DE1793403B1 - Verfahren zur miktrobiologischen Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxykanamycin in erhöhter Ausbeute.

2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin hemmt wirksam das Wachstum grampositiver, gramnegativer und säurebeständiger Bakterien, wie Staphylococcus. Pseudomonas. Salmonella, Shigella und Mycobakterium, sowie auch pathogener Bakterien, die beständig sind gegenüber bekannten Antibiotika und synthetischen chemotherapeutischen Mitteln. Dieses 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin weist eine viel geringere Toxizität, insbesondere eine geringe Oto-Toxizität auf und zeigt eine brauchbare therapeutische Wirkung bei Infektionen grampositiver, gramnegativer und säurebeständiger Bakterien an Mensch und Tier.

2-Amino-2'-deoxy-kanamycin hat die Bruttoformel C₁₈H₃₇N₅O₁₀ ' H₂O und kann durch die Strukturformel

ch,oh

HO

4>-OH

Η,Ν

O^ „

H,N

dargestellt werden.

Bei der Untersuchung der großtechnischen Herstellung von Kanamycin A durch Fermentation wurde festgestellt, daß die gewöhnlichen natürlichen Stämme von Streptomyces kanamyceticus, die zu diesem Zwecke verwendet werden. Kanamycin A gewöhnlich in größerer Menge in der Kultur erzeugen können, daß sie aber nur eine sehr viel kleinere Menge von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin bilden.

Als Ergebnis weiterer Untersuchungen wurde festgestellt, daß sich das Verhältnis von in der Kultur erzeugtem und angereichertem 2'-Amino-2'-deoxykanamycin merklich verbessern und letzteres sich in höherer Ausbeute daraus isolieren läßt, wenn entweder gewöhnliche Stämme von Streptomyces kanamyceticus in an sich bekannter Weise, aber in Gegenwart einer Aminoglukose oder einer glukosidartigen Verbindung aus Aminoglukose und Deoxystreptamin kultiviert werden, oder wenn einige neue Mutanten von Streptomyces kanamyceticus in an sich bekannter Weise auf einem gewöhnlichen Kulturmedium, wie es herkömmlicherweise für die Kultivierung bekannter Mikroorganismen von Actinomyceten verwendet wird, gezüchtet werden.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin durch Züchten des Stammes von Streptomyceticus kanamyceticus ATCC 21 252 unter aeroben Bedingungen in einem üblichen Kulturmedium, das eine Kohlehydrat- und eine Stickstoffquelle enthält, und Isolieren des Fermentations-

Produktes mit Hilfe einer Kationenaustauscherbehandlung, dadurch gekennzeichnet, daß entweder das Nährmedium zusätzlich eine Aminoglukose und/ oder glukosidartige Verbindung derselben mit Deoxystreptamin enthält oder an Stelle des Stammes Streptomyces kanamyceticus seine unter den Hinterlegungsnummern ATCC 21 159, 21 260, 21 261 und 21 268 hinterlegten Mutanten verwendet werden.

Beispiele von Aminoglukosen, die sich im erwähnten Verfahren verwenden lassen, sind D-Glukosamin, S-Amino-S-deoxy-D-glukose, 6-Amino-6-deoxy-D-glukose und 2,6-Dideoxy-2,6-di-amino-D-glukose. Als glukosidartige Verbindungen der Aminoglukose mit Deoxystreptamin bezeichnet man solche Verbindungen, in denen die Aminoglukose mit Deoxystreptamin im Molverhältnis 1:1 vorliegt, oder Komplexe dieser glukosidartigen Verbindungen mit weiteren angelagerten Glukose- oder Aminoglukose-Molekülen. Beispiele geeigneter glukosidartiger Verbindungen der Aminoglukose mit Deoxystreptamin sind Paromamin (4 - (2 - D - Glukosaminyl) - a - deoxystreptamin), Deoxystreptamin- O-kanosaminid, Neamin (4-(2,6-Dideoxy-2,6-di-amino-glukosyl)-a-a-deoxystreptamin). Antibiotikum NK-1001 (ein Glukosid des Antibiotikums NK-1003, vgl. »Asian Medical Journal«, Bd. 11, Nr. 2, S. 69 bis 75) und Antibiotikum NK-1003 (5 - O - (6 -Amino - 6 - deoxy- a- D - glukosyl) - deoxystreptamin. Die obenerwähnten Antibiotika NK-1001 und NK-1003 sind neue Substanzen, beschrieben und beansprucht in den japanischen Patentanmeldungen 40 145/67 und 40 146/67 bzw. britischen Patentschriften 1 181 623 bzw. 1 224 379.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der obenerwähnte Zusatz aus Aminoglukose oder deren glukosidartigen Verbindungen mit Deoxystreptamin dem Kulturmedium vor Beginn der Streptomyces-Kultivierung zugegeben werden oder auch während der Kultivierung in der für gewöhnliche Nährmethoden bekannten Weise. Der geeignete Anteil des im Kulturmedium vorliegenden Zusatzes ist nicht kritisch, kann aber zwischen 0,05 und 1,0 Gewichtsprozent, insbesondere zwischen 0,1 und 0,5 Gewichtsprozent, des Kulturmediums betragen. Es wurde festgestellt, daß die in der Kultur erzeugte und sich anreichernde Menge an 2-Amino-2-deoxy-kanamycin nach Ablauf von 3 bis 7 Tagen nach Beginn der Kultivierung ein Maximum erreicht.

Im Gegensatz zur obenerwähnten Tatsache, daß die gewöhnlichen Stämme von Streptomyces kanamyceticus, die zur derzeit üblichen großtechnischen Herstellung von Kanamycin A dienen, eine höhere Kapazität zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-deoxykanamycin nur dann aufweisen, wenn sie in einem üblichen Kulturmedium in Gegenwart der genannten Aminoglukosen und deren Deoxystreptaminderivaten kultiviert werden, wurde ferner festgestellt, daß einige neue Mutanten von Streptomyces kanamyceticus, die von einem typischen natürlichen Stamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus abstammen, selbst dann eine stärkere Fähigkeit zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin aufweisen, wenn sie in einem üblichen Kulturmedium mit üblichen Kohlehydrat- und Stickstoffquellen und in Abwesenheit der erwähnten Aminoglukosen und deren Deoxystreptaminderivaten unter aeroben Bedingungen kultiviert werden.

Diese neuen Mutanten mit der ihnen eigenen erhöhten Fähigkeit zur Bildung von 2'-Amino-2'-deoxykanamycin wurden durch Behandeln des bekannten natürlichen Stammes 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus mit einem Mutationsmittel, wie Methylbis-(^-chloräthyl)-amin oder Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen und spezielle Auslese der überlebenden Mycele oder Sporen erhalten.

Diese neuen Mutanten mit der ihnen eigenen erhöhten Fähigkeit zur Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxykanamycin schließen vier Mutantenarten mit den Laborbezeichnungen A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 ein. Diese neuen Mutanten haben nur eine geringe oder gar keine Fähigkeit Xylose zu verbrauchen und sind dadurch von dem ursprünglichen Stamm, der eine größere Fähigkeit zur Verwendung von Xylose aufweist, unterscheidbar.

Eine Variation oder Mutanten von Streptomyces kanamyceticus ist zu erwarten, da dies eine allgemeine Eigenschaft der Actinomyceten ist. Wenn daher irgendein bekannter Stamm von Streptomycetices kanamyceticus mit einem bekannten Mutationsmittel, wie Methyl- bis-(/J-chloräthyl)-amin behandelt wird, kann man erwarten, daß neben den obenerwähnten Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 auch andere Mutanten erhalten werden, denen eine erhöhte Fähigkeit zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin eigen ist.

Bei beiden Verfahren kann das Kulturmedium als Kohlenstoffquelle Stärke, Sucrose, Maltose oder Glycerin enthalten und als Stickstoffquelle z. B. Sojabohnenmehl, lösliche Pflanzenproteine, Maisquellwasser, Pepton, Fleischextrakt, Nitrate und Ammoniumsalze. Das Kulturmedium kann gegebenenfalls auch andere geeignete anorganische Salze, wie NaCl, MgSO₄ und solche Mittel enthalten, die das Wachstum von Streptomyces kanamyceticus fördern.

