DE1793403C - Verfahren zur mikrobiolo gischen Herstellung von 2' Amino 2' deoxy kanamycin - Google Patents
Verfahren zur mikrobiolo gischen Herstellung von 2' Amino 2' deoxy kanamycinInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxy-
kanamycin in erhöhter Ausbeute.
2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin hemmt wirksam das Wachstum grampositiver, gramnegativer und säurebeständiger Bakterien, wie Staphylococcus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella und Mycobakterium,
sowie auch pathogener Bakterien, die beständig sind
gegenüber bekannien Antibiotika und synthetischen chemotherapeutischen Mitteln. Dieses 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin weist eine viel geringere Toxizität, insbesondere eine geringe Oto-Toxizität auf
und zeigt eine brauchbare therapeutische Wirkung bei Infektionen grampositiver, gramnegativer und
säurebeständiger Bakterien an Mensch und Tier.
2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin hat die Bruttoformel C18H37N5O10 ■ H2O und kann durch die Struk-
turformel
H3N
dargestellt werden.
Bei der Untersuchung der großtechnischen Herstellung von Kanamycin A durch Fermentation wurde
festgestellt, daß die gewöhnlichen natürlichen Stämme von Streptomyces kanamyceticus, die zu diesem
Zwecke verwendet werden, Kanamycin A gewöhnlich in größerer Menge in der Kultur erzeugen kön
nen, daß sie aber nur eine sehr viel kleinere Menge von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin bilden.
Als Ergebnis weiterer Untersuchungen wurde festgestellt, daß sich das Verhältnis von in der Kultur
erzeugtem und angereichertem 2'-Amino-2'-deoxy- kanamycin merklich verbessern und letzteres sich in
höherer Ausbeute daraus isolieren läßt, wenn entweder
gewöhnliche Stämme von Slreptomyces kanamvceticus
in an sich bekannter Weise, aber in Gegenwart einer Aminoglukose oder einer glukosidartigen
Verbindung aus Aminoglukose und Deoxystreptamin kultiviert werden, oder wenn einige neue
Mutanten von Streptomyces kanamyceticus in an sich bekannter Weise auf einem gewöhnlichen Kultur
medium, wie es herkömmlicherweise für die Kultivicrung
bekannter Mikroorganismen von Actinomyceten verwendet wird, gezüchtet werden.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin
durch Züchten des Stammes von Streptomyccticus kanamyceticus ATCC 21 252
unter aeroben Bedingungen in einem üblichen Kulturmedium, das eine Kohlehydrat- und eine Stickstoffquelle
enthält, und Isolieren des Fermentations-
Produktes mit Hilfe einer Kationenaustauscheroehandlung,
dadurch gekennzeichnet, daß entweder das Nährmedium zusätzlich eine Amincglukose und/
oder glukosidartige Verbindupg derselben mit Deoxystreptamin enthält oder an Stelle des Stammes
Streptomyces kanamyceticus seine unter den Hinterlegungsnummern ATCC 21 159, 21 260, 21 261 und
21 268 hinterlegten Mutanten verwendet werden.
Beispiele von Aminoglukosen, die sich im erwähnten Verfahren verwenden lassen, sind D-Glukosamin,
S-Amino-ß-deoxy-D-glukose, 6-Amino-6-deoxy- D-glukose
und 2,6-Dideoxy-2,6-di-amino-D-glukose. Als glukosidartige Verbindungen der Aminoglukose mit
Deoxystreptamin bezeichnet man solche Verbindungen, in denen die Aminoglukose mit Deoxystreptamin
im Molverhältnis 1:1 vorliegt, oder Komplexe dieser glukosidartigen Verbindungen mit weiteren angelagerten
Glukose- oder Aminoglukose-Molekülen.
Beispiele geeigneter glukosidartiger Verbindungen der Aminoglukose mit Deoxystreptamin sind Paromaniin
(4 - (2 - D - Glukosaminy!) - a - deoxystreptamin),
Deoxystreptamin-O-kanosaminid, Neamin (4-(2,6-Dideoxy-2,6-di-amino-glukosyl)-a-ci-deoxystreptamin),
Antibiotikum NK-1001 (ein Glukosid des Antibiotikums
NK-1003, vgl. »Asian Medical Journal«, Bd. 11, Nr. 2, S. 69 bis 75) und Antibiotikum NK-1003
(5-O-(6-Amino-6-deoxy-u-n-glukosyl)-deoxystreptamin.
Die obenerwähnten Antibiotika NK-IW)* und NK-1003 sind neue Substanzen, beschrieben und
beansprucht in den japanischen Patentanmeldungen 40 145 67 und 40 146/67 bzw. britischen Patentschriften
1 181 623 bzw. 1 224 379.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der obenerwähnte Zusatz aus Aminoglukose oder deren
glukosidartigen Verbindungen mit Deoxystreptamin dem Kulturmedium vor Beginn der Streptomyces-Kultivierung
zugegeben werden oder auch während der Kultivierung in der für gewöhnliche Nährmethoden
bekannten Weise. Der geeignete Anteil des im Kulturmedium vorliegenden Zusatzes ist nicht kritisch,
kann aber zwischen 0,05 und 1,0 Gewichtsprozent, insbesondere zwischen 0,1 und 0,5 Gewichtsprozent,
des Kulturmediums betragen. Es wurde festgestellt, daß die in der Kultur erzeugte und sich
anreichernde Menge an 2 -Amino-2 '-deoxy-kanamycin nach Ablauf von 3 bis 7 Tagen nach Beginn der Kultivierung
ein Maximum erreicht.
Im Gegensatz zur obenerwähnten Tatsache, daß die gewöhnlichen Stämme von Streplomyces kanamyceticus,
die zur derzeit üblichen großtechnischen Hersf ellung von Kanamycin A dienen, eine höhere
Kapazität zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-deoxykanamycin nur dann aufweisen, wenn sie in einem
üblichen Kulturmedium in Gegenwart der genannten Aminoglukosen und deren Deoxystrcplaminderivaten
kultiviert werden, wurde ferner festgestellt, daß einige neue Mutanten von Streptomyces kanamