DE2633508C2

DE2633508C2 - Fortimicin C, Verfahren zu seiner Herstellung und Arzneimittel

Info

Publication number: DE2633508C2
Application number: DE2633508A
Authority: DE
Inventors: Yasuki Kawasaki Kanagawa Mori; Takashi Tokio/Tokyo Nara; Ryo Okachi; Moriyuki Machida Tokio/Tokyo Sato; Yoshiaki Shizuoka Shimizu; Masahiro Sugimoto; Mitsuyoshi Machida Tokio/Tokyo Yamamoto
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1975-08-01
Filing date: 1976-07-26
Publication date: 1985-07-25
Also published as: FR2319377B1; ATA565776A; JPS5218888A; DK140152C; AU507317B2; CA1079212A; NO762573L; MX3770E; IN144515B; BE844756A; NO142919B; GB1539808A; DK140152B; ES450339A1; AU1595276A; US4048015A; CH619734A5; DE2633508A1; GR61127B; AR210360A1

Description

CH₂-NH-CO-NH₂

und dessen Salze mit Säuren.

2» 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

Mlcromonospora ollvoasterospora ATCC 21819, Micromonospora olivoasterospora ATCC 31009 oder Mlcromonospora ollvoasterospora ATCC Nr. 31010 oder eine aus diesen Stammen durch ein übliches Mutationsverfahren erhaltene Mutante In üblicher Welse in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet und anschließend das entstandene Antibiotics kum nach üblichen Methoden aus der Gärflüssigkeit abtrennt und gegebenenfalls durch Umsetzen mit einer Säure In ein Salz überführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen von 25 bis 40° C während 2 bis 15 Tagen bei etwa neutralem pH-Wert durchführt.

4. Arzneimittel mit antiblotlscher Wirkung, enthaltend Fortimicin C oder dessen Salze mit Säuren.

Die Erfindung betrifft das als Γ >rtimlcln C bezeichnete Antibiotikum der Formel

CH₃

CH-NH₂ NH₂ OH

NH₂ HO N-CH₃

?! ⁴⁵ co

I I

ψ CH₂-NH-CO-NH₂

U 50 und dessen Salze mit Säuren. Die Salze können sich von anorganischen oder organischen Säuren ableiten.

ft Spezielle Beispiele fur die zur Salzbildung verwendeten Säuren sind Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasser-

p. stoffsäure, Schwefelsäure, Sulfamlnsäure, Phosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure. Citronensäure, Oxalsäure.

J| Bernsteinsäure, Benzoesäure, Weinsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, Mandelsäure und Ascorbinsäure.

^ Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Fortimicin C und dessen Salzen mit Säuren.

i^:; ^ das dadurch gekennzeichnet Ist, daß man Mlcromonospora olivoasterospora MK-70 (FERM-P Nr. 1560; ATCC

[(; 21819), Mlcromonospora olivoasterospora MK-80 (FERM-P Nr. 2192; ATCC Nr. 31010) oder Mlcromonospora

Ij ollvoasterospora Mm 744 (FERM-P Nr. 2193; ATCC Nr. 31009) oder eine aus diesen Stämmen durch ein ObIl-

'£; ches Mutationsverfahren erhaltene Mutante in üblicher Welse In einem Nährmedium, das assimilierbare

S; Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet und anschließend das ent-

"λ ^wi siandene Antibiotikum nach üblichen Methoden aus der Gärflüsslgkelt abtrennt und gegebenenfalls durch

; Umsetzen mit einer Säure in ein Salz überführt.

?.■' Diese Stämme wurden bei der American Type Culture Collection, Rockvllle, Maryland, V.St.A. und beim

Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tokyo, Japan hinterlegt. Die Hinterlegung bei der American Type Culture Collection erfolgte ohne Beschränkungen. Die Stämme slnii somit

⁶⁵ der Öffentlichkeit unbeschränkt zugänglich. Die morphologischen Elgsnschaften dieser Stämme sind In der

ι' US-PS 39 31 400 und den DE-OS 24 18 349 und 24 35 160 beschrieben.

Ebenso wie andere Stamme von Actinomyceten können die für das erflndungsgemäße Verfahren eingesetzten Mikroorganismen durch mutagene Mittel, wie UV-Licht, Bestrahlung mit Co^s0. Röntgenstrahlen und den

verschiedensten mutagenen chemischen Verbindungen mutiert werden. Alle Stämme und Mutanten, die die Fähigkeit zur Bildung von Fortimicin C besitzen, können für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.

