DE2326781C3 - Antibioticum XK-62-2, dessen Sulfat und Verfahren zur Herstellung desselben - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Antibioticum der Formel

C-O

H J C-O

H H

OH NHCH₃ NHCH,

Ή*

C-O

I \

H H

\ H H NH,
C-C

HO—C-H Η—C-H

/^C~"^C
/' H H NH,

c—o

H-C-H

CC

I I

H NH₂

das als XK-62-2 bezeichnet wird, dessen Sulfat und ein Verfahren zur Herstellung derselben.

Das neue Antibioticum XK-62-2 ist ein wasserlösliches, basisches Antibioticum von sehr starker antibakterieller Aktivität gegen verschiedene grampositive und gramnegative Bakterien. Es besitzt auch starke antibakterielle Aktivität gegen Staphylococcus aureus und Escherichia coli, die gegen verschiedene bekannte Antibiotica resisteni sind. Ferner ist das neue Antibioticum sehr wirksam gegen Mikroorganismen des Genus Proti-us und Pseudomonas, gegen die nur sehr wenige Antibiotica wirksam sind, und unter den Mikroorganismen des Genus Pseudomonas ist das neue Antibioticum besonders wirksam gegen Stämme, die gegen das Antibioticum Gentamicin C_la resistent sind (vgl. Cooper und Mitarbeiter, Journal o^r Chemical Society, 1971, S. 3126 bis 3129).

F.s wurde gefunden, daß das Antibioticum XK-62-2 eine ausgezeichnete therapeutische Wirkung auf verschiedene Infektionen (bei Menschen und Tieren) ausübt, die durch die oben beschriebenen phlogogenen Bakterien verursacht werden. In Anbetracht dieser ausgezeichneten antibakleriellen Aktivität kann das Antibioticum XK-62-2 für medizinische Zwecke verwendet werden. Es kann auch als Zusatz zu Tierfutter oder als wuchsforderndes Mittel verwendet werden.

In Anbetracht seiner Natur, die nachstehend im einzelnen beschrieben wird, dürfte das neue Antibioticum zu dem Gentamicin-Komplex gehören.

Die Herstellung des basischen Anlibioticums Gentamicin ist in der IJS-Patentschrift 30 91 572 beschrieben. Es ist bekannt, daß Gentamicin sowie zwei weitere Fraktionen, die als Fraktion A und Fraktion B bezeichnet werden, durch Mikroorganis-

men der Species Micromonospora cchinospora und Micromonospora purpurea hergestellt werden können. Andere Forscher haben festgestellt, daß der Gentamicin-Komplex weitere sechs Bestandteile enthält (vgl. »Separation. Structural and Physical Studies on the Gentamicin C Complex«, Kcrshner.Rutgers, the Sia"te-University of New Jersey. 1971). Diese sechs Bestandteile werden als C₁. CV₁. C₂-I. C₂-Il, C₂-IU und C,„ bezeichnet.

Das Antibioticum gemäß der Erfindung ist am engsten mit der Fraktion C,_a verwandt, wird jedoch in Anbetracht bedeutender Unterschiede in den Kernmagnetresonauzspektren, die nachstehend beschrieben werden, als verschieden von der in der Literatur beschriebenen Fraktion C_2a angesehen.

Gemäß der Erfindung wird das Antibioticum XK-62-2 dadurch hergestellt, daß man in üblicher Weise einen das Antibioticum XK-62-2 erzeugenden Mikroorganismus von Micromonospora sagamiensis ATCC 21 826, Micromonospora sagamiensis var. flavaATCC21 827, Micromonospora sagamiensis var. nonreducans ATCC 21 803 und Micromonospora sagamiensis var. nonreducans Mutanten ATCC 21 949 in einem üblichen Nährmedium bei 25 bis 55''C bei rtwa neutralem pH-Wert züchtet, das Antibioticum XK-62-2 in dem Medium in an sich bekannter Weise, wie durch eine Kationenaustauscher- und anschließend Anionenaustauscherbehandlung. anreichert, es anschließend daraus in üblicher Weise, wie durch Chromatographie, abtrennt und gewiinschienfalls in üblicher Weise in sein Sulfat überführt.

Die Stämme ATCC 21 826. 21 803 und 21 827 werden intern auch als Stämme MK 65. MK 62 und Mm 628 bezeichnet.

DiL Stämme haben die folgenden Eigenschaften: I. Morphologie

Es entsteht ein gut entwickeltes, Verzweigungen aufweisendes Substratmyccl ohne Scheidewände mit einem Durchmesser von etwa 0,5 μ, aber kein echtes Luftmycel. Die Sporen sind sehr gut ausgebildet, und einzelne Sporen bilden sich an den Enden von einfachen Sporophoren (Länge 1,0 bis 2,0 μ), die von dem Substratmycel abzweigen. Viele Sporen bilden sich um die Enden des Substratmycels herum. Ausgereifte Sporen haben einen Durchmesser von etwa 1,0 μ, sind in ihrer Form oval bis kugelförmig und haben eine rauhe Oberfläche.

II. Charakteristische Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien

Der Stamm MK 65

Auf gut züchtenden Agarmcdien braune Kultur, die viele Sporen bildet, auf schlecht züchtenden Medien, auf denen sich Sporen nur schlecht bilden, ist die" Kultur orangefarben. Mitunter variiert der Farbton je nach dem Medium.

Der Stamm Mm 628

Auf gewöhnlichen synthetischen Medien ist das Wachstum sehr schlecht; gut gedeiht der Stamm nui auf natürlichen Medien unter Bildung einer Sporenschicht. Der Farbton unterscheidet sich auf aller Medien deutlich von demjenigen des Stamme:; M K 65 er ist moslrichfarben bis hellbraun Im ausigereiftcr Zustand ist die Kultur infolge der Farbe der Sporer bräunlich bis schwärzlich und mitunter grau.

Der Stamm MK 62

Im allgemeinen werden auf gut züchtenden Agar medien viele Sporen erzeugt, und die Kultur ist ineis' dunkelbraun. Auf schlecht züchtenden Medien ist du Kultur jedoch orangefarben, und es bilden sich nicln leicht Sporen. Ferner bildet sich eine schwarze Spor< auf Agarmedium, auf dem das Wachstum des Substratmycels schlecht ist, aber sich leicht Sporen bilden. Ir flüssigen Medien ist die Kultur infolge de. Farbe dci Substratmedien orangefarben.

Die charakteristischen Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien nach 2wöchigem Züchten bei 27⁰C sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Die Farbangaben entsprechen der Klassifizierung in »Color Harmony Manual« (Container Corporation oi America).

Tabelle 1

Medium

Stämme

Micromonospora sagamiensis Micromonospnra sagamiensis Micromonospora sacairicnsis var. nonreducans var. fiava

MK 62 MK 65

Mm fO8

Czapeks Agar G: mäßig, flach

S: hellmelonenfarbig

(3ia)

bis dunkelbraun (3pn) SP: keines Glukose-Asparaginagar G: mäßig, flach

Nähragar

Medium
Eieralbuminagar

Stärkeacar

G:	mäßig, flach G:	schlecht
S:	aprikosenfarbie
	(4ga)
	bis dunkelbraun (4nl)
SP:	keines
G:	schlecht bis mäßig, G:	schlecht
	flach

S: ziegelrot Henna (5ng) S:

SP: keines

G: schlecht bis mäßig,

flach

S: orange (41a) SP: keines

G: schlecht, flache schwarze Sporenschicht

G: mäßig, körnig SP:
G:

ziegelrot (5ne)
keines

G: schlecht bis mäßig.

flach hellgoldfarben (2ic) S: hellweizenfarbig (2ea)

SP: keines

schlecht bis mäßig,
flach

S:

SP: keines

G: schlecht bis mäßic
flach

S: kakaobraun (51g)

SP: keines G: mäßig, körnig

G: schlecht

G: schlecht

S: hcllkupferbraun (5pg) S: tiefbraun (4pl)

SP: keines SP: keines

G = Kultur (Wachstum).
S = Farbe des Subslraimyccls
SP -- Lösliches Pigment.