Zur Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin ist die Kultivierung auf einem festen Medium möglich, aber für die großtechnische Herstellung bevorzugt man die Kultivierung in einem flüssigen Medium unter aeroben Bedingungen. Insbesondere bevorzugt man für die großtechnische Herstellung des Antibiotikums die Methode einer stark belüfteten Tauchkultivierung. Es ist auch möglich, mit Schüttelkulturen und belüfteten Kulturen in flüssigen Medien, die gerührt werden, zu arbeiten. Die Kultivierungstemperatur liegt gewöhnlich zwischen 25 und 35° C, insbesondere bei oder um 28° C. Es wurde festgestellt, daß die sich in der Kultur anreichernde Menge an 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin 3 bis 7 Tage nach Beginn der Kultivierung ein Maximum erreicht.

2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin, das sich in der Kultur angereichert hat, kann daraus nach irgendeiner an sich bekannten Methode isoliert werden, z. B. unter Anwendung von Ionenaustauscherharzen, durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und durch Verwendung eines Fällungsmittels, wie sie gewöhnlich zur Einigung der bekannten wasserlöslichen basischen Antibiotika angewandt werden. Bei der großtechnischen Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxykanamycin nimmt man dessen Isolierung bevorzugt nach der Methode der Adsorption an und Eluierung von Ionenaustauschern, vorzugsweise einem Kationenaustauscher vom Carbonsäuretyp, oder nach der Extraktionsmethode mit einem organischen Lösungsmittel, das einen geeigneten Träger, wie p-Toluolsulfonsäure oder Laurinsäure enthält, vor. Beispielsweise läßt sich 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin -isolieren, indem man die Feststoffe, d. h. den Mycelkuchen von der 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin ent-

haltenden Gärbrühe abfiltriert, das Filtrat an einem schwach sauren Methacrylsäure-Divinylbenzol-Mischpolymerisat mit funktioneilen Carbonsäuregruppen adsorbiert, das Ionenaustauscherharz mit wäßrigem Ammoniak eluiert. die aktiven Fraktionen sammelt, einengt und die konzentrierte Fraktion mit einem stark basischen Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisat mit funktioneilen tertiären Amingruppen chromatographisch auftrennt und die aktiven Fraktionen erneut sammelt und einengt. Die konzentrierte Fraktion wird wiederum einer chromatographischen Trennung unterworfen, und zwar durch Adsorption an einem schwach sauren Ionenaustauscher, wie er vorstehend erwähnt wurde, und allmähliches Eluieren mit Wasser/wäßrigen Ammoniak.

Es läßt sich eine Einzelfraktion, die 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin enthält, erhalten. Diese Fraktion wird der Gefriertrocknung unterworfen, das erhaltene Pulver ergibt beim Umkristallisieren aus Wasser/Dimethylformamid kristallines 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin.

2'-Ammo-2'-deoxy-kanamycin kann in Form von farblosen, nadeiförmigen Kristallen mit einem Schmelzpunkt von 183 bis 186⁰C erhalten werden, die basisch und in Wasser, wäßrigem Methanol, .väßrigem Äthanol und wäßrigem Aceton löslich, aber unlöslich in absolutem Methanol, absolutem Äthanol, Äthylacetat, Butylacetat, Äthyläther, Chloroform und Benzol sind, und eine positive Reaktion mit Ninhydrin, Elson-Morgan- und Molisch-Reagens zeigen, aber eine negative Reaktion mit Sakaguchi-, Tollens-, Fehling-, Millon- und Benedict-Reagens. Eine wäßrige l%ige Lösung dieser Substanz zeigt eine spezifische optische Drehung [«]i'° = 118. Ein durch Acetylierung von 2'-Amino-2'-deoxy-kana- :nycin mit Methanol/Essigsäureanhydrid erhaltenes N~Aceivderivat mit der Bruttoformel

Tabelle I

Untersuchte Mikroorganismen

C₁₈H₃₂N₅O₁₀-S(CH₃CO)-H₂

40

schmilzt bei 290 bis 300⁰C unter Zersetzung und zeigt eine spezifische Drehung von [«]o^: = 318'.

Die antibakterielle Aktivität des 2'-Amino-2'-deoxylcanamycins ist wärmestabil. Wenn eine Lösung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin in 6n-Salzsäure durch 40minutiges Erwärmen auf i00⁵C abgebaut wird, beträgt die antibakterielle Aktivität der abgebauten Lösung gegen Bacillus subtilis noch 60 bis 80% der ursprünglichen. Die abgebaute Lösung wird in Form eines Tupfens auf ein 40 χ 40 cm-Toyo-Filterpspier Nr. 50-Blatt aufgebracht und aufsteigend mil einem Lösungsmittel aus Butanol - Essigsäure - Wasser ^;4:2:1) entwickelt. Auf diesem Papierchromatogramm erscheinen zwei Tupfen, die eine positive Reaktion mit Ninhydrin zeigen, wobei einer der Tupfen auch positiv auf ammoniaKaiisches Silbersitrat reagiert.

2-Aniino-2'-deoxy-kanamycin zeigt eine hohe ormjakterieüe Aktivität gegen gramposiüve. gramrega- ::ve und säurebeständige Bakterien sowie mich «esen ^:<o \oichi Bakterien und Stämme, die gegesi Knroiny- v.n f^:, \ma andere bekannte Antibiotika utid Cheriv."»- -.jerapeatir.a re?;sient sind. Oh Toxizriit von j'-AmiEu-y-deoxv-kaivjmycin ist sehr niedrig: der LD₅₀-~A'ert beträgt nur 19Ö mg/kg bei Mäusen (intra- ^!λ5 venös;. Das antibakterielle Spektrum von 2'-Arr-;no-2'-deoxy-kanamycin ist in Tabeii? 1 /usriirorienaestellt."

Aerobacter aerogenes IAM 1102

Alcaligenes faecalis

Bacillus agri

Bacillus subtiiis ATCC o633

Bacillus subtilis PCI 219

Diplococcus pneumoniae Typ 311 D

Escherichia coli IAM 1253

Klebsiella pneumoniac 607

Lactobacillus arabinosus ATCC 8014 ....

Lactobacillus fermenti ATCC 9338

Staphylococcus albus PCI 1200A

Staphylococcus aureus 209 P

Staphylococcus aureus Terashima

Mycobacterium phlei Nr. 56

Mycobacterium phlei S?kiguchi

Mycobacterium 607

Proteus vulgaris

Pseudomonas aerugincsj IAM 1007

Pseudomonas aeruginosa Takasaki

Pseudomonas aeruginosa Masakuro

Salmonella paratyphi .A

Salmonella paratyphi Γ

Salmonella paratyphi C

Sarcina lutea PCI 10υί

Saccharomyces cerevisiae IAM 4626

Shigella flexneri EW 10 2a

Streptococcus faecalis ATCC 8043

Staphylococcus aureus 209 P

(resistent geu.n Streptomycin)

Staphylococcus aureus 209 P

(resistent gegen Erythromycin)

Escherichia coli K-]2 CS-2

Escherichia co!' K-12 CS-2

(rc-istent ee-κιι Anüi"-^;otikai

Mindestkonzen tration für vollständige Hemmung in ag/ml

0,15 0,031 0.078 0,039 0,078 0,31 1,25 0,31 1,56 0,15 0,039 0,31 0,015 0,62 0,31 0,78 7.8 0,1 0,78 0,39 0,62 0,62 1,25 0,31 500 0.039 15,6

0.31 0.31

1.56

In den Zeicirumceii zcisi.i

F i ii. 1 eine fCuvve des L'ltraviolett-Absorptions-.-■nektrums von 2'-A;ii^:iⁱo-2'-deoxy-k:i?)a^tnvcⁱ'.n in Wasser gelöst, bei eiiier Konzentration von ! mg ml Wasser,

E i 2. 2 ^ire Kit^vo <*< Iiifnu'o

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und seiner ständigen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer 21 252 eingereiht worden. Ferner sind Kulturen der Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 von Streptomyces kanamyceticus, die sich zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung verwenden lassen, bei der A.T.C.C. unter den Nummern 21 260, 21 159, 21 261 und 21 268 hinterlegt worden.

