DE2908150C2 - Fortimicin KG↓1↓, KG↓2↓ und KG↓3↓ Verfahren zu ihrerHerstellung und pharmazeutische Zubereitung - Google Patents

Fortimicin KG↓1↓, KG↓2↓ und KG↓3↓ Verfahren zu ihrerHerstellung und pharmazeutische Zubereitung

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DE2908150C2
DE2908150C2 DE2908150A DE2908150A DE2908150C2 DE 2908150 C2 DE2908150 C2 DE 2908150C2 DE 2908150 A DE2908150 A DE 2908150A DE 2908150 A DE2908150 A DE 2908150A DE 2908150 C2 DE2908150 C2 DE 2908150C2
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spectrum
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Description

NH2 OH N-CH3
3. Verfahren zur Herstellung von Fortimicin KGi, KGt und KG3 gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Micromonospora olivoastcrospora ATCC 21819, ATCC 31 009, ATCC 3101G oder NRRL 8178 in einem flüssigen Nährmedium bei einem pH-Wert um den Neutralpunkt 2 bis 15 Tage bei 25 bis 40°C züchtet und anschließend mindestens eine dieser Verbindungen aus der Kulturbrühe isoliert
4. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend mindestens eine der Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1 und 2 und übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe.
in der R den Rest
O
-C-CH2NH2
(Fortimicin KG3) oder ein Wasserstoffatom (Fortimicin KGi und Fortimicin KG2) bedeutet, wobei Fortimicin KGi folgende Kenndaten aufweist:
(1) Schmelzpunkt 95-98° C,
(2) spezifischer Drehwert:
[λ]? +58,3° (c = 0,66, H2O),
(3) I R-Spektrum (KBr): 3360,2930,1675,1590,1370, »110,1055und 1000 cm-' und
(4) CM R-Spektrum in Deuteriumoxidlösung
(pD = 10.7):
o(ppm) 153,1, 101,2, 95,2, 83,4, 83,2, 75,2, 73,4, 62,2,60,1,54,8,48,9,47,4,33,6,25,7,20,5,
und Fortimicin KG2 die folgenden Kenndaten aufweist
(1) Schmelzpunkt: 83-85°C,
(2) spezifischer Drehwert:
Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
In der US-PS 39 31 400 wird Fortimicin B und ein Verfahren zu seiner Herstellung beschrieben. In der US-PS 39 76 768 wird Fortimicin A sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung beschrieben. In der US-PS 40 48 015 wird Fortimicin C sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung beschrieben.
In der nachveröffentlichten DE-OS 27 48 530 wird
ju Fortimicin C und KE und ein Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben.
Es besteht ein ständiger Bedarf nach Antibiotika mit einem breiten Wirkungsspektrum gegen Bakterien. Es wurde festgestellt, daß bestimmte Stämme von Micromonospora bei der Züchung in einem Nährmedium verschiedene Antibiotika in der Kulturflüssigkeit bilden. Aus der Kulturflüssigkeit von Micromonospora olivoasterospora MK-70 (ATCC 2! 819; FERM-P Nr. 1560) wurden Fortimicin A, B, C, D und KE der nachstehend
•40 angegebenen Formeln isoliert:
[<%]? +30° (C= 0,76, H2O),
IR-Spektrum (KBr): 3350,2920,1675,1590,1370, 1090,1030 und 990 cm - · und
(4) CMR-Spektrum in Deuteriumoxidlösung (pD = 10,6):
<5(ppm) 153,1, 101,3, 95,3, 82,2, 80,0, 71,3, 71,1, 61,1,59,3,53,8,48,9,47,3,35,4,25,6,20,5
sowie deren Salze mit Säuren.
2. Fortimicin KG3 der Formel
Fortimicin A
CH3
CH-NH2 NH2 OH
NH2
OH
N-CH3
C-CH2NH2
0
OCH3
NH2 OH N-CH3
Fortimicin B
CH3
sowie dessen Salze mit Säuren.
NHCH3
Fortimicin C NH,
CH3
I 		/
OH
I
CH-		 -NH2
-O
ν-
Ί
NH2
OH
OCH3
N-CH3
C-CH2NHCNH2
Fortimicin D
CH2NH2
NH2
OH
NH2
OCH3
OH N-CH3
C-CH2NH2
O
Fortimicin KE
CH2NH2 NH2 OH
■Ο—ζ >—OCH3
NH2 OH NHCH3
Die chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften dieser Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung sind in den vorstehend erwähnten Patentveröffentlichungen angegeben.
Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß bei der Züchtung von Micromonospora olivoasterospora MK-70 drei weitere Wirkstoffe freigesetzt werden. Eine Untersuchung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften dieser Wirkstoffe zeigt, daß es sich um neue, wertvolle Antibiotika handelt, die als Fortimicin KGi, Fortimicin KG2 und Fortimicin KG3 bezeichnet werden.
Nach beendeter Züchtung werden die aktiven Fraktionen mit einem Gehalt an mindestens einer der Verbindungen Fortimicin KGi, KG2 und KG3 aus der Kulturflüssigkeit in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, isoliert.
Fortimicin KGi, KG2 und KG3 weisen ein breites antibakterielles Wirkungsspektrum auf. Sie sind deshalb unter anderem auch zur Reinigung und Sterilisation von Laboratoriums-Glasgeräten und chirurgischen Instrumenten geeignet. Ferner können sie zusammen mit Seifen, Waschmitteln und Waschlösungen, für sanitäre Zwecke eingesetzt werden.
Darüber hinaus eignen sich Fortimicin KGi, KG2 und KG3 für medizinische Anwendungszwecke.