Fortsetzung

Medium

Stämme

Micromonnspora sagamiensis Micronionospora satüimiuisis Mi'.Tomonospora lagamiensis var. nonrcducans v;tr. flava

MK 62 MK 65

Mm 62X

Malzexlrakl-Hefeexlrakt- G: mäßig, erhaben agar

S: tiefbraun (5pl)

Hafermehlagar

Dcxtrose-Caseinhydrolysat (1:3)-agar

Bennetts Agar

Emersons Agar

SP: keines

G: schlecht, flach

S: orange (4Ia)

SP: keines

G: mäßig, erhaben

S: kofferbraun (4ne)

SP: keines

G: mäßig, erhaben.

geriffelt S: staubigoraneefarben

(41c)

SP: keines G: schlecht, gefaltet G: mäßig, körnig

S: kastanienbraun
(4ni)

G: schlecht, flach
S: orange (41a)

SP: keines

G: mäßig, flach

S: hellgeib (31a)

SP: keines

G: mäßig, körnig

G: gut. erhaben, geriffelt

S: mostrich braun (2pl) bis schwarz

SP: keines

G: schlecht

S: mostrichbraun (2pl)

bis schwarz SP: keines G: schlecht, körnig

S: hellgelb (2ea)

SP: keines

G: mäßie. flach

S: eichenbraun (4pi) S: mostrichbraun (2pi)

S: hellorangefarben

(4na)

SP: keines

Glukose-Hefeextraktagar G: mäßig, erhaben

S: hellorangefarben

(4na) SP: keines SP: keines

G: schlecht bis mäßig,

körnig
S: orangefarben (41a)

SP: keines

G: mäßig, körnig

S: rotbraunorange

(4nc)
SP: keines

SP: keines

G: mäßig, körnig

S: hellmelonengelb

(3ia)

SP: keines G: mäßig, körnig S: mostrichbraun

(2pi) SP: keines

G = Kultur (Wachstum).
S = Farbe des Substraimyccls. SP = Lösliches Pigment.

III. Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften der Stämme MK 62, MK 65" und Mm 628 sind in Tabelle angegeben. Die günstigste Temperatur wird nach

Tabelle Il

Stägiger Züchtung bestimmt, und die Wirkung au 45 Milch sowie die Zersetzung von Cellulose werder nach einmonatiger Züchtung beobachtet. Die übrigei Beobachtungen werden nach 2wöchiger Züchtung be 27° C durchgeführt.

Physiologische Eigenschaften

Micromonospora Micromonospora

sagamiensis var. nonrcducans sagamiensis

MK 62

MK 65

Micromonospora sagamiensis var. flava

Mm 628

Verflüssigung von Gelatine Verflüssigung von Milch Koagulation von Milch Zersetzung von Cellulose Hydrolyse von Stärke
Ausnutzung von Kohlenstoffquellen D-Arabinose

D-Galactose

D-Glukose

+ (langsam)

+ (langsam»

509 687/:

Fortsetzung

Physiologische Higeiischaficn

Miaoniniinsp'ir;! Miciomonosponi

s;ipnmicnsis v;ir. nonreihkuns suguniicnsis

MK (O

MK 65

MIT. ll.l\.l

Mm (OS

Ghcerin

n-Lactose

Lävulose + +

l.-lnosit . -

n-Mannit

D-Raffinose -

L-Rhamnose

»-Xylose τ f

Saccharose 4

Für das Wachstum günstigster pH-Wert 7.0 bis S.O Fürdas Wachstumgünstigste Temperatur 35 bis 40 C Nitratreduktion
Tvrosinasebildung
Melanoidbildung

7.0 bis 8,0

30 bis 40 C

7.0 bis 8.5
30 bis 40 C

Da die Stämme MK 62. MK 65 und Mm 62S kein echtes Luftmycel bilden und auf dem Substratmycel nur eine einzige Spore ausbilden, werden diese Stämme als dem Genus Micromonospora angehörig betrachtet. Die bekannten Mikroorganismen des Genus Micromonospora können auf Grund der Farbe des Mycels in vier Gruppen eingeteilt werden, nämlich die orangefarbene Gruppe, die violcttrote Gruppe, die blaugriine Gruppe und die braune Gruppe. In Anbetracht der Unterschiede im Farbton und der übrigen, in den Tabellen 1 und II angegebenen Unterschiede wurde festgestellt, daß die Stämme MK 62. MK 65 und Mm 62S zu einer neuen Species gehören, die ihrerseits dem Genus Micromonospora angehört.

Der Stamm MK 65 wurde als Sortenkultur ausgewählt und als Micromonospora sagainiensis bezeichnet, weil er aus Waldboden in den Vororten von Sagamihara-shi. Kanagawa-ken. Japan, isoliert wurde. Der Stamm MK 62 hat sehr ähnliche Eigenschaften wie der Stamm MK 65 und unterscheidet sich von diesem nur in der Reduktion von Salpetersäure, dem Schmelzen und Koagulieren und der Farbe des Mycels auf verschiedenen Medien. Daher wurde der Stamm NiK 62 als Variante der SortenkuHur angesehen und als Micromonospora sagamiensis var. nonreducans bezeichnet, weil er Salpetersäure nicht reduziert. Der Stamm Mm 62$ andererseits unterscheidet sich von den ersten beiden Stämmen darin, daß das Wachstum auf Agarmedium im allgemeinen schlechter ist und die Kultur eine mostrichbraune bis hellgelbe Farbe hat und daß dieser Stamm D-Arabinose. aber nicht Lävulose. ausnutzt. Dieser Stamm wird daher ebenfalls als eine Variante der Sortenkultur betrachtet und wurde wegen des gelben Farbtons als Micromonospora 6c sagamiensis var. flava bezeichnet.

Die oben beschriebenen Vertreter der neuen Species erzeugen nicht nur das Antibioticum XK-62-2. sondern auch andere Antibiotica. die zu dem Gentamicin-C-Komplex gehören.

Eine durch Einwirkung von N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin auf eine Kultur von Micromonospora sagamiensis var. nonreducans ATCC 21 SO?

erhaltene Mutante des Stammes MK 62 ist der Stamm MK-62-NG-164 (ATCC 21 949).

Wie im Falle, von anderen Stämmen von Actinomyccten können auch die zur Durchführung der Erfindung verwendeten Mikroorganismen unter dem Einfluß künstlicher Mittel, wie Ultraviolettbestrah

lung. Bestrahlung mit

ν O

Röntgenbestrahlung und

unter dem Einfluß verschiedener Chemikalien Mutation erleiden. Im Rahmen der Erfindung können alle diese Stämme, auch wenn sie in dieser Weise mutiert sind, verwendet werden, sofern sie nur die Fähigkeit haben, das Antibiotikum XK-62-2 zu erzeugen.

