeignet ist. Der aktive Bestandteil kann beispielsweise mit üblichen Tx*ägern für Tabletten, Pellets, Kapseln, Suppositorien, Lösungen, Emulsionen, Suspensionen und anderenfür die Verwendung geeigneten. Formen gemischt werden. Beispiele für Träger, die verwendet werden können, sind Wasser, Glukose, Lactose, Akazienguinmi, Gelatine, Mannit, Stärkepaste, Magnesiumtrisilikat, Talk, Maisstärke, Keratin, kolloidales Siliciumdioxid, Kartoffelstärke, Harnstoff und andere Träger, die sich für die Verwendung bei der Herstellung von Präparaten in fester, halbfester oder flüssiger Form eignen, und zusätzlich Hilfs-, Stabilisierungs-, Eindickungs- und Färbemittel

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und Parfüms. Die antimikrobiellen Zubereitungen können auch Konservierungsmittel oder bakteriostatische Mittel enthalten, wodurch die Aktivität des aktiven Bestandteils in den gewünschten Präparaten stabil gehalten wird. Die erfindungsgemäßen Nocardicine oder Salze davon sind in der antimikrobiellen Zubereitung in einer Menge enthalten, die ausreicht, um den gewünschten therapeutischen Effekt auf das bakteriell infizierte Verfahren oder den bakteriell hervorgerufenen Zustand zu erzielen.

Für die Applikation der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Zubereitung bei Menschen ist es bevorzugt, sie in Form einer 'intravenösen oder intramuskulären Injektion zu applizieren. Obgleich die Dosierung oder die therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Nocardicine oder ihrer Salze variiert und auch abhängt von dem Alter und dem Zustand jedes einzelnen Patienten, der damit behandelt werden soll, wird im allgemeinen für die Behandlung von Erkrankungen eine tägliche Dosis von etwa 2 bis etwa 200 mg des aktiven Bestandteils pro kg Körpergewicht des Menschen oder des Tieres verabreicht.

Die erfindungsgemäßen Nocardicine können auch als Zwischenprodukte für die Herstellung des anderen 3-Acylamino-1-(ot-carboxy-4—hydroxybenzyl)-2-acetidinons verwendet werden, das weiter verbessert ist in bezug auf seine antimikrobielle Aktivität (Wirksamkeit) gegenüber pathogenen grampositiven Bakterien.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Herst ellung _yon_lTocardi£in E

300 ml eines wäßrigen Mediums, das 2 % Saccharose, 2 % Baumwollsamenmehl, 1 % getrocknete Hefe, 2,18 % KH-PO^ und 1,4-3 %

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.I2H2O enthielt, wurden in einen 1 1-Erlenmeyer-Kolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert. Eine ösenfüllung einer Schrägkultur von ITocardia uniforinis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 wurde in das Medium inokuliert (eingeimpft) und ^A- Stunden lang bei 30°C kultiviert.

In eine 500 1-Fermentationsvorrichtung wurden I50 1 des gleichen Mediums wie oben eingeführt. Das Fermentationsmedium wurde 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert und dann mit dem gesamten Volumen des oben hergestellten vegetativen Inokulums- inokuliert und 42 Stunden lang bei 3°°C kultiviert.

Andererseits wurden 3OOO 1 eines wäßrigen Mediums, das 2 % lösliche Stärke, 1 % Pepton, 0,4 % Hefeextrakte, 1 % KH₂PO₄, 1 % Na₂HPO₄.12H₂O, 0,5 % MgSO₄.7H₂O, 0,1 % I^-Tyrosin und 0,1 % Glycin enthielt, in eine 4-000 1-Ferme nt at ions vorrichtung gegossen und 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert. Das gesamte Volumen der oben hergestellten Eulturbrühe wurde in das Medium inokuliert.