Gegenstand der Erfindung sind auch Säureadditionssalze von Fortimicin KGi, KG2 und KG3, insbesondere pharmazeutisch verträgliche, nicht toxische Salze. Es ΐ kommen hierbei die Additionssalze mit Mineralsäuren, wie die Hydrochloride, Hydrobromide, Hydrojodide, Sulfate, Phosphate, Carbonate oder Nitrate sowie auch Additionssalze an organische Säuren, wie die Acetate, Fumarate, Malate, Citrate, Mandelate, Ascorbate, ίο Tartrate oder Succinate in Frage.
Als Salze kommen Mono-, Di-, Tri- oder Tetra-Additionssalze in Frage, die durch Umsetzung von 1 Molekül Fortimicin KGi, KG2 und KG3 mit 1 bis 4 Äquivalenten einer pharmazeutisch verträglichen, nicht-toxischen Säure gebildet werden.
Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften von Fortimicin KGi der Erfindung in Form der freien Base zusammengestellt:
2(i 1) Basisch reagierendes, weißes Pulver.
2) Elementaranalyse, gefundene Werte:
C = 52,09%, H = 8,81%, N = 16,23%.
3) Schmelzpunkt: 95 bis 98° C.
2> 4) UV-Absorptionsspektrum:
Das UV-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung dieser Verbindung zeigt kein charakteristisches Absorpticnsmaximum zwischen 220 und 360 nm, sondern nur eine terminale Absorption. 3D 5) Spezifische Drehung:
[«]? = + 58,3° (c = 0,66, H2O)
IR-Absorptionsspektrum:
Das IR-Spektrum wird in einem KBr-Preßling gemessen. Fortimicin KGi zeigt bei den nachstehenden Wellenzahlen (cm-1) Absorptionsmaxima: 3360,2930,1675,1590,1370,1110,1055, lOOP. Farbreaktionen:
Ninhydnn-Reaktion: positiv
Kaliumpermanganat- Reaktion: positiv
Elson-Morgan-Reaktion: negativ
Biuret-Reaktion: negativ
Das CMR-Spektrum von Foriimicin KGi wird in Deuteriumoxidlösung (pD = 10,7) mit einem JEOL JNM-IOOA gemessen:
ö (ppm) 153,1, 101,2, 95,2, 83,4, 83,2, 75,2, 73,4, 62,2 60,1,54,8,48,9,47,4,33,6,25,7,20,5.
Das Massenspektrum dieser Verbindung zeigt das nachstehende M+ -Ion und Fragmentionen. Die in Klammern angegebenen Summenformeln stellen die bei hochauflösender Massenspektrometrie erhaltenen Summenformeln der Fragmente wieder.
mle 346,2218(M+)(CisH30N4O5), 247,1543(CoH2IN3O4),
235,1248(C9Hi9N2O5),
207,1318(C8Hi9N2O4),
172,0938(C8H14NO3)
Aus dem Massenspektrum ergibt sich ein Molekulargewicht von 346 und eine Summenformel von Ci5H30N4O5. Die für diese Summenformel berechneten Werte der Elementaranalyse sind
C = 52,00%, H = 8,73% und N = 16.17%.
10) Aufgrund der vorstehenden physikochemischen Daten wird für Fortimicin KGi folgende Strukturformel zugeordnet:
CH3
CH-NH7
-O
NH2
OH
NH2
OH
OCH3
NHCH3
C15H30N4O5. Die auf Grund dieser Summenformel berechneten Analysenwerte sind
C = 52,00%, H = 8,73% und N = 16,17%.
10) Auf Grund der vorstehenden physikochemischen Daten wird Fortimicin KG2 die nachstehende Summenformel zugeordnet:
11) Fortimicin KG, in Form der freien Base ist in Wasser leicht löslich, löslich in Methanol und geringfügig löslich in Äthanol und Aceton. Es ist unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Äthylacetat, Butylacetat, Diäthyläther, Butanol, Petroläther, n-Hexan.
Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften von Fortimicin KG2 gemäß der Erfindung in Form der freien Base zusammengestellt:
1) Basisch reagierendes, weißes Pulver.
2) Elementaranalyse:
C = 52,05%, H = 8,80%, N = 16,21 %.
3) Schmelzpunkt: 95 bis 980C.
4) U V-Absorptionsspektrum:
Das UV-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung dieser Verbindung zeigt kein charakterisusches Absorptionsmaximum zwischen 220 und 360 nm, sondern nur eine terminale Absorption.
5) Spezifische Drehung:
[φ = + 30° (c = 0,76, H2O)
6) IR-Absorptionsspektrum:
Das IR-Absorptionsspektrum wird in einem KBr-Preßling gemessen. Das Fortimicin KG2 in Form der freien Base zeigt bei folgenden Wellenzahlen (cm-1) Absorptionsmaxima: 3350, 2920, 1675, 1590, 1370,1090,1030,990.
7) Farbreaktionen:
Ninhydrin-Reaktion: positiv
Kaliumpermanganat-Reaktion: positiv
Elson-Morgan-Reaktion: negativ
Biuret-Rcaktion: negativ
8) Das CMR-Spektrum von Fortimicin KG2 wird in Deuteriumoxidlösung (pD = 10,6) mit einem JEOL JNM-IOOA gemessen:
ό (ppm) 153,1, 101,3,95,3,82,2,80,0,71,3, 71,1,61,1, 59,3,53,8,48,9,47,3,35,4,25,6,20,5.