Im allgemeinen kann man sich herkömmlicher Methoden zum Züchten von Mikroorganismen der Aetinomyceten bei dem ertindungsgemäßcn Verfahren bedienen. Als Kulturmedien k.ip.n man verschiedene Nährmedien verwenden. Als Kohlenstoffquellc kommen Glukose, Stärke. Mannose. Fruktose, Saccharose. Dextrin. Melasse usw. allein oder in Kombination miteinander in Betracht. Ferner können Kohlenwasserstoffe. Alkohole, organische Säuren usw. verwende! werden, sofern sie von den Mikroorganismen genulzl werden können. Es können anorganische und organische Stickstoffquellen. wie Ammoniiimchlcrid. Ammoniumsulfat. Harnstoff. Ammoniumnitrat, Natriumnitrat usw. sowie auch in der Natur vorkommende Stickstoffquellen. wie Pcpton. Fleischextrakt. Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellwasser. Sojabohnenpulver. Casaminosäure. lösliches Pflanzenproicin usw. allein oder in Kombination miteinander venvendci werden. Ferner kann man dem Medium im Bedarfs falle anorganische Salze, wie Kochsalz. Kalium chlorid. Caleiumcarbonal und -phosphat, zusetzen Ebenso kann man organische oder anorganische Stoffe zusetzen, die das Wachstum der Mikroorganismen fördern.

Am besten eignet sich für das Verfahren gemäl der Erfindung eine 1 Uissigkeitskulturmethodc. ins besondere eine Submct.s-RÜhikuliui methode. Dis Züchuingslcmpcralui liegt /wischen 25 und 55'C und es ist zweckmäßig, die Züchtung bei etwa neu tialem pl I-Wert lUnvh/iiluhrcn.

Das Antibioticum gemäß der Erfindung sammelt sich in der Kullurflüssigkeit gewöhnlich nach 1- bis 12tägiger Züchtung an. Wenn die Ausbeute an Antibioticum XK-62-2 in der Kullurflüssigkeit ihr Maximum erreicht, wird die Züchtung unterbrochen und das Produkt aus dem Kulturmedium isoliert und gereinigt, nachdem die Mikrobenzellcn, z. B. durch Abtiltrieren, entfernt worden sind.

Das Isolieren und Reinigen des Anlibiolicums aus dem Filtrat erfolgt nach herkömmlichen Isolier- und Reinigungsmethoden für aus Kulturflüssigketlen gewonnene mikrobielle Stoffwechselproduktc.

Da das Antibioticum XK-62-2 basisch und in Wasser sehr löslich, in gewöhnlichen organischen Lösungsmitteln jedoch schwer löslich ist, kann das Produkt nach den gleichen Methoden gereinigt werden, die gewöhnlich zur Reinigung der sogenannten wasserlöslichen basischen Antibiotica angewandt werden. Insbesondere kann es durch eine geeignete Kombination von Adsorption an und Desorption von einem Kationenaustauschharz und Aktivkohle, Säulenchromatographie unter Verwendung von Cellulose, einem Gel aus verälhertcm Dextrcn und Kieselsäuregel sowie ähnlichen Methoden gereinigt werden. Da die freie Base in Aceton löslich und das Sulfat in Methanol schwer löslich ist, kann das gewünschte Produkt durch geeignete Ausnutzung dieser Eigenschaften in Lösung gebracht und ausgefällt werden.

Zum Beispiel wird das Kulturfiltrat zunächst auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und dann an dem Kationenai! auschhar/ »Ambcrlite IRC-50« (in NH₄ ¹"-Form/ adsorbiert. Nach dem Auswaschen mit Wasser eiuierl man mit !normalem wäßrigem Ammoniak. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird dann mit dem Anionenaustausch!™^ »Dowex 1 χ 2« (in der OH-Form) behandelt und weiter unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird auf einen pH-Wert von 10.5 eingestellt und mit 5 Raumtcilen Aceton versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrai eingeengt und mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4.5 eingestellt. Sodann setzt man 5 bis 10 Raumieile Methanol zu. Der Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Man erhält das Rohprodukt als weißes Pulver. 4s

Das so erhaltene pulverförmigc Rohprodukt wird in der unteren Schicht eines Lösungsmittelgemisches aus 2 Teilen Chloroform. 1 Teil Isopropanol und 1 Teil wäßrigem Ammoniak gelöst und die Lösung in einer Säule an Kieselsäuregel Chromatographien. Das Eluieren erfolgt mit dem gleichen Lösungsmittel bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml/Stunde. Die Fraktionen des Antibioticums XK-62-2 werden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Durch Gefriertrocknen des Konzentrats erhält man die weiße freie Base des Antibioticums. Man kann auch das Konzentrat der aktiven Fraktion mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 einstellen und dann filtrieren. Beim Gefriertrocknen des Filtrats erhält man das weiße Sulfat des Antibioticums XK-62-2. _Das Antibioticum

Die freie Base des Antibioticums XK-62-2 ist ein weißes basisches Pulver. Die Elementaranalyse ergibt: C 51,90, H 8,81, N 15,18 und O 24,11% (durch Differcnz). Der Schmelzpunkt des Sulfats beträgt 260⁰C (Zersetzung). Die spezifische Drehung der freien Base beträgt [h]?¹ = +116° (Konzentration 1% in H₂O).

Fig. 1 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung des Antibioticums XK-62-2. Hieraus ergibt sich, daß kein charakteristisches Absorptionsmaximum zwischen 220 und 360 ηΐμ vorhanden ist, sondern nur endständige Absorptionen.

F i g. 2 zeigt das Ultrarot-Absorptionsspektrum des Antibioticums (KBr-Tablette). Wie sich aus F i g. 2 ergibt, zeigt das Antibioticum XK-62-2 Maxima bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in cm"¹;

610, 1040, 1110, 1285, 1340, 1390, 1460, 1510. 1620, 2050, 2920, 3030, 3350.

Das KMR-Speklrum des Sulfats ist in Fig. 3 dargestellt. Das KMR-Spektrum wurde mit einem »Varian Associates HA-l00«-Spektrometer bestimmt, nachdem die Wasserstoffatome des Anlibioticums XK-62-2durch mehrmaliges Gefriertrocknen in schwerem Wasser durch Deuteriumatome ersetzt worden sind. Die Absorptionen bei 5,60 ppm und 6,32 ppm beruhen auf dem anomercn Proton des am Molekül beteiligten Zuckers. Die Absorptionen der N-Methylgruppe und der tert.C-Methylgruppe werden bei 3,38 ppm bzw. 1,80 ppm bestätigt. Charakteristischerweisc wird eine weitere Absorption der N-Methylgruppc bei 3,21 ppm beobachtet, also bei einem Unterschied von 0,17 ppm gegenüber 3,38 ppm.

Als Ergebnis der Messung des Massenspektrums unter Verwendung einer Vorrichtung von hohem Auflösungsvermögen wird festgestellt, daß das Antibioticum XK-62-2 ein Molekularion (M + \}⁺ mit der Masse 464 und daher ein Molekulargewicht von 463 sowie die Formel C₂₀H₄₁N₅O₇ aufweist. Infolgedessen ergeben sich für die Elementaranalyse die berechneten Werte C 51,84, H 8,86. N 15.12 und O 24,19%.

Die freie Base ist gut wasserlöslich, löslich in Methanol, etwas löslich in Äthanol oder Aceton, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Äthylacetat, Butylacetat. Äther. Butanol. Petroläther, η-Hexan usw. Sein Sulfat ist gut löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Aceton usw.

Die bei der Papierchromatographie und der Dünnschichtchromatographie mit verschiedenen Entwicklern erhaltenen Rf-Werte des Antibioticums XK-62-2 sind in Tabelle IH angegeben.

Tabelle HI

I. Rf-W^rte des Antibioticums XK-62-2 bei der
aufsteigenden Papierchromatographie (bei 28" C)

Entwickler Rf-Wen

Kntwickluniisdüiicr

(Stunden)

Ammoniumchloridlösung, 0.98

20 Gewichtsteile Ammoniumchlorid auf 100 Raumteile
Mit Wasser gesättigtes 0,00

n-Butanol

Gemisch aus 3 Teilen 0,06

n-Butanol, 1 Teil Essigsäure

und 1 Teil Wasser

Mit Wasser gesättigtes 0.00

Äthylacetat 15
15

Fortsetzung

Entwickler

Rf-VVcr!

