DE2408121A1

DE2408121A1 - Platomycin a und b, verfahren zu ihrer herstellung, arzneimittel und ihre verwendung als desinfektionsmittel

Info

Publication number: DE2408121A1
Application number: DE19742408121
Authority: DE
Inventors: Taakshi Nara; Seigo Takasawa
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-02-22
Filing date: 1974-02-20
Publication date: 1974-08-29
Also published as: JPS5128719B2; GB1448521A; FR2218875A1; ATA142374A; CA1032097A; AU6576574A; AT328084B; BE811311A; CH596304A5; JPS49108292A; FR2218875B1; NL7402283A; US3873692A

Description

u.Z.: K 673 (Vo/kä)
Case: 142-4

KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.,
Tokyo, Japan

" Platomycin A und B, Verfahren zu ihrer Herstellung, Arzneimittel und ihre Verwendung als Desinfektionsmittel "

Priorität: 22. Februar 1973, Japan, Nr. 20 624/73

Die Erfindung betrifft neue Antibiotika, nachstehend mit
Platomycin A und B bezeichnet, ihre Salze mit Säuren, ein Verfahren zu ihrer Plerstellung, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und die Verwendung dieser Verbindungen als Desinfektionsmittel .

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Platomycin A ■ und B ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Platomycin A
und/oder B bildenden Mikroorganismus der· Gattung Streptosporan-gium unter üblichen Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert
und aus der Kulturbrühe das Platomycin A und/oder. B abtrennt und gegebenenfalls durch Umsetzen mit einer anorganischen oder organischen Säure in ein Salz überführt.

409835/1046

Platomycin A und B sind wasserlösliche basisch reagierende Antibiotika, die eine starke antibakterielle Aktivität gegenüber den verschiedensten grampositiven und gramnegativen' Bakterien aufweisen. Die Verbindungen der Erfindung besitzen auch eine starke antibakterielle Aktivität gegenüber bestimmten Stämmen von Staphylococcus aureus und Escherichia coli, die gegenüber verschiedenen bekannten Antibiotika resistent sind.

Die Verbindungen der Erfindung besitzen auch eine wachstumshemmende Wirkung gegenüber bestimmten Tumoren. Sie hemmen das 7.^Tachstüm von HeLa-Zellen in Gewebekulturen bei sehr niedriger Konzentration. Ferner haben sie eine ausgezeichnete Antitumorwirkung gegenüber dem festen Tumor Sarcom 180 und Ehrlich Ascitestumoren in Mäusen.

Aufgrund ihrer antibakteriellen 'und tumorstatischen Wirkung stellen Platomycin A und B wertvolle Arzneistoffe dar. Die Verbindüngen der Erfindung können ferner-als bakterizide Desinfektions-· mittel verwendet werden.

Platomycin A und B werden erfindungsgemäß durch Kultivieren eines Mikroorganismus der Gattung Streptosporangium hergestellt. Ein besonders bevorzugter Mikroorganismus gehört zu Streptosporangium violaceochromogenes subsp. globophilum, einer neuen Art. Ein typischer Stamm ist Streptosporangium violaceochromogenes subsp. Globophilum MK-78, der aus einer Bodenprobe in Ito-shi, Shizuoka-ken, Japan, isoliert wurde. Die von dem Stamm MK-78 erzeugten beiden Antibiotika wurden ursprünglich XK-78-1 und XK-78-2 bezeichnet. Danach wurde festgestellt, daß die bei-

409835/1046

den Antibiotika neue Substanzen sind, und sie wurden als Platomycin A und B bezeichnet. Der Stamm MK-78 wurde bei der American Type Culture Collection unter der Nummer 21893 hinterlegt. Dieser Stamm hat die nachstehend angegebenen Eigenschaften:

I) Morphologie:

Substratmycel gut entwickelt, verzweigt, Durchmesser 0,4 bis 0,8 μ,· septiert.

Luftmycel septiert, Durchmesser etwa 0,8 u; entwickelt sich aufrecht mit einfacher Verzweigung. Beim Luftmycel kann praktisch keine Bildung von Schlingen oder Spiralen beobachtet werden. Kugelige Sporangien bilden sich an den Sporangiophoren des Luftmycels. Die Sporangien haben einen Durchmesser von etwa 5 bis 10^1. Die Sporangiophoren sind verhältnismäßig lang (15 bis 30 μ) und etwa 0,8 μ dick. Am Substratmycel sind keine Sporangien feststellbar.

Die Sporangiosporen sind in spiraliger Form in jedem Sporangium angeordnet. Sie haben ovale oder zylindrische Gestalt mit den Abmessungen 0,8 bis 0,9 ja x 1,2 bis 1,6 u. Ihre Oberfläche ist glatt, und sie besitzen keine Geißeln und sind unbeweglich.

II) Wachstum auf verschiedenen Nährböden

Das Wachstum ist im allgemeinen auf natürlichen Nährböden gut. Das Substratmycel ist goldfarben und das Luftmycel weiß bis rosastichig weiß. In einigen Medien bilden sich lösliche, tiefrotstichig violette Pigmente. Auf synthetischen Nährböden ist das Wachstum mäßig, es bildet sich jedo.ch eine beträchtliche Menge

an Luftmycel.
L J

409835/1046

Die ¥achstumseigenschaften auf verschiedenen Nährböden nach 2-wöchiger Züchtung bei 27⁰C sind in Tabelle I zusammengefaßt. Die .Farbangaben entsprechen der Klassifikation der Color Harmony-Manual (Container Corporation of America); ¥ = ¥achstum; F = Farbe.

