DE2435160C3 - Fortimicin A und dessen pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze sowie Arzneimittel mit einem Gehalt dieser Verbindungen - Google Patents

Fortimicin A und dessen pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze sowie Arzneimittel mit einem Gehalt dieser Verbindungen

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DE2435160C3
DE2435160C3 DE2435160A DE2435160A DE2435160C3 DE 2435160 C3 DE2435160 C3 DE 2435160C3 DE 2435160 A DE2435160 A DE 2435160A DE 2435160 A DE2435160 A DE 2435160A DE 2435160 C3 DE2435160 C3 DE 2435160C3
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Description

Forlsei/ung
Testkeim
Testkeim
MHK-Wert MHK-Wert y/ml
Pseudomonas aeruginosa KY 8510 (resistent gegenüber Kanamycin, Kanamycin B, Tobramycin, GentamycinCIa und Ribostamycin) Proteus vularis ATCC 6897 Proteus vulgaris KY4296
(resistent gegenüber Nalidixinsäure) Proteus vulgaris Abbott JJ, KY4295 Proteus mirabilis Finland 9 KY4293 Proteus mirabilis No. 825 KY4292
0,16 0,41
0,8 0,8 0,41
Proteus mirabilis No.39 KY4290 0,8
Proteus morganii Jenkins KY4298 1,6
Proteus rettgeri Booth KY4288 0,8
iu Proteus rettgeri Hambrook KY4289 0,41
Shigella sonnei ATCC 9290 0,3
Salmonella typhosa ATCC9992 0,08
Ferner ist in der folgenden Tabelle II die nach der obengenannten Methode ermittelte minimale Hemmkonzentration des Sulfats und des Hydrochlorids von Fortimicin A gegenüber den verschiedenen Mikroorganismen angegeben.
Tabelle II
Testkeim
Streptococcus faecalis ATCC 10541 Bacillus subtilis Nr. 10707 Bacillus cereus ATCC 9634 Bacillus cereus var. mycoides ATCC9462 Staphylococcus aureus ATCC 6538 P Staphylococcus aureus KY8942 Staphylococcus aureus KY8950 Staphylococcus aureus KY8953 Staphylococcus aureus KY 8956 Staphylococcus aureus KY8957 Klebsiella pneumoniae ATCC10031 Escherichia coli ATCC Escherichia coli KY8302 Escherichia coli KY8310 Escherichia coli ΚΥ8Γ14 Escherichia coli KY8315 Escherichia coli KY8327 Escherichv·. coli KY8331 Escherichia coli KY8332 Pseudomonas aeruginosa BMH Nr. Pseudomonas aeruginosa KY8510 Protv-us vulgaris ATCC 6897 Proteus vulgaris KY4296 Proteus vulgaris Abbott JJ, KY4295 Proteus mirabilis Finland 9, KY4293 Proteus mirabilis Nr. 825, KY4292 Proteus mirabilis Nr. 39, KY429Q Proteus morganii Jenkins KY4298 Proteus rettgeri Booth KY4288 Proteus rettgeri Hambrock KY4289 Shigella sonnei ATCC 9290 Salmonella typhosa ATCC 9992 MHK-Wert, y/ml
Fortimicin A-sulfat Fortimicin
A-hydrochlorid
0,04 0,04
0,6 0,6
1,2 1.2
0,08 0.0s
U
1.3		 1,3
1.3 2,6
0,64 0,64
0,32 0,64
0,08 0,08
0,16 0,16
0.52 0,26
0.13 0.13
0.26 0.26
0,26 0.26
0,13 0.13
0.3 0.3
0.3 0,3
10 10
5 5
0,16 0.16
0,8 0,8
0,8 0.8
0,8 0.8
0,8 0.8
0,8 0,8
1,6 1,6
0,8 0,8
0.41 0,41
0,3 0,3
0,16 0,16
ι ι
Weiterhin wurden in vivo-Untcrsuchungcn an Mäusen durchgeführt, die intrapcriloneal mit Escherichia coli Jtihl KY 4286 infiziert wurden. Den infizierten Mäusen wurde das Fortimicin A in unterschiedlicher Dosis subkutan injiziert. Die EDw für Fortimicin A beträgt 6 mg/kg.
Geeignete Salze des Fortimicins A sind solche mit entsprechenden anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäurc, Jodwasserstoffsäure, Schwefelsäure. Sulfarninsäure und Phosphorsäure, oder organisehen Säuren, wie Maleinsäure. Essigsäure, Citronensäure. Oxalsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure. Weinsäure. Fumarsäure, Apfelsäure, Mandelsäure oder Ascorbinsäure.
Das Fortimicin A der im Anspruch I angegebenen Formel und dessen pharmakologisch verträgliche Säiireadditionssalze werden dadurch hergestellt, daß man den Stamm Micromonospora olivoasterospora ATCC 21819 oder Micromonospora olivoasterospora ATCC 31009 oder Micromonospora olivoasterospora ATCC 31010 in üblicher Weise in einem Nährmcdium. das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25° bis 400C züchtet und anschließend das gebildete Antibioticum nach üblichen Methoden aus der Gärflüssigkeit abtrennt und dann gegebenenfalls das erhaltene Fortimicin A in üblicher Weise in ein pharmakologisch verträgliches Säureadditionssalz überführt.
Der betreffende Mikroorganismus ist aus einer Bodenprobe isoliert worden, die einem Reisfeld bei einer Vorstandt von Hiroshima, Japan, entnommen wurde.