9) Das Massenspektrum der erfindungsgemäßen Verbindung zeigt folgendes M+ -lon sowie Fragmentionen. Die in Klammern angegebenen Strukturformeln sind Fragmente, die be> hochauflösender Massenspektrometrie erhalten wurden.
mle 346,2244 (M+) (C15H30N4O5),
247,1528(CoH2IN3O4),
235,1301(CHnN2O5),
207,1357(C8HnN2O4).
172,0981(C8H14NO3)
Aus dem Massenspektrum ergibt sich ein Molekulargewicht von 346 und eine Summenformel von
CH3
ι		 -O NH2 OH
\-OCH3
CH- /
OH		 NHCH3
-NH2
-O
-Λ
I
NH2
11) Fortimicin KG) in Form der freien Base ist in Wasser leicht löslich, löslich in Methanol und geringfügig löslich in Äthanol und Aceton. Es ist unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Äthylacetat, Butylacetat, Diäthyläther, Butanol, Petroläther, n-Hexan.
Wie aus den vorstehenden Ausführungen ersichtlich, weisen Fortimicin KGt und Fortimicin KG2 die gleichen planaren Formeln auf.
Jedoch unterscheiden sich diese beiden vorstehenden Verbindungen durch unterschiedliche Schmelzpunkte, spezifische Drehwerte, IR-Spektren und CMR-Spektren. Deshalb werden diese beiden Verbindungen als Stereoisomere angesehen.
Zum Vergleich werden nachstehend einige physikochemische Eigenschaften von Fortimicin KG angegeben:
4(i 1) Schmelzpunkt: 72 bis 74°C.
2) Spezifische Drehung:
[Oi]V = +90° (c= 0,33,H2O).
3) IR-Absorptionsspektrum:
4-, Das !R-Spektrum wird in einem KBr-Preßling
gemessen. Fortimicin KG in Form der freien Base zeigt bei folgenden Wellenzahlen (cm-1) Absorptionsmaxima: 3350,1678,1590,1448,1365,1110.
4) Das CMR-Spektrum dieser Verbindung wird in -,o Deuteriurnoxidlösung (pD=10,6) mit einem JEOL
PFT-IOOA gemessen:
<5 (ppm) 154,1, 101,2, 94,6, 84, 5, 79,7, 73,9, 73,3, 62,8. 62,2,53,4,48,8,47,4,33,9,25,8,21,2.
y, Nachstehend sind weiterhin die physikochemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Fortimicin KG3 in Form der freien Base zusammengestellt:
1) Basisch reagierendes, weißes Pulver.
bo 2) Elementaranalyse:
C = 50,68%, H = 8,92%, N = 17,45%.
3) Schmelzpunkt: 135 bis 1380C.
4) UV-Absorptionsspektrum:
hi Das UV-Absorptionsspektrum einer wäßrigen
Lösung dieser Verbindung zeigt kein charakteristisches Absorptionsmaximum zwischen 220 und 360 nm, sondern nur eine terminale Absorption.
5) Spezifische Drehung:
[α] +185° (c= 0,265, H2O)
6) IR-Absorptionsspektrum:
Das IR-Absorptionsspektrum wird in einem KBr-Preßling gemessen. Fortimicin KG3 der freien Base zeigt bei folgenden Wellenzahlen (cm ;) ein Absorptionsmaximum: 3370, 2940, 1640, 1580, 1462 und 1110.
7) Farbreaklionen:
Ninhydrin-Reaktion: positiv
Kaliumpermanganat-Reaktion: positiv
Elson-Morgan-Reaktion: negativ
Biuret-Reaktion: negativ
8) Das CMR-Spektrum von Fortimicin KGi wird in Deuteriumoxidlösung, die DCl enthält (pD=1,2) mit einem JEOLJNMFX 100 gemessen.
(5 (ppm) 168,8, 146.7, 99,5, 95,9, 76,1, 73,9, 71,4, 66,5, 57,3, 54,2. 52,9, 49,6, 47,2, 41,4, 32.8, 22,2. 16,9.
9) Das Massenspektrum dieser Verbindung zeigt das folgende M+ -Ion sowie die nachstehenden Fragmentionen. Die in Klammern angegebenen Summenformeln geben die Zusammensetzung der bei der hochauflösenden Massenspektrometrie aufgezeigten Fragmentzusammensetzungen wieder:
m/e 403,2490(IH + )(C7H33NiO6),
304,1750(C12H24N4O5),
264,1534(CoH22N3O5),
246,1430(CoH2ON3O4),
100,0723(C5H10NO)
Aus dem Massenspektrum ergibt sich ein Molekulargewicht von 403 und eine Summenformel von C7H33N5Ob. Die nach dieser Summenformel berechnete Elementaranalyse ergibt:
C = 50,61 %, H = 8.24% und N = 17,36%.
Auf Grund der vorstehenden physikochemischen Daten wird Fortimicin KG3 folgender Strukturformel zugeordnet
CH3
OH
NH2
OCH3
CH3
C-CH2NH2
11) Fortomicin KG3 in Form der freien Base ist in Wasser leicht löslich, löslich in Methanol und geringfügig löslich in Äthanol und Aceton. Es ist unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Äthylacetat, Butylacetat, Diäthyläther, Butanol, Petroläther, n-Hexan
Die Rf-Werte von Fortimicin KGi, KG2 und KG3 unter Verwendung von Papierchromatographie und Dünnschichtchromatographie sind in den nachstehenden Tabellen 1 und II zusammengefaßt Für Vergleichszwecke sind die Rf-Werte für ähnliche Antibiotika ebenfalls angegeben.
Tabelle I
RrWerte bei aufsteigender Papierchromatographie untet Verwendung der unteren Schicht eines Gemisches von Chloroform, Methanol und konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung (Volumenverhältnis 2:1:1) bei Raumtemperatur und nach 4stündiger Entwicklung.