Im allgemeinen können im erfindungsgemäßen Verfahren die Qblichen Verfahren zur Züchtung von Actinomyceten verwendet werden. Für das Nährmedium können die verschiedensten Nährstoffe eingesetzt werden. Geeignete Kohlenstoffqueüen sind beispielsweise Glucose, Stärke, Mannose, Fructose, Sucrose und Melassen und deren Gemische. Ferner können z. B. Kohlenwasserstoffe, Alkohole und organische Säuren verwendet wenden, je nach der VerwertungsfählgkeU des eingesetzten Mikroorganismus. Anorganische und organische Stickstoffqufcüen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat, sowie natürliche StickstoffqueHen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellwasser, ■« Sojabohnenmehl, Casaminosäure und lösliche pflanzliche Proteine können entweder allein oder im Gemisch verwendet wenden. Ferner können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Phosphate, dem Nährmedium zugesetzt werden.

Schließlich können organische oder anorganische Verbindungen dem Nährmedium zugesetzt werden, welche das Wachstum des Mikroorganismus und. die Bildung von Fortimicin C fördern. '5

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise ein flüssiger Nährboden eingesetzt und das Verfahren als Submersverfahren und unter Rühren durchgeführt. Vorzugsweise wird die Züchtung bei Temperaturen von 25 bis 40⁰C und bei annähernd neutralem pH-Wert durchgeführt. Nach etwa 2- bis 15tägiger Züchtung hat sich in der Gärbrühe eine ausreichende Menge des Antibiotikums gebildet. Sobald die Ausbeute an Fortimicin C in der Gärbrühe ein Maximum erreicht hat, wird die Züchtung abgebrochen, die Zellmasse von der Kulturfiüssigkeit abgetrennt und das Antibiotikum aus dem Flltrat isoliert und gereinigt. Die isolierung und Reinigvng von Fortimicin C aus dem Filtrat wird nach übliCiien Methoden zur Isolierung und Reinigung von mlkrobieilen Stoffwechselprodukten aus Gärfiüssigkeiten durchgeführt. Da Fortimicin C eine Base darstellt und in Wasser löslich, jedoch in üblichen organischen Lösungsmitteln schlecht löslich Ist, kann das Antibiotikum nach üblichen Methoden zur Reinigung sogenannter wasserlöslicher basischer Antibiotika gereinigt werden. Die Reinigung von Fortimicin C kann insbesondere durch eine geeignete Kombination von Adsorption und Desorption an Katlonenharzaustauschern, Säulenchromatographie an Cellulose, Adsorption und Desorption an Sephadex® LH-20 und Chromatographie an Kieselgel erfolgen.

Beispielsweise wird das zellfreie Kulturfllirat zunächst auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und hierauf an einem Kationenharzaustauscher in der Ammoniumform adsorbiert. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit ^w 0,5 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft und hierauf auf eine Säule eines Anionenharzaustauschers in der OH"-Form gegeben. Die beim Eluleren mit Wasser erhaltenen aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter verminderten Druck eingedampft. Man erhält ein pulverförmiges Rohrprodukt, das In Wasser gelöst und mit 2 η-Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt wird. Die Lösung wird auf eine mit Aktivkohle gefüllte Säule gegeben. Das Fortimicln C wird an der Aktivkohle adsorbiert. Verunreinigungen werden durch Waschen der Säule mit Wasser abgetrennt. Sodann wird die Säule mit 0,2 η-Schwefelsäure eluiert. Die aktiven Fraktioner, werden vereinigt und zur Neutralisation auf eine Säule eines Anionenharzaustauschers in der OH~-Form gegeben. Die ablaufende Flüssigke't wird gefriergetrocknet. Es wird die freie Base in Form eines Komplexes der aktiven Komponenten erhalten.

Das erhaltene rohe Pulver wird sodann an Kieselgel Chromatographien. Als Entwicklungslösungsmittel wird die untere Schicht eines Gemisches von Chloroform, Isopropancl und wäßriger Ammoniaklösung (2:1:1) verwendet. Das rohe Pulver wird In dem Lösungsmittel suspendiert und auf die Säule gegeben. Die Entwicklung wird mit dem gleichen Lösungsmittel bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 30 ml/.Std. durchgeführt. Zu Beginn wird eine aktiv*· Fraktion eluiert, die Fortimicin B enthält. Nach dem Eluieren mehrerer in Spuren vorliegender Komponenten wird In großen aktiven Fraktionen eine Fraktion eluiert, die Fortimicin A enthält. Danach wird die Eluierung fortgesetzt und in den nächsten großen aktiven Fraktionen das Fortimicin C eluiert.