Wie schon erwähnt, besitzen die Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 von Streptomyces kanamyceticus nur geringe oder gar keine Fähigkeit zur Verwendung von Xylose, was sie von ihrem Elternstamm 0-4-1, der eine starke Fähigkeit zum Verbrauch von Xylose unterscheidet.

Der Mutantenstamm A-4-6 ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß er auf einer Sucrose-Czapek-Agarplatte, die kein Deoxystreptamin enthält, im Gegensatz zum Elternstamm 0-4-1, nicht wächst. Die Mutante 3AG unterscheidet sich vom Elternstamm ferner dadurch, daß sie auf einer 3-Aminoglukose enthaltenden Czapek-Agarplatte bedeutend größere Kolonien bildet als der Elternstamm 0-4-1. Die Mutanten 18-8 und 19-2 unterscheiden sich vom Elternstamm 0-4-1 ferner dadurch, daß sie wenig oder kein Dulcit verbrauchen. Der Elternstamm weist eine viel höhere Fähigkeit zur Verwendung von Dulcit auf.

Diese Mutanten wurden nach der folgenden Mutations- und Auslesemethode gewonnen. Die Verfahren zur Herstellung jeder dieser Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 sind im folgenden eingehend beschrieben.

Die Mutante A-4-6 wurde durch Behandeln des typischen Stammes 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus wie folgt gewonnen: Der erwähnte Stamm wurde auf die Oberfläche einer geneigten Sucrose-Czapek-Agarplatte geimpft, die dann bei 28° C 7 Tage lang bebrütet wurde. Mit einer der Größe einer Platinöse entsprechenden Menge der entstandenen Kultur wurden 10 ml eines flüssigen Mediums, das 1% Maisquellwasser und 0,25% getrocknete Hefe enthielt • und einen pH-Wert von 7,0 aufwies, in einem 70-ml-Reagensglas geimpft. Eine Schüttelkultur wurde bei 28° C 24 Stunden lang in einem Hin- und Herschüttler mit 350 Perioden pro Minute bei einer Amplitude von 2 cm durchgeführt. Das so erhaltene wachsende Mycel wurde aus der Gärbrühe in 10 Minuten bei einer Beschleunigung vdn 2000 g abzentrifugiert; die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Der Mycelkuchen wurde zweimal mit gleichen Mengen 0,9%iger physiologischer Salzlösung gewaschen. Das nasse Mycel wurde dann in der 0,9%igen physiologischen Salzlösung suspendiert und auf ein Volumen von 5 ml gebracht; dieser Menge wurden 4 ml einer ¹/₄molaren Na₂HPO₄-Lösung und der Mischung 1 ml einer 500 μg/ml Methyl-bis-(ß-chloräthyl)-amin enthaltenden Lösung zugesetzt, dann ließ man das Gemisch 10 Minuten stehen. Anschließend wurde 1 ml der erhaltenen Mischung in 9 ml einer neutralisierten Lösung von 0,2% Glycin und 0,17% NaHCO₃ aufgenommen und die Mischung etwa 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur stehengelassen. Der Mycelkuchen wurde daraus durch Zentrifugieren isoliert, gewaschen und die gesamte Menge des Mycels in 10 ml Maisquellwasser in einem 70-ml-ReagensgJas übergeführt. Eine Schüttelkultur wurde Hann bei 28 - C 24 Stunden lang wie oben beschrieben durchgeführt. Die Kultur wurde zweimal gewaschen, verdünnt und dann zum Impfen einer Sucrose-Czapek-Agarplatte, die zusätzlich 100 μ§/ιη1 Deoxystreptamin enthielt, verwendet. Die Inkubationszeit bei 28° C betrug 10 Tage, in dieser Zeit entwickelten sich Kolonien.

Von jeder der Kolonien wurde etwas Mycel entnommen, welches zum Impfen von 10 ml Maisquellwasser in einem 70-ml-Reagensglas diente. Eine Schüttelkultur wurde wiederum bei 28° C 24 Stunden lang wie oben erwähnt durchgeführt. Die erhaltene Kultur wurde zweimal gewaschen, verdünnt und dann auf eine Sucrose-Czapek-Agarplatte und eine Sucrose-Czapek-Agarplatte, die zusätzlich 100 μg/ml Deoxystreptamin enthielt, geimpft. Die Inkubation erfolgte bei 28⁰C und ergab in 7 Tagen Kolonien. Ein Stamm, der nicht auf der ersten Platte, sondern nur auf der letzteren wuchs, wurde isoliert und als Mutante A-4-6 von Streptomyces kanamyceticus bezeichnet. Diese Mutante, die einen notwendigen Bedarf an Deoxystreptamin zeigte, lag im Verhältnis von etwa einer Kolonie zu 100 gebildeten Kolonien vor.

Die Mutante 3AG wurde durch Behandeln des älteren Stammes 0-4-1 wie folgt hergestellt: Mit einer Kultur des typischen Stammes 0-4-1 wurde die Oberfläche einer geneigten Sucrose-Czapek-Agarplatte beimpft und bei 28° C 7 Tage lang bebrütet. Eine Platinöse voll der erhaltenen Kultur wurde daraus entfernt und in 10 ml eines flüssigen Mediums, das 1% Maisquell wasser und 0,25% getrocknete Hefe enthielt, beim pH-Wert 7 in ein 70-ml-Probierglas übergeführt. Eine Schüttelkultur wurde bei 28° C 24 Stunden in einem Hin- und Herschüttler mit 350 Perioden pro Minute bei einer Amplitude von 2 cm durchgeführt. Die Kultur wurde zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen und dann mit einer Lösung von 50 μg/ml Methyl-bis-(/S-chloräthyl)-amin behandelt. Mit Mycelien des so behandelten Stammes wurde dann ein 3-Aminoglukose-haltiges Czapek-Medium beimpft, das 3% 3-Aminoglukose an Stelle von 3% Sucrose enthielt, und eine Schüttelkultur bei 28° C 24 Stunden wie oben durchgeführt. Aus der Kultur wurden die wachsenden Mycelien durch Zentrifugieren abgetrennt und zur Förderung des Wachsturns in ein Maisquellwassermedium übergeführt. Eine Schüttelkultur wurde abermals bei 28° C 24 Stunden in der beschriebenen Weise durchgeführt. Danach wurde die Kultur gewaschen, die entstandene Suspension homogenisiert, verdünnt und auf eine 3-Aminoglukose-Czapek-Agarplatte geimpft, die anschließend bei 28° C 14 Tage lang zur Bildung von Kolonien bebrütet wurde. Als Ergebnis bildeten sich kleine, mittlere und große Kolonien. Mycelien wurden nur von den großen Kolonien entnommen und auf Maisquellwasser geimpft. Eine Schüttelkultur wurde wiederum bei 28° C 24 Stunden wie oben erwähnt durchgeführt. Nach dem Waschen wurde die Suspension homogenisiert und verdünnt, eine damit geimpfte 3-Aminoglukose-Czapek-Agarplatte wurde bei 28° C 14 Tage lang zur Bildung von Kolonien bebrütet. Als Resultat konnte man einen Stamm, der nur große Kolonien bildete, daraus isolieren, der als Mutante 3AG von Streptomyces kanamyceticus bezeichnet wurde.