Entwicklungsdauer

(Stunden)

Mit Wasser gesättigtes 0,03 15

n-Butanol, das 2 Gewichtsteile

p-Tolucisulfonsäure und

2 Gewichtsteile Piperidin auf 100 Raumteile enthält

2. Rf-Werte von XK-62-2 bei der Diinnschichtchromatographie an Kieselsäuregel (bei Raumtemperatur)

Die obere Schicht eines Ge- 0,86 3

misches aus 2 Raumteilcn

Chloroform, 1 Raumteil

Methanol und 1 Raumteil 17prozentigem wäßrigem

Ammoniak

Gemisch aus gleichen Raum- 0,21 3

teilen lOprozentiger

Ammoniumacetatlösung und Methanol

Ein Vergleich der Rf-Wertc des Antibioticums XK-62-2 mit denjenigen bekannter Antibiotica bei der Papierchromatographie unter Verwendung der unteren Schicht eines Gemisches aus 2 Raumteilen Chloroform, 1 Raumteil Methanol und I Raumteil 17%igem wäßrigem Ammoniak als Iintwickler sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Fraktionen angegeben, die als Fraktion A und Fraktion B bezeichnet werden. Später sind weitere Fraktionen isoliert worden. Zum Beispiel ist in der Dissertation von Allan S. Kershner, »Separation. Structural and Physical Studies on The Gentamicin C Complex«, Rutgers University, The State University of New Jersey, 1971, eine Reihe von Gentamicin-Antibiotica als C₁, C_2a, C₂-I, Q-Il. C₂-IIl bzw. C_{1 a} identifiziert.

Das Antibioticum gemäß der Erfindung ist zwar eng mit den bekannten Antibiotica des Gentarciicin-Komplexes verwandt, erweist sich aber auf Grund der oben angegebenen charakteristischen Kennwerte. besonders seines Ultraviolett-Absorptionsspektrums. seines Ultrarot-Absorptionsspektrums und seines kernmagnetischen Resonanzspektrums, als ein bisher noch nicht bekanntes Antibioticum. Das Antibioticum gemäß der Erfindung ähnelt am meisten der Geniamicinfraklion C_2a; diese Fraktion hat aber nicht das gleiche kernmagnetische Resonanzspektrum wie das Antibioticum gemäß der Erfindung. Das Antibioticum XK-62-2 ist daher ein neuer Stoff, der ausgezeichnete antibiotische Eigenschaften aufweist, wie djrch die nachstehenden Tabellen nachgewiesen wird.

Das antibakterielle Spektrum des Antibioticums XK-62-2 gegen verschiedene Mikroorganismen ist in Tabelle V angegeben.

Tabelle V

Antibakteriell Spektrum des Antibioticums XK-62-2 nach der Agarverdünnungsmethode

Untersuchte Mikroorganismen

35

Tabelle IV

Aufsteigende Papierchromatographie (bei Raumtemperatur); Entwicklungszeit 12 Stunden Mindest-

hcmmungv

kon/entralion

(; mil

Antibioticum

Gentamicin A
Gentamicin C,_a
Gentamicin C₂
Gentamicin C₁
Antibioticum Nr. 460
Sisomicin
Neomycin A
Neomycin B
Kanamycin A
Kanamycin B
Paromomycin
Nebramycin-Komplex
Tobramycin
Antibioticum XK-62-2

Rr-Wcrt

0,00 0,18 0,38 0,59 0,01 0,18 0,00 0,02 0,01 0,00 0,02 0,02 0,00 0,49

Auf Grund der obigen Bestimmungen wird das Antibioticum gemäß der Erfindung als dem Gentamicin-Komplex zugehörig betrachtet. Wie oben erwähnt, ist die Herstellung des Antibioticums Gentamicin in der USA.-Patentschrift 30 91 572 beschrieben. In dieser Patentschrift sind die Eigenschaften und die Struktur des Gentamicins sowie zweier zugehöriger

Streptococcus faecalis ATCC 10 541 1.05

Staphylococcus aureus ATCC 6538 P < 0.0041 Staphylococcus aureus KY 8942 0,065

(resistent gegen Kanamycin,
Paromomycin und Streptomycin)

Staphylococcus aureus KY 8950 0.0082

(resistent gegen Streptomycin,
Tetracyclin, Penicillin und Sulfonamide)

Staphylococcus aureus KY 8953 0.0041

(resistent gegen Streptomycin,
Kanamycin, Paromomycin, Tetracyclin.

Npnrnvrin Knnpnrlnmvrin iinH

Erythromycin)

Staphylococcus aureus KY 8956 < 0,001

(resistent gegen Streptomycin,

Paromomycin, Tetracyclin, Erythromycin und Oleandomycin)

Staphylococcus aureus KY 8957 0,0021

'resistent gegen Chloramphenicol, Streptomycin, Kanendomycin, Tetracyclin und Paromomycin)
Bacillus subtilis Nr. 10 707 < 0.004

Bacillus cereus ATCC 9634 0.016

Bacillus cereus var. mycoides 0 008""

ATCC 9463

KIebsiella pneunioniac ATCC 10031 ^(W)UN2 Eschcrichia coli ATCC 26 ..ii)S2

₆ ⁵

15

Fortsetzung

Untersuchte Mikroorganismen

Escherichia coli KY 8302 (resistent gegen Chloramphenicol. Streptomycin, Kanamycin. Paromomycin. Tetracyclin und Spectinomycin) Escherichia coli KY 8310 (resistent gegen Chloramphenicol, Streptomycin, Kanamycin, Gentamicin. Kanendomycin, Paromomycin. Tetracyclin und Spectinomycin) Escherichia coli KY 8314 (resistent gegen Streptomycin) Escherichia coli KY 8315 (resistent gegen Streptomycin. Kanamycin, Paromomycin und Meomycin)

Pseudomonas aeruginosa BMH Nr. Proteus vulgaris ATCC 6897 Shigella sonnei ATCC 9290 Salmonella typhosa ATCC 9992

Mindest-

hemmunp.-

konzenlration

0,033

1,05

0,0082

0.016

0,53 0.03 0,07 0,018

Die ln-vitro-Aktivitäi des Antibiolicums XK-62-2 gegen eine Anzahl von grampositiven und gramnegativen Bakterien ist viel höher als diejenige des Streptomycins und des Kanamycins und isi derjenigen des Gentamicins vergleichbar. Die In-vitro-Vergleichsaktivitäten dieser Antibiotica gegen verschiedene Mikroorganismen des Genus Proteus sind in Tabelle Vl angegeben.

Die antibakterielle Aktivität des Antibioticums

to XK-62-2 gegen verschiedene, klinisch isolierte Stämme von Pseudomonas aeruginosa wird mit der Aktivität von Streptomycin. Kanamycin, dem Gentamicin-Komplex und Gentamicin C_la in "labeile VII verglichen.

Außerdem wird die In-vitro-Aktivität des Antibioticums XK-62-2 gegen palhogene bakterielle Infektionen bei Mäusen untersucht. Die Mäuse werden durch intraperiloneale injektion mi! einem Impfgut von Pseudomonas aeruginosa BMH Nr. 1 oder Pseudomonas aeruginosa KY 8510 infiziert. Dann werden sie mit verschiedenen Dosen des zu untersuchenden Antibioticums durch subkutane Injektion behandelt. Die Wirkung des Antibioticums XK-62-2 auf den Schutz gegen Bakterieninfektionen ergibt sich aus Tabelle VIII; für jeden dieser Versuche wurden zehn Mäuse verwendet.