Die Fortimicin C enthaltenden aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird gefriergetrocknet. Man erhält ein weißes Pulver, das die freie Base von Forti- ⁵" niicin C darstellt. Das erhaltene Präparat von Fortimicin C ist verhältnismäßig rein. Bisweilen ist das Präparat verunreinigt. In diesem Fall wird das Präparat an Cellulose Chromatographien. A!s Entwicklungslösungsmittel wird ein Gemisch von n-Butanol, Pyrldin, Essigsäure unc Wusssr (6:4:2:4) verwendet. Die beim Eluieren erhaltenen aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält ein gereinigtes Präparat von Fortimicin C. -

Sofern die Verunreinigung eine Substanz ist. die eine positive Nlnhydrln-Reaktlon ergibt, kann die Reinigung auch an Carboxymethylcellulose erfolgen. In diese Fall wird eine Lösung des rohen Pulvers auf eine mit Carboxymethylcellulose in der Ammuniumform gefüllte Säule gegeben. DIp aktiven Verbindungen werden an der Carboxymethylcellulose adsorbiert. Sodann wird die Säule zur Abtrennung des größten Teils der Pigmente und der anorganischen Salze gründlich mit Wasser gewaschen. Hierauf wird die Säule mit 0,2 η wäßriger ^W) Ammoniumbicarbonatlösung eluiert.

Die Fortimicin C enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Es wird ein gereinigtes Fortimicin C Präparat erhalten.

Während der vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahren werden dir Fraktionen durch aufsteigende PnpicTchromiitogruphic an Filterpapier Whatman Nr. S untersucht. Als Laufmir.tel wird die untere Schicht eines ⁽'⁵ Gemisches von Chloroform. Methanol und I7prozentlger wäßriger Ammoniaklösung (1:1:1) verwendet. Die Entwicklung wird 6 bis 15 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Rf-Wert für Fortimicin Im Papierehromalogramm beträgt etwa 0,18.

Fortimicin C 1st als freie Base ein weißes, basisch reagierendes Pulver, das 44,84% Kohlenstoff, 8,19% Wasserstoff, 17,36% Stickstoff und 29.61% Sauerstoff enthält. Die Verbindung hat die Summenformel CHi.N.O,. Das Molekulargewicht, berechnet durch Massenspektroskopie In hoher Auflösung, beträgt 448. Somit beträgt der theoretische Gehalt an Kohlenstoff 44,62%, an Wasserstoff 8.32%, an Stickstoff 17,34% und an Sauerstoff 29,72%. Fortimicin C schmilzt bei 160" C unter Zersetzung.

Das UV-Absorptlonsspektrum einer wäßrigen Lösung von Fortimicin C zeigt keine charakteristischen Maxima Im Spektralbereich von 220 bis 360 ηιμ und lediglich eine Endadsorption.

Die freie Base des Fortimicin C hat folgenden optischen Drehwert: (ar]# = + 84° (c = 0,l, HjO).

In Flg. 1 Ist das Ultrarot-Absorptlonsspektrum von Fortimicin C als Kallumbromld-Preßllng wiedergegeben. Fortimicin C zeigt Absorptlonsmaxlma bei folgenden Wellenzahlen (cm'¹):

,1400, 2900. 1625, 1570, 1450, 1350. 1100 und 1030.

Flg. 2 zeigt das PMR-Spektrum von Fortimicin C-hydrochlorld (DjO-Lösung), wobei die chemischen !> Verschiebungen In ppm (6) feldabwärts von Tetramethylsllan als äußerem Standard angegeben sind.

Fig. 3 zeigt das CMR-Spcktrum von Fortimicin C-hydrochlorld (DjO-Lösung), wobei die chemischen Verschiebungen In ppm feldabwärts von Tetramethylsllan angegeben sind, jedoch gemessen wurden vom Inter-

C. A 1 Πι £T Λ _M

Aufgrund der Analysen hat Fortimicin C die vorstehend angegebene Formel.
Fortimicin C ergibt eine positive Nlnhydrln-Reaktlon und Kaliumpermanganat-Reaktlon, sowie eine negative

Elson-Morgan- und Bluret-Reaktlon.
Die freie Base des Fortimicin C Ist in Wasser gut löslich, In Methanol löslich. In Äthanol und Aceton mäßig

löslich und in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Äthylacetat, Butylacetat, Dläthyläther, Butanol, Petrcläther und η-Hexan unlöslich.
Die Rf-Werte von Fortimicin C bei der Papierchromatographie und Dünnschichtchromatographie mit den verschiedensten Entwicklungslösungsmitteln sind In den Tabellen 1, II und III zusammengefaOt. Diese Werte wurden mit den Rf-Werten verschiedener ahnlicher Antibiotika vergehen, die In ähnlicher Welse entwickelt wurden.

W Tabelle I

R/-Werte von Fortimicin C im aufsteigenden
Papierchromatogramm bei 28° C

Entwicklungslösungsmittel R/^Wert Entwicklungs

dauer, Std.