Der bei der American Type Culture Collection. Rockville, Maryland USA unter der ATCC nr. 21819 uneingeschränkt hinterlegte Mikroorganismus, der auch als Stamm MK-70 bezeichnet wurde, und bei dem Fermentation Research Institute, Tokyo, Japan, unter der Nr. FERM P-Nr. 1560 hinterlegt wurde, besitzt folgende biologischen Eigenschaften:
I. Morphologie
Der Stamm ATCC 21819 ist gram-positiv. Auf üblichem Agar-Nährboden bildet er kein echtes Luftmycel, wie dies bei Slfeplomyces beobachtet wird. Bei guter Sporenbildung beobachtet man auf der Oberfläche eines Agarnährbodens eine olivgrüne, wachsähnliche, glänzende Schicht von Sporen; Beim Züchten des Stamms in einem flüssigen Nährmedium Zeigt die Kullurflüssigkelt während der Anfangsstufen der Züchtung eine hellbraune Farbe, in den Endstufen der Züchtung eine dunkel-olivgrüne Farbe. In der Kühlflüssigkeit kann eine große Zahl von Sporen beobachtet werden. Die mikroskopische Untersuchung der Zellen des Stammes ATCC 21819, der in einem flüssigen Nährmedium gezüchtet wurde, hat ergeben, daß das Mycel einen Durchmesser von etwa 0,5 Mikron aufweist, gut entwickelt und nicht septiert ist. Eine einzige Spore wird am Ende jedes Sporophoren (etwa 03 bis 1,0 Mikron lang) gebildet, die vom Substratmyce! abzweigt. Die Sporen werden über das gesamte, verhältnismäßig lange Substratmycel gebildet. Die reifen Sporen sind kugelförmig und haben einen Durchmesser von etwa 1,0 Mikron. Unter dem Elektronenmikroskop erscheinen die Spiren wie ein Stern, da aus ihnen eine große Zahl von Vorsprüngen herausragen, deren Enden abgerundet sind.
?l. Wuchsformen
In der folgenden Tabelle III sind die Wuchsformen des Mikroorganismus ATCC 21819 auf verschiedenen Standard-Nährböden zusammengefaßt. Die Angaben über die Farbe werden nach der Einteilung in Color Harmony Manual (Container Corporation of America) gegeben. Der Tyrosin-Agar ist von Gordon&Smith in J. Bact, Bd. 69 [ 1955], S. 147 beschrieben.
Tabelle III
Nährboden
Wachstum und Koloniegestalt Farbe des Substratmycels
Bildung von
löslichem Pigment
Czapek's Agar mäßig; flach staubig olivgrün (1 Ig) keines
GIucose-Asparagin-Agar mäßig, flach, wachsartig olivgrün (1 pl) keines
Nähragar gut; erhaben, gefurcht olivgrün (1 pl) keines
Eialbumin-Agar mäßig; flach, wachsartig hell olivgrün
gelbbraun (110		 keines
Stärke-Agar gut; flach schwach olivgrün (1 po) keines
Malzextrakt-Hefeextrakt-
Agar		 gut; erhaben, gefurcht dunkel olivgrün (1 pn) dunkel olivgrün
(1-1/2 pn)
Hafermehl-Agar gut; faltig, wachsartig berastein-karamelfarben
(3 1c)
dunkelbraun (2 pn)		 staubig, olivgrün
dpg)
Dextrose (1%) - NZ-Amin
(3%)-Agar		 mäßig, flach, wachsartig hell weizenfarben (2 ea) keines
Bennefs Agar gut; erhaben, gefurcht dunkel olivgrün (1 pn) keines
Emerson's Agar mäßig; erhaben, gefurcht,
wachsartig		 olivfarben (1 ni) keines
l-oilsel/tiiu!
Nährboden
Wachstum und Kolonicgestalt Farbe des Substratmycels
Bildung von
löslichem Pigment
Glucosc^Hefeexlrnkt-Agar
Pepton-Eiserl-Agar
Tyrosin-Agar
gut; erhabenj gefurcht. Wachsartig
mäßig; flach, wachsartig müßig; flach, wachsartig
dunkel olivgrün (1 pn) keines
dunkel olivgrün (1 nl) keines
olivgrün (1 ni) keines
Uli. Physiologische Eigenschaften
Die physiologischen Eigenschaften des Stammes ATCC 21819 sind in der Tabelle IV zusammengefaßt. In den Versuchen, ausgenommen den Versuchen zur Bestimmung des TernpefatUföpltriiüfnS Und der Einwirkung gegenüber Milch und Cellulose, wird der Stamm 2 Wochen bei 27°C gezüchtet. Das Temperaturoptimum wird nach Stiigigcr Züchlung bestimmt. Die Einwirkung auf Milch und Cellulose wird nach Imonaligcr Züchlihg bestimmt.
Tabelle IV
(1) Verwertung von Kohlensioffquellen:
KohlenslofTquelle Verwertung
D-Arabiinose -
D-Galactose -
D-Glucose ++
Glycerin -
D-Lactose -
D-Fructose -
L-Inosit -
D-Mannit -
D-Raffinose -
I -Rhamnn^p -
Sucrose ++
Stärke ++
D-Xylose -
(2) Verflüssigung von Gelatine schwach
(3) Einwirkung auf Milch Peptonisierung
(4) Cellulosezersetzung schwach positiv
(5) Stärkehydrolyse positiv
(6) pH-Optimum des Wachstums 6,8 bis 7,5
(7) Temperaturoptimum des 30 bis 38 C
Wachstums
(8) Nitrat-Reduktion positiv
(9) Tyrosinase-Reaktion negativ
(10) Bildung von melanoiden negativ
Pigmenten
Der Stamm ATCC 21819 ist ein mesophiler Mikroorganismus, der bei der Züchtung auf einem Agar-Nährboden kein echtes Luftmycel bildet, sondern auf dem Substratmycel eine einzige Spore bildet Die Analyse der 2'eIIwand dieses Stammes hat ergeben, daß sie Mesodiaminopimelinsäure enthält. Dementsprechend gehört der Stamm ATCC 21819 zu einem Stamm der Gattung Micromonospora.