Tabelle I

Nährmedium	Substratmycel	schlecht farblos	Luftmycel	lösliches Pigment
Czapek's Agar	¥: F:	schlecht farblos	¥: schlecht; ■ . pulverig F: weiß (a)	keines
Glucose- Asparagin-Agar	¥: F:	¥: mäßig; pulverig F: weiß (a)	keines

Nähragar

Hefeextrakt-Malzextrakt

¥: gut

F: gelb (3ng)

¥: mäßig

F: weiß (a)* sandfarben (3cb)

F: kirschrot (7pe)

Eialbumin-Agar	¥: F:	schlecht farblos	¥: F:	keines	keines
Stärkeagar	'¥: F:	schlecht farblos	schlecht weiß (a)	keine

¥: mäßig
F: orangerostfarben (4pe)

V/: mäßig F: weiß (a)

keines

Hafermehlagar

¥: schlecht F: pfirsichrosa (5ea)

¥: schlecht oder mäßig

F: weiß C fleisch-rosaiarben (6ca)

keines

Glycerin-Asparagin-Agar

¥: schlecht oder mäßig

F: perlenschalenartige Farbe (2ba)

¥: schlecht F: weiß (a)

keines

409835/1046

Tabelle I - Fortsetzung

Nährmedium

Substratmycel

Luftmycel

lösliches Pigment

Bennett's Agar

W: guf
F: goldfarben (21c)

W: gut;

pulverig F: weiß (a)

keines

Emerson's Agar

W: gut;

granuliert

F: bernsteinfarben (3pc)

¥: mäßig

F: weiß (a)-> fleisch-rosafarben (4ca)

keines

Glucose-Hefeextrakt-Agar

¥: gut

F: senffarbig gold (2ne)

W: gut;

pulverig F: weiß (a.

keines

Hickey Tresner's- \'!i mäßig·
Agar F: hellgelb

(1 1/2 ea)

V(^T: mäßig; pulverig

F: v/eiß (a)-* perlenschalen-artige Farbe (3ba)

keines

Tyrosin-Agar

W: gut W: gut F: bernsteinfar- F: v/eiß (a) big (3pc)

F.: bernsteinfarben (3pe)

III) Verv/ertung von Kohlenstoffquellen Die Verv/ertung von Kohlenstoff quellen ist in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

* ·	Verwertung	Kohlenstoffquelle Verv/ertung
Kohlenstoffquelle		D-Mannit +
:D-Arabinose	+	D-Raffinose
D-Galactose	++	L-Rhamnose
D-Glucose	-	Rohrzucker +
Glycerin	-	Stärke +
D-Lactose	+	D-Xylose +
D-Laevulose	-
D-Inosit
L

409835/1046

IV) Physiologische Eigenschaften;

(1) Wachstumsbedingungen: Gutes Wachstum unter aeroben Bedin- . gungen. Die Wachstumstemperatür liegt bei 25 bis 40⁰C mit einem Temperatüroptimum bei 30 bis 37⁰C Der Stamm wächst · in einem pH-Bereich von 6,0 bis 8,5; das pH-Optimum beträgt etwa 7,3. ·

(2) Gelatineverflüssigung: negativ auf Gelatine-Stichkultur (27°C; 1 Monat).

(3) Einwirkung auf Milch: keine Veränderung nach 1-monatiger Züchtung bei 27°C

(4) Abbau von Cellulose: negativ

(5) Hydrolyse von Stärke: positiv

(6) Nitratreduktion: schwach positiv

(7) Tyrosinasebildung: schwach positiv

(8) farbbildende Wirkung: negativ.

Das Stamm MK-78 bildet kugelige Sporangien nur auf Luftmycel auf einem Agarmedium. Die Sporangiosporen besitzen keine Geißeln und sind unbeweglich. Im Sporangium sind zahlreiche Sporangiosporen miteinander unter Bildung einer Spirale verbunden. Aufgrund der vorgenannten morphologischen Eigenschaften wird der Stamm MK-78 als ein sporangienbildender Actinomycet, insbesondere als ein Stamm angesehen, der zur Gattung Streptosporangium gehört. Es sind etwa 20 Arten der Gattung Streptosporangium bekannt. Der Stamm MK-78 ist am ähnlichsten dem Stamm Streptosporangium violaceochromogenes MK-49 (ATCC 21807; FERM-P 1518), der in der US-Patentanmeldung Nr. 393 829 beschrieben ist, und zwar hinsichtlich folgender Eigenschaften: Die Sporangien haben einen Durchmesser von 5 bis 10u, die Sporangiosporen sind oval oder

409835/1046

zylindrisch geformt, das Substratmycel ist goldfarben, das Luftmycel weiß bis rotstichig-weiß, und es bilden sich tiefrotstichig violette lösliche Pigmente. Die Unterschiede zwischen den beiden Stämmen sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Stamm " MK-78 MK-49

Unterschiede ATCC 21893 . ATCC 21807

Zustand gut* gewachse- bildet granulierte wächst gleichmäßig ner Kolonien auf Kolonien unregel- auf dem Medium, bil-Ägarmedium mäßiger Größe det auf dem Medium

flache Oberfläche

Bildung löslicher Nähragar: Nähragar, Bennett ¹S-Pigmente kirschrot (7pe) Agar und Emerson¹S

Agar: himbeerrot (9nc)

Verwertung von Kohlen	negativ	-
stoff quellen:	positiv	Positiv
Glycerin		negativ
D-Mannit

Gelatineverflüssigung	negativ	positiv	schwach	positiv
Einwirkung auf Milch	negativ	schwach	positiv
Tyrosinase	schwach	negativ

Obwohl sich die Stämme MK-78 und MK-49 voneinander unterscheiden, sind diese Unterschiede nicht derart signifikant, wie die Unterschiede zwischen dem Stamm MK-78 und den Mikroorganismen der . anderen bekannten Arten der Gattung Streptosporangium. Dementsprechend wird der Stamm MK-78 als eine Subspecies von Streptosporangium violaceochromogenes angesehen und deshalb als Streptosporangium violaceochromogenes subsp. globophilum bezeichnet, weil er zur Bildung granulierter Kolonien auf einem Agarmedium

neigt.
L

409835/1046

Ebenso wie andere Actinomyceten kann dieser Stamm durch mutagene Behandlung z.B. mit UV-Licht, Co -Bestrahlung, Röntgenstrah len und verschiedene mutationsauslösende chemische Verbindungen mutiert werden. Dementsprechend können im erfindungsgemäßen Ver fahren auch Mutanten dieses Stammes eingesetzt werden, sofern sie die Fähigkeit zur Bildung von Platomycin A und/oder B besitzen. .