Tabelle Vl

Mindesthemmungskonzentration. ;/ml (nach der Agarverdünnungsmethode)

Mikroorganismen	Antibioticum XK-bl-2 Gentamicin-Komplex	0,021	streptomycin	is.aii<i
Proteus vulgaris KY 4296	0,02 i	0,021	■ —
Proteus vulgaris KY 4297	0.021	0,04
Proteus vulgaris ATCC 6897	0,04	0,021	>40	0.34
Proteus vulgaris Abbott JJ	0,021	0,04	>40	0,16
Proteus mirabilis Finland 9	0,04	0.021	>40	0,04
Proteus mirabilis Nr. 825	0,021	0.04	>40	0.04
Proteus mirabilis Nr. 39	0,021	0,04	>40	0,33
Proteus morganii Jenkins	0,04	0.021	>40	0,16
Proteus rettgeri Booth	0,021	<0,01	>40	0.08
Proteus rettgeri Hambrook	0.021	>40	0,08

Tabelle VII

Mindesthemmungskonzentration. WmI (nach der Agarverdünnungsmethode)

	Antibioticum
Stämme von Pseudo	XK-62-2
monas aeruginosa	0,33
KY 4276	0,33
KY 8510	>42
KY 8511	0,33
KY 8512	0,55
KY 8514	>42
KY 8515	0.33
KY 8516	0,33
KY 8520	>42

Gentamicin-	Gentamicin
Komplex	C1.
0.33	0.33
1,3	2,6
42	42
0.65	0,33
1.3	0.33
62	>42
1.3	5,2
0,65	0,33
62	>42

Streptomycin

2,6
0.65
> 2500

156

624
0.65
5.2

156

Kanamycin

1,63

13

13
3,3
208
416

26
104
167

Tabelle VIII

Dosis, mg je Maus

Pseudom"n:i< aeruginosa BMH Nr. I

Antibioticum XK-62-2

Gentamicin-Komplex

18

Pseudomonas aeruyinosa KY K5K1

Antibioticum
XK-62-2

Gentamicin-Komplex

entamicin

Prozentuales überleben der Mäuse

2 loo loo >oo 90 o

. 90 100 80 40 ,

0,5 50 70 50 30

0,25 ■ 10 20 30 10

0,125 0 0 0 0 0

Wie sich aus den obi₂en Daten ersibt, hat das Anti- monospora erzeugt Wie sich jedoch aus den obigen feioticum XK-62-2 eine sehr starke antibakterielle Kennwerten ergibt laßt sich das Antib.oticuii, Aktivität eeeen einen weiten Bereich von gram- XK-62-2 auf Grund der ^erte bei der Papjerpositiven und gramnegativen Bakterien. Ferner weist 20 Chromatographie deutlich von Gentam^n A, C₁,, es eine starke antibakterielle Aktivität gegen Sta- C, und C₁, die alle Bestandte Ie des GenUm.cmphylococcus aureus und Escherichia coli auf, die gegen Komplexes sind, von dem Antibuticum Nr. 460 und verschiedene bekannte Antibiotica resistent sind, und -on Sisomicin unterscheiden Wasserlöslichen _ba. es ist besonders wirksam cegen Mikroorganismen der sischen Aminoglucosid-Ant.biot.ca, z. B. Neomycin A, Genera Proteus und Pseudomonas, gegen die bisher 25 Neomycin B, Kanamycin A, Kanamycin B, Paromonur wenige Antibiotica als wirksam bekannt sind. mycin, Nebramycm-Komplex und Tobramycin, wer-

Aus den obiuen Tabellen ist ersichtlich, daß es im den ähnliche Eigenschaften wie dem Antibioticum Vergleich zu dem Gentamicin-Komplex oder zu XK-62-2 zugeschrieben. Es ist jedoch klar, daß das Gentamicin C₁.,, welches einer der Bestandteile des Antibioticum XK-62-2 sich hinsichtlich der Rf-Werte Gentamicin-Komplexes ist. eine ausgezeichnete anti- 30 einwandfrei von diesen Antibiotica unterscheidet,
bakterielle Aktivität und therapeutische Wirkung . .

gegen gewisse (klinisch isolierte) Stämme von Pseudo- Beispiel

rnonas aeruginosa aufweist. Insbesondere zeigt das ^ Züchtung von MK 65

Antibioticum XK-62-2 eine viel höhere antibakterielle

Aktivität ccgen Pseudomonas aeruginosa KY 8510 35 In diesem Beispiel wird Micromonospora saga- und KY 8516 als der Gentamicin-Komplex oder miensis MK 65 AT^C 21 826 (r-bRM-I Nr. 1530) als Gentamicin C_la. Auf Grund von enzymologischcn Impfstamm verwendet. 30 ml eines ersten Nähr-Untersuchungen wurde eefunden, daß die Stamme mediums werden in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben KY 8510 und 8516 ein spezifisches Enzymsystem ha- mit einer Schleife voll Impfstamm beimpft. Das Nährben, welches Gentamicin C₁₁, oder Kanamycin durch 40 medium dieser ersten Impfkultur hat die folgend. Acetylierung der 6-ständigen NH_rGruppe des Pur- Zusammensetzung:

porosamins von Gentamicin C_la oder der 6'-ständigen Dextrin 1 %

NH₂-Gruppe des Kanamycins inaKtiv macht. Dies Glukose 1 %

ist die Hauptursache für die Resistenz der Stämme Pepton 0.5%

KY 8510 und 8516 besonders gegen Gentamicin C_1?. 45 Hefeextrakt 0,5%

Jedoch sind diese beiden Stämme gegen das Anti- Calciumcarbonat OJ %

bioticum XK-62-2 empfindlich. Es ist anzunehmen, (pH· 7 2 vor der Sterilisierung)

daß dies darauf beruht, daß das Antibioticum XK-62-2

durch dieses inaktivierende Enzym nicht acetyliert Die Züchtung wird 5 Tage unter Schütteln bei 3OC

werden kann, weil seine 6'-ständige NH₂-Gruppe 50 durchgeführt. Dann werden mit 30 ml dieser Impfmethyliert ist. Verglichen mit Gentamicin C_la oder kultur 300 ml eines zweiten Nährmediums der gleichen mit dem Gentamicin-Komplex, der Gentamicin C_la Zusammensetzung wie das erste Medium in einem mit enthält, ist also das Antibioticum XK-62-2 besonders Scheidewänden versehenen 2-I-Erlenmeyerkolben bewirksam in seiner antibakteriellen Aktivität gegen impft. Die zweite Impfkultur wird 2 Tage bei 30 C Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli und Kleb- 55 unter Schütteln durchgeführt. Mit 1,5 1 der zweiten sieiiä pneurnoniae, die diesen acetylierenden Resistanz- Impfkultur (entsprechend dem Inhalt von 5 Kolben) mechanismus aufweisen. werden dann 15 1 eines dritten Nährmediums der