Zuverlässige Grundlagen für die systematische Klassifizierung von Arten der Gattung Micromonospora fehlen bislang. Deshalb wurde die Klassifizierung der Mikroorganismen dieser Gattung bis jetzt durch einen Gesamtvergleich der morphologischen und physiologischen Eigenschaften durchgeführt. Entsprechend dieser Klassifizierungsmethode wurde von drei Stämmen berichtet, die zur Gattung Micromonospora gehören, nämlich Micromonospora echinospora subsp. echinospora NRRL-2985 (ATCC 15837). Micromonospora echinospora subsp. pallida NRRL-2996 (ATCC 15838) und Micromonospora echinospora subsp. ferruginea NRRL-2995 (ATCC 15836). Diese besitzen runde Vorsprünge auf der Oberfläche der Sporen. Diese drei Stämme von M. echinospora bilden Sporen von dunkelbrauner bis schwarzer Farbe, wenn sie auf einem
jo üblichen Agar-Nährboden gezüchtet werden. Sie zeigen jedoch nicht eine olivgrüne Farbe, wie der Stamm ATCC 21819. Die drei Stämme von M. echinospora können im Gegensatz zum Stamm ATCC 21819 L-Rhamnose verwerten. Ferner können diese drei bekannten Stämme zwei antibiotisch aktive Verbindungen bilden, von denen eine nur gegenüber gram-positiven Bakterien wirkt und einen Rf-Wert von 0.4 bis 0,5 bei der Papierchromatographie mit Wasser gesättigtem n-Butanol als Entwicklungslösungsmitlel hat. sowie das Antibiotikum Gentamicin, das einen Rf-Wert von 0,(K1 besitzt. Der Stamm ATCC 21819 kann dagegen vier
Substanz, die nur gegenüber gram-positiven Bakterien wirksam und einen Rf-Wert von 0,05 bis 0,1 bei der Papierchromatographie mit dem vorgenannten Entwicklungslösungsmittel hat, eine Verbindung, die nur gegenüber gram-positiven Bakterien wirksam ist und einen Rf-Wert von 0,00 hat, sowie die Verbindungen Fortimicin A und B, die sowohl gegenüber gram-positiven als auch gram-negativen Bakterien wirken und einen Rf-Wert von 0,00 haben. Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß der Stamm ATCC 21819 sich von den drei bekannten Stämmen von M. echinospora unterscheidet.
Der Stamm ATCC 21819 zeigt eine olivgrüne bis dunkel olivgrüne Farbe bei der Züchtung auf einem Nährbonden, der zur Sporenbildung geeignet ist. und er bildet ein lösliches, olivgrünes Pigment in anderen Nährmedien.^Jnter den Stämmen der Gattung Micro-
bo monospora gibt es einige Stämme, die olivgrüne Sporen bilden können, nämlich Micromonospora chalcea und Micromonospora fusca. Diese Stämme unterscheiden sich jedoch im Aussehen der Sporenoberfläche und der Farbe der löslichen Pigmente.
Andere Arten von Micromonospora. nämlich Micromonospora coerulea zeigen gewöhnlich eine grün-blaue Farbe und bilden blaugrüne lösliche Pigmente. Die Pigmente wirken als Säure-Base-Indikatoren und sind
daher verschieden von dem Pigmem dos Stammes ATCC 21819. Die Sporen von M. coerulea liegen iraubenförmig vor und die Sporenoberfläche ist glatt. Somit isl M. coerulea verschieden vom Stamm ATCC 21819.
Wie vorstellend beschrieben, gibt es keine Stumme miier den bis jetzt bekannten Stämmen der Gattung Micromonospjra, die dem Stamm ATCC 21819 tntsprechen. Deshalb wird dieser Stamm als ein neuer Stamm angesehen, der zur Gattung Micromonospora gehört. Er wurde deshalb als Micromonospora olivoaiterospora bezeichnet. Der Name dieser Art leitet sich »on der Bildung olivgrüner kugelförmiger Sporen mit Vorsprüngen ab.
Es wurden ferner zwei Variantenstämme von Micromonospora olivoasterospora isoliert, die ebenfalls Fortimicin A bilden können und bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Nr. 31009 und ATCC Nr. 3!0!0 uneingeschränkt hinterleg· worHi»n lind. Diese Varianten unterscheiden sich vom Stamm ATCC 21819 dadurch, daß sie D-Galactose, D-Fructose •nd D-Xylose verwerten können. Bei der Züchtung dieser Varianten auf den verschiedensten Nährböden teigen sie eine helle Weizenfarbe, da sie nicht die Fähigkeit haben, auf dem Mycel Sporen zu bilden.
Die Herstellung des Fortimicins A erfolgt nach üblichen, zur Züchtung von Actinomyceten angewendeten Verfahren. Für das Nährmedium können die verschiedensten Nährstoffe eingesetzt werden. Geeigtiete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Stärke, Mannose, Fructose, Sucrose und Melassen und deren Gemische. Ferner können z. B. Kohlenwasserstoffe, Alkohole und organische Säuren verwendet werden, je nach der Verwertungsfähigkeit des eingesetzten Mikroorganismus. Anorganische und organische Stickstoffquellen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff. Ammoniumnitrat und Natriumnilrat, sowie natürliche Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Casaminosäure, und lösliche pflanzliche Proteine können entweder allein oder im Gemisch verwendet we-den. Ferner können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Phosphate dem Nährmedium zugesetzt werden. Schließlich können organische oder anorganische Verbindungen dem Nährmedium zugesetzt werden, welche das Wachstum des Mikroorganismus und die Bildung von Fortimicin A fördern. Wenn die Bildung von Fortimicin A durch Änderung der Zusammensetzung des Nährmediums verbessert wird, nimmt die Bildung an anderen aktiven Substanzen ab.
Vorzugsweise wird ein flüssiger Nährboden eingesetzt und das Verfahren als Submersverfahren und unter Rühren durchgeführt. Die Züchtung wird bei Temperatur von 25 bis 40° C und bei annähernd neutralem pH-Wert durchgeführt. Nach etwa 4 bis 15tägiger Züchtung hat sich in der Kulturbrühe eine ausreichende Menge des Antibiotikums gebildet. Sobald die Ausbeute an Fortimicin A in der Kulturbrühe ein Maximum erreicht hat, wird die Züchtung abgebrochen, die Zellmasse von der Kulturflössigkeit abgetrennt und das Antibiotikum aus dem Filtrat isoliert und gereinigt Die Isolierung und Reinigung von Fortimicin A aus dem Filtrat wird nach üblichen Methoden zur Isolierung und Reinigung von mikrowellen Stoffwechselprodukt^n aus Kulturflüssigkeilen durchgeführt. Da Fortimicin A eine Base darstellt und in Wasser löslich, jedoch in üblichen organischen Lösungsmitteln schlecht löslich ist, kann das Antibiotikum nach üblichen Methoden zur Reinigung sogenannter wasserlöslicher basischer Antibiotika gereinigt werden.