Antibiotikum R1-Werte
Fortimicin A 0,41
Fortimicin B 0,72
Fortimicin C 0,22
Fortimicin D 0,22
Fortimicin KE 0,63
Fortimicin KO*) 0,53
Fortimicin KG1 0,66
Fortimicin KG2 0,70
Fortimicin KG-, 0,28
*) Rjrtimicin KO wird in der japanischen Patentanmeldung Nr. 113 193/1977 beschrieben, und weist die nachsiehende Formel auf:
CH3
CH-NH2 NH2 OH
NH2
O-^~\— OCH3 OH NHCH3
C-CH2NH,
Il ο
Tabelle II
RpWerte bei Kieselgel-Dünnschichtchromatographie (Raumtemperatur; Entwicklungsdauer: 3 Stunden; Kieselgel 60 von Merck & Co., Inc.)
Antibiotikum R ,-Werte Laufmittel II**)
Laufmittel I*) 0,09
Fortimicin A 0,36 0,13
Fortimicin B 0,75 0,19
Fortimicin C 0,23 0,06
Fortimicin D 0,21 0.12
Fortimicin KE OSO 0,24
Fortimicin KO 0.55 0,14
Fortimicin KG1 0.58 0,20
Fortimicin KG2 0,70 0,11
Fortimicin KG3 0,32
*) Laufmittel I: Untere Schicht eines Gemisches von Chloroform. Methanol und einer konzentrierten wäßririgen Ammoniaklösung im Volumen verhältnis 2:1:1. **) Laufmittel II: Gemisch aus einer lOprozentigen (W/V) wäßrigen Ammoniumacetatlösung, Methanol und einer konzentrierten wäßrigen Ammoniaklösung im Volumenverhältnis von 50 :50 : 1.
In der nachstehenden Tabelle III sind die antibakteriellen Wirkungsspektren von Fortimicin KG,, KG3 und KG3 gegen verschiedene Mikroorganismen angegeben.
9 IO
Tabelle 111
Mindesthemmkonzentration ^g/ml) gemessen nach der Agar-Verdünnungsmethode beim pH-Wert 8,0
Wie aus der vorstehenden Tabelle ersichtlich, hat das Fortomicin KG3 eine starke antibakterielle Wirkung gegen einen breiten Bereich von gram-positiven und gram-negativen Bakterien. Insbesondere ist es charakteristisch, daß dieses Antibiotikum gegen bestimmte J5 Stämme von Escherichia coli, die gegenüber verschiedenen anderen Antibiotika resistent sind, wirksam ist. Aus vorstehender Tabelle geht auch hervor, daß Fortimicin KGi und KG2 eine starke antibakteriell Wirksamkeit aufweisen. Deshalb ist bei Fortimicin KGi, KG2 und -to insbesondere bei Fortimicin KG3 eine günstige therapeutische Wirksamkeit gegen verschiedenartige bakterielle Infektionen bei Mensch und Tier zu erwarten. Auf Grund dieser antibakteriellen Eigenschaften eignen sich Fortimicin KGi, KGj und KG3 für medizinische Zwecke.
Der LDso-Wert für Fortimicin KG3 (freie Base) beträgt bei intravenöser Verabfolgung für Mäuse 225 mg/kg.
Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen Verbindungen als pharmazeutische Präparate kann parenteral so (durch intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse oder subkutane Injektionen) oder rektal erfolgen. Die jeweils geeigneie Verabreichung richiei sich nach der erwünschten Verabfolgungsweise.
Spezielle Beispiele für geeignete parenterale Verabreichungsformen sind sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen.
Die jeweils geeignete Dosierung hängt von der erwünschten therapeutischen Wirkung, der Verabfolgungsweise und der geplanten Behandlungsdauer ab. Im allgemeinen sind tägliche Dosierungen von etwa 5 bis etwa 300 mg/kg Körpergewicht für das Erreichen einer antibiotischen Wirksamkeit ausreichend
Fortimicin KGi, KG2 und KG3 werden durch Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Micromonospora, nämlich Micromonospora olivoasterospora MK-70 (FERM-P Nr. 1560, ATCC 21 819), Micromonospora olivoasterospora MK 80 (FERM-P Nr. 2192, ATCC 31 010) und Micromonospora olivoasterospora Mm 744 (FERM-P Nr. 2193, ATCC 31 009) gebildet. Diese vorstehenden Stämme wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, und beim Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, Chiba-ken, Japan, unter den genannten Hinterlegungs-Nummern hinterlegt.
Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Stämme sind in der US-PS 39 31 400 beschrieben.
Wie im Fall von anderen Stämmen von Actinomyceten, können die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Mikroorganismen einer an sich bekannten künstlichen Mutationsbehandlung, beispielsweise durch UV-Bestrahlung, Röntgenbestrahlung und Mutation durch chemische Wirkstoffe, unterworfen werden, um die Bildung von Stoffwechselprodukten zu steigern. Ein Beispiel dafür ist Micromonospora olivoasterospora CS-26 (FERM-P Nr. 3567, NRRL 8178). Dieser letztgenannte Stamm ist beim United States Department of agriculture, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt, und der Öffentlichkeit frei zugänglich.