Der Organismus wurde 119 Stunden lang bei 30⁰C in dem Fermentationsmedium gezüchtet. Während der Wachstumsperiode wurde die Brühe mit 230 UpM gerührt und es wurde sterile Luft in einem Verhältnis von 3000 1 pro Minute durch die Brühe geleitet. Nach Beendigung der Kultivierung wurde die Kulturbrühe unter Verwendung von Diatomeenerde (180 kg) filtriert. Zu einem Teil des Filtrats (I5OO 1) wurden 45 kg Aktivkohle zugegeben, danach wurde die Mischung 30 Minuten lang gerührt und filtriert, um die Aktivkohle abzutrennen. Zu der Aktivkohle wurden 200 1 eines Aceton/Wasser (7/3)-G-emisches zugegeben, danach wurde die erhaltene Mischung mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,0 eingestellt und 60 Minuten lang gerührt. Das so erhaltene Eluat (5°0 1) wurde auf ein Volumen von 50 1 eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 6 η Chlorwasserstoff säure auf pH 4,0 eingestellt. Anschließend wurden 60 1 n-

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Butanol zu dem Konzentrat zugegeben, danach wurde die Mischung 30 Minuten lang; gerührt. Die n-Butano!schicht (50 1) wurde abgetrennt "und unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 10 1 eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 5 %igem wäßrigem Ammoniak auf pH 8,0 eingestellt und 30 Minuten lang gerührt. Die wäßrige Schicht (15 1) wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 1,3 1 eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 6 η Chlorwasserstoff säure auf pH 4-,Q eingestellt, mit 1,3 kg Diatomeenerde gemischt und dann getrocknet. Das Pulver wurde mit 3 1 Chloroform gewaschen und die erfindungsgemäße Verbindung wurde mit Äthylacetat eluiert. Das Eluat (5 IT wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 50 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 50 g Diatomeenerde gemischt und getrocknet, Bas Pulver wurde einer Säulenchromatographie an Kieselsäure (Entwicklungslösungsmittelrilthylacetat) unterworfen. Das Eluat (600 ml) wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 10 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 10 g Diatomeenerde gemischt und getrocknet. Das Pulver wurde einer Säulenchromatographie an Kieselsäure (Entwicklungslösungs— mittel: ein Chloroform/Methanol (100/7)-Gemisch) unterworfen. Das Eluat (200 ml) wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 3 ml eingeengt. Anschließend wurde das Konzentrat mit 3 g Diatomeenerde gemischt und getrocknet. Das Pulver wurde einer Säulenchromatographie an Kieselsäure (Entwicklungslösungsmittel i ein Chloroform/Äthylacetat (1/4-)-Gemisch) unterworfen. Das Eluat (50 ml) wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wurde in 1 ml Methanol gelöst. Zu der Lösung wurden 5 ml Chloroform zugegeben und dann wurde über Facht bei 4⁰C stehen gelassen, wobei 230 mg Kristalle erhalten wurden, die aus 12 ml eines Methanol/Chloroform (1/5)-Gemisches umkristallisiert wurden, wobei man I90 mg Nocardicin E in Form von weißen Kristallen erhielt.

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Beispiel· 2

von

100 ml eines wäßrigen Mediums, das 2 % Saccharose, 2 % Baumwollsamenmehl, 1 % getrocknete Hefe, 2,18 % KH₂PO^, und 1,4-3 % NapEPOn .12HpO enthielt, wurdenin jeden von 24 500 ml-Sakaguchi-Kolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert. Eine Ösenfüllung der Schrägkultur von Koeardia uniformis sub sp. tsuyamanensis ATCC 21806 und der Organismus wurden 48 Stunden lang bei 30°C kultiviert .