Die Mutanten 18-8 und 19-2 wurden durch Behandlung des Elternstammes 0-4-1 folgendermaßen hergestellt: Eine Kultur des Elternstammes 0-4-1 wurde auf die Oberfläche einer geneigten Stärke-

209 548/545

ίο

Czapek-Agarplatte geimpft und bei 28 C 7 i agc lang bebrütet. Eine Platinöse voll der entstandenen Kultur wurde in 1 ml sterilem Wasser suspendiert. Nach dem Aufschlämmen der Suspension wurde sie in eine Stärke-Czapek-Agar enthaltende Schale überführt und dann bei 28^? C 10 Tage bebrütet. Nach dein Bebrüten wurde die Schale unter eine Ultravioku-Lampe (19-W-Sterilisierlampe, hergestellt von der Toshiba Company. Japan) gebracht und dann mit Ultraviolett-Strahlen 10 Minuten lang im Abstand von 30 cm bestrahlt. Nach dieser Mutationsbehandlung wurde das Mycel von der Agarobertliiche abgekratzt und in 10 ml sterilem Wasser suspendiert. Die Suspension wurde homogenisiert und dann auf ein Stärke-Dulcit-Czapek-Agar (ein 0.1% Stärke und 3% Dulcit enthaltendes Czapek-Agar) gebracht und bei 28'C 7 Tage bebrütet. Das Mycel wurde nur von den kleinen Kolonien, die mäßig auf dem Agar gewachsen waren, entfernt. Mit dem Mycel wurden dann geneigte Stärke-Czapek-Agarplatten beimpft und bei 28^C C 7 Tage inkubiert. Auf diesen Stärke-Czapek-Agarplatten zeigten alle Kolonien ein gutes Wachstum. Platinösen große Mengen des Mycels wurden von jeder der Platten entfernt und Duicit-Mineralsalz-Agarplatten (enthaltend 1% Dulcit. 0,264% Ammoniumsulfat. 0,565% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,238% Monokaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Magnesiumsulfat-Heptahydrat. 0,00064% Kupfersulfat-Pentahydrat, 0.00079% Manganchlorid-Tetrahydrat. 0.00011% Eisensulfat-Heptahydrat. 0,00015% Zinksulfat-Heptahydrat und 1.5% Agar. pH-Wert 7,0) damit beimpft. Die Bebrütung bei 28 C innerhalb von 14 Tagen ergab eine vorherrschende Anzahl von Stämmen mit normalem Wachstum und nur zwei Stämme, die nicht merklich wachsen konnten. Diese zwei Stämme, die wohl auf Stärke-Czapek-Agar, aber nicht auf Dulcit-Mineralsalz-Agar wachsen konnten, zeigten die Fälligkeit zur Bildung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin mit erhöhter Ausbeute. Diese Mutanten wurden als 18-8 und 19-2 von Streptomyces kanamyceticus bezeichnet.

Die Mutanten 3AG. A-4-6. 18-8 und 19-2 von Streptomyces kanamyceticus zeigen die folgenden Eigenschaften:

Sie sind einander morphologisch ähnlich, die Luft-Mycelien bilden verhältnismäßig grobe Äste und gewöhnlich keine Spiralen und Wirbel, die Sporen bilden sich an den Enden der Luft-Mycelien und haben gewöhnlich eine ovale oder zylindrische Form mit allgemein 1.0 bis 1,5 Mikron Durchmesser und eine glatte Sporenoberfläche. Sie sind allerdings voneinander unterscheidbar bezüglich ihrer Wachstumsbedingungen auf Nährmedien, ihrer physiologischen Wirkungen und ihrer Fähigkeit, Kohlenstoffquellen zu verwenden, welche Eigenschaften in den Tabellen II. III und IV aufgeführt sind. Ferner sind die Unterschiede zwischen dem typischen Stamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus und seinen Mutanten A-4-6. 3AG, 18-8 und 19-2 bezüglich ihrer Wachstumsbedingungen, physiologischen Wirkungen und Verwendbarkeit von Kohlenstoffquellen in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabellen

Wachstumsbedingungen von Mutanten des Streptomyces kanamyceticus auf verschiedenen Nährmedien (beobachtet nach 14tägiger Bebrütung, Gärtemperatur 28C)

Nährmedium	Beobachtungen	Streptomyces kanamyceticus Mutante A-4-6	Streptomyces kanamyceticus Mutante 3 AG	1 Streptomyces kanamyceticus Mutante 18-8	Streptomyces kanamyceticus Mutante 19-2
Sucrose- Czapek-Agar	Wachstum	feines Wachstum, blaßgelb gefärbt	feines Wachstum, tiefgelb gefärbt	feines Wachstum, tiefgelb gefärbt	feines Wachstum, dunkelgelb gefärbt
	Luft-Mycel	keines	keines	keines	keines
	lösliches Pigment	blaßgelb	blaßgelb	gelb	blaßgelb
	Rückseite	schwach gräulichgelb gefärbt	gräulichgelb gefärbt
Glycerin-Agar	Wachstum	sehr schwaches farbloses Wachstum	feines Wachstum, gelblichgrau gefärbt	feines Wachstum, gelblichgrau gefärbt	feines Wachstum, hellbraun gefärbt
	Luft-Mycel	keines	keines	keines	stark olivgrau gefärbt
	lösliches Pigment	keines	keines	keines	schwach gelblichbraun gefärbt
	Rückseite	—	schwachgrau gefärbt	schwachgrau gelb gefärbt	gelblichbraun gefärbt

Fortsetzung

Nährmedium	Beobachtungen	Streptomyces kanamyceticus Mutante A-4-6	Streptomyces kanamyceticus Mutante 3 AG	Streptomyces kanamyceticus Mutante 18-8	Streptomyces kanamyceticus Mutante 19-2
Glucose- Asparagin-Agar (Krainsky)	Wachstum	gelblichbraun bis tiefgelb gefärbt	tiefgelblich- braun bis braun gefärbt	leuchtend tiefgelb gefärbt	gelb gefärbt
	Luft-Mycel	keines	keines	schwachgelb gefärbt	keines
	lösliches Pigment	keines	keines	keines	keines
	Rückseite	schwachgrau gefärbt	schwachbraun gefärbt	—	—
Glucose- Asparagin-Agar (Uschinsky)	Wachstum	tiefgelb bis gelb gefärbt	tiefgelb bis gelb gefärbt	tiefgelb gefärbt	tiefgelb gefärbt
	Luft-Mycel	keines	keines	keines	keines
	lösliches Pigment	keines	keines	keines	keines
	Rückseite	gelb bis schwachgelb gefärbt	gelb bis schwachgelb gefärbt
Calciummalat- Agar	Wachstum	schwachgelb bis gelb gefärbt	weiß bis schwachgelb gefärbt	weiß bis sehr schwachgelb gefärbt	weiß bis sehr schwachgelb gefärbt
	Luft-Mycel	keines	keines	keines	keines
	lösliches Pigment	schwachgelb gefärbt	keines	keines	keines
	Rückseite	—	weiß gefärbt	weiß gefärbt	—
Glycerin- calciummalat- Agar	Wachstum	gelblichbraun braun gefärbt	braun bis gelblichbraun gefärbt	gutes Wachstum, gelb gefärbt	gutes Wachstum, gelb gefärbt
	Luft-Mycel	keines	keines	keines	keines
	lösliches Pigment	gelb	gelb	gelb	blaßgelb
	Rückseite	blaßgelb gefärbt	braun gefärbt	—	—
Bouillon-Agar	Wachstum	farblos bis graugelb gefärbt	farblos bis graugelb gefärbt	farblos bis graugelb gefärbt	farblos bis graugelb gefärbt
	Luft-Mycel	keines	keines	keines	keines
	lösliches Pigment	keines	keines	keines	keines
Glucose- Nährstoff- Agar	Wachstum	feines runzeliges Wachstum, weißlich schwachgelb gefärbt	feines runzeliges Wachstum, weißlich schwachgelb gefärbt	feines runzeliges Wachstum, weißlich schwachgelb gefärbt	feines runzeliges Wachstum, weißlich schwachgelb gefärbt
	Luft-Mycel	keines	keines	keines	keines
	lösliches Pigment	keines	keines	keines	keines

Fortsetzung

14

Nährmedium

Stärke-

Ammoniumsulfat-

Agar

Beobachtungen

Kartoffelpfropf

Karottenpfropf

Loefflers-Blutserum

Ei'

Magermilch

Wachstum

Luft-Mycel

lösliches Pigment

Rückseife Wachstum

Streptomyces kanamyceticus Mutante A-4-6

Streptomyces
kanamyceticus
Mutante 3 AG

Streptomyces kanamyceticus Mutante 18-8

Streptomyces kanamyceticus Mutante 19-2

Luft-Mycel

lösliches Pigment

Wachstum

Luft-Mycel

lösliches Pigment

Wachstum bei 37° C

Wachstum

Luft-Mycel

lösliches Pigment

Wachstum bei 37° C

Wachstum

Luft-Mycel

lösliches Pigment

Wachstum

Luft-Mycel

lösliches Pigment

gelb bis gelblichbraun gefärbt .

keines
keines

erhabenes gutes

Wachstum, ockerfarbig

weiß gefärbt keines !