Zur Durchführung des erfiiidungsgemäSen Verfahrens können herkömmliche Verfahren zur Züchtung von Actinomyceten verwendet werden. Im Züchtungsmedium können verschiedene Nährstoffquellen eingesetzt werden. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Glukose, Stärke, Mannose, Fructose, Saccharose und/oder Melassen. Kohlenwasserstoffe und Alkohole, organische Säuren und dergL können je nach ihrer Verwertbarkeit durch die verwendeten Mikroorganismen, ebenfalls verwendet werden. Beispiele für anorganische oder organische Stickstoffquellen sind Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat Diese können alleine oder zusammen mit natürlichen Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenpulver, Kasaminsäure und
Mikroorganismen Fortimicin - Fortimicin Fortimicin | 0,18
KG, KG2 KG3 I
Bacillus subtilis Nr. 10707 _ 26,1 - <0,045 I 0,33 j
Staphylococcus aureus 13,1 26,1 10,5 0,083 I 0,52 j
ATCC 6538p I i
Klebsieila pneumoniae - ft
ATCC 10031 y
Escherichia coli ATCC 26 26,1 41,7 0,33 :
Escherichia coli KY8302 41,7
(resistent gegen Chloramphenicol, Streptomycin, I
Kanamycin, Paromomycin, Tetracyclin und 26,1
Spectinomycin) I
Escherichia coli KY8327 26,1 20,9 0,66 1
(resistent gegen Kanamycin, Gentamicin und - 0,7 I
Tobramycin) - 0,18 $
Escherichia voli KY8348 >208 166,6 5,2 I
(resistent gegen Streptomycin und Gentamicin)
Proteus vulgaris ATCC 6897 83,3
Shigella sonnei ATCC 9290 -
Salmonella typhosa ATCC 9992 -
Pseudomonas aeruginosa BMHttl >166,6
löslichen Pflanzenproteinen, verwendet werden. Gegebenenfalls können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Phosphate, dem Medium zugesetzt werden.
Außerdem können organische und anorganische Produkte, die das Wachstum des speziellen Stamms und die Bildung von Fortimicin KGi, KG2 und/oder KG] fördern, zugegeben werden.
Die Züchtung wird in einem flüssigen Medium, insbesondere unter Rühren im Submersverfahren, bei einem pH-Wert um den Neutralpunkt durchgeführt. Die Züchtungstemperaturen betragen 25 bis 4O0C. Im allgemeinen haben sich nach 2- bis 15tägiger Züchtung im flüssigen Medium Fortimicin KGi, Fortimicin KG2 und Fortimicin KG3 in der Kulturflüssigkeit gebildet und angereichert. Sobald eine wesentliche antibakterielle Aktivität in der Kulturflüssigkeit nachgewiesen wird, vorzugsweise wenn die Ausbeute der Antibiotika in der Kulturflüssigkeit ein Maximum erreicht, wird die Züchtung abgebrochen. Das gewünschte Produkt wird nach dem Entfernen der Mikroorganismenzellen aus der Kühlflüssigkeit, beispielsweise durch Abfiltrieren, isoliert und gereinigt.
Die Isolierung und Reinigung von Fortimicin KGi, KG2 und KG3 wird nach an sich üblichen Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Mikroorganismen-Stoffwechselprodukten aus Kulturflüssigkeiten durchgeführt.
Da die Antibiotika Fortimicin KGi, Fortimicin KG2 und Fortimicin KG3 basisch reagierende Verbindungen sind und in Wasser leicht, und in üblichen organischen Lösungsmitteln schwach löslich sind, können sie nach üblichen Verfahren zur Reinigung von sogenannten wasserlöslichen, basisch reagierenden Antibiotika gereinigt werden. Insbesondere können Fortimicin KGi, KG2 und KG3 durch eine geeignete Kombination von Adsorption und Desorption an Kationenaustauscherharzen, mittels Säulenchromatographie an Cellulose, Adsorption und Desorption an mit Sephadex LH-20 gepackten Säulen, Säulenchromatographie an Kieselgel und dergleichen, gereinigt werden.
Ein Beispiel für ein Reinigungsverfahren für die Reinigung von Fortimicin KGi, KG2 und KG3 aus der Kulturflüssigkeit, bei Verwendung eines Stammes, der den gesamten Fortimicin-Komplex (ein Gemisch, enthaltend Fortimicin A, B, C, D, KE und KO, sowie Nebenprodukten mit antibakterieller Aktivität) bildet ist nachstehend angegeben:
Das zellfreie Kulturfiltrat wird auf den pH-Wert 7,5 eingestellt und anschließend über eine mit einem Kationenaustauscherharz, wie Amberlite ®iRC-50 (Ammoniumform) gepackte Säule gegeben. Nach dem Waschen des Harzes mit Wasser erfolgt die Elution mit einer ö,5 N wäörigen Ammoniaklösung. Die aktiven Fraktionen werden vereint und unter vermindertem Druck eingeengt. Das entstandene Konzentrat wird sodann durch ein Kationenaustauscherharz, Amberlite® CG-50 (Ammoniumform) geleitet Nach dem Waschen des Harzes mit Wasser erfolgt die Elution mit einer 0,1 N wäßrigen Ammoniaklösung, die 0,1 M Ammoniumchlorid enthält Zuerst werden Fortimicin KO und Fortimicin C eluiert, anschließend Fortimicin KGi, KG2 und KG3, gemeinsam mit Fortimicin B. Anschließend erfolgt die Elution von Fortimicin A, D und KG. Die Fraktionen, welche das Fortimicin KGi, KG2 und KG3 enthalten, werden vereint mit Salzsäure neutralisiert und anschließend durch eine mit einem Kationenaustauscherharz (Amberlite® IRC-50, Ammoniumform) gepackte Säule geleitet Nach dem Waschen
des Harzes mit Wasser, erfolgt die Elution mit einer 0,5 N wäßrigen Ammoniaklösung. Die durch Elution erhaltenen aktiven Fraktionen werden vereint und zur Trockene eingeengt. Man erhält ein rohes Pulver, das Fortimicin KGi, KG2 und KG3 enthält. Das rohe Pulver wird in den oberen Teil einer mit Kieselgel gepackten Säule eingebracht. Die Entwicklung erfolgt mittels der unteren Schicht eines Gemisches von Chloroform, Methanol, und einer konzentrierten wäßrigen Ammoniaklösung im Volumenverhältnis von 3:1:1. Als erstes wird das im rohen Pulver enthaltene Fortimicin B eluiert. Anschließend erfolgt die Elution von Fortimicin KG2, KGi und KG3 in der genannten Reihenfolge. Die Fortimicin KGi, KG2 und KG3 enthaltenden Fraktionen werden jeweils gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält die jeweils weißen Verbindungen Fortimicin KGi, KG2 und KG3 in Form ihrer jeweiligen freien Basen.