Andererseits wurden 20 1 eines wäßrigen Mediums, das 2 % lösliche Stärke, 1 % Pep ton, 0,4- % Hefe extrakt e, 1 % KH₂PO^, 1 % Na₂HPO^. 12H₂O, 0,5 % MgSO^.TH₂O, 0,1 % L-Tvrosin und 0,1 % Glycin enthielt, in jeden von 6 30 1—Jlaschen-IFermentiervorrichtungen gegossen und 20 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert. Danach wurde die oben erhaltene Kulturbrühe in jedes der Medien in einem Verhältnis von 2 Vol.-% des Mediums inokuliert. Der Organismus wurden 96 Stunden lang bei 30°C in dem Medium gezüchtet. V/ährend der Wachstums— periode wurde die Brühe mit 25O TJpM gerührt und es wurde sterile Luft in einer Menge von 20 1 pro Minute durch die Brühe geleitet. Nachdem die Kultivierung beendet war, wurde die Kulturbrühe (100 l) unter Verwendung von 10 kg Diatomeenerde filtriert. Zu dem Filtrat (90 1) wurden 1,5 kg Aktivkohle zugegeben, danach wurde die Mischung 10 Minuten lang gerührt und dann filtriert. Die Aktivkohle wurde zweimal mit 10 1 Nasser gewaschen und die erfindungsgemäße Verbindung wurde zweimal mit 30 1 und 20 1 80 tigern wäßrigem Methanol eluiert« Das Eluat (50 1) wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 6 1 eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 6 η Chlorwasserstoff säure auf pH 4-,O eingestellt und durch eine mit 3 1 Diaion HP 20 gefüllte Säule geleitet, Nachdem die Säule mit 1 1 wasser gewaschen worden war, wurde die erfindungsgemäße Verbindung mit 8

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4-0 %igem lthanol eluiert. Die die erfindungsgemäße Verbindung enthaltenden Fraktionen (4- l) wurden gesammelt ■und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 100 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit JOO g pulverformiger Cellulose gemischt, danach wurde die Mischung unter vermindertem Druck getrocknet. Das getrocknete Pulver wurde in eine Säule gefüllt und mit 6 1 Aceton aus der Säule wurde eine Elution durchgeführt. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 50 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 50 S Diatomeenerde gemischt und die Mischung wurde getrocknet. Die getrocknete Mischung wurde einer Säulenchromatographie unterworfen unter Verwendung einer mit Kieselsäure gefüllten Säule (Entwicklungslösungsmittel: ein Chloroform/Methanol (10/1)-Gemisch). Die die erfindungsgemäße Verbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wurde in 20 ml Methanol gelöst. Zu der Lösung wurden 40 ml Wasser zugegeben, danach wurde die Mischung bei 4-°0 über Nacht stehen gelassen, wobei man 560 mg Niederschlag erhielt, der durch Filtrieren abgetrennt und in 10 ml Methanol gelöst wurde. Zu der Lösung wurden "20 ml Wasser zugegeben, danach wurde die Mischung über ITacht bei 4-⁰C stehen gelassen, wobei Kristalle erhalten wurden, die abgetrennt und getrocknet wurden; dabei erhielt man 300 mg Nocardicin F in Form von weißen Kristallen.

Patentansprüche:

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Claims (7)

Anmelder: FUJISAWA PHARMACEUTICAL CO., LTD. No. 35, 4-chome, Doshomachi, Higashi-ku Osaka-shi / Japan Pat ent a η s ρ r ü c he

1. Nocardicine, ausgewählt aus der Gruppe Ubcardicin E und ITocardicin F, gekennzeichnet durch die Formel

HO-

C-NH

Nocardicin E

HO-N O

C- C-NH.

>~N—CH-f V-

f COOH

Nocardicin F

sowie ihre Salze, insbesondere ihre pharmazeutisch verträglichen Salze. .

2· Verfahren zur Herstellung der Hocardicine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Nocardicin E und/oder F bildenden Stamm, der zu dem Genus Nocardia gehört, in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert und das ΪΓο cardio in E oder F daraus gewinnt und gewünscht enf alls in sein Salz überführt.

3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nocardicin E und/oder F bildenden Stamm einen Stamm von Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis verwendet.

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4·. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Höcardicin E und/oder E¹ bildenden Stamm Noeardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 oder eine Mutante davon verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Focardicin E aus der Kulturbrühe gewinnt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß man das Focardicin E aus der Kulturbrühe gewinnt.

7. Pharmazeutische Zubereitung,dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff ITocardicin E und/oder Έ oder ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Salze davon, gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten Träger- und/oder Hilfsstoff, enthält.

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