Das erfindungsgemäße Verfahren kann nach den herkömmlichen Verfahren zur Züchtung von Actinomyceten durchgeführt werden. Im Nährmedium können die verschiedensten Nährstoffe eingesetzt werden. Als Kohlenstoffquellen können z.B. Glucose, Stärke, Mannose, Fructose, Mannit, Rohrzucker und Melassen allein oder in Kombination eingesetzt werden. Ferner können Kohlenwasserstoffe, Alkohole und Carbonsäuren verwendet werden, je nach der Fähigkeit des speziell eingesetzten Mikroorganismus zur Verwertung dieser Verbindungen. Anorganische und organische i

Stickstoffquellen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat, sowie natürliche Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Casaminosäure und lösliche pflanzliche Proteine können entweder allein oder im Gemisch verwendet werden. Ferner können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonate und verschiedene Phosphate dem Nährmedium zugesetzt v/erden. Schließlich können organische oder anorganische Verbindungen, die das Wachstum des Mikroorganismus und die"Bildung von Platomycin A und/oder B fördern, dem Nährmedium einverleibt werden.

L -J

409835/ 1046

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise in flüssigen Nährböden, insbesondere nach dem Submersverfahren unter Rühren des Nährmediums durchgeführt. Die Züchtungstemperatur liegt im allgemeinen bei 25 bis 40°C. Vorzugsweise wird die Züchtung um den Neutralpunkt durchgeführt.

Die Antibiotika haben sich gewöhnlich nach etwa 5 bis 15 Tagen in ausreichender Menge in der Kulturbrühe angereichert. Sobald' die Ausbeute an den Verbindungen der Erfindung in der Kulturbrühe ein Maximum erreicht hat, wird die Züchtung abgebrochen. Die Zellmasse wird abgetrennt, z.B. abfiltriert, und aus dem Filtrat wird das Produkt isoliert und gereinigt. Die Isolierung und Reinigung der Verbindungen der Erfindung wird in an sich bekannter V/eise durchgeführt.

Da Platomycin A und B basisch reagierende Verbindungen sind, die in Wasser leicht löslich, mit Ausnahme von Methanol und Äthanol in organischen Lösungsmitteln schwer löslich sind, läßt sich das Produkt nach üblichen Verfahren reinigen, wie sie zur Reinigung sogenannter wasserlöslicher basisch reagierender Verbindungen angewendet werden. Platomycin A und B kann z.B. durch geeignete Korabination von Adsorption und Desorption an Kationenharzaustauschern und Aktivkohle, Säulenchromatographie an Cellulose, Sephadex LH-20, Sephadex G-10, Sephadex G-25 und CM (Carboxymethyl)-Sephadex C-25, Adsorption und Desorption von Ionenaustauscherharzen des porösen Typs und anderen ähnlichen Methoden gereinigt werden.

409835/1046

Beispielsweise wird das Kulturfiltrat zunächst auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und anschließend auf einen Kationenharzaustauscher Amberlite IRC-50 in der H⁺-Form gegeben. Nach dem · Vaschen mit Wasser wird mit 0,5 η Salzsäure eluiert. Die aktive Fraktion wird aufgefangen, neutralisiert und an Amberlite IRC-50 in der Ammoniumform adsorbiert und anschließend mit 0,5 η Salzsäure eluiert. Das Eluat wird neutralisiert und die aktive Fraktion an Amberlite IRC-50 in der H⁺-Form adsorbiert und anschließend mit 0,5 η Salzsäure eluiert. Die erhaltene aktive Fraktion wird hierauf mit dem Anionenharzaustauscher Dowex 44 in der 0H~-Form neutralisert und anschließend zur Trocke ne eingedampft. Der erhaltene trockene Rückstand wird in 50prozentigem wäßrigem Methanol gelöst und auf e,ine mit Sephadex LH-20 gefüllte Säule gegeben. Die Entwicklung und Eluierung. wird mit 50prozentigem wäßrigem Methanol durchgeführt. Das Eluat der aktiven Fraktion wird eingedampft. Man erhält ein rohes Pulver von graustichig grüner Farbe. Das erhaltene Rohprodukt, das ein Gemisch darstellt, das Platomycin A und B enthält, wird in einer 0,1 m wäßrigen Ammoniumformiatlösung gelöst. Die erhaltene Lösung wird an CM-Sephadex C-25 adsorbiert und nach der Konzentrationsgradientenmethode mit 0,1 bis 1,0 molarer wäßriger Ammoniumformiatlösung eluiert. Platomycin A wird in einer Fraktion eluiert, deren Ammoniumformiatkonzentration etwa 0,3 molar 1st. Platomycin B wird in einer Fraktion eluiert, deren Ammoniumformiatkonzentration etwa 0,4 molar ist. Die Fraktionen von Platomycin A und B werden an Amberlite CG-50 in der H⁺-Form adsorbiert. Sodann wird mit 0,5 η Salzsäure eluiert. Die aktiven Fraktionen werden mit Dowex 44 in der OH*"-Form auf einem pH-Wert von 6,5 eingestellt und zur Trockene eingedampft. Die trockenen Produkte j

409835/1046

werden in 50prozentigem wäßrigem Methanol gelöst, und die Lösungen werden auf Kolonnen gegeben, die mit Sephadex LH-20 gefüllt sind. Die Entwicklung und die Eluierung vrird mit 50prozentigem wäßrigem Methanol durchgeführt. Die aktiven Fraktionen werden eingedampft. Die Konzentrate werden mit Aceton versetzt, und es werden die Hydrochloride von Platomycin A und B erhalten.

Die Hydrochloride von Platomycin A und B haben eine schwach blaustichig oder grünstichige Farbe. Sie sind leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol, mäßig löslich in Äthanol und nahezu unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Butanol, Äthylacetat, Butylacetat, Diäthyläther und Benzol.