runzeliges Wachstum, schwächer als auf dem Kartoffelpfropf, körnige Oberfläche

keines keines

kein
Wachstum

grau bis creme

gefärbtes

Wachstum

keines keines

gleich wie bei 28° C

runzeliges Wachstum, gelb gefärbt

keines keines

kein
Wachstum

gelb bis

gelblichbraun

gefärbt

keines
keines

runzeliges

Wachstum.

kernige

Oberfläche.

schwaeh-

sjelblichbraun

gefärbt

schwachweiß
gefärbt

keines

runzeliges
Wachstum,
schwächer als
auf dem
Kartoffelpfropf,
körnige
Oberfläche

keines
keines

kein
Wachstum

grau bis creme

gefärbtes

Wachstum

keines
keines

gleich wie
bei 28° C

runzeliges
Wachstum,
gelb gefärbt

keines
keines

kein
Wachstum

schwachgelb bis gelb gefärbt

keines keines

schwachgelb gefärbt

runzeliges Wachstum, kernige Oberfläche, schwachgelblichbraun gefärbt

schwachweiß gefärbt

keines

runzeliges Wachstum, schwächer als aufdem Kartoffelpfropf, körnige Oberfläche

schwachweiß gefärbt

keines

grau bis creme

gefärbtes

Wachstum

keines keines

gleich wie bei 28 C

runzeliges Wachstum, gelb gefärbt

keines keines

R in s~ wachstum

keines keines

schwachgelb bis gelb gefärbt

keines keines

schwachgelb gefärbt

runzeliges Wachstum, kernige Oberfläche, schwachgelblichbraun gefärbt

keines keines

schwaches Wachstum

keines

keines

grau bis creme

gefärbtes

Wachstum

keines keines

runzeliges Wachstum, gelb gefärbt

keines keines

Ringwachstum

keines keines

16

TabeIleIII

Physiologische Wirkung der Mutante von Streptomyces kanamyceticus (beobachtet nach Mtägiger Bebrütungszeit bei 28°C)

Physiologische Wirkungen	Streptomyces kanamyceticus Mutante A-4-6	Streptomyces kanamyceticus Mutante 3 AG	Streptomyces kanamyceticus Mutante 18-8	Streptomyces kanamyceticus Mutante 19-2
Nitratreduktion	positiv	positiv	positiv	positiv
Stärkehydrolyse	positiv	positiv	positiv	positiv
Schwefelwasserstoffbildung	negativ	negativ	negativ	negativ
Tyrosinasebildung	negativ	negativ	negativ	negativ
Gelatineverfiüssigung bei 15° C während 14 Tagen	stark verflüssigt	verflüssigt	verflüssigt	verflüssigt
Verflüssigung von Loefflers Blut serum bei 28°C und 37°C innerhalb von 14 Tagen	keine beobachtet	keine beobachtet	keine beobachtet	keine beobachtet
Magermilchmedium	keine Koagulierung, rasche Petonisierung	keine Koagulierung, rasche Petonisierung	keine Koagulierung, langsame Petonisierung	keine Koagulierung, langsame Petonisierung

Tabelle IV
Unterschiede zwischen dem typischen Stamm 0-4-1 und den Mutanten von Streptomyces kanamyceticus

	Streptomyces	Streptomyces	Streptomyces	Streptomyces	Streptomyces
Beobachtungen	kanamyceticus	kanamyceticus	kanamyceticus	kanamyceticus	kanamyceticus
	Stamm 0-4-1	Mutante A-4-6	Mutante 3 AG	Mutante 18-8	Mutante 19-2
Wachstum auf
Sucrose-	***	*	**
Czapek-
Agarplatte
Deoxystrept-	*	*	*	*
amin-Czapek-
Agarplatte
3-Amino-	*	—	***	*
glucose-
Czapek-
Agarplatte
Dulcit-Czapek-	***	***	**	*	♦II
Agarplatte
Kartoffelpfropf	runzeliges	erhabenes	runzeliges	runzeliges	runzeliges
	Wachstum,	gutes	Wachstum,	Wachstum,	Wachstum,
	körnige	Wachstum,	körnige	körnige	körnige
	Oberfläche,	ockerfarbig	Oberfläche,	Oberfläche,	Oberfläche,
	leicht braun		schwach	schwach	schwach
	gefärbt		gelbbraun	gelbbraun	gelbbraun
			gefärbt	gefärbt	gefärbt
Physiologische
Wirkung
Gelatine	+	+ +	+	+	+
verflüssigung
Magermilch	langsame	rasche	rasche	langsame	langsame
medium	Peptonisierung	Peptonisierung	Peptonisierung	Peptonisierung	Peptonisierung
Verwendbarkeit
von Kohlenstoff
quellen
Sucrose	+ + +	±	+ +	+	+
Xylose	+ +	—	—	±	±
Natriumacetat	+ +	-	±	+ + +	+

Fortsetzung

	Streptomyces	Streptomyces	Streptomyces	Streptomyces	Streptomyces
Beobachtungen	kanamyceticus	kanamyceticus	kanamyceticus	kanamyceticus	kanamyceticus
	Stamm 0-4-1	Mutante A-4-6	Mutante 3 AG	Mutante 18-8	Mutante 19-2
Verwendbarkeit
von Kohlenstoff
quellen
Natriumeitrat	+ + +	+	+ +	+
Natrium-	+	±	+ +	+	+
succinat
Dulcit	+ + +	+ +	+ + +	±	±

Die Antibiotika NK-1001 und N K-1003. die als Zusatz beim erfindungsgemäßen Verfahren dienen können, sind neue antibiotische Substanzen und lassen sich durch Züchten eines Stammes von Streptomyces kanamyceticus in einem Nährmedium herstellen, das einen besonderen Zusatz enthält.

Das Antibiotikum NK-1001 ist eine solche neue antibiotische Substanz, die das Wachstum grampositiver und gramnegativer Bakterien, wie Bacillus subtilis, Lactobacillus fermenti und Shigella dysenteriae wirksam hemmt, basisch und löslich ist in Wasser, wäßrigem Methanol, wäßrigem Äthanol, aber unlöslich in absolutem Methanol, absolutem Äthanol. Äthylacetat, Butylacetat und Benzol, die eine positive Reaktion mit Ninhydrin, Elson-Morgan- und Molisch-Reagens, aber eine negative Reaktion mit Sakaguchi-, Tollens-, Fehling-, Millon- und Benedict-Reagenzien zeigt, die die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff, aber keinen Schwefel, Halogene und Asche enthält, die Bruttoformel

C₁₈H₃₅N₃O₁₂ · H₂O

aufweist und farblose nadeiförmige Kristalle bildet, die sich bei 238 bis 242° C zersetzen, in l%iger wäßriger Lösung eine spezifische Drehung [«] I' = +132^: zeigt, keine Absorption im Ultraviolett-Licht von 220 bis 340 Millimikron zeigt, wie in Fig. 3, und charakteristische Absorptionsbanden, wie in Fig. 4, im Infrarot-Gebiet des Spektrums in Paraffinöl aufweist. Wenn man das Antibiotikum NK-1001 durch Erwärmen in 6n-Salzsäure auf 100⁰C innerhalb von 40 Minuten hydrolysiert, verliert es seine antibakterielle Aktivität. Die entstandene hydrolysierte Lösung wird in Form eines Tupfens auf ein Blatt (40 χ 2 cm) Toyo-Filterpapier Nr. 50 aufgebracht und dann fallend mit einem Lösungsgemisch von Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:1:3) entwickelt. Auf dem so erhaltenen Papierchromatogramm haben sich drei Tupfen gebildet, nämlich einer, der mit Ninhydrin und ammoniakalischem Silbernitrat, ein anderer, der nur mit Ninhydrin, und ein weiterer, der mit ammoniakalischem Silbernitrat positiv reagiert. Verglichen mit bekannten Proben wurde festgestellt, daß diese drei Tupfen Deoxystreptamin bzw. 6-Amino-6-deoxy-D-glucose, bzw. D-Glucose, entsprechen. Angesichts dieser Tatsache und des für das Antibiotikum NK-1001 bestimmten Molekulargewichts hält man es für wahrscheinlich, daß das Antibiotikum NK-1001 eine neue Verbindung ist, die aus einem Molekül Deoxystreptamin, einem Molekül 6-Amino-6-deoxy-D-glukose und einem Molekül D-Glukose besteht. Antibiotikum NK-1001 ist praktisch uhgiftig, da seine LD₅₀ 3050 mg/kg bei intravenöser Injektion an Mäusen beträgt.