Obwohl man mittels der vorgenannten Verfahren das Fortimicin KGi, KG2 und KG3 in ziemlich reiner Form erhält, enthalten die vorgenannten erfindungsgemäßen Produkte jedoch noch Verunreinigungen in geringfügiger Menge. Deshalb werden die erfindungsgemäßen Verbindungen jeweils durch eine mit einem Kationenaustauscherharz, Bio-Rex®-70 (Ammoniumform, Bio-Rad Laboratories) gepackten Säule geleitet. Nach dem Waschen des Harzes mit Wasser erfolgt die Elution mit 0,04 N wäßriger Ammoniaklösung, die 0,04 m Ammoniumacetat enthält.
Die aktiven Fraktionen werden vereint, neutralisiert und durch eine mit Amberlite®CG-50 (Ammoniumform) gepackte Säulen geleitet. Nach dem Waschen des Harzes mit Wasser erfolgt die Elution mit 0,5 · N wäßriger Ammoniaklösung. Die aktiven Fraktionen werden vereint, konzentriert und gefriergetrocknet. Man erhält Fortimicin KGi, KG2 und KG3 (freie Basen) in reiner Form.
Während der vorgenannten Reinigungsverfahren werden die Fraktionen durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel geprüft. Als Laufmittel wird die untere Schicht eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung im Volumenverhältnis von 2:1:1 und ein Gemisch aus einer lOprozentigen (W/V) wäßrigen Ammoniumacetatlösung, Methanol und einer konzentrierten wäßrigen Ammoniaklösung im Volumenverhältnis von 50 :50 :1 verwendet. Der Nachweis erfolgt durch Färbungsverfahren unter Verwendung von Ninhydrin und durch ein bioautographisches Verfahren unter Verwendung von Bacillus subtilis Nr. 10 070 als Test-Mikroorganismus. Die RrWerte von Fortimicin KGi, KG2 und KG3 bei Kieselgel-DC-Chrornatogrammen gehen aus der vorstehenden Tabelle II hervor.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
A. Züchtung des Stammes MK-70
Micromonospora olivoasterospora MK-70 (ATCC 21 819, FERM-P Nr. 1560) wird als Einsaatstamm in einem ersten Vorkulturmedium gezüchtet das 2 g/dl Glukose, 04 g/dl Pepton, 0,5 g/dl Hefeextrakt und 0,1 g/dl Calciumcarbonat enthält Das Nährmedium wurde vor der Sterilisation auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt Eine Platinöse des Einsaatstammes wird in 10 ml Chargen des ersten Vorkulturmediums in 50 ml fassenden großen Reagenzgläsern überimpft Die Züchtung wird 5 Tage bei 300C durchgeführt Sodann
werden jeweils 10 ml der auf diese Weise entstandenen ersten Vorkulturen in 30 ml Chargen eines zweiten Vorkulturmediums in 250 ml Erlenmeyerkoiben überimpft. Die Zusammensetzung des zweiten Vorkulturmediums ist die gleiche, wie die des ersten Vorkulturmedi- ϊ ums. Die Züchtung der zweiten Vorkuitur wird 2 Tage unter Schütteln bei 30°C durchgeführt. Sodann werden jeweils 30 ml der zweiten Vorkultur zu 300 ml Chargen eines dritten Vorkulturmediums in 2 Liter fassende Erlenmeyerkoiben überimpft, die mit Prallplatten ι» ausgerüstet sind. Die Zusammensetzung des dritten Vorkulturmediums ist die gleiche, wie die des ersten Vorkulturmediums. Die Züchtung im dritten Vorkulturmedium wird 2 Tage unter Schütteln bei 300C durchgeführt Sodann werden 1,5 Liter der dritten π Vorkultur — entsprechend dem Inhalt von 5 Kolben — in 15 Liter eines vierten Vorkuiturmediums in einem 30 Liter fassenden Fermenter aus korrosionsbeständigem Stahl überimpft. Die Zusammensetzung des vierten Vorkulturmediums ist die gleiche, wie die des ersten Vorkulturmediums. Die Züchtung der vierten Vorkultur in dem Fermenter wird 2 Tage unter Belüftung und Rühren (350 U/min: Belüftung 15 Liter/min) bei 37°C durchgeführt. Schließlich werden 15 Liter der vierten Vorkulturbrühe in 150 Liter eines Fermentationsmedi- r> ums in einem 300 Liter fassenden Fermenter überimpft. Dieses Nährmedium weist die nachstehende Zusammensetzung auf:
lösliche Stärke 4 g/dl
Sojabohnenmehl: 2 g/dl
Maisquellwasser: lg/dl
K2HPO4: 0,05 g/dl
MgSO4 · 7 H2O: 0,05 g/dl
KCl: 0,03 g/dl
CaCO3: 0,1 g/dl
Vor der Sterilisation wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Die Züchtung in dem Fermenter wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren (150 U/min; Belüftung 80 Liter/min) bei 37°C durchgeführt.