In Figur 1 und Figur 2 sind die UV-Absorptionsspektren der Hydrochloride von Platomycin A bzw. B angegeben. Die Spektren zeigen Absorptionsmaxima bei 244 mu und 293 mu.

In Figur 3 und Figur 4 sind die IR-Absorptionsspektren der Hydrochloride von Platomycin A bzw. B als Kaliumbromid-Preßlinge angegeben. Beide Spektren zeigen Absorptionsmaxima bei folgenden Wellenzahlen (cm~ ):

3350, 3200 (Sh), 2950, 1710, 1655, 1635, 1550, 1510, 1455, 1375, 1325, 1245, 1160, 1120, 1090, 1045, 1010, 920.

t -

Sowohl Platomycin A als auch B ergeben eine positive Reaktion im Test nach Sakaguchi, Pauli, Ehrlich und IiMnO^ und eine negative Reaktion im Ninhydrin-, Elson-Morgan- und FeCl,-Test.

409835/1046

Die optischen- Drehwerte der Antibiotika wurden nicht bestimmt, weil die wäßrigen Lösungen die vom Natriumdampf imittierte gelbe Doppellinie (D-Linie) absorbieren. Die Antibiotika der Erfindung konnten noch nicht in reiner kristalliner Form erhalten werden. Dagegen lassen sich die Hydrochloride der Antibiotika in praktisch reiner Form sehr leicht herstellen. Dementsprechend werden für die Antibiotika der Erfindung die charakteristischen Parameter der Hydrochloride angegeben. Beispielsweise wurden für die Hydrochloride von Platomycin A und B, die gemäß Beispiel 5 hergestellt wurden, folgende Werte für die Elementaranalyse erhalten:

Platomycin A: C 37,48 % H 5,57 % N 15,02 % Cu 3,90 % Platomycin B: C 37,46 % H 6,02 Ji N 15,65 % Cu 5,35 %.

Platomycin A und B zeigen keine definierten Schmelzpunkte oder Zersetzungspunkte. Platomycin A zersetzt sich allmählich bei Temperaturen oberhalb 220⁰C, während Platomycin B sich bereits bei einer Temperatur oberhalb 200⁰C zersetzt.

In Lösung zeigt Platomycin A und B eine grünstichig blaue Farbe. Es ist schwierig, den aktiven Teil des Moleküls der Antibiotika vom anderen Teil abzutrennen, der für die grünstichig-blaustichige Farbe verantwortlich ist. Vermutlich liegen die Antibiotika als Chelatkomplexe mit Kupfer vor. ,

Die R_f-Werte der Hydrochloride von Platomycin A und B bei der Papierchromatographie mit aufsteigendem Entwicklungslösungsmittel sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

409835/1046

Tabelle IV

Entwicklungslösungsmittel _ππ . ^RfY„_n . ° Platomycin A Platomycin B

Ammoniumchloridlösung 5&Lge Ammoniumchloridlösung mit Wasser gesättigtes n-Butanol n-Butanol-Essigsäure-Wasser (Volumverhältnis 3:1 : 1) mit ¥asser gesättigtes n-Butanol mit 2 ^ZA p-Toluolsulfonsäure und 2 % Piperidin

mit Wasser gesättigtes Äthylacetat

0,67	0,63
0,65	0,60
0,00	0,00
0,02	. 0,01
.0,02	0,01
0,00	0,00

Aufgrund der vorstehend beschriebenen Eigenschaften wurden die Verbindungen der Erfindung, mit bekannten Antibiotika verglichen.

Als einziges wasserlösliches, basisch reagierendes Antibioti- . kum, das von einem Mikroorganismus der Gattung Streptosporangium gebildet wird, ist die Verbindung XK-49-1-B-2 bekannt, die in der US-Patentanmeldung 393 829 beschrieben ist. Aus den vorstehenden Angaben ist ersichtlich, daß Platomycin A und B wasserlösliche, basisch reagierende Antibiotika darstellen, die Amidbindungen und Kupfer im Molekül enthalten und im UV-Absorptionsspektrum Maxima bei 244 ima und 293 mu aufweisen. Antibiotika mit diesen Eigenschaften sind Phleomycin (vgl. T. Ikekawa et al., J. Antibiotics, Ser. A17: 194, 1964), Bleomycin (vgl. H. Umezawa et al., J. Antibiotics Ser. A19: 200, I966; H. Umezawa et al., J. Antibiotics Ser. A19: 210, I966; US-PS 3 681 491; Dissertation von Akio Fujii, Universität Tokyo, 1971), Zorbamycin, Zorbonomycin B, Zorbonomycin C (A.D. Argoudelis et al., J.

Antibiotics, Bd. 24 (1971), S. 543) YA56-X und YA56-Y (vgl.

409835/1046

Y. Ito et al., J. Antibiotics, Bd. 24 (1971), S. 727) und die vorgenannte Verbindung XK-49-1-B-2.

Das Verhältnis der Absorption bei 244 mu und bei 293 mu im Falle von Platomycin A beträgt 1,31 : 1 und im Falle von Platomycin B 1,33 : 1, während die Verhältnisse der Absorption für Phleomycin, Zorbamycin, Zorbonomycin C, YA56-X und YA56-Y 2,89 : 1, 2,91 : 1, 2,77 : 1, 2,78 : 1 bzw. 2,85 : 1 betragen. Aus diesem Grunde sind Platomycin A und B von den bekannten Antibiotika verschieden. Die Verhältnisse der Absorption für Bleomycin, Zorbonomycin B und XK-49-1-B-2 betragen 1,1 bis 1,3 : 1, 1,21 : 1 bzw. 1,34 : 1. In dieser Hinsicht verhalten sich also Platomycin A und B ähnlich wie diese Antibiotika.