Die Reinigung von Fortimicin A kann insbesondere % durch Kombination von Adsorption und Desorption an Kationenharzaustauscheni, Säulenchromatographie an Cellulose, Adsorption und Desorption an dem Dcxtrangel Sephadex LH-20 und Chromatographie an Kiesclgel durchgeführt werden.
Beispielsweise wird das zellfreie Kulturfillrat zunächst auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und hierauf an einem Kationcnharzaustauscher in der Ammoniumform adsorbiert. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 1 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die gegen-
B über z. B. Rucillus subtilis Nr. 10707 antibiotisch aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck eingedampft und hierauf eine Säule eines Anionenharzaustauschers in der OH -Form gegeben. Die adsorbierten Substation werden mit Wasser eluiert und die eluierten
ίο antibiotisch aktiven Fraktionen vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält ein pulverförmiges Rohprodukt, das Fortimicin A und noch andere antibiotisch aktive Komponenten enthält.
Das Rohprodukt wird in Wasser gelöst, die wäßrige Lösung mit 2 n-Schwefelsüure auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und auf eine mit Aktivkohle gefüllte Säule gegeben. Die antibiotisch aktiven Substanzen werden an Aktivkohle adsorbiert. Danach wird die Säule zur Abtrennung von Verunreinigungen mit Wasser gewasehen und hierauf mit 0.2 η-Schwefelsäure eluiert. Die eluierten antibiotisch aktiven Fraktionen werden gesammelt und auf eine Säule eines Anionenharzaustauschers in der OH -Form zur Neutralisation gegeben. Das Eluat wird gefriergetrocknet. Man erhält dann ein pulverförmiges Rohprodukt, das Fortimicin A als freie Base enthält.
Zur Isolierung des Fortimicins A wird das Rohprodukt z. B. an Kieselgel Chromatographien. Als Entwicklungslösungsmittel wird die untere Schicht eines Gemisches aus Chloroform, Isopropanol und wäßriger Ammoniaklösung (2:1 : 1) verwendet. Zu diesem Zweck wird das pulverförmige Rohprodukt im Entwicklungslösungsmittel gelöst und aul eine mit Kieseigei gefüllte Säule gegeben. Sodann wird mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt. Die erste antibiotisch aktive Fraktion enthält Fortimicin B. Spuren an anderen Komponenten werden in anschließenden Fraktionen eluiert. Fortimicin A wird in Fraktionen eluiert, die breiter sind als die Fortimicin B oder Spuren an anderen Komponenten enthaltenden Fraktionen. Die das Fortimicin A enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft. Nach dem Gefriertrocknen des Konzentrats wird ein weißes Pulver erhalten, das die Base des Antibiotikums enthält.
Das erhaltene Fortimicin A ist von verhältnismäßig hoher Re'nheit, es enthält jedoch bisweilen noch Verunreinigungen. In diesem Fall wird es an einer mit Cellulose gefüllten Säule unter Verwendung eines Gemisches aus n-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser (6 :4 : 2 :4) als Entwicklungslösungsmittel chromatographiert Die erhaltenen antibiotisch aktiven Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei ein reines Fortimicin Α-Präparat erhalten wird.
6* Sofern die Verunreinigung eine Substanz darstellt, die einen positiven Ninhydrin-Tesi Hefen, kann diese Substanz durch Chromatographie an einer mit Carboxymethylcellulose gefüllten Säule abgetrennt werden. In
diesem Fall wird eine Lösung des Rohproduktpulvers von Fortimicin A auf eine mit Carboxymethylcellulose in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Die anlibiotisch aktiven Substanzen werden an der Carboxymethylcellulose adsorbiert. Nach gründlichem Waschen der Säule mit Wasser zur Abtrennung der meisten Pigmente und anorganischen Salze wird mit 0,2 n-Ammoniumbicarbonatlösung eluicrt. Die erhaltenen gereinigten Fraktionen von Fortimicin A werden gesammelt und gefriergetrocknet.
Die das Fortimicin A enthaltenden Fraktionen werden durch aufsteigende Papierchromalographie mit Filterpapier Whatman Nr. 1 bestimmt. Die Entwicklung wird bei Raumtemperatur während 10 bis 15 Stunden unter Verwendung der unteren Schicht eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (2:1:1) durchgeführt. Der Rr-Wert von Fortimicin A auf dem Papierchromatogramm beträgt etwa 0,37.
Das erhaltens Fortimicin A stellt eine weiß gcfüi'bte Substanz nv< einem Molekulargewicht von 405 (berechnet auf Grund des Massenspektrogramms) und einem Schmelzpunkt von oberhalb 2000C (Zers.)dar.
Entwicklungslösungsmittel
Std.
20ge\vichtsprozent!ge 0,96 3
Ammoniumchloridlösung
Wassergesättigtes n-Butanol 0,00 15
Gewichtsanalyse in % I
Ber.: C 50,4, H 8,71, N 17,3, O 23,7%, gcf.: C 50,2, H 8,67, N 17,5, 0 23,6%.
In Fig. 1 ist das UV-Absorptionsspektrum von Fortimicin A in wäßriger Lösung wiedergegeben. Das Spektrum zeigt keine charakteristischen Maxima im Spektralbereich von 220 bis 360 ιημ und lediglich eine Endabsorption.
In Fig. 2 ist das IR-Absorptionsspektrum von Fortimicin A dargestellt. Dieses zeigt Absorptionsmaxima bei folgenden Wellenzahlen (era-1): 1030,1100,1340, 1390,1480,1570.1625,2900 und 3400.
Das Fortimicin A hat folgenden spezifischen Drehwert [«] » = + 26° (c= 0,2, H2O).
Fortimicin A ist in Wasser gut löslich, in Methanol löslich, in Äthanol mäßig löslich und in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Äthylacetat, DUtyiaceiai, Diüihyiälher, Buuuiui, Peiruläther und η-Hexan unlöslich.
Fortimicin A ergibt eine positive Ninhydrin-Reaktion und Kaliumpermanganat-Reaktion, sowie eine negative Elson-Morgan- und Biuret-Reaktion.