20gewichtsprozentige 0,96 3

Ammoniumchloridlösung

wassergesättigtes n-Butanol 0,00 15

n-Butanol-Essigsäure-Wasser 0,06 15
(3:1:1)

wassergesättigtes Äthylacetat 0,00 4

wassergesättigtes n-Butanol 0,04 15
mit 2 Gew.-% p-Toluolsulfonsäure und 2 Vol-%
-₀ Piperidin

Tabelle II

R^-Werte von Fortimicin C, Gentamicinkomplex,

Gentamicin C\_a und Sisomicin bei der Dünnschicht

chromatographie an Kieselgel; entwickelt bei
Raumtemperatur während 3 Stunden

Entwickler·)	Antibiotikum	Ry-Wert
I	Fortimicin C	0,74
I	Gentamicin Komplex	0,71
I	Gentamicin Ci„	0,71
I	Sisomicin	0,71
II	Fortmicin C	0,40
Π	Gentamicin Komplex	0,06-0,16

Fortsetzung

Entwickler·) Antibiotikum R,-Wert |

Il Gentamicin C|„ 0,16

II Sisomicin 0,18

·) Entwickler I: Die obere Schichl eines Gemisches von Chloroform, Methanol und 17pro/enliger wäßriger Ammoniaklösung (Volumverhältnis 2:1 : U

Entwickler II: lüpro/.entigeAmmoniumacetallösungundMethanol (Volumverhältnis 1:1)

Tabelle III

Ry-Werte bekannter Antibiotika bei der aufsteigenden Papierchromatographie unter Verwendung der unteren Schicht des Gemisches von Chloroform, Methanol üiiu ι / proZcfiiigcr "vVäungcF /ΛίΤΊΓΓιοΠίάΚιο5*ύΠβ ν vöiüiTiverhältnis 2 : 1 : 1) als Entwicklungslösungsmittel, entwickelt bei Raumtemperatur während 12 Stunden.

Antibiotikum Ry-Wert

Streptomycin A Ü,U2

Streptomycin B 0,00

Bluensomycin 0,01

Ribostamycin 0,00

Lividomycin A 0,00

Lividomycin B . 0,03

Lividomycin D 0,02

Spectinomycin 0,45

Kasugamycin 0,01

uuuiusiii η

Butirosin B 0,01

Hygromycin B 0,02

Gentamicin A 0,00

Gentamicin B 0,00

Gentamicin Ci₀ 0,18

Gentamicin C, 0,59

Gentamicin C₂ 0,38

Sisomicin 0,18

Neomycin A 0,00

Neomycin B 0,03

Antibiotikum Nr. 460 0,01

Neomycin C 0,00

Kanamycin A 0,02

Kanamycin B 0,01

Kanamycin C 0,02

Paromomycin 0,00

Mebramycin Komplex 0,01

Tobramycin 0,02

Apramycin 0,02

Mebramycin Faktor 4 0,01

Mebramycin Faktor 5 0,00

Myomycin 0,00

XK-62-2 0,49

Fortsetzung

Antibiotikum

Fortimicin B 0,65

Fortimicin A 0,37

Fortimicin C 0,18

Das antibakterielle Spektrum von Fortimicin C gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wird In üblicher

Weise nach der Agar-Verdünnungsmethode beim pH-Wert 8 bestimmt. Die Ergebnisse sind In Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Mikroorganismus minimale Hemm

konzentration, y/ml

2" Bacillus subtilis Nr. 10707 0,16

Staphylococcus aureus ATCC 6538P 0,33

Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 0,66

:5 Escherichia coli ATCC 26 1,3

Escherichia coli KY 8327 1,3

: (Resistent gegenüber Kanamycin,

■ Gentamicin und Tobramycin)

•a ^l" Pseudomonas aeruginosa BMH Nr. 1 5

% Pseudomonas aeruginosa KY 8510 5

,α (Resistent gegenüber Kanamycin,

[;■ Kanamycin B, Tobramycin, Genta-

'n 35 micin Ci₀ und Ribostamycin)

|i Shigella sonnei ATCC 9290 2,6

'f\ Salmonella typhosa ATCC 9992 0,66

ΐ ⁴⁰ Aus Tabelle IV ist ersichtlich, daß Fortimicin C eine starke antibakterielle Aktivität gegenüber den ver-

Li schiedensten gram-positiven und gram-negativen Keimen sowie auch gegenüber bestimmten Stammen von

^rH Escherichia coil besitzt, die gegenüber Kanamycin, Gentamicin und Tobramycin resistent sind.

jsj Fortimicin C ist ein neues Antibiotikum. Als wasserlösliche basische Antibiotika, die durch Mikroorganismen

|ί der Gattung Mlcromonospora erzeugt werden, und die ein breites antibakterielles Wlrkungsspektrurn besitzen.

is ⁴⁵ sind beispielsweise folgende Verbindungen bekannt:

H Gentamicin-Komplex, M. J. Weinstein u. Mitarb., Antimicrobial

jS Agents and Chemotherapy, 1963. 1; D. J. Cooper u. Mitarb.,

■; J. Infect. DIs., Bd. 119 (1969). S. 342 und J. A. Waltz u. Mitarb., Antlmlcrob. Ag. Chemoth., Bd. 2 (1972).

\\ S. 464.

|j «> Antibiotikum Nr. 460, JP-AS 16 153/71.