Die Herstellung von Antibiotikum NK-1001 kann durch Züchten des obenerwähnten typischen Stammes 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium erfolgen, das Kohlehydrate und eine stickstoffhaltige Nährstoffquelle sowie eine Menge Streptidin enthält, bis sich das Antibiotikum NK-1001 in der Kultur anreichert und daraus isoliert werden kann. Die Methode zur Durchführung der fermentativen Herstellung von Antibiotikum NK-1001 wie auch die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen dafür können die gleichen sein wie die zur Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxykanamycin früher erwähnten. Demnach ist die Anwendung der Schüttelkultur und der Tankkultur möglich. Die Kulturtemperatur kann zwischen 25 und 35 C. insbesondere um 28 C liegen. Die dem Nährmedium zugegebene Streptidinmenge ist nicht kritisch, aber wirtschaftlich sind 0,05 bis 1.0 Gewichtsprozent, insbesondere 0,1 bis 0,5 Gewichtsprozent, bezogen auf das Medium. Streptidin kann sowohl zu Beginn als auch während der Kultur zugegeben werden.

Die Isolierung und Reinigung des Antibiotikums NK-1001 läßt sich in ähnlicher Weise wie für 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin erwähnt durchführen.

Das Antibiotikum NK-1003. das wie das Antibiotikum NK-KX)I als Zusatz dienen kann, ist ebenfalls eine neue antibiotische Substanz, die eine brauchbare antibakterielle Aktivität gegen grampositive, gramnegative und säurebeständige Bakterien, wie Bacillus subtilis. Lactobacillus fermenti und Shigella dysenteriae zeigt. Das Antibiotikum NK-1003 ist eine antibiotische Substanz, die das Wachstum von grampositiven, gramnegativen und säurebeständigen Bakterien wirksam hemmt, basisch und löslich ist in Wasser, wäßrigem Methanol, wäßrigem Äthanol, aber unlöslich in absolutem Methanol, absolutem Äthanol, Äthylacetat, Butylacetat und Benzol, mit Ninhydrin, Elson-Morgan- und Molisch-Reagenzien positiv, aber mit Sakaguchi-, Tollens-. Fehling-, Millon- und Benedict-Reagenzien negativ reagiert, die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff, aber keinen Schwefel, Halogen und Asche enthält, die Bruttoformel C₁₂H₂₅N₃O₇ besitzt und farbloses nadeiförmige Kristalle bildet, die sich bei 202 bis 205"^JC zersetzen, in wäßriger l%iger Lösung eine spezifische Drehung [«]a' = +95 zeigt, keine Absorption von Ultraviolett-Licht von 220 bis 340 Millimikron, wie in Fig. 5. aber charakteristische Absorptionsbanden im Infrarotabsorptionsspektrum in Paraffinöl, wie in F i g. 6. aufweist. Wird Antibiotikum NK-1003 durch Erwärmen in 6n-SaIzsäure auf 100 C innerhalb von 40 Minuten hydrolysiert, so verliert es seine antibakterielle Aktivität. Die entstandene Hydrolyselösung wird in Form eines Tupfens auf ein Blatt (40 χ 2 cm) Toyo-Filterpapier Nr. 50 aufgebracht und dann absteigend mit einem Lösungsmittelgemisch von Butanol-Pvridin-Essig-

säure-Wasser (6:4:1:3) entwickelt. Das erhaltene Papierchromatogramm weist zwei Tupfen auf, die mit Ninhydrin positiv reagieren, wobei der eine auch auf ammoniakalisches Silbernitrat positiv reagiert. Durch Vergleich mit bekannten Proben hat man festgestellt, daß diese zwei Tupfen Deoxystreptamin, bzw. 6-D-Glukosamin, entsprechen. Angesichts dieser Tatsache und des ermittelten Molekulargewichtes scheint das Antibiotikum NK-1003 eine Verbindung zu sein, die aus einem Molekül m Deoxystreptamin und einem Molekül 6-D-Glukosamin besteht. Das Antibiotikum NK-1003 ist praktisch ungiftig, da seine LD₅₀ 1550 mg/kg beträgt, bei intravenöser Injektion an Mäusen.

Das Antibiotikum NK-1003 läßt sich durch Züchten eines Stammes von Streptomyces kanamyceticus in einem Nährmedium, das Kohlehydrate und eine stickstoffhaltige Nährstoffquelle sowie eine Menge Antibiotikum NK-1001 enthält, unter aeroben Bedingungen herstellen, bis sich Antibiotikum NK-1003 in der Kultur anreichert und daraus isoliert werden kann. Die Methode zur Durchführung der fermentativen Herstellung von Antibiotikum NK-1003, wie auch die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen dafür, sind gleich denen zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin. Man bevorzugt die Anwendung der belüfteten Tieftankkultur. Die Kulturtemperatur liegt gewöhnlich bei 25 bis 30⁰C, insbesondere bei oder um 28° C. Die dem Nährmedium zugesetzte Menge Antibiotikum NK-1001 ist unkritisch, kann aber 0,05 bis 1,0 Gewichtsprozent, vorzugsweise von 0,1 bis 0,5 Gewichtsprozent, bezogen auf das Medium, betragen. Das Antibiotikum NK-1001 kann entweder zu Beginn oder während der Kultur zugesetzt werden.

Die Isolierung und Reinigung von Antibiotikum NK-1003 läßt sich in ähnlicher Weise wie Tür 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin beschrieben durchführen.

In den Zeichnungen zeigt

F i g. 3 eine Kurve des Ultraviolett-Absorptionsspektrums von Antibiotikum NK-1001, gelöst in Wasser, bei einer Konzentration von 1 mg/ml Wasser,

F i g. 4 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums von Antibiotikum NK-1001 in Paraffinöl,

F i g. 5 eine Kurve des Ultraviolett-Absorptionsspektrums von Antibiotikum NK-1003, gelöst in Wasser, bei einer Konzentration von 1 mg/ml Wasser, und

F i g. 6 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums von Antibiotikum NK-1003 in Paraffinöl.

Die antibakteriellen Spektren der Antibiotika NK-1001 und NK-1003, die als Zusatz beim erfindungsgemäßen Verfahren dienen können, sind in Tabelle V zusammengestellt.

	Mindestkonzentration	Anti	g/nu	Anti
	für vollständige Hemmung	biotikum	biotikum
Untersuchter Mikroorganismus	in μ	NK-1001	NK-1003
	über	über
	500	500
Candida albicans	500	250
	125	125
Diplococcus pneumoniae	31,2	31,2
Typ 31ID
Escherichia coli IAM 1253	39	3,9
Klebsiella pneumoniae 607
Lactobacillus fermenti	15,6	7,8
ATCC 9338	62,5	62,5
Staphylococcus albus
PCI 1200A	6,25	3,125
Staphylococcus aureus 209 P	15,6	25
Staphylococcus aureus	62,5	50
Terashima	62,5	62,5
Mycobacterium phlei MS ..	500	250
Mycobacterium 607
Salmonella paratyphi A ....	über	über
Sarcina Iutea PCI 1001	500	500
Saccharomyces cerevisiae	6,25	3,125
IAM 4626
	500	500
Shigella flexneri EW 10 2 a
Streptococcus haemolyticus
D-90

Tabelle V

	Mindestkonzentration	Anti	>/mi	Anti
	für vollständige Hemmung	biotikum	biotikum
Untersuchter Mikroorganismus	in μ{	NK-1001	NK-1003
	31,2	15,6
		3,9
Aerobacter aerogenes	7,8	2,0
IAM 1102	6,25	3,125
Alcaligenes faecalis
Bacillus aiiri
Bacillus subtilis ATCC 6633