Die Rr-Werte von Fortimicin A bei der Papierchromatographie und Dünnschichtchromatographie mit den verschiedensten Entwicklungslösungsmitteln sind in den folgenden Tabellen V, VI und VII zusammengefaßt. Diese Werte wurden mit den Rf-Werten verschiedener ähnlicher Antibiotika verglichen, die in gleicher Weise entwickelt wurden.
Tabelle V
R1-Werte von Fortimicin A im aufsteigenden Papierchromatogramm bei 28°C
Rf-Wert Entwicklungsdauer
Entwicklungslösungsmittel
Rr-Wert Eritwlcklungsdauer
Std.
n-Bulanol-Essigsäure-Wasser 0,06 15 (3:1:1)
Wassergesättigtes Äthylacetat 0,00 4 Wassergesättigtes n-Bulanol 0,04 15 mit 2 Gewichtsprozent
p-Toluolsulfonsäure und
2 Volumprozent Piperidin
tabelle VI
RrWerte von Fortimicin A und Gentamicin C Komplex bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel; entwickelt bei Raumtemperatur während 3 Stunden
Entwicklungs Antibiotikum Rr-Wert
lösungsmittel*)
I Fortimicin A 0,74
I Gentamicin C 0,71
Komplex
I Gentamicin C2 0,71
Il Fortimicin A 0,37
II Gentamicin C 0,06 bis 0,16
Komplex
II Gentamicin C? 0,08 bis 0,14
*) Entwicklungslösungsmittel I:
Die obere Schicht eines Gemisches von Chloroform, Methanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (Volumverhältnis 2:1:1).
EntwicklungslösungsmiUsI II:
lOprozentige Ammoniumacetatlösung und Methanol (Volumverhältnis 1:1).
Tabelle VlI
Ri-Werte bekannter Antibiotika bei der aufsteigenden Papierchromatographie unter Verwendung der unteren Schicht des Gemisches von Chloroform, Methanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (Volumverhältnis 2:1:1) als Entwicklungslösungsmittel, entwickelt bei Raumtemperatur während 12 Stunden
Antibiotikum
Rr-Wert
Streptomycin A
Streptomycin B
Bluensomycin
Ribostamycin
Lividomycin A
Lividomycin B
Lividomycin D
Spectinomycin
Kasugamycin
Buti rosine A
0,02 0,00 0,01 0,00 0,00 0,03 0,02 0,45 0,01 0,00
Fiirlset/uni!
Antibiotikum
Rf-Wert
Butirosine B
Hygromycin B
Destomycin A
Gentamicin A
Gentamicin B
Gentamicin C|3
Gentamicin Q
Gentamicin C2
Sisomicin
Neomycin A
Neomycin B
Neomycin C
Antibiotikum Nr.460
Kanamycin A
Kanamycin B
Kanamycin C
Paromomycin
Nebramycin Komplex
Tobramycin
Apramycin
XK-62-2
Fortimicin B
Fortimicin A
0,01 0,02 0,03 0,00 0,00 0,18 0,59 0,38 0,18 0,00 0,03
ο,υυ
0,01 0,02 0.01 0,02 0,00 0.01 0.02 0,02 0.49 0.65 0.37
Beispiel
Micromonospora olivoasterospora ATC C 21819 wird als Einsaalslamm in einem ersten Vorkulturmedium gezüchtet, das 2% Glucose. 0.5% Pepton. 03% Hefeextrakt und 0,1% Calciumcarbonat enthält. Das Nährmedium wurde vor der Sterilisation auf einen pH-Wert von 7.2 eingestellt. Eine Platinöse des Einsaatstammes wird in 10 ml des Vorkulturmediums in einem 50 ml fassenden großen Reagensglas überimpft. Die Ziichuing wird 5 Tage unter Schütteln bei 300C durchgeführt. Sodann werden 10 ml der ersten Vorkultur in 30 ml eines zweiten Vorkuiturmediums in einem 250 ml Erlenmeyerkolbcn überimpft. Die Zusammensetzung des zweiten Vorkuiturmediums ist die gleiche wie die des ersten Vorkuiturmediums. Die Züchtung wird 2 Tage unter Schütteln bei 30°C durchgeführt. Sodann werden 30 ml des zweiten Vorkuiturmediums in 300 ml eines drillen Vorkuiturmediums in einem 2 Liter fassenden Lrlenmeyerkolben ülierimpft. der mil Prallplaticn ausgerüstet ist. Die Zusammenscizung des dritten Vorkuiturmediums ist die gleiche wie die des ersten Vorkulturmediums. Die Züchtung im drillen Vorkulturmedium wird 2 Tage unter Schütteln bei 30' C durchgeführt. Sodann werden 1,5 Liier der dritten Vorkulturbrühe - entsprechend dem Inhalt von 5 Kolben — in 15 Liter eines vierten VorkuHufrnediufns in einem 30 Liter fassenden Fermenler überimpft. Die Zusammensetzung des vierten Vorkullurmediums ist die gleiche wie die des ersten Vorkullurmediums. Die Züchtung in dem Fcrmemer wird 2 Tage unter Belüftung und Rühren (350 U/ttiin; Belüftung 15 Liter/min) bei 30" C durchgeführt. Schließlich werden 15 Liier der vierten Vorkullurbrühc in 150 Liier eines Mediums in einem 300 Liter fassenden Fermenter aus Edelstahl überimpft. Dieses Nahrmedium enthält 4% Stärke, 2% Sojabohnenmehl, 1% Maisquellwasser, 0,05% K2HPO4, 0,05% MgSO4 · 7 H20,0,03% KCI und 0,1 % CaCOl· Vor der Sterilisation wurde das Nahrmedium mittels 2 η-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt Die Züchtung in dem Fermenter wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren (150 U/min; Belüftung 80 Liter/min) bei 300C durchgeführt. Die dann erhaltene
to Gärmaische wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 23 eingestellt und 30 Minuten gerührt. Sodann werden etwa 7 kg Diatomeenerde als Filtrierhilfe eingetragen und die Zellen abfiltriert. Das Filtrat wird mit 6 η-Natronlauge auf einen pH-Wert von 73 eingestellt und auf eine mit etwa 20 Liter eines Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Die durch das Austauscherbett abfließende Flüssigkeit wird verworfen. Antibiotisch aktive Verbindungen sind am Austauscher adsorbiert.