Es ist bekannt, daß das Antibiotikum Bleomycin mehrere Komponenten enthält, die als A^, A₂, Demethyl A₂, ^₂__a, A-fy-b' ^A3' ^A4' Ac, Ag, B₁, BJJ, B₂, B,, B^, Bc und Bg bezeichnet werden. Im Sakaguchi-Test zeigen Platomycin A und B, Bleomycin B₁, B₂, B₇, B^, Bc und Bg eine positive Reaktion und sämtliche A-Komponenten und die BJJ Komponente zeigeneine negative Reaktion; vgl. Dissertation von Akio Fujii, 1971, Universität Tokyo. Ferner zeigt Platomycin A und B eine negative Ninhydrin-Reaktion, während Bleomycin A₂__a, Α₂_^, A^, Ac und Ag eine positive Reaktion zeigen. Somit sind Platomycin A und B verschieden von den Antibiotika der Bleomycin A Komponenten und der Bleomycin BJj Komponente.

Ferner wurden die R^-Werte von Platomycin A und B mit denen von Bleomycin A₂, Ac, B₂ und B^, Zorbonomycin B und XK-49-1-B-2

409835/1046

"bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit den verschiedensten Entwicklungslösungsmitteln verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt.

Tabelle V

	' 1	2	•	⁰I	R_f	-Wert 3	62	'4	15
-Entwicklungs- ■ lösungsmittel		o_r			47		05
Substanz	0,43	°f	73	⁰I	52	°?	03
Platomycin A	0.10		60	⁰I	28	°/	05
Platomycin B	0,27	°r	45	°r	88	°r	03
Bleomycin A_?	0,05		60	⁰I	68	⁰J	03
¹¹ A ^A5	0j45	⁰I	80	⁰J	84	°;	19
Il D ²	0,10		75	0.	40	⁰J	45
¹¹ B 4	0j33		76	⁰I		0.
I Zorbonomycin B	0_;26	78	⁰I	°;
XK-49-1-B-2

Entwicklungslösungsmittel 1

obere Schicht von Chloroform-Methanol-17?aige wäßrige Ammoniaklösung (Volumenverhältnis 2:1:1)

2: 10/Oige Ammoniumacetatlösung-Methanol (Volumenverhältnis 1:1)

3: Methanol- 1O$oige Ammoniumacetat- * lösung- '1O5uige wäßrige Ammoniaklösung (Volumenverhältni s 10:9:1)

4: 0,05 m Citronensäurepufferlösung, pH-Wert 6,9.

409835/1046

Aus Tabelle V" ist ersichtlich, daß Platomycin A und B sich von Bleomycin Bp und B^, Zorbonomycin B und XK-49-1-B-2 hinsichtlich der R_f-Werte bei der DUnnschichtchromatographie an Kieselgel unterscheiden. Aus dieser Tabelle ist ferner ersichtlich, daß Platomycin A und B niedrigere R_f-Werte als Bleomycin B^ zeigen, wenn als Entwicklungslösungsmittel ein Gemisch gleicher Volumteile lOprozentiger wäßriger Ammoniumacetatlösung und Me-■ thanol verwendet wird. In der vorgenannten Dissertation von Akio Fujii ist beschrieben, daß die R_f-V/erte von Bleomycin B₁ und B-T bei der DUnnschichtchromatographie an Kieselgel mit dem gleichen Lösungsmittelsystem, d.h. einem Gemisch aus gleichen Volumteilen lOprozentiger wäßriger Ammoniumacetatlösung und Methanol, höher sind, als der R^-¥ert von Bleomycin B^. Somit sind Platomycin A und B auch von Bleomycin B₁ und B, verschieden. Ferner ist in der Dissertation von Fujii sowie von H. Umezav/a et al., J. Antibiotics, Ser. A19: 210, 1960, beschrieben, daß Bleomycin B^ und Bg von CM-Sephadex C-25 mit Ammoniumformiatlösungen mit einer Konzentration von 0,67 molar bzw. 0,9 molar oder mehr eluiert werden, und daß Bleomycin B^ aus CM-Sephadex C-25 mit einer Ammoniumformiatlösung einer Konzentration von 0,67 bis 0,9 molar eluiert wird. V.^Tie vorstehend beschrieben, wird Platomycin A mit e_#iner etwa 0,3 molaren Ammoniumformiatlösung und Platomycin B mit einer 0,4 molaren Ammoniumformiatlösung eluiert. Somit sind Platomycin A und B auch von Bleomycin Bc und Bg verschieden.

Zum weiteren Nachweis, daß Platomycin A und B neue Verbindungen darstellen, werden 10 ng Mengen von·Platomycin A und B, Phleomycin und Bleomycin in 6 η Salzsäure 20 Stunden bei 105⁰C ,

409835/1046

Γ "I

hydrolysiert.'Die Hydrolysate werden zur Trockene eingedampft, und die erhaltenen Rückstände werden in jeweils 1 ml Wasser gelöst. Diese Lösungen werden sodann der Papierchromatographie mit einem Gemisch aus n-Butanol., Essigsäure und 'fässer im Volumenverhältnis 4:1:2 als Entwicklungslösungsmittel unterwor-.fen. Die Hydrolysate von Platomycin A und B zeigen die Gegenwart von L-Threonin und ß-Carboxyhistidin an. Das Hydrolysat von Bleomycin zeigt die Gegenwart von 2^l-(2-Aminoäthyl)-2,4'~bithiazol-4-carbonsäure mit einem UV-Absorptionsmaximum bei 284 bis 288 mu bei einem R^-Viert von 0,46. Dagegen kann keine Verbindung mit einem UV-Absorptionsmaximum bei 284 bis 288 mu bei einem Rf-Wert von 0,46 im Falle von Platomycin A und B festgestellt werden. Die Analyse der Säurehydrolysate mit einem Aminosäure-Analysengerät ergibt, daß in den Säurehydrolysaten von Phleomycin 2^l-(2-Aminoäthyl)-2,4'-bithiazol-4-carbonsäure vorliegt, während dies bei den Platomycinen nicht der Fall ist.

Aus dem vorstehenden ist ersichtlich, -daß Platomycin A und B neue Verbindungen darstellen, die sich von allen vorstehend beschriebenen Antibiotika unterscheiden.