Andere Antibiotica. nämlich der Gentamicin-Kom- gleichen Zusammensetzung in einem 30 I fassenuen plex (M. J. Weinstein und Mitarbeiter: »Anti- Glashafen-Fcrmenlcr beimpft. Die Züchtung in dem microbial Agents and Chemotherapy« [1963] I, und 60 Glashafen-Fermenter wird 2 Tage lang bei 30 C unter D. J. Cooper und Mitarbeiter: »J. Infect. Dis.«, Belüflimg(15 l/Min.)und Rühren (350 U Min. (durch-Bd. 119, S. 342 [1969]), das Antibioticum Nr. 460 geführt. Mit 15 1 der dritten Impfkultur weiden dann (bekanntgemachtc japanische Patentanmeldung 601 eines vierten Nährmediums der gleichen Zu-16 153/71) und Sisomicin (M. J. Weinstein und sammcnselzung in einem 3001 fassenden Fermenler Mitarbeiter: »J. Antibiotics«, Bd. 23, S. 551, 555, 559 65 beimpft. Die Züchtung in dem Fermentcr wird im [197O]) sind wasserlösliche, basische Antibiolica mit Verlaufe von 2 Tagen bei 30 C unter Belüftung einem weitreichenden antimikrobiellen Spektrum und (60 l/Min.) und Rühren (150 U/Min.) durchgeführt, werden duirch Mikroorganismen des Genus Micro- Schließlich werden mit 60 1 der vierten Impfkultur

600 1 eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung in einem 1000 1 fassenden Fermenter beimpft:

Dextrin 5%

Sojabohnenmehl 4%

CaCO₃ 0,7%

(pH: 7,2 vor der Sterilisierung)

Die Züchtung in dem Fermenler wird 5 Tage lang bei 35'C unter Belüftung (6001 Min.) und Rühren (150 U Min.) durchgeführt.

B. Isolierung des rohen Antibioticums

15

Sobald die Fermentation vollständig ist, wird die Kühlflüssigkeit mit 1 !normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und 30 Minuten gerührt. Dann setzt man Ϊ0 kg Filterhilfsmittel zu und nitriert die Mikrobenzellen ab. Das Filtrat wird mit onormaler Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und durch eine Säule geleitet, die mit 501 Kationenaustauschhar^ (»Amberlite lRC-50« in der Ammoniumionenform) beschickt ist. Die aktive Substanz wird an dem Harz adsorbiert und das Eluat verworfen. Nach dem Waschen des Harzes mit Wasser wird die aktive Substanz mit 1 normalem wäßrigem Ammoniak eluiert. Die Aktivität des so erhaltenen Eluats gegen Bacillus subtilis Nr. 10 707 wird nach einer Papierscheibenmethode unter Verwendung einer Agarplatte bestimmt.

Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum auf 5 1 eingeengt. Dann wird das Konzentrat mit onormaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und durch eine Säule geleitet, die mit 1 1 eines Anionenaustauschharzes (»Dowex 1 χ 2« in der Hydroxylionenform) beschickt ist. Die Säule wird mit 51 Wasser gewaschen und die aktive Substanz auf ¹Z₁₅ ihres Volumens eingeengt. Das Konzentrat wird mit onormaler Natronlauge auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und mit 5 Raumteilen Aceton versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat auf 500 ml eingeengt. Das Konzentrat wird mit onormaler Schwefel";'ure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und mit 2,5 1 Methanol versetzt. Nach dem Kühlen erhält man einen weißen Niederschlag. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum erhält man 300 g eines weißen Pulvers. Dieses weiße Pulver ist ein Gemisch aub dem Sulfat von Gentamicin C_{1 a} und dem Sulfat des Antibioticums ' XK-62-2 und zeigt eine Aktivität von 620 Einheiten/mg (die Aktivität von 1 mg des reinen Produkts ent- ■ spricht 1000 Einheilen).

55 C. Isolierung und Reinigung

100 g des in Stufe B erhaltenen weißen Pulvers werden in einer dünnen, gleichmäßigen Schicht L".f dem oberen Teil einer 150 cm langen Säule von 5 cm Durchmesser ausgebreitet, die mit 3 kg Kieselsäuregel beschickt ist, welches zuvor in einem Lösungsmitlei aus 2 Raumteilen Chloroform, 1 Raumteil Isopropanol und 1 Raumleil wäßrigem Ammoniak suspendiert worden ist. Das F.luieren erfolgt mit dem gleichen Lösungsmittel bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 250 mlStd. Das Eluat wird in Anteile zu 100 ml zerlegt. Die aktive Fraktion wird der Papierchromato-

graphic unterworfen, um die eluierten Bestandteile zu untersuchen. Das Antibioticum XK-62-2 wird in den Fraktionen Nr. 53-75 und Gentamicin C_la in den Fraktionen Nr. 85-120 eluiert. Die Fraktionen Nr. 53-75 werden vereinigt und unter vermindertem Druck so weit eingeengt, daß das Lösungsmittel abgetrieben wird. Das Konzentrat wird in ~twas Wasser gelöst. Nach dem Gefriertrocknen der Lösung erhält man 38 g reines Antibioticum XK-62-2 als freie Base. Die Substanz hat eine Aktivität von 950 Einheiten/mg. Die Fraktionen Nr. 85-120 werden ebenfalls vereinigt und unter vermindertem Druck so weit eingeengt, daß das Lösungsmittel abgetrieben wird. Das Konzentral wird dann in etwas Wasser gelöst. Nach dem Gefriertrocknen der Lösung erhält man 50 g gereinigtes Präparat von Gentamicin C_{1 a} als freie Base. Die Aktivität dieses Präparats beträgt 980 Einheilen/mg.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird Micromonospora sagamiensis var. flava Mm 628 ATCC 21 827 (FERM-P Nr. 15"M) als Impfstamm verwendet. Die Impfkulturen werden in der gleichen "Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, mit dem gleichen Nährmedium angelegt. Mit 60 1 der vierten Impfkultur werden 600 1 eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung in einem 1000 1 fassenden Fermenter beimpft:

Lösliche Stärke 4%

Maisquellwasser 1 %

Sojabohnenmehl 2%

K₂HPO₄ 0.05%

MgSO₄-7H,O 0,05%

KCl 0,03%

CoCl₂ -2H₂O 0,005%

CaCO₃ 0,1%

Die Fermentation wird 96 Stunden bei 30' C unter Belüftung (600 l/Min.) und Rühren (150 U/Min.) durchgeführt. Nach beendeter Fermentation wird das Rohprodukt von der Kühlflüssigkeit, wie im Beispiel 1 beschrieben, abgetrennt, und man erhält 400 g eines weißen Pulvers. Durch Papierchromatographie wird gefunden, daß das Pulver Gentamicin C₁, C₂ und C_{1 a} sowie außerdem das Antibioticum XK-62-2 enthält.

Die 400 g des weißen Pulvers werden dann auf den oberen Teil einer zylinderförmigen Glassäule geschüttet, die gleichmäßig mit 8 kg Kieselsäuregel beschickt ist, welches zuvor in einem Lösungsmittel aus 2 Raumteilen Chloroform, 1 Raumteil Isopropanol und 1 Raumteil 17%igem wäßrigem Ammoniak suspendiert worden ist. Nachdem das Pulver auf der oberen Teil der Säule geschüttet worden ist, eluien man mit dem gleichen Lösungsmiltelgemisch bei einei Geschwindigkeit von 500 ml/Stunde. Das Eluat wire in Anteile zu 500 ml zerlegt. Jede der Fraktionen wire durch Papierchromatographie untersucht. Hierbe wird gefunden, daß die einzelnen Bestandteile in de folgenden Reihenfolge eluiert werden: Gentamicin C₁ Antibioticum XK-62-2. Gentamicin C₂ und Genta micin C_{1 a}. Diejenigen Fraktionen, die den gleichei Bestandteil haben, werden miteinander vereinigt um eingeengt. Das Konzentrat wird in Wasser gelöst um gefriergetrocknet, und die folgenden Bestandteil werden in Form der freien Basen isoliert:

22

Bestandteil

Gentamicin C₁
Antibioticum XK-62-2
Gentamicin C₂
Gentamicin C_{1 a}

Aktivität

(Einheilen mg)

880
932

925
940

Ausheule

150

60

113

52

Beispiel 3

In diesem Beispiel dient Micromonospora sagamiensis var. nonreducans MK 62, ATCC 21 803 (FERM-P Nr. 1477) als Impfstamn
Impfgut wird zum Beimpfen von
Nährmediums der folgenden Zusammensetzung ir einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet Nr. 10 707 wird nach einer Papierscheibenmethode
unter Verwendung einer Agarplattc bestimmt.

Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und im
Vakuum auf 5 1 eingeengt. Das Konzentrat wird mit
onormaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 8.0
eingestellt und durch eine Säule geleitet, die mit 1 1
des Anionenaustauschharzcs »Dowex 1 χ 2« (in der
OH * -Form) beschickt ist. Die Säule wird dann mit 5 I
Wasser gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen.
Die aktive Fraktion wird auf V₁₅ ihres Volumens eingeengt. Dann wird das Konzentrat mit onormaler
Natronlauge auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt
und mit 5 Raumtcilen Aceton versetzt. Der Niederabfiltriert und die Acetonschicht auf
Das

Dextrin 1%

Glukose 1 %

Pepton 0.5%

Hefeextrakt 0.5%

Calciumcarbonat ' 0,1 %

(pH: 7,2 vor der Sterilisierung)

Die Züchtung wird 5 Tage unter Schütteln bei 30° C

durchgeführt. Dann werden mit 30 ml der ersten

Impfkultur 300 ml eines zweiten Nährmediums der

gleichen Zusammensetzung in einem mit Scheide-

UHU Hill i,J I ινίν,ιΐίαιιν/ι · w „~

erhält man einen weißen Niederschlag. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen.
Nach dem Trocknen im Vakuum erhält man 16 bis
α weißes Pulver. Das weiße Pulver ist ein Gemisch
aus^dem Sulfat von Gentamicin C₁, und demjenigen
des Antibioticums XK-62-2 und zeigt eine Aktivität
von 550 Einheiten/mg (die Aktivität von 1 mg reinem
Produkt entspricht 1000 Einheiten).

s> des weißen Pulvers werden als dünne, gleichmäßige Schicht auf dem oberen Teil einer 50 cm langen
und 25 mm weiten Säule ausgebreitet, die mit 300 ml

nzung in einem um .».....,».ν.- Kieselsäuregel beschickt ist, welches zuvor in einem versehenen 2-1-Erlenmeyerkolben beimpft. ₃₀ Lösungsmittel aus 2 Raumteilen Chloroform. 1 Kaume Kultur wird 2 Tage bei 30^C unter teil Isopropanol und 1 Raumteil wäßriger Ammoniakrf, SdTUhTt Hierauf werden mit 1,5 1 der lösung suspendiert worden ist. Das Eluieren erfolgt STtaSÄ ^rechend dem Inhalt von mit dem gleichen Lösungsmittel bei einer Strömung Γκο£βηΠ5 1 einrad ritten Nährmediums der gleichen geschwindigkeit von 30 ml/Stunde. Das Eluat wird η /immense zung in einem 30 I fassenden Glashafen- _3S Anteile zu !0 ml zerlegt. Die aktive. Fraktion wird Zusammensetzung _durch ρ_{Αρίβκ1ΐΓΟΐηΑΐΟΒΓ8}ρΗι_β auf die eluierten Be-

nTeÄunf η dem Glashafen-Fermenter wird standteile untersucht. Das Antibioticum XK-62-2 wird ■> ? ρ hrii 30⁰C untCT Belüftung (15 l/Min.) und in den Fraktionen Nr. 53-75 und Gentamicin C₁. in RuSn (350 U/Min durchgeführt. Dann werden mit den Fraktionen Nr. 85-120 elu.ert. Die Fraktionen *₅f derdriuen %Ault»r fiO 1 eines vierten Nähr- ₄₀ Nr. 53-75 werden vereinigt und unter vemuito em mediums der gleichen Zusammensetzung in einem Druck so weit eingeengt, daß das Lösungsmittel Sf fassendenΓ Fermenter beimpft. Diese Züchtung abgetrieben wird. Das Konzentrat wird in etwas erfol JinnerSb vo™ Tagen bei 30° C unter Belüftung Wasser gelöst. Nach dem Gefriertrocknen der Losung Soffi und Rühren (150 U/Min.). Schließlich erhält man 900 mg gereinigtes Antibioticum Xk-62-werden mit 60 1 der vierten Impfkultur 600 1 eines ₄₅ (als freie Base). Die Substanz hat eine A " "
Fermentationsmediums der folgenden Zusammen- 950 Einheiten/mg. Ebenso werden die

t-ermeniduu ι. _{r j} ^ ₁_ u„;™.,r. _Nr 85-120 miteinander vereinigt und unter

dertem Druck so weit eingeengt, daß das Lösungsmittel abgetrieben wird. Das Konzentrat wird in
etwas Wasser gelöst. Nach dem Gefriertrocknen der
Lösung erhält man 1,8 g gereinigtes Präparat von

^, . ■ ■ ^ ,_,_ r ·_ η \ n;_o Aktivität des

Fermentationsmeuium» u>.i .v,.₆^>.—. —--....-—-Setzung in einem 1000 1 fassenden Fermenter beimpft.

Dextrin 5%

Soiabohnenmehl ■*·->^/o

CaCO₃ °'^7%

(pH: 7,2 vor der Sterihsierung)

Die Züchtung in dem Fermenler wird 5 Tage bei 30⁰C unter Belüftung (500 l/Min.) und Rühren (150 U/Min.) durchgeführt. ·..·„,

Nach Beendigung der Fermentation wird die Kulturflüssigkeit mit 12normaler Schwefelsäure auf einen oH Wert von 2,0 eingestellt und 30 Minuten gerührt. Dann setzt man 10 kg Filterhilfsmittel zu und filtriert die Mikrobenzellcn ab. Das Filtrat wird mit onormaler Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und durch eine Säule geleitet, die mit 501 des Kationenaustauschharzes »Ambcrhte lRC-50« (in der Ammoniumionenform) beschickt ist. Das Elual wird verworfen. Nach dem Auswaschen des Harzes mit Wasser wird die aktive Substanz mit 1 normaler wä ßriger Amrnoniumhydroxidlösung eluiert. Die Aktivität des so erhaltenen Eluais gegen Bacillus subtihs Gentamicin C₁, (als freie Base). Die Aktivität des
Präparats beträgt 980 Einheiten/mg.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird wiederum Micromonospora sagamiensis var. nonreducans MK 62 (ATCt
803) als Impfstamm verwendet. Die Zusammensetzung des Nährmediums ist die folgende:

Lösliche Stärke ²°^/0

Caseinhydrolysat (eßbar) °-^{5 /o}

Hefecxtrakt ^λ

Calciumcarbonat °·' ^/o

Mit einer Schleife voll von der Impfkultur werden
ml Nährmedium in einem 21 fassenden Erlenmeyerkolben beimpft. Die erste Impfkultur wird
Tage unter Schütteln bei 30" C durchgeführt. Dann

wer lm{ fass kul ren Im₁ luh

Ku voi Wf ent hie filt ab. ein Säi hai for wa hai Ha

säi Eh ver pH wii im· ein 5F sei wii vei

eir un in wi de m; Cn

23 ' 24

werden mit dem Inhalt von drei Kolben der ersten jenigen des Antibioticums XK-62-2 und hat eine

Impfkultur 15 1 frisches Nährmedium in einem 301 Aktivität von 450 Einheiten mg.

fassenden Glasfermenter beimpft. Die zweite Impf- 60 g dieses rohen Pulvers werden in 101 Wasser

kultur wird 2 Tage bei 30°C unter Belüftung und Ruh- gelöst. Die Lösung wird mit 2normaler Natronlauge

ren durchgeführt. Dann werden 1501 der dritten 5 auf einen pH-Wert von 8.0 eingestellt und durch eine