H Sisomicin, M. J. Weinstein u. Mitarb., J. Antibiotics, Bd. 23, (1970). S. 551, 555 und 559.

Ü Fortimicin B, US-PS 39 31 400 und DE-OS 24 18 349.

i Fortimicin A. DE-OS 24 35 160.

S Aus Tabelle III Ist ersichtlich, daß die Komponenten des Gentamicin-Komplexes Gentamicin A, Gentamicin

i ⁵⁵ B, C₂ und Ci Rf-Werte bei der Papierchromatographie von 0.00. 0,00. 0,38 bzw. 0,59 zeigen. Im gleichen Paplerchrornatogramm beträgt der Rf-Wert für Fortimicin C 0,18. Fortimicin C zeigt den gleichen Rf-Wert wie Gentamicin C₁,,, jedoch ist der Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (vgl. Tabelle II) mit dem Entwickler II verschieden vom Rf-Wert des Gentamicin Ci₀. Fortimicin C unterscheidet sich von Antibiotikum Nr. 460, XK-62-2 und Fortimicin B hinsichtlich seines Rf-Wertes. Sisomicin hat bei der Papler-⁶⁰ Chromatographie ebenfalls einen Rf-Wert von 0,18, bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit dem Entwickler II jedoch einen deutlich verschiedenen Rf-Wert.

Fortimicin C als Breitspektrum-Antiblotikum unterscheidet sich von den anderen wasserlöslichen basischen Breltspektrum-Antiblotika, die durch Actinomyceten gebildet werden, wie Streptomycin, Ribostamycin, Lividomycin, Spectlnomycin, Kasugamlcin, Neomycin, Kanamycin, Nebramycin und Parcmomycln. ⁶⁵ Die Beispieie erläutern die Erfindung.

Beispiel I

Mlcromonospora ollvoasterospora MK-70 (ATCC Nr. 21819; FERM-P Nr. 1560) wird als ElnsatzsUimm In einem ersten VorkuHurmcdlum gezüchtet, das 2 Gewichtsprozent Glucose, 0,5 Gewichtsprozent Pcpton, 0,5 Gewichtsprozent llcfecxtnikt und 0.1 Gewlchtspro/cnt Culclumciirboruii cnthillt. Das Nührmcdlum vurdc vor "■ der Sterilisation auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Eine Platinösc des Elnsaaisiammcs v.lrd in IO ml des Vorkulturmedlums in einem 50 ml fassenden großen Reagensglas übcrlmplt. Die Züchtung wird 5 Tage bei .10 C unter Schütteln durchgeführt. Sodann werden 10 ml der ersten Vorkultur In 30 ml eines zweiten Vorkulturmedlums in einem 250 ml fassenden Er'.enmeyerkolben überimpft. Die Zusammensetzung des zweiten Vorkulturmedlums Ist die gleiche wie die des ersten Vorkulturmedlums, Die Züchtung wird 2 Tage bei 30° C ^l() unter Schütteln durchgeführt.