B. Isolierung von rohem Fortimicin -Komplex,
der Fortimicin KG., KG2 und KG3 enthält
43
Nach beendeter Züchtung wird die Kulturflüssigkeit mit konzentrierter Schwefelsäure auf den pH-Wert 2,5 eingestellt und 30 Minuten gerührt. Anschließend werden etwa 7 kg Filterhilfe, Radiolite Nr. 600 (hergestellt von Showa Kagaku Kogyo Co., Ltd., Japan) zugesetzt. Die Mikroorganismenzellen werden sodann abfiltriert. Das Filtrat wird mit 6 N Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und auf eine mit etwa 20 Liter eines Kationenaustauscherharzes, Amberlite IRC-50 (Ammoniumform), gefüllte Säule gegeben. Die si aktiven Bestandteile werden an das Harz adsorbiert Die durch das Austauscherbett abfließende Flüssigkeit wird verworfen. Nach dem Waschen des Austauscherharzes mit Wasser werden die adsorbierten aktiven Verbindungen mit 1 N wäßrigem Ammoniak eluiert Die bo Aktivität des Eluats wird durch ein Antibiogramm nach der Testplättchenmethode auf einer Agarplatte und mit Bacillus subtilis Nr. 10707 bestimmt Die antibiotisch aktiven Fraktionen werden gesammelt und das Gemisch wird unter vermindertem Druck auf etwa 1 b5 Liter eingeengt Das Konzentrat wird mit konzentrierter Salzsäure auf den pH-Wert 7 eingestellt und anschließend durch eine mit 3 Liter Amberlite CG-50 (Ammoniumform) gepackte Säule geleitet. Nach dem Waschen des Austauscherharzes mit Wasser erfolgt die Elution mit 0,1 N Ammoniumhydroxid, das 0,1 M Ammoniumchlorid enthält. Das Eluat wird in 500 ml-Fraktionen entnommen. Jede der Fraktionen wird auf deren antibakterielle Aktivität gegen Bacillus subtilis Nr. 10707 getestet. Der Nachweis der aktiven Komponente erfolgt mittels DC-Chromatographie auf Kieselgelplatten (Entwicklung erfolgt mit der unteren Schicht eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und einer konzentrierten wäßrigen Ammoniaklösung im Volumenverhältnis von 2:1 : 1; Färbung erfolgt durch Ninhydrin). Nachdem das Volumen des Eluats etwa 3 Liter erreicht hat, erfolgt die Elution von Fortimicin KGi, KG2 und KG3. Die Fraktionen, welche Fortimicin KGi, KG2 und KG3 enthalten, werden gesammelt, unter vermindertem Druck zur Entfernung von Ammoniak eingeengt, mit konzentrierter Salzsäure neutralisiert und durch eine mit 500 ml Amberlite IRC-50 (Ammoniumform) gefüllte Säule geleitet. Nach dem Waschen des Austauscherharzes mit Wasser erfolgt die Elution mit 0,5 N wäßrigem Ammoniak. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 2 g eines weißen Pulvers. Das Pulver enthält 250 mg Fortimicin KGi, 640 mg Fortimicin KG2 und 330 mg Fortimicin KG3.
C. Isolierung und Reinigung von
Fortimicin KG1, KG2 und KG3
2 g des pulverförmigen Rohprodukts werden in eine Uli; K.iesclgd gefüllte Säule gegeben (Kieselgei von Wako Junyaku Co., Ltd., Japan; Säulendurchmesser ca. 3 cm). Die Elution erfolgt mit der unteren Schicht eines Gemisches von Chloroform, Methanol und konzentriertem wäßrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 3:1 :1). Das Eluat wird in 20 ml Fraktion eingeteilt. Mit jeder der Fraktionen wird eine Dünnschichtchromatographie mit Kieselgel durchgeführt. Zunächst wird Fortimicin B eluiert, sodann Fortimicin KG2, KGi und KG3 in der vorstehenden Reihenfolge. Die Fraktionen, die die jeweiligen Verbindungen Fortimicin KGi, KG2 und KG3 enthalten, werden gesammelt unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet Man erhält 200 mg Fortimicin KGi (Aktivität 970 Einheiten/mg), 500 mg Fortimicin KG2 (Aktivität 970 Einheiten/mg) und 250 mg Fortimicin KG3 (Aktivität 950 Einheiten/ mg). Die Aktivität der reinen Verbindung entspricht 1000 Einheiten/mg.
200 mg des vorstehend erhaltenen Fortimicin KGi werden in Wasser gelöst. Die Lösung wird auf den pH-Wert 7.0 eingestellt und durch eine mit 50 ml Kationenaustauscherharz Bio-Rex-70 (Ansmonissnjform) gefüllte Säule geleitet Nach dem Waschen des Austauscherharzes mit Wasser erfolgt die Elution mit 0,04 N wäßrigem Ammoniak, das 0,04 M Ammoniumacetat enthält Das Eluat wird in 10 ml Fraktionen aufgeteilt Jede der Fraktionen wird der Kieselgel-Dünnschichtchromatographie unterworfen. Die ausschließlich das Fortimicin KGi enthaltenden Fraktionen werden gesammelt unter vermindertem Druck zur Entfernung des Ammoniaks eingeengt und auf den pH-Wert 7,0 eingestellt Anschließend werden sie durch eine mit 100 ml Kationenaustauscherharz Amberlite IRC-50 (Ammoniumform) gefüllte Säule geleitet Nach dem Waschen des Austauscherharzes mit Wasser erfolgt die Elution mit 0,5 N wäßrigem Ammoniak. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt unter vermin-
dertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet Man erhält 150 mg der freien Base des reinen Fortimicin KGi als weißes Pulver.