Die antibiotische Aktivität von Platomycin A und B gegenüber verschiedenen Mikroorganismen - bestimmt nach der Agar-Verdün-.nungsmethode - ist in Tabelle VI zusammengefaßt.

409835/1046

- 18 Tabelle VI

Teststamm

minimale Hemmkonzentration,

y/ml .
Platomycin A Platomycin B

Streptococcus faecalis ATCC 10541 >0,83

>0,83

Staphylococcus aureus ATCC 6538P 0,014

<0,001

Staphylococcus aureus XY 8942 (resistent gegen Kanamycin, Paromomycin und Streptomycin) 0,-11

0,013

Staphylococcus aureus KY 8950 (resistent gegen Streptomycin, Tetracyclin. Penicilline und Sulfonamide)

0,11

0,013

Staphylococcus aureus KY 8953 Cresistent /regen Streptomycin, Kanamycin, Paromomycin, Tetracyclin, Neomycin. Kanendomycin und Erythromycin)

>0,42

Staphylococcus aureus KY 8956 (resistent gegen Streptomycin, Paromomycin, Kanamycin, Tetracyclin, Erythromycin und Oleandomycin)

>0,83

>0,42

Staphylococcus aureus	. >0,83	>0,42
(resistent gegen Chloramphenicol, Streptomycin, Kanendomycin, Tetra cyclin, Kanamycin und Paromomycin)	0,007	<0,001
Bacillus subtilus Nr. 10707	0,027	0,026
Bacillus cereus ATCC 9634	<0,001
	- _t 0,027	<0,001
Bacillus cereus var mycoides	0,007	0,014
ATCC 9463		0,0035
Klebsiella pneumoniae
ATCC 10031
Escherichia coli ATCC 26

409835/1046

- ig -.
Tabelle VI - Fortsetzung

Teststamm

minimale Hemmkonzentration,

y/ml Platomycin A Platomycin B

Escherichia coli KY 8310 (resistent gegen Chloramphenicol, Streptomycin, Kanamycin, Gentamicin, Kanendomycin, Paromomycin, Tetracyclin und Spectinomycin)

0,053

0,027

Escherichia coli KY 8302 (resistent gegen Chloramphenicol, Streptomycin, Kanamycin, Paromomycin, Tetracyclin und · Spectinomycin;

0,11

0,027

Escherichia coli KY 8314 resistent gegen Streptomycin) 0,053

0,027

Escherichia coli KY 8315 (resistent gegen Streptomycin, Kanamycin, Paromomycin und Neomycin)

0,014

0,027

Proteus vulgaris ATCC 6897 >0,83

0,21.

Pseudomonas aeruginosa BMH No.

>0,83

Shigella sonnei ATCC 9290 0,053

0,014

Salmonella typhosa ATCC 9992 0,053

0,027

Aus.der Tabelle ist ersichtlich, daß Platomycin A und B sich durch eine starke antibakterielle Aktivität gegenüber den verschiedensten grampositiven und gramnegativen Bakterien auszeichnen. Platomycin A und B zeigen auch eine starke antibakterielle Aktivität gegenüber bestimmten Stämmen von S.taphylococcus aureus und Escherichia coli, die gegenüber verschiedenen bekannten Antibiotika resistent sind.

409835/1046

^Γ - 20 - ^Π

Die Verbindungen der Erfindung zeigen auch eine starke Antitumorwirkung gegenüber verschiedenen Tumortypen. Zur Erläuterung der Antitumoraktivität von Platomycin A und B werden kleine- ■ Anteile des festen Tumors Sarcom 180 subcutan männlichen Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 20 g transplantiert. Diese Mäuse erhalten während 8 Tagen einmal täglich am Tage nach der Transplantation eine Lösung von 2 mg/kg von Platomycin A • oder B intraperitoneal injiziert. Es wurde festgestellt, daß Platomycin A und B eine nahezu 80prozentige Hemmung des Tumors bei Mäusen bewirkt.

In einer zweiten Versuchsreihe wurden Mäuse mit Ehrlich Ascites-Tumoren infiziert. Nach der Implantation, wird einer Hälfte der Versuchsgruppe während 6 Tagen einmal täglich 2 mg/kg Platomycin A oder B intraperitoneal injiziert. Es überleben 90 Prozent der behandelten Tiere, während sämtliche unbehandelten Tiere sterben.

Platomycin A und B in Lösung in einer Konzentration von 1 y/ml zeigen eine etwa 40 bis 50prozentige Hemmung des Wachstums von HeLa-Zellen in Gewebekulturen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

C -

Beispiel 1

Als Einsaatstamm wird Streptosporangium violaceochromogenes subsp. globophilum MK-78 (ATCC 21893; FEM-P 1894) verwendet. Eine Platinöse des· Einsaatstamms wird in 30 ml eines Einsaatmediums überimpft, das 2 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Ilefeextrakt,