Sodann werden 30 ml des zweiten Vorkulturmedlums In 300 ml eines dritten Vorkulturmedlums In einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben Uberlmpft, der mit Prallplatten ausgerüstet ist. Die Zusammensetzung des dritten Vorkulturmedlums ist die gleiche wie die des ersiin Vorkulturmediums. Die Züchtung wird im dritter. Vorkulturmedlum 2 Tage unter Schütteln bei 30° C durchgeführt. Hierauf werden 1,5 Liter der dritten Vorkul- '⁵ turbrühe - entsprechend dem Inhalt von 5 Kolben - In 15 Lliter eines vierten Vorkulturmediums in einem 3t/ Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des vierten Vorkulturmedlums Ist die gleiche wie aie des ersten Vorkulturmedlums. Die Züchtung in dem Fermenter wird 2 Tage unter Belüftung und Rühren (350 U/mln. Belüftung 15 Llter/mln) bei 37° C durchgeführt. Schließlich werden 15 Liter der vierten Vorkulturbrühe In 150 Liter eines Mediums In einem 300 Liter fassenden Fermenter aus Edelstahl überimpfi. Dieses Nährmedium enthält 4 Gewichtsprozent lösliche Stärke, 2 Gewichtsprozent Sojabohne η mehl, 1 Gewichtsprozent Malsquellwasser, 0,05 Gewichtsprozent K₂HPO₄, 0.05 Gewichtsprozent MgSO₄ ■ 7H₂O, 0,03 Gewichtsprozent KCl und 0.1 Gewichtsprozent CaCOj. Vor der Sterilisation wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Die Züchtung In dem Fermenter wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren (150 U/min; Belüftung XO Liter/min) bei 37" C durchgeführt. Die erhaltene Gärmaische wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen ^2<l p!l-Wert von 2,5 eingestellt und 30 Minuten gerührt. Sodann werden etwa 7 kg einer Filtrierhilfe (Radiolite Nr. 600) eingetragen und die Zellen abfiltriert. Das Flltrat wird mit 6 η-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und auf eine mit etwa 20 Liter eines Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Die durch das Ausuiuscherbett abfließende Flüssigkeit wird verworfen. Aktive Verbindungen sind am Austauscher adsorbiert. Nach dem Waschen des Austauscherbetts mit Wasrer werden die adsorbierten aktiven Verbindungen mit 0,5 η wäßriger Ammoniaklösung elulert. Die Aktivität des Eluats wird durch ein Antlblogramm nach der Testplättchenmethode auf einer Agarplatte und mit Bacillus subtllis 10707 bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa 1 Liter eingedampft. Das Konzentral wird auf eine mit 500 ml eines Anlonenharzaustauschers In der OH~-Form gefüllte Säule gegeben. Sodann wird das Austauscherbett mit etwa 2 Liter Wasser gewaschen, um Verunreinigungen abzutrennen. Die aktiven -¹⁵ Verbindungen werden mit Wasser elulert, die aktiven Fraktionen vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa i00 mi eingedampft. Sodann wird das Konzentrat auf eine mit etwa 50 mi pulverisierte Aktivkohle gefüiiic Kolonne gegeben. Die aktiven Verbindungen werden an der Aktivkohle adsorbiert. Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen, und das abfließende Wasser und das Waschwasser werden verworfen. Sodann werden die adsorbierten aktiven Verbindungen mit 0,2 η-Schwefelsäure elulert. Die Aktivität des Eluats wird nach der Test- ⁴⁽⁾ plättchenmethode an Bacillus subtills bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf eine mit einem Anlonenharzaustauscher in der OH'-Form gefüllte Säule gegeben. Die aktiven Verbindungen werden sodann mit Wasser eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf etwa 50 ml eingedampf Das erhaltene Konzentrat wird gefriergetrocknet. Es wird ein pulveriges Rohprodukt erhalten, das den Fortimicin-Komplex enthält. Die Ausbeute beträgt 31 g. Das Rohprodukt besitzt eine Aktivität von 570 Einheiten/mg (die Aktivität von 1 mg reiner Verbindung entspricht 1000 Einheiten).

Zur Isolierung und Reinigung von Fortimicin C werden etwa 500 ml Kieselgel in ein Glasrohr gefüllt. Über das Kleselge! werden in gleichmäßiger Schicht 10 g des erhaltenen Rohproduktpulvers gefüllt. Die Kieselgelkolonne wird folgendermaßen hergestellt:

Zunächst wird das Kieselgel In der unteren Schicht eines Gemisches von Chloroform, Isopropanol und 17prozentlger wäßriger Ammoniaklösung (Voiumenverhältnis 2:1:1) suspendiert. Die Suspension wird in die Kolonne in gleichmäßiger Schicht eingefüllt und sodann mit dem gleichen Lösungsmittel gut gewaschen. Hierauf wird das Rohproduktpuiver in den Kopf der Kolonne eingefüllt. Sodann wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch elulert, das langsam in den Kolonnenkopf eingespeist wird. Danach wird das Eluieren bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 50 ml/Std. fortgesetzt. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 20 ml gesammelt. Die Aktivität jeder Fraktion wird nach der TestplSttehenmethode bestimmt. Fortimicin B, gefolgt von Fortimicin A. wird zuerst eluiert. Die Eluierung wird fortgesetzt, und sodann wird Fortimicin C eluiert. Die aktiven Fraktionen werden der Papierchroma'ographJe unterworfen, und die Fortimicin C enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute 0,9 g eines gereinigten Präparats der freien Base von Fortimicin C. Das Produkt ^ω hat eine Aktivität von etwa 980 Einheiten/mg.

Beispiel 2

Der in Beispiel i verwendete Stamm wird ais Einsaizstamm verwendet und der ersten bis vierten Vorkuitur " gemäß Beispiel 1 unterworfen. Das Nährmedium im 300 Liter fassenden Fermenter aus Edelstahl enthält jedoch 4 Gewichtsprozent lösliche Stärke, 3 Gewichtsprozent Trockenhefepulver, 0,05 Gewichtsprozent K₂HPO₄, 0,05 Gewichtsprozent MgSO₄ ■ 7H₂O, 0,03 Gewichtsprozeit KCl und 0,1 Gewichtsprozent CaCO₃. Die Züchtung und