500 mg Fortimicin KG2 und 250 mg Fortimicin KG3, die auf die zuvor geschilderte Weise mittels Kieselgel-DC-Chromatographie hergestellt worden sind, werden, wie vorstehend der zuletzt erfolgten Reinigung von Fortimicin KGi unterworfen. Man erhält 470 mg der freien Base des reinen Fortimicin KG2 und 230 mg dei freien Base des reinen Fortimicin KG3, beide Verbindungen als weißes Pulver.
Beispiel 2
In diesem Beispiel wird Micromonospora olivoasterospora Mm 744 (ATCC 31 009, Ferm-P Nr. 2193) als Einsaatstamm eingesetzt.
Das erste Vorkulturmedium enthält 2 g/dl Glukose, 0,5 g/dl Pepton, 0,3 g/dl Hefeextrakt und 0,1 g/dl Calciumcarbonat. Das Nährmedium wurde vor der Sterilisation auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. Die Fermentation (erste bis vierte Vorkultur) wird gemäß Beispiel 1, Stufe A, durchgeführt. Die Zusammensetzungen des zweiten bis vierten Vorkulturmediums sind die gleichen, wie in Beispiel 1. 15 Liter der auf diese Weise erhaltenen vierten Vorkulturbrühe werden in 150 1 eines Fermentationsmediums in einen 300 Liter fassenden Fermenter aus korrosionsbeständigem Stahl eingefüllt.
Das Fermentationsmedium weist die nachstehende Zusammensetzung auf:
Lösliche Stärke: 2 g/dl
Sojabohnenmehl: 0,5 g/dl
Glukose: 2 g/dl
Maisquellwasser: lg/dl
Hefeextrakt: lg/dl
K2HPO4 0,05 g/dl
MgSO4 · 7 H2O 0,05 g/dl
KCl: 0,03 g/dl
CaCO3: 0,1 g/dl
Vor der Sterilisation wurde das Nährmedium auf den pH-Wert 7,0 eingestellt.
Die Züchtung in dem Fermenter wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren (150 U/min; Belüftung 80 Liter/Min) bei 30° C durchgeführt.
Nach beendeter Fermentation wird die Kulturflüssigkeit bezüglich der Reinigungs- und Isolierungsschritte gemäß Beispiel 1 behandelt. Man erhält 120 mg der freien Base des reinen Fortimicin KGi, 350 mg der freien Base des reinen Fortimicin KG2 und 180 mg freien Base des reinen Fortimicin KG3.
Beispiel 3
In diesem Beispiel wird Micromonospora olivoasterospora MK 80 (ATCC 31 010; FERM-P Nr. 2192) als Einsaatstamm verwendet Das erste Vorkulturmedium enthält 1 g/dl Glukose, 1 g/dl lösliche Stärke, 0,5/dl Hefeextrakt 0,5 g/dl Pepton und 0,1 g/dl Calciumcarbonat (pH 7,0 vor der Sterilisation). Die Züchtung der ersten bis vierten Vorkultur erfolgt gemäß Beispiel 1.
: 0 Die Zusammensetzung des zweiten bis vierten Vorkulturmediums entspricht der Zusammensetzung des ersten Vorkulturmediums. Die auf diese Weise erhaltene vierte Vorkultur wird gemäß Beispiel 1 fermentiert Das Fermentationsmedium weist die gleiche Zusammensetzung wie das entsprechende Fermentationsmedium in Beispiel 1 auf.
Nach beendeter Fermentation wird die Kulturflüssigkeit den in Beispiel 1 angegebenen Reinigungs- und Isolierungsstufen unterworfen. Man erhält 130 mg der freien Base des reinen Fortimicin KG], 390 mg der freien Base des reinen Fortimicin KG2 und 200 mg der freien Base des reinen Fortimicin KG3.
Beispiel 4
2) Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird anstelle des dort eingesetzten Einsaatstammes der Stamm Micromonospora olivoasterospora CS-26 (NRRL 8178; FERM-P Nr. 3567) verwendet. Dieser Stamm ist eine Mutante, die sich aus dem Stamm Micromonospora olivoasterospora MK-70 (ATCC 21 819; FERM-P Nr.
1560) ableitet und durch Behandlung mit Nitrosoguanidin, UV-Bestiaiilurig und y-Strahlen erzeugt worden ist Man erhält 170 mg der freien Base des reinen
Fortimicin KGt, 450 mg der freien Base des reinen
Ji Fortimicin KG2 und 280 mg der freien Base des reinen Fortimicin KG3.
Beispiel 5
Jeweils 1 g der freien Basen von Fortimicin KGi, KG2 und KG3 werden in geringen Mengen Wasser gelöst.
Die Lösung wird mit 6 N-Schwefelsäure auf den pH-Wert 4,5 eingestellt. Die Lösungen werden jeweils mit dem lOfachen Volumen Aceton versetzt, worauf die jeweiligen Sulfate vkn Fortimicin KGi, KG2 und KG] j ausgefällt werden. Die Niederschläge werden abzentrifugiert und getrocknet Man erhält etwa 1,6 g des Sulfats von Fortimicin KGi (Aktivität 620 Einheiten/mg), etwa 1,6 gdes Sulfats von Fortimicin KG2 (620 Einheiten/mg) und etwa 1,5 g des Sulfats von Fortimicin KG> (65C
jo Einheiten/mg), alle in Form eines weißen Pulvers.
230 213/46

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Fortimicin KGj, KGj und KGj der allgemeinen Formel 1,
CH3
CH-NH2 NH2 OH -O
(D
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