Nach dem Waschen des Austauscherbetts mit Wasser werden die adsorbierten aktiven Verbindungen mit 60 Liter 1 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die Aktivität des Eluais wird durch ein Antibiogramm nach der Testplättchenmethode auf einer Agarplatte und mit Bacülus sublilis Nr. 10707 bestimmt. Die antibiotisch aktiven Fraktionen (etwa 20 Liter) werden gesammelt, und das Gemisch wird unter vermindertem Druck auf etwa I Liter eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine mil 500 ml eines Anionenharzausiauschers in der
jo OH I orm gefüllte Säule gegeben. Die Verunreinigungen werden am Austauscher adsorbiert. Das Austauscherbett wird mit etwa 2 Liter Wasser eluiert. Die antibiotisch aktiven Fraktionen (etwa 200 ml) werden gesammelt und unier vermindertem Druck auf etwa
Ji 100 ml eingedampft Sodann wird das Konzentral auf eine mit etwa 50 ml pulverisierte Aktivkohle gefüllte Säule gegeben, wobei die antibiotisch. aktiven Verbin düngen an der Aktivkohle adsorbiert werden. Die Säule wird mit Wasser gewaschen, und das abfließende
•10 Wasser und das Waschwasser wird verworfen. Sodann werden die adsorbierten aktiven Verbindungen mit 0.2 n-Schwcfelsäure cluicri. Die Aktivität de«. Fluals wird nach der Tesiplältchenmclhode an Bacillus sublilis Nr. 10707 bestimmt Die aktiven Fraktionen (etwa 200 ml)
4Ί werden gesammelt. Die erhaltenen Fraktionen werden auf eine mil einem Anionenharzausiauschcr in der OH -Form gefüllte Säule gegeben. Die aktiven Verbindungen werden sodann mit Wasser cluieri. die aktiven Fraktionen (etwa 300 ml) gesammelt und auf
in etwa 50 ml cingedampfl. Das erhaltene Konzenlral wird gefriergetrocknet. Fs wird ein pulveriges Rohprodukt erhallen, das I ortimicin A enthalt. Die Ausbeute beträgt etwa i2 g. Das Rohprodukt besitzt eine Aklivilal von 575 i.inheiten/mg (die Aktivität von I mg reiner
Y, Verbindung enlspricht 10ΠΟ Finnen 11).
Zur weiteren Reinigung wird das Kohpmdtikt an kieselgel Chromatographien
500 ml Kieselgel werden in eine Säule aus dliis eingefüllt, Die Sauje wird folgendermaßen gefüllt Das Kieselgel wird in der unteren Schicht eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Isopropanol und 17proz.erttiger wäßriger Ammoniaklösung (Volumenverhältnis 2 :1 :1) suspendiert. Sodann wird die Kieselgel*Suspensiofi in die Säule als gleichmäßige Schicht eingefüllt.
6S Anschließend wird sie mit dem gleichen Lösungsmiticlgemisch gewaschen. Danach werden 10 g des pulverigen Rohprodukts in dünner und gleichmäßiger Schicht auf den Kopf der Säule gegeben. Hierauf wird mit dem
vorgenannten Lösungsmittel eluiert, das vorsichtig in den Kopf der Kolonne gegossen wird. Anschließend wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml/ Stunde eluiert. Es werden Fraktionen von jeweils 20 ml gesammelt und die Aktivität jeder Fraktion wird nach der Testplättchenmethode an Bacillus subtilis Nr. 10707 bestimmt. Die ersten antibiotisch aktiven Fraktionen enthalten Fortimicin B, danach folgen antibiotisch aktive Fraktionen, die Fortimicin A enthalten. Die antibiotisch aktiven Fraktionen mit Fortimicin A werden der Papierchromatographie unterworfen, wobei der Rf-Wert des Fortimicins A durch Bioautographie mit Bacillus subtilis Nr. 10707 bestimmt wird. Die Fortimicin A enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und die wäßrige Lösung gefriergetrocknet. Man erhält 1,8 g gereinigtes Fortimicin A als freie Base. Die Aktivität des Präparats beträgt 970 Einheiten/mg. Die Konstanten für das Fortimicin A sind bereits weiter oben in der Beschreibung angegeben worden.
Beispiel 2
Wie im Beispiel 1 wird Micromonospora olivoasterospora ATCC 21819 als Einsaatstamm verwendet und wie dort in vier Stufen der Vorkultur gezüchtet. Dann wird gemäß Beispiel 1 die Vorkulturbrühe in einem Fermenter. der als Hauptfermentationsmedium ein Nährmedium bestehend aus 4% lösliche Stärke. 3% gepulverte Trockenhefe (Ebios). 0.05% K2HPO4. 0.05% MgSO4 ■ 7 H2O. 0.03% KCI und 0.1% CaCO, enthält, ge.'ü· htet. Die Fermentation wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren bei U C durchgeführt. Nach beendeter Züchtung wird die Gärmaische gemäß Beispiel I aufgearbeitet. Es werden 63 g eines pulverformigen Rohprodukts mit einer Aktivität von 650 Einheiten/mg erhalten. Das Rohprodukt wird gemäß Beispiel I gereinigt. Man erhält 18 g gereinigtes Fortimicin A mit einer Aktivität von 850 F.inheitep'mg. Diese gereinigte Substanz wird durch (. hromatographic an Cellulose weiter gereinigt. 500 ml Cellulosepulver worden in eine GUssäule fogendermaßen gefüllt: Das Cellulosepulver wird in einem I.ösungsmittelgemisch am n-ßutanol. Essigsäure. Pyridin und Wasser (b 2 ■ 4 :4) suspendiert. Sodann wird die Suspension gleichmäßig in die Kolonne gefüllt und anschließend mit drm gleichen I.osungsmitielgemisch gewaschen. Hier auf wird die Substanz in dünner und gleichmäßiger Schicht ,Ulf den Kopf der Celluloscsäure gegeben. Die Miiierung wird mit dem gleichen l.osungsmiltelgemisch durchgeführt. Das I osungsmiltclgcmisch wird vorsieh it in ckn Kopf der Säule gegossen und sodann wird hei liner Strömungsgeschwindigkeit von eiwa 1 ml'Minnle cluiei' Das final wird in fraktionell von IO ml iiiil(jet<inpen und die ,intibmiische Aktivität jeder friktion wird muh de ι testplältchcmnethodc an DiU'illiis subtilis Nr 10707 bestimmt. Die aktiven l'.iklioncn werden gesammelt (50Γ ml) und unter vermindertem Druck air trockene eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ma(I erhält 9 g gereinigtes Fortimicin A-Basc einer Aktivität Von 980 Einheiten/mg. Die Verbindung entspricht der des Beispiels I.