Isolierung wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Es werden etwa 63 g eines Rohpulvers des Fortimlcin-Komplexes mit einer Aktivität von etwa 650 Einheiten/mg erhalten. 50 g des Rohpulvers werden gemäß Beispiel I gereinigt. Es werden 7 g Fortimicin C mit einer Aktivität von etwa 850 Einheiten/mg erhalten. Zur weiteren Reinigung wird das Präparat an Cellulose Chromatographien. Zu diesem Zweck werden etwa 500 ml Celluloseoulver in einem Gemisch von n-Butanol, Essigsäure, Pyridin und Wasser (6:2:4:4) suspendiert und in eine Glassäule gleichmäßig eingefüllt. Hierauf wird die Kolonne mit dem gleichen Lösungsmittel gründlich gewaschen. Danach wird das Präparat in danner Schicht auf die Kolonne gegeben und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert, das langsam in den Kolonnenkopf eingespeist wird. Danach wird das Eluieren bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 1 ml/mln fortgesetzt. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 10 ml gesammelt. Die Aktivität jeder Fraktion wird nach der Testplättchenmethode bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute 3,5 g gereinigtes Fortimicin C mit einer Aktivität von 950 Einheiten/mg.

'5 Beispiel 3

Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird ein Nährmedium für den Edelstahlfermenter verwendet, das 4 Gewichtsprozent lösliche Stärke, 3 Gewichtsprozent Casamlnosäure (ein Säurehydrolysat von Casein), 0,05 Gewichtsprozent K₂HPO*, 0,05 Gewichtsprozent MgSO₄ ■ 7HjO, 0,03 Gewichtsprozent KCl und 0,1 Gewichts-

prozen: CaCÖ3 enthält. Die Züchtung und die Isolierung und Reinigung von Fortimicin werden gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Ausbeute 6,5 g gereinigtes Fortimicin C mit einer Aktivität von etwa 980 Elnheiten/mg.

Beispiel 4

-⁵ Die Züchtung und Isolierung wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Ausbeute 3 g Fortimicin C enthaltendes Rohproduktpulver. Das Rohprodukt wird in 5 ml Wasser gelöst und auf eine mit etwa 200 mg Carboxymethylcellulose in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Danach wird die SIuIe mit etwa 1 Liter Wasser gewaschen. Die aktiven Verbindungen werden an der Carboxymethylcellulose adsorbiert, wahrend der größte Teil der Pigmente und anorganischen Salze eluiert werden. Hierauf wird mit einem 0,2 molaren Cltronensäure-Phosphor-

-W säure-Puffer (pH-Wert 3,0) In einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 50 ml/Stunde eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von 10 ml aufgefangen. Die Aktivität jeder Fraktion wird nach der Testplättchenmethode bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden der Papierchromatographie unterworfen, und die Fortimicin C enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und auf einen Kationenaustauscher in der H*-Form gegeben. Die aktiven Verbindungen werden am Kationenharzaustauscher adsorbiert. Danach wird der Kationenharzaustauscher mit Wasser gewaschen und mit 0,5 η-Salzsäure eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Neutralisation auf eine mit einem Anlonenharzaustauscher in der OH'-Form gefOllte Säule gegeben. Die ablaufenden aktiven Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausbeute 350 mg Fortimicin C mit einer Aktivität von etwa 985 Elnhelten/mg.

*» Beispiel 5

Als Einsatzstamm wird Mlcromonospora olivoasterospora Mm 744, KY 11067 (FERM-P Nr. 2193; ATCC Nr. 31009) verwendet. Als Einsaatmedium für die erste bis vierte Vorkultur wird ein Nährmedium verwendet, das 2 Gewichtsprozent Glucose, 0,5 Gewichtsprozent Pepton, 0,3 Gewichtsprozent Hefeextrakt und 0.1

^4S Gewichtsprozent Calciumcarbonat enthält. Vor der Sterilisation wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. Die erste bis vierte Vorkultur wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Sodann werden 15 Liter der vierten Vorkulturbrühe In 150 Liter eines Nährrnedlums In einem 300 Liter fassenden Edelstahlfermenter überimpft. Dieses Nährmedium enthält 2 Gewichtsprozent lösliche Stärke, 0,05 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl, 2 Gewichtsprozent Glucose, 1 Gewichtsprozent Malsquellwasser, 1 Gewichtsprozent Hefeextrakt, 0,05 Gewichts prozent K₂HPO₄, 0,05 Gewichtsprozent MgSO₄ · 7H₃O, 0,03 Gewichtsprozent KCl und 0,1 Gewichtsprozent CaCO). Vor der Sterilisation wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Züchtung wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren (150 U/mln; Belüftungsgeschwindigkeit 80 Llter/mln) bei 30⁰C durchgeführt. Nach beendeter Züchtung wird die Gärmaische gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute 42 g roher Fortimlcln-Komple >! mit einer Aktivität von etwa 560 Elnhelien/mg. Das Rohproduktpulver wird gemäß Beispiel 1 gereinigt. Ausbeute 2,4 g Fortimicin B mit einer Aktivität von etwa 980 Elnhelten/mg.