55

60 Das erfindungsgemäße Verfahren wird in den Beispielen 1 bis 7 erläutert.

Beispiel 1

151 eines flüssigen Nährmediums, das 3,0 Gewichtsprozent Stärke, 2,0 Gewichtsprozent Maltose, 2,5 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl, 1,2 Gewichtsprozent Natriumnitrat und 0,5 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthielt, wurde mit dem typischen Stamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus beimpft und bei 28⁰C unter Belüftung und Rühren bebrütet. Nach 22 Stunden wurden dem Nährmedium 50 g 3-Aminoglukose zugefügt; danach wurde die Bebrütung fortgesetzt. Die in der Kultur erzeugte Menge 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin erreichte ein Maximum nach 150 Stunden. Die Flüssigkultur wurde dann filtriert und das Filtrat mit 4 1 eines schwach sauren Methacrylsäure - Divinylbenzol - Mischpolymerisats mit funktionellen Carbonsäuregruppen behandelt. Die am Harz adsorbierten Antibiotika wurden danach mit 0,5-n wäßrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und zu einem Sirup konzentriert. Der Sirup wurde in 500 ml Wasser gelöst und die Lösung durch Behandeln mit 6 g Aktivkohle entfärbt. Zur Entfernung der Aktivkohle filtrierte man die Lösung und chromatographierte das Filtrat mit 600 ml eines stark basischen Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisats mit funktionellen tertiären Amingruppen. Die das 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin enthaltenden Fraktionen wurden zuerst eluiert vor der Abtrennung von Kanamycin A. Die an 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin hochkonzen-

trierten Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert und ergaben gefriergetrocknet 2,2 g rohes Pulver von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin. Diese Rohsubstanz (2,2 g) wurde in 50 ml Wasser gelöst und die Lösung mit einem schwach sauren Ionenaustauscher, wie er vorstehend erwähnt wurde, behandelt. Das Harz wurde mit 0,1-n bis 0,5-n wäßrigem Ammoniak chromatographisch eluiert und das als Nebenprodukt in geringer Menge vorhandene Kanamycin A zuerst eluiert. 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin wurde danach getrennt als Einzelfraktion eluiert, konzentriert und zu einem rohen Pulver gefriergetrocknet. Durch Umkristallisieren des Pulvers aus Wasser-Dimethylformamid erhielt man 1,1 g 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin in Form von farblosen nadelartigen Kristallen. Eine Elementaranalyse des Produktes ergab 42,62% C, 7,52% H und 12,30% N (gefunden). Das Molekulargewicht des Produktes wurde mit 435 bestimmt.

Beispiel 2

15 1 eines flüssigen Nährmediums mit der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 1 wurden mit demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus wie im Beispiel 1 beimpft und dann bei 28° C unter Belüftung und Rühren bebrütet. Nach 22stündiger Bebrütung fügte man dem Nährmedium 50 g 6-Aminoglukose zu und setzte dann die Bebrütung fort. Die sich in der Kultur anreichernde Menge an 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin erreichte ein Maximum nach 145 Stunden Bebrütungszeit.

Die Gärflüssigkeit wurde dann in gleicher Weise behandelt und das Rohprodukt gereinigt wie im Beispiel 1 und ergab 1,0 g 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin in Kristallform.

Beispiel 3

15 1 eines flüssigen Nährmediums, das 3,0 Gewichtsprozent Stärke, 2,5 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl, 1,2 Gewichtsprozent Natriumnitrat und 0,35 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthielt, wurde mit demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus wie im Beispiel 1 beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28° C bebrütet. Nach 20stündiger Bebrütung wurden 30 g Antibiotikum NK-1001 dem Nährmedium zugefügt und die Bebrütung fortgesetzt. Die Bildung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin erreichte ein Maximum nach 140stündiger Bebrütung.

Die Gärflüssigkeit wurde dann aufgearbeitet und das erhaltene Rohprodukt wie im Beispiel 1 gereinigt, wonach man 2,5 g kristallines 2'-Amino-2'-deoxykanamycin erhielt.

Beispiel 4

15 1 eines flüssigen Nährmediums derselben Zusammensetzung wie im Beispiel 3 wurden mit demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus wie im Beispiel 1 beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28° C bebrütet. Nach 20stündiger Bebrütung fügte man dem Nährmedium 30 g Antibiotikum NK-1003 zu und setzte die Bebrütung fort. Die sich in der Kultur anreichernde Menge 2'-Amino-2'-deoxykanamycin erreichte ihr Maximum nach 140stündiger Inkubation.

Die Gärflüssigkeit wurde dann aufgearbeitet und das erhaltene Rohprodukt wie im Beispiel 1 gereinigt; die Ausbeute an kristallinem 2'-Amino-2'-deoxykanamycin betrug 1,5 g.

Beispiel 5

151 eines flüssigen Nährmediums derselben Zusammensetzung wie im Beispiel 3 wurden mit demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus wie im Beispiel 1 beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28 C bebrütet. Nach 20stündiger Bebrütung wurden dem Nährmedium 45 g Neamin zugeführt und das Bebrüten fortgesetzt. Die sich in der Kultur anreichernde 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin-Menge erreichte ein Maximum nach 140 Stunden.

Die Kulturbrühe wurde dann aufgearbeitet. Das erhaltene Rohprodukt wurde wie im Beispiel 1 gereinigt; es wurde eine Ausbeute von 1,2 g kristallinem 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin erzielt.

Beispiel 6

15 1 eines flüssigen Nährmediums, das 3,0 Gewichtsprozent Stärke, 2,5 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl, 1,2 Gewichtsprozent Natriumnitrat und 0.35 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthielt, wurden sterilisiert, gekühlt und mit einer sterilisierten und gekühlten Lösung von 30 g Antibiotikum NK-1001 in Wasser vermischt. Die erhaltene Mischung wurde mit demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus wie im Beispiel 1 beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28° C bebrütet. Die sich in der Kultur anreichernde Menge 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin erreichte ihr Maximum nach 140 Stunden.

Die Kulturbrühe wurde dann aufgearbeitet und das erhaltene Rohprodukt wie im Beispiel 1 gereinigt; man erzielte eine Ausbeute von etwa 2,2 g kristallinem 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin mit einem Schmelzpunkt von 183 bis 186° C.

Beispiel 7

Eine Kultivierung von Streptomyces kanamyceticus wurde in Gegenwart von Antibiotikum NK-1001 wie im Beispiel 3 durchgeführt. Die erhaltene Kulturflüssigkeit wurde filtriert und das Filtrat (141) mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 10 eingestellt. Das Filtrat wurde dann mit einem Viertel seines Volumens an n-Butanol, das 2 g Benzaldehyd pro Gramm im Filtrat vorhandener, wasserlöslicher, basischer Antibiotika enthielt, extrahiert. Der n-Butanol-Extrakt wurde abgetrennt und mit einem Zehntel seines Volumens an Wasser vermischt. Nach dem Einstellen des pH-Wertes mit Schwefelsäure auf 2,0 und Rühren des erhaltenen Gemisches gingen die wasserlöslichen basischen Antibiotika in die wäßrige Phase über. Die anfallende wäßrige Lösung der Antibiotika wurde mit Aktivkohle entfärbt und mit einem stark basischen Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisat mit funktionellen tertiären Amingruppen und einem schwach sauren Ionenaustauscher, wie er vorstehend erwähnt wurde, wie im Beispiel 1 Chromatographien. Durch Umkristallisieren des Rohproduktes aus Wasser und Dimethylformamid erhielt man 1,1g 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin als farblose nadelartige Kristalle.

Vergleichsbeispiel

In diesem Beispiel wurde eine Anzahl Versuche durchgeführt, um die unerwartete und vorteilhafte &5 Wirkung des Zusatzes von Aminoglukosen und deren Deoxystreptaminverbindungen zur Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu zeigen.

In diesen Versuchen führte man die Kultur des typischen Stammes 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus bei 28° C innerhalb von 150 Stunden wie im Beispiel 1 mit den gleichen Gärungsbehältern und Kulturmedien gleicher Zusammensetzung durch. Nach verschiedenen, seit Beginn der Kultur verflossenen, unten aufgeführten Zeitspannen wurden verschiedene nachstehend erwähnte Aminoglukosen und deren Deoxystreptaminverbindungen dem Kulturmedium zugesetzt. Nach 150stündiger Bebrütung wurden die Kulturbrühen wie im Beispiel 1 behandelt, so daß sich so viel als möglich 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin und Kanamycin A isolieren ließen. Die Produktausbeuten und Einzelheiten der Versuche sind in Tabelle VI zusammengestellt.