Beispiel 3
Wie im Beispiel I wird unter Verwendung von Mieromonospora olivciasierospora ATCC 21819 als F.insaalstanim in vier Stufen einer Vorkuliurbrühc gezüchtet. Diese wird dann gemäß Beispiel 1 in einem Fermenter unter Verwendung eines Hauptfermentationsmediums, das 4% lösliche Stärke, 3% Casaminosäure (ein Säurehydrolysat von Casein), 0.05% KjHPO4, 0,05% MgSO4 · 7 H2O, 0,03% KCI und 0,1% CaCO3 enthält, gezüchtet Die Züchtung, Isolierung und Reinigung des Fortimicin A wird gemäß Betspiel 1 durchgeführt. Es werden 18,5 g gereinigtes Fortimicin A mit einer Aktivität von 965 Einheiten/mg erhalten. Die ίο Verbindung entspricht der des Beispiels 1.
Beispiel 4
Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von Micromonospora olivoasterospora ATCC 21819 durchgeführt und die dabei erhaltene Gärmaische wird gemäß Beispiel aufgearbeitet Es wird ein pulverförmiges Rohprodukt erhalten, das Fortimicin A enthält. 3 g des Rohprodukts werden in 5 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird auf eine mit 200 ml Carboxy-
methylcellulose in der Ammoniumlorm gefüllte Säule gegossen. Danach wird die Säule mit 1000 ml Wasser gewascher.. Antibiotisch aktive Substanzen werden an der Carboxymethylcellulose adsorbiert, während der größte Teil der Pigmente und anorganischen Salze abgetrennt wird. Hierauf wird mit einer wäßrigen Lösung eines 0.2 molaren Citronensäure-Phosphorsäure-Puffergemisches (pH-Wert 3.0) mit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 50ml'Std. eluiert. Das Eluat wird in 10 ml Fraktionen gesjmmelt. Die antibiotische Aktivität jeder Fraktion wird nach der Testplättchen methode bestimmt. Die Fortimicin A enthaltenden Fraktionen werden gesammelt (200 ml). Die das Fortimicin A enthalte Jen vereinigten Fraktionen werden dann auf eine mit einem Kationenharzaustau-
i'i scher in der H'-Form gefüllten Säule gegeben, wobei das Antibiotikum am Kationenharzaustauscher adsorbiert ivird. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wird mit 0.5 η-Salzsäure eluiert Die antibiotisch aktiven Fraktionen werden gesammelt, vereinigt und mit einem Anionenharzaustauscher in der OH -Form neutralisiert. Die erhaltene I osung wird gefriergetrocknet. Man erhält 56Og Fortimicin A-Bjsc mit einer Aktivität von 985 Einheilen/mg. Di Verbindung entspricht der des Beispiels I.
Beispiel 5
Als F.insaatstamm wird Micromonospora livoastero spora ATCC 31009 verwendet Als t ir aatincdium fur die erslc bis vierte Vorkullur wird das in Beispiel I
in ver > endete Nährmcdium eingesetzt, das 2% Glucose. OVVn Pcpion. 0.3% Hefccxtrakt und 0.1% ( iilciumtar bonat enthält, und die Züchtung gemäß Beispiel I durchgeführt. Vor der Sterilisation wurde das Nährnic diiim mit 2 n-N.itronlaugc m\\ einen pH Wert 7.2
>> eingestellt Sodann werden I1J liier der vierten Vorkulturbrühe in 150 l.ncr eines Nahrmcdiums in einen 300 Liter fassenden LdelsUihlfermentcr liberimpfi Dieses Nahrmedium enthält 2% loslnhe Starke. 005"/» Sojabohnenmehl. 2% Glucose. Γ".» Maisquellw.isscr
1% HefeexlrakL 0,05% K2IIPO4. 0.05% MgSO4 ■ 7 H20,0.03% KCI iitvd OJ % CäCOj.
Vor der Sterilisation wurde das Nahrmedium mit 2 η-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Züchtung wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren
(150 U/min; Belüfiungsgeschwindigkeii 80 Liter/min) bei 3O0C durchgeführt. Nach beendeter Züchtung wird die Gäfmaische gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet und das Fortimicin A wie dori beschrieben, isoliert und
gereinigt. Die Aktivität des erhaltenen pulverformigen Rohprodukts beträgt 560 Einheiten/mg. Das Rohprodukt wird gemäß Beispiel 1 weiter gereinigt. Man erhält 6,8 g Fortimicin A mit einer Aktivität von 975 Einheiten/mg. Die Verbindung entspricht der des Beispiels 1.
Beispiel 6
Als Einsaatstamm wird Micromonospora olivoasterospora ATCC 31010 verwendeL Als Einsaatmedium für die erste bis vierte Vorkultur wird ein Nährmedium verwendet, das 1% Glucose, 1% lösliche Stärke, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Pepton und 0,1% Calciumcarbonat enthält, und die Züchtung wird gemäß Beispiel I durchgeführt. Der pH-Wert des Nährmediums wurde vor der Sterilisation mit 2 η-Natronlauge auf 7,0 eingestellt Die Einsaatkultur der vierten Vorkultur wird sodann gemäß Beispiel 1 in einem Fermenter, der ein Hauptfermentatiö"ismedium mit der in Beispiel 5 angegebenen Zusammensetzung enthält, überimpft und gemäß Beispiel 1 gezüchtet und weiter aufgearbeitet. Aus der Gärmaische des Hauptfermentationsmediums werden 52 g eines pulverförmigen Rohprodukts erhalten, das Fortimicin A enthält. Die Aktivität des Rohprodukts beträgt 530 Einheiten/mg. Das Rohprodukt wird gemäß Beispiel 1 gereinigt- Man erhält 9 g Fortimicin A mit einer Aktivität von 980 Einheiten/mg. Die Verbindung entspricht der des Beispiels 1.