Impfkultur in einen 30001 fassenden Behälter über- Säule geleitet, die mit 3 1 des Anionenaustauschharzes

führt, der 150i eines Fermentationsmediums der »Amberlite lRA-400« (in der Hydroxylionenform)

folgenden Zusammensetzung enthält: beschickt ist. Die Säule wird mit 101 Wasser ge-

i ·· r κ ς»·· ν- AV waschen, und das Eluat und die Waschflüssigkeiten

Loslicne Marke 4 /o _{|o werden vereinigt und au}f ι ι eingeengt. Das Konzen-

Maisquellwasser I/o ^ _{wird mjt 6nonnakr Schwef}ei_{säure au}f einen

Sojabohnenmehl 2/o _pH-Wert von 4,5 eingestellt und mit 10 1 Methanol

x» e^ '-,λ ; 'Λ „„„'' versetzt. Auf diese Weise erhiill man 50 a gereinigtes

MgSO₄-TH₂O 0,05% Sulfat eines Antibioticums.

r π iHf\ ruw'o/ '⁵ ^ S ^es gereinigten Antibioticums werden auf den

rrA' " n\o/ oberen Teil einer 100 cm langen und 4 cm weiten Säule

*-^aL ·' ^{υ<1 /0} geschüttet, die mit 2,8 1 Cellulosepulver beschickt ist

Die Fermentation wird 4 Tage bei 30'C unter Das Lluieren erfolgt allmählich mit der unteren Schicht

Belüftung und Rühren durchgeführt. Die Erzeugung eines Lösungsmittelgemisches aus 2 RaumtHlen

der aktiven Substanz erreicht nach 4tägiger Fermen- 20 Chloroform, 1 Raumteil Methanol und 1 Raumteil

tation ein Maximum, und die Aktivität fällt einige Zeit 17%iger Ammoniaklösung. Die Geschwindigkeit des

lang nicht ab. Eluierens wird so gesteuert, daß die einzelnen Anteile

Wenn die Fermentation vollständig ist. wird die 100 ml nicht überschreiten. Das Eluat wird in Anteile

Kulturflüssigkeit mit Oxalsäure auf einen pH-Wert zu 20 ml zerlegt, und das Antibioticum XK-62-2 von 2,0 eingestellt und 1 Stunde gerührt. Auf diese 25 sowie Gentamicin C_{1 a} werden gesondert in den Weise wird der größte Teil der in den Mikrobenzellen Fraktionen Nr. 62-86 bzw. in den Fraktionen Nr.

enthaltenen aktiven Substanz in die Flüssigkeit extra- 95-130 eluiert. Die Fraktionen eines jeden Bestandteils hiert. Dann setzt man 20 kg Filterhilfsmittel zu und werden miteinander vereinigt, unter vermindertem

filtriert die Mikrobenzellen sowie das Calciumoxalat Druck eingeengt, um das Lösungsmittel abzutreiben, ab. Das Filtrat wird mit 6normaler Natronlauge auf 30 und das Konzentrat wird in etwas Wasser gelöst,

einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und durch eine Diese Lösung wird mit 2normaler Schwefelsäure auf

Säule geleitet, die mit 1001 des Kationenaustausch- einen pH-We~rt von 4,5 eingestellt. Nach dem Gefrier-

harzes »Amberlite IRC-50« (in der Natriumionen- trocknen erhält man 8,7 g des Sulfats des Anti-

form) beschickt ist. Die Säule wird mit Wasser ge- bioticums XK-62-2 (792 Einheiten/mg) und 1,8 g

waschen. Der Ablauf und die Wasehflüssigkeiten ent- 35 Sulfat von Gentamicin C_la (787 Einheiten/mg) jeweils

halten Verunreinigungen und Stoffe, die nicht an dem in Form eines weißen Pulvers. Um die freie Base

Harz adsorbiert worden sind und nur eine Aktivität herzustellen, werden 5 g des Sulfats des Antibioticums

gegen grampositive Mikroorganismen aufweisen. XK-62-2 zu 500 ml Wasser und einer Säule mit 70 ml

Das Eluieren erfolgt mit 300 1 2normaler Schwefel- des Anionenaustauschharzes »Dowex 1 χ 2« (in der

säure, und die aktiven Bestandteile werden in den 40 Hydroxylionenform) gegeben. Nach dem Auswaschen

Eluatfraktionen gewonnen. Die Fraktionen werden der Säule mit 500 ml Wasser wird das eine Aktivität

vereinigt und mit 2normaler Natronlauge auf einen aufweisende Eluat unter vermindertem Druck aul

pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die so erhaltene Lösung 100 ml eingeengt. Durch Gefriertrocknen des Konzen-

wird unter vermindertem Druck auf 201 eingeengt trats erhält man 3,3 g freie Base XK-62-2 (990 Ein- und das Konzentrat mit 2normaler Natronlauge auf 45 heiten/mg).

einen pH-Wert von 10,5 eingestellt. Nach Zusatz von .

5 Raumtetkn Aceton unter Rühren fällt ein Nieder- Beispiel 5

schlag aus, der abfiltriert und mit Aceton gewaschen MK-62-NG-164(ATCC 21 949) wird in der gleicher

wird. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden Weise wie im Beispiel 3 beschrieben gezüchtet, wöbe

vereinigt und unter Druck auf 1 I eingeengt. Das 50 man 95 g (750 Einheiten/mg) einer Mischung dei Konzentrat wird mit 6noirmaler Schwefelsäure auf Antibiotica von C₁; uad XK-62-2 erhält. Die Mischung

einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Dann setzt man wird in gleicher Weise wie in Stufe C des Beispiels 1

unter Rühren 5 I Methanol zu und läßt das Gemisch behandelt, wobei man 49 g des Antibioticums XK-62-]

in einem kalten Raum stehen. Der weiße Niederschlag (975 Einheiten/mg) erfeält-

wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Nach 55 Die Mutante MK-62-NG-164 war erhalten wordei

dem Trocknen des Niederschlages im Vakuum erhält durch Einwirkung von N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso

man 65 g rohes Antibioticum. Das rohe Pulver ist ein guanidin auf eine Kultur von Micromonospora saga

Gemisch aus dem Sulfat von Gentamicin C_u und dem- miensis var. nonreducans ATCC 21 803.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Antibioticum XK-62-2 der Formel

HO

HO—C-H H —C —H

mit einem Molekulargewicht von 463, der Bruttoformel C₂₀H₄J N₅O₇, einem Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäß Fig. 1, einem Ultrarotabsorptionsspektrum gemäß F i g. 2 und einem kernmagnetischen Resonanzspeklrum gemäß F i g. 3 und dessen Sulfat.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibioticums X K.-62-2 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in üblicher Weise einen das Antibioticum XK-62-2 erzeugenden Mikroorganismus Von Mieromonospora sagamiensis ATCC 21 826, Mieromonospora sagamiensis var. fiava ATCC 21 827, Mieromonospora sagamiensis var. nonreducans ATCC 21 803 und Mieromonospora sagamiensis var. nonreducans-Mutanten ATCC 2i 949 in einem üblichen Nährmedium bei 25 bis 55° C bei etwa neutraiem pH-Wert züchtet, das Antibioticum XK-62-2 in dem Medium in an sich bekannter Weise, wie durch eine Kationenaustauscher- und anschließend AnionenaustauscherbehandUing, anreichert, es anschließend daraus in üblicher Weise, wie durch Chromatographie, abtrennt und gewünschtenfalls in üblicher Weise in sein Sulfat überführt.