Beispiel 6 Als Einsaatstamm wird Mlcromonospora olivoasterospora MK-80, KY 11055 (ATCC Nr. 31010; FERM-P Nr. 2192) verwendet. Als Einsaatmedium für die erste bis vierte Vorkultur wird ein Nährmedium verwendet.

das I Gewichtsprozent Glucose. I Gewichtsprozent lösliche Stärke. 0.5 Gewichtsprozent Hefeexlrakt. 0,5

Gewichtsprozent Pepton und 0.1 Gewichtsprozent Calclumcarbonal enthalt. Der pH-Wert des Nflhrmcdlums

wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt. Die vierte Kulturbrühe wird sodann In ein llauptfcrmcntailons medlum der In Beispiel 5 angegebenen Zusammensetzung uberlmpft. Aus der erhaltenen Gärbrühc wird gcmill!

^(l< Beispiel I der Fortlmlcln-Komplex als Rohpulver Isoliert. Ausbeute 52 g mit einer Aktivität von etwa 515

Elnheiten/mg. Das Rohprodukt wird gemäß Beispiel I gereinigt. Ausbeute 5 g gereinigtes Fortimicin C mit

einer Aktivität von etwa 990 Elnhelten/mg.

Beispiel 7

Als Einsaatstamm wird Micromonospora olivoasterospora MK-70 (FERM-P Nr. 1560; ATCC Nr. 21819) verwendet. Der Stamm wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden 150 Liter der erhaltenen Gärflüssigkeit mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt und 30 Minuten ^s gerührt. Danach wird die Kulturflüsslgkeli mit 6 η-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Hierauf werden 15 Liter eines Katlonenharzaustauschers in der Ammoniumform eingetragen, und das Gemisch wird 30 Minuten langsam gerührt. Danach wird der Kationenharzaustauscher auf einem groben Filtertuch abfUtriert, 'gründlich mit Wasser gewaschen und sodann In ein 170cm langes Rohr mit einem Innendurchmesser von 15 cm eingefüllt. Hierauf wird der Kationenharzaustauscher mit 30 Liter 0,5 η wäßriger Ammoniaklösung ^lü eluiert. Es werden 7 Liter eines den Fortimlcln-Komplex enthaltenden Konzentrats erhalten. Das Konzentrat enthält neben Fortimicin C, Fortimicin A und B noch mehrere Komponenten in Spuren. Zur Fraktionierung des Konzentrats wird es unter vermindertem Druck auf 500 ml eingedampft. Schließlich werden 49 g des rohen Fortimicin-Komplexes durch Gefriertrocknung als Pulver erhalten. Das Pulver wird in 50 ml der unteren Schicht eines Gemisches von Chloroform, Methanol und 17prozentlger wäßriger Ammoniaklösung (2:1:1) suspendiert und auf eine mit Cellulosepulver gefüllte, 100 cm lange Kolonne mit einem Innendurchmesf-r von 5 cm gegeben. Die Entwicklung wird mit dem gleichen Lösungsmittel durchgeführt. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und die Aktivität jeder Fraktion wird nach der Testplättchenmethode bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden der Bioautographle gegen Bacillus subtllls Nr. 10707 unterworfen, um die aktive Komponente in den Fraktionen zu bestimmen. Bei der Chromatographie an Cellulose werden Fortimicin B, A und C in ^M dieser Reihenfolge eluiert. Die Fortimicin C enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampit. Ausbeute 12,5 g eines amporphen weißen Pulvers, das Fortimicin C als Heuptbesiandteil enthalt. Das Rohprodukt wird in etwa 50 ml Wasser gelöst und die Lösung mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Sodann *lrd die Lösung auf eine mit Blo-Rex 70 in der Ammoniumform gefüllte, 80 cm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 2 cm gegeben. Der Kationenaustauscher wird gründlich mit Wasser gewaschen. Der Fortimicin C als Hauptbestandteil enthaltende Fortlmlcln-Komplex wird an dem Kationenharzaustauscher adsorbiert, während die Verunreinigungen mit Wasser eluiert werden. Danach wird mit 0 bis 0,2 η wäßriger Ammoniaklösung mit zunehmender Konzentration eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und jede Fraktion wird der Papierchromatographie unterworfen, um die Fortimicin C enthaltenden Fraktionen zu bestimmen. Die Fortimicin C enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unier vermindertem ^M Druck eingedampft und schließlich gefriergetrocknet. Ausbeute 10,2 g reines Fortimicin C als weißes amorphes Pu? <er mit einer Aktivität von 1000 Elnhelten/mg.

10 g der erhaltenen freien Base des Fortlmlcins werden in einer geringen Menge Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 6 η-Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4.5 eingestellt und gefriergetrocknet. Ausbeute 13,3 g Fortlmlcin-C-Sulfat als weißes amorphes Pulver mit einer Aktivität von 600 Einhelten/mg. ·¹⁵

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Fortimicin C der Formel
CH₃
CH-NH₂ NH₂ OH

ίο <^

NH₂ HO N-CH₃