409835/1046

^Γ -21- "■

0,5 Prozent Pepton und 0,1 Prozent Calciumcarbonat enthält. Der pH-Wert des Mediums vor der Sterilisation beträgt 7,2. Die Züchtung wird in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben 5 Tage .bei 3O⁰C unter Schütteln durchgeführt. Hierauf werden 30 ml der Einsaatkulturbrühe in 300 ml eines zweiten Einsaatmediums in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft, der mit Prallplatten ausgerüstet ist. Die Zusammensetzung des zweiten Einsaatmediums ist die gleiche wie die des ersten Einsaatmediums. Die ~ Züchtung im zweiten Einsaatmedium wird 2 Tage bei 3O⁰C unter Schütteln durchgeführt. Anschließend v/erden 1,5 Liter der zweiten Einsaatkulturbrühe (entsprechend dem Inhalt von 5 Erlenmeyer-Kolben) in 15 Liter eines dritten Einsaatmediums in einem. 30 Liter fassenden Fermenter aus korrosionsbeständigem Stahl überimpft. Die Zusammensetzung des dritten Einsaatmedium.s ist die gleiche wie .die des ersten Einsaatmediums. Die Züchtung in diesem Fermenter wird 2 Tage bei 30⁰C unter Belüftung und Rühren (Rührgeschv/indigkeit 350 U/min: Luftzufuhr 15 Liter/min) durchgeführt. Sodann werden 15 Liter der dritten Einsaatkulturbrühe in 100 Liter eines vierten Einsaatmediums in einem 300 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des vierten Einsaatmediums ist die gleiche wie die des ersten Einsaatmediums. Die Züchtung in diesem Fermenter wird 2 Tage bei 3O⁰C unter Belüftung und Rühren (Rührgeschv/indigkeit 150 U/min: Luftzufuhr 100 Liter/min) durchgeführt. Schließlich werden 100 Liter der vierten Einsaatkulturbrühe in 1000 Liter eines Nährmediums in einem 2000 Liter fassenden Fermenter überimpft. Dieses Nährmedium"enthält 2 Prozent Glucose, 0,1 Prozent Hefeextrakt, 0,5 Prozent Pepton und 0,1 Prozent Calciumcarbonat. Der pH-Wert vor der Sterilisation beträgt 7,2. Die Züchtung in

. 409835/1046

r ""

diesem Fermenter wird 12 Tage bei 3O⁰C unter Belüftung und Rühren durchgeführt (Umdrehungsgeschwindigkeit 150 U/min; Luftzufuhr 500 Liter/min). Nach 12-tägiger Züchtung haben sich Platomycin A und B in der Kulturbrühe gebildet.

Beispiel' 2

In dies-em Beispiel werden 100 Liter der vierten Einsaatkulturbrühe, die gemäß Beispiel 1 erhalten wurde, in 1000 Liter eines Nährmediums in einem 2000 Liter fassenden Fermenter überimpft. Das Nährmedium enthält 2 Prozent Glucose, 3 Prozent Haisquellwasser und 0,1 Prozent Calciumcarbonat. Der pH-^T.'.^rert vor der Sterilisation beträgt 7,2. Die Züchtung im Fermenter wird 12 Tage bei 30⁰C unter Belüftung und Rühren durchgeführt (Rührgeschwindigkeit 150 U/min; Luftzufuhr 300 Liter/min). Nach 12-tägiger Züchtung haben sich Platomycin A und B in der Kulturbrühe gebildet.

Beispiel 3

In diesem Beispiel v/erden 1000 Liter der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-^T..^Tert von 3 eingestellt. Sodann wird die Kulturbrühe mit 40 kg einer Filtrierhilfe (Radiolite Nr. 600) versetzt. Zellmasse und unlösliche Stoffe werden abfiitriert. Das Filtrat wird mit konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und auf eine Kolonne gegeben, die etwa 50 Liter des Kationenharzaustauschers Amberlite IRC-50 in der H⁺-Form enthält. Platomycin A und B werden an dem Harzaustauscher adsorbiert. Anschließend wird der Austauscher mit !/asser gewaschen, und mit 0,5 η Salzsäure eluiert. Die aktive Fraktion v/ird mit , L _ ^

409835/1046

dem Anionenharzaustauscher Amberlite IR-4B in der OH"-Form neutralisiert und sodann auf eine Kolonne gegeben, die mit 500 ml des Kationenaustauschers Amberlite IRC-50 in der Ammoniumform gefüllt ist. Sämtliche aktiven Substanzen werden an dem • Harzaustauscher adsorbiert. Nach dem Waschen mit "wasser werden Verunreinigungen mit 0,3 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Sodann wird der Harzaustauscher mit Wasser gewaschen und mit 0,5 η Salzsäure eluiert. Es wird eine Fraktion erhalten, die Platomycin A und B enthält. Diese aktive Fraktion wird mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und sodann auf eine Kolonne gegeben, die mit 200 ml des Kationenaustauschers Amberlite IRC-50 in der H⁺-Form gefüllt-ist. Die aktive Substanz wird an dem Harzaustauscher adsorbiert. Danach wird der Harzaustauscher mit Wasser gewaschen und mit Ό,5 η Salzsäure eluiert. Die aktive Fraktion wird mit dem Anionenaustauscher Dowex 44 in der 0H~- Form neutralisiert und sodann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das Konzentrat wird in einer geringen Menge 50prozentiger wäßriger Methanollösung gelöst und auf eine mit Sephadex LH-20 gefüllte Kolonne gegeben, die vorher mit 50prozentiger wäßriger Methanollösung behandelt worden war. Die Entwicklung und Eluierung wird mit 50prozentigem wäßrigem Methanol durchgeführt. Das Eluat mit der aktiven Fraktion wird unter vermindertem Druck eingedampft. Nach Zusatz von etwa 10 Volumteilen Aceton wird eine graustichlg grüne Fällung erhalten. Insgesamt werden 2 g eines Trockenpulvers erhalten. Die Aktivität von 1 mg des Pulvers entspricht der von 300 y reinem Platomycin A-hydrdchlorid, das gemäß Beispiel 5 hergestellt worden ist. Die Aktivität der erhaltenen Pulver in den folgenden Beispielen bezieht sich auf die Aktivität dieses Platomycin A-

409835/1046

hydrochlorids.