Tabelle VI

	Zusatzmittel	Zusatzmenge	Zeitspanne	Gehalt an	Ausbeute von	Gehalt an	Ausbeute von
		(g)	bis zum Zusatz	2'-Amino-	2'-Amino-	Kanamy cin A	Kanamy cin A
Versuch Nr.	kein Zusatz		(Std.)	2-deoxy- kanamycin	2'-deoxy- kanamycin	fcg/ml)	(g)
	3-Aminoglukose	50		(Kg/ml)	(g)	2790	26,8
1	6-Aminoglukose	50	22	26	0,12	1480	12,7
"2	Antibiotikum NK-1001	30	22	260	1,10	1730	15,2
3	Antibiotikum NK-1001	30	20	225	1,00	1240	11,2
4	Antibiotikum NK-1003	30	0	575	2,50	1450	13,6
5	Neamin	45	20	480	2,20	. 1700	16,0
6			20	345	1,50	1390	12,8
7		260	1,20

Wie aus den Resultaten in Tabelle V ersichtlich ist, bringt der Zusatz von Aminoglukosen und deren Deoxystreptaminverbindungen zum Kulturmedium eine merkliche Steigerung der Ausbeute an 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin.

Die folgenden Beispiele 8 bis 11 sollen weitere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erläutern.

Beispiel 8

151 eines flüssigen Kulturmediums, das 3,0 Gewichtsprozent Maltose, 2,0 Gewichtsprozent Stärke, 3,0 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl, 1,0 Gewichtsprozent Natriumnitrat und 0,5 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthielt, wurden mit der Mutante A-4-6 von Streptomyces kanamyceticus beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28° C bebrütet. Die sich in der Kultur anreichernde Menge an 2'-Amino-2'-deoxykanamycin erreichte nach 6tägiger Bebrütung ihr Maximum.

Die filtrierte Kulturbrühe ergab 141 Filtrat, das mit 41 eines schwach sauren Methacrylsäure-Divinylbenzol-Mischpolymerisats mit funktioneilen Carbonsäuregruppen behandelt wurde. Das Harz wurde anschließend mit 0,5-n wäßrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und zu einem Sirup konzentriert, den man in 500 ml Wasser löste. Die Lösung wurde durch Behandeln mit 6 g Aktivkohle entfärbt, diese abfiltriert und das Filtrat einer chromatographischen Eluierung mit 600 ml eines stark basischen Styrol-pivinylbenzol-Mischpolymerisats mit funktionellen tertiären Amingruppen unterworfen. 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin wurde vor dem Abtrennen von Kanamycin A eluiert. Die an 2' -Amino -T- deoxy - kanamycin hochkonzentrierten Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und zu 3,2 g Produkt gefriergetrocknet. Das Rohprodukt wurde in 50 ml Wasser gelöst und die Lösung mit einem schwach sauren Ionenaustauscher, wie er vorstehend erwähnt wurde, zur Adsorption der Anti

biotika behandelt. Das Harz wurde wieder mit 0,1 - bis 0,5-n wäßrigem Ammoniak chromatographisch eluiert. Das als Nebenprodukt in geringer Menge vorhandene Kanamycin A wurde zuerst eluiert und dann das 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin separat als Einzelfraktion. Diese Einzelfraktion wurde konzentriert und zu rohem 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin gefriergetrocknet. Durch Umkristallisieren aus Wasser-Dimethylformamid erhielt man 1,9 g 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin in Form von farblosen, nadelartigen Kristallen.

Beispiel 9

151 flüssiges Kulturmedium gleicher Zusammensetzung wie im Beispiel 9 wurden mit der Mutante 3 AG von Streptomyces kanamyceticus beimpft und dann unter Belüftung und Rühren bei 28° C bebrütet. Die sich in der Kultur anreichernde Menge an 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin erreichte ihr Maximum nach 6tägiger Bebrütung.

Die Kulturflüssigkeit wurde dann wie im Beispiel 9 behandelt und ergab 1,2 g kristallines 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin.

Beispiel 10

151 eines flüssigen Kulturmediums gleicher Zusammensetzung wie im Beispiel 9 wurden mit der Mutante 18-8 von Streptomyces kanamyceticus beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28⁰C bebrütet. Die sich in der Kultur anreichernde Menge an 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin erreichte ihr Maximum nach 7tägiger Bebrütung.

Die Kulturflüssigkeit wurde dann wie im Beispiel 9 behandelt und gab etwa Iß. g kristallines 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin.

Beispielll

Das Verfahren nach Beispiel 9 wurde wiederholt unter Verwendung der Mutante 19-2 von Streptomyces kanamyceticus. Man erhielt ein ähnliches Resultat

209 548/545

wie im Beispiel 9. Ausbeute: 3,15 g kristallines 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin.

Vergleichsbeispiel

In diesem Beispiel wurden eine Anzahl Versuche durchgeführt, um die unerwartete und vorteilhafte Wirkung bei Verwendung der Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 aufzuzeigen, die eine erhöhte Fähigkeit to zur Bildung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufweisen, verglichen mit dem Elternstamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus.

In diesen Versuchen wurden die Kulturen des Elternstammes 0-4-1 und der Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 von Streptomyces kanamyceticus während 150 Stunden bei 28° C, wie im Beispiel 9. unter Verwendung ähnlicher Fermentationsbehälter und Kulturmedien gleicher Zusammensetzung behandelt. Nach Beendigung der Züchtung wurden die erhaltenen Kulturbrühen auf ihren Gehalt an 2'-Amino-2'-deoxykanamycin und Kanamycin A untersucht. Die Untersuchungsresultate sind in Tabelle VII zusammengestellt.

Tabelle VII

	Stamm	Gehalt an	Gehalt an
Versuch		2'-Amino-	Kanamycin A
Nr.		2'-deoxy-
	Elternstamm	kanamycin	(■.ig, ml)
	0-4-1	(ag/ml)
1	Mutante A-4-6		2790
	Mutante 3AG	26	1970
2	430	1785
3	285

	Stamm	Gehalt an	Gehalt an
Versuch		2'-Amino-	Kanamycin A
Nr.		2'-deoxy-
	Mutante 18-8	kanamycin	(ag ml)
	Mutante 19-2	(ug/ml)	1900
4	520	1690
5	700

Je 151 der erhaltenen Kulturbrühen wurden wie im Beispiel 8 behandelt, so daß sich so viel 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin und Kanamycin A als möglich daraus isolieren ließ. Die Produktausbeuten sind in Tabelle VIII zusammengestellt.

Tabelle VIII

	Stamm	Ausbeute von	Ausbeute von
Versuch		2-Amino-	Kanamycin A
Nr.		2-deoxy-
	Elternstamm	kanamycin	Ig)
	0-4-1	(gl
1	Mutante A-4-6		26.8
	Mutante 3AG	0,12	19.0
1	Mutante 18-8	1,90	15.8
3	Mutante 19-2	1,20	17.6
4	2,20	16.1
5	3,15

Aus dem in Tabelle VIII zusammengestellten Resultat ist klar ersichtlich, daß den Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und' 19-2 die Fähigkeit eigen ist, 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin in merklich höherer Ausbeute zu erzeugen als der typische Elternstamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur mikrobiologischen Hersteilung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin durch Züchten des Stammes von Streptomyces kanamyceticus ATCC 21252 unter aeroben Bedingungen in einem üblichen Kulturmedium, welches eine Kohlehydrat- und eine Stickstoffquelle enthält, und Isolieren des Fermentationsproduktes mit Hilfe einer Kationenaustauscherbehandlung, d adurch gekennzeichnet, daß entweder das Nährmedium zusätzlich eine Aminoglukose und/oder glukosidartige Verbindung derselben mit Deoxystreptamin enthält oder an Stelle des Stammes Streptomyces kanamyceticus ATCC 21252 seine unter den Hinterlesunesnummern ATCC 21 159, 21260, 21261 und 21268 hinterlegten Mutanten verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminoglukose 3- oder 6-Aminoglukose zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als glukosidartige Verbindung aus Aminoglucose und Deoxystreptamin Paromamin, Deoxystreptamin-o-kanosaminid, Neamin oder die Antibiotika NK-1001 und NK-1003 zusetzt.