Beispiel 7
1 g gemäß Beispiel 1 hergestelltes Fortimicin A wird in 50 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 6 η-Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und gefriergetrocknet. Es werden 1,6 g des Sulfats von Fortimicin A als weißes Pulver erhalten. F. >200"C (Zers.). [α]Is = +74,2° (c = 0,5 in H2O). Spezifische AHivität:585 Einheiten/mg.
Beispiel 8
1 g gemäß Beispiel 1 hergestelltes Fortimicin Λ wird in 50 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 6 η-Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und gefriergetrocknet. Ausbeute Ug des Hydrochlorids von Fortimicin A als weißes Pulver. F. 180° C (Zers.). [α]?= +77,5° (C= 0,1 in H2O).Spezifische Aktivität:645 Einheiten/mg.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

  1. 24 35 I Patentansprüche; j 5 1fi0
    2     MHK-Wert     fr 1 Testkeim y/ml I 1. Fortimicin A der Formel |i Die Erfindung betrifft den in de Patentansprüchen I 1 I und 2 gekennzeichneten Gegenstand. in I CH3
    Ϊ I     i Es wurde gefunden, daß das Antibioticum Frolimicin 0,6     I CH-NH-, Η,Ν OH I A antibakteriell Aktivität gegenüber den verschieden-
    '; ilen gram-positiven und gram-negativen Bakterien     Bacillus cereus ATCC 9634 0,6     i K " " X I jowie auch gegenüber Staphylococcus aureus und Bacillus cereus var. mycoides I < > O <( VOCH3 jj Escherichia coli besitzt, die gegenüber den verschieden- ATCC 94 63 0,04 I —ι /\ I ilen bekannten Antibiotika resistent sind. Fortimicin A Staphylococcus aureus ATCC 6538 P 10 I NH, HO N-CH3 1 icichnrt sich durch starke antibaktenellc Aktivität Staphylococcus aureus KY8942 I " I I gegenüber Escherichia coli und .Staphylococcus aureus
    I ius, die normalerweise resistent sind gegenüber
    S Kanamycin. Gcntamycin und Tobramycin. Ferner hat
    ξ Fortimicin A eine befriedigende antibakteriell Aktivi-     (resistent gegenüber Kanamycin     ? co a lät gegenüber Bakterien der Gattung Proteus. Es eigne! Paromomycin, Streptomycin, ! I j lieh daher /ur Therapie von verschiedenen Infeklions 20 Gentamicin und Nebramicin) 1,3 I krankheiten, die durch die vorgenannten Bakterien 25 Staphylococcus aureus KY8950 t hervorgerufen werden. Außerdem ist es auch als
    j Infektionsmniel geeignet.     (resistent gegenüber Streptomycin,     < und das folgende Kenndaten aufweist:
    j Molekulargewicht 405;
    ■ spezifischer Drehwert [α] j? = + 26° (c= 0,2 η. HjO);
    U V-Absorptionsspektrum (in wäßriger Lösung)
    gemäß F i a t ■     I In Tabelle I ist die minimale I lemmkonzentration Tetracyclin, Penicillin und Sulfon-     IR-Absorptionsspektrum (bestimmt als Kaliumbro- ; (MHK) von Fortimicin A. bestimmt nach der Agar Vcr amiden) 1,3 I mid·Preßling) gemäß Fig. 2, sowie dessen pharma- ί ilünnungsmcthodc (pH 8.0; vgl. Nihon Kagaku Pyoho Staphylococcus aureus KY 8953
    (resisiertt gegenüber Streptomycin,
    Kanamycin, Paromomycin, Tetracyclin,
    Neomycin, Kanamycin B und         1 kologisch verträgliche Säureadditionssalze. \ G&kkai Hyajunho-Antihioiika (.rundlagen. Hcrausg. so Erythromycin) 0,32 i 2. Arzneimittel, enthaltend Fortimicin A oder ein i Nan/ando, |apan [I975|. S. 88 91) gegenüber verschic Staphylococcus aureus KY 8956 j! pharmakologisch verträgliches Säureadditionssalz I denen püthogenen Keimen zusammengefaßt (resistenl gegenüber Streptomycin, gemäß Anspruch I neben üblichen inerten Träger
    stoffen.     i
    ü     Paromomycin, Tetracyclin,     I Tabelle I i> Erythromycin und Oleandomycin) 0,32 Staphylococcus aiireus KY8957 1 Testlceim MIIKAVcrt (resistent gegenüber Chloramphenicol, I y/m\ Streptomycin, Kanamycin B, !I 40 Tetracyclin und Paromomycin) 0,08 p Streptococcus faecalis ATCC10541 10 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 I Bacillus subtilis Nr. 10707 0,02 0,16 Escherichia coli ATCC 26 0,26 4 V Escherichia coli KY8302 (resislent gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin, Kanamycin, Paromomycin, Vl Tetracyclin und Speclinomycin) 0,13 Escherichia coli KY8310 (resistent gegenüber Chloramphenicol,
    Streptomycin, kanamycin. Gentamicin,
    Kanamycin B, Paromomycin, Tetracyclin
    1 I f^ f I ^h ΤΎ ^t F* f I m f\ TY^ 1 f F* t f^ \         unci ^pecunomycin/ 0,26 v» Escherichia coli KY8314 (resistent gegenüber Streptomycin) 0.13 Escherichia coli KY83I5 (resistent gegenüber Streptomycin, M) Kanamycin. Paromomycin und Neomycin) 0,13 Escherichia coil KY8327 (resistent gegenüber Kanamycin. Gentamicin, Sisomicin und Tobramycin) 0,3 Escherichia coli KYX331 (resistent gegenüber Kanamycin, Ribostamycin, Neomycin, Paromomycin und Lividomycin) 0,3 Escherichia coli KY8332 (resistent gegenüber Kanamycin und Tobramycin) 5 Pscudomonas aeruginosa BMH Nr. 1
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