Beispiel4

In diesem Beispiel werden 950 Liter der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Kulturbrühe mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Sodann werden etwa 40 kg Filtrierhilfe Radiolite Nr. 600 zugesetzt, und das Gemisch wird filtriert. Das Filtrat wird auf eine Kolonne gegeben, die mit 100 Liter eines Ionenaustauscherharzes des porösen Typs HP 10 gefüllt ist. Nach dem Waschen des Ionenaustauschers mit Wasser wird mit 50prozentiger wäßriger Methanollösung eine aktive Substanz eluiert. Die aktive Fraktion wird konzentriert. Nach Zusatz von etwa 10 Volumteilen Aceton zum Konzentrat werden etwa 50 g eines dunkelbraunen Pulvers erhalten. Die Aktivität von 1 mg des Pulvers entspricht der von 50 y des Hydrochlorids von Platomycin A. Das Pulver wird in 200 ml Wasser gelöst und auf eine Kolonne gegeben, die mit dem Kationenaustauscher Amberlite IRC-50 in der Ammoniumform gefüllt ist. Zunächst wird mit 0,3 η wäßriger Ammoniaklösung und anschließend mit 0,5 η Salzsäure gemäß Beispiel 3 eluiert. Auf diese Weise wird eine Fraktion erhalten, die Platomycin A und B enthält. Diese Fraktion wird an Amberlite IRC-50 in der H⁺-Form und Sephadex LH-20 gemäß Beispiel 3 gereinigt. Es werden auf diese Weise etwa 6 g eines graustichig grünen Pulvers erhalten. Die Aktivität,von 1 mg des Pulvers entspricht der von 300 y des, Hydrochlorids von Platomycin A. Das erhaltene Rohpulver ist ein Gemisch von Platomycin A und B.

409835/1046

Γ "1

Beispiel 5 5 g des gemäß Beispiel 3 und 4 erhaltenen Rohpulvers von Plato-

mycin A und B werden in 200 ml wäßriger 0,1 molarer Ammoniumformiatlösung gelöst und sodann, auf-eine Kolonne gegeben, die mit 50 ml CM-Sephadex C-25 gefüllt ist. Die aktive Substanz wird vom Harz adsorbiert. Nach dem Waschen des Harzes mit 500 ml 0,1 molarer Ammoniumformiatlösung wird eine Konzentrationsgradienteneluierung mit einem Gesamtvolumen von 2 Liter einer wäßrigen 0,1 bis 1,0 molaren Ammoniumformiatlösung durchgeführt. Platomycin A wird in einer Fraktion eluiert, in der die Konzentration des Lösungsmittels etwa 0,30 molar beträgt. Platomycin B wird in einer Fraktion eluiert, in der die Konzentration des Lösungsmittels etwa 0,4 molar beträgt. Die·erhaltenen aktiven Fraktionen von Platomycin A und B v/erden jeweils auf eine Kolonne gegeben, die mit 50 ml Amberlite CG-50 in der H⁺-Form gefüllt ist. Nach dem Waschen des Austauschers mit Wasser wird mit 0,5 η Salzsäure eluiert. Die aktive Fraktion wird mit Dowex 44 in der OH"-Form auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und zur Trockene eingedampft. Das Konzentrat wird in einer geringen Menge 50prozentiger wäßriger Methanollösung gelöst und auf eine Kolonne gegeben, die mit Sephadex LH-20 gefüllt ist, das mit wäßriger 50prozentiger Methanollösung vorbehandelt wurde. Die Entwicklung und Eluierung wird mit 50prozentigem wäßrigem Methanol durchgeführt. Die eluierte aktive fraktion wird eingedampft und das Konzentrat mit dem 10-fachen Volumen Aceton versetzt. Von der Platomycin Α-Fraktion werden etwa 3OQ mg eines hellblauen Pulvers des Hydrochloride von. Platomycin A, von der Platomycin B-

T, ι x. · ^ ^ . Hydrochlorids

Fraktion werden etwa 150 mg eines hellblauen Pulvers des / von etwa 150 mg eines hellblauen Pulvers des Hydrochlorids von

409835/1046

Platomycin B erhalten.

Zur Herstellung der Salze der Verbindungen der Erfindung können anorganische und organische Säuren verwendet v/erden, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, SuIfaminsäure, Phosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure, Citronensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Weinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Äpfelsäure, Mandelsäure und Ascorbinsäure.·

409835/1046

Claims

Patentansprüche

i/. Platomycin A und seine Salze mit Säuren, g e k e η η w

zeichnet durch folgende Parameter des Hydrochlorids: ' (a) Elementaranalyse: C 37,48 % N 15,02 % H 5,57 % Cu 3,90 %;

(b) UV-Absorptionsspektrum (Wasser), Figur 1;

(c) IR-Absorptionsspektrum, Figur 3' . '

(d) Verhältnis der Absorption bei 244 mu und 293 mu vie

1,31 : 1;

(e) Farbreaktionen: positive Sakaguchi-, Pauli-, Ehrlich-und KMnO^-Reaktion;

negative Ninhydrin-, Elson-Morgan- und FeCl,-Reaktion;

(f) R_f-Werte im aufsteigenden Papierchromatogramm vgl. Tabelle IV;

(g) R,,-Werte im Kieselgel-Diinnschichtchromatogramm vgl. Tabelle V.
2. Platomycin B und seine Salze mit'Säuren, gekennzeichnet durch folgende Parameter des Hydrochlorids:

(a) Elementaranalyse: C 37,46 % N 15,65 % H 6,02 % Cu 5,35 %;

(b) UV-Absorptionsspektrum (Wasser), Figur 2: (cO IR-Absorptionsspektrum, Figur 4;

(d) Verhältnis der Absorption bei 244 mu und 293 mu wie 1,33 : 1;

(e) Farbreaktionen: positive Sakaguchi-, Pauli-, Ehrlich- und KMnO^-Reaktion;

negative Ninhydrin-, Elson-Morgan- und FeCl-z-Reaktion:

409835/1046

(f) R_f-Werte' im aufsteigenden Papierchromatogramm; vgl. . Tabelle IV;

(g) R_f-tferte im Kieselgel-Dünnschichtchromatogramm, vgl. Tabelle V.
3. Verfahren zur Herstellung von Platomycin A und B und ihren Salzen mit Säuren, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Platomycin A und/oder B bildenden Mikroorganismus der Gattung Streptosporangium unter üblichen Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert und aus der Kulturbrühe das Platomycin A und/ oder B abtrennt und gegebenenfalls durch Umsetzen mit einer anorganischen oder organischen Säure in ein Salz überführt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptosporangium violaceochromogenessubsp. globophilum ATCC 21893 verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei Temperaturen von 25 bis 40⁰C und bei einem pK-l.'ert um den Neutralpunkt durchführt.

L .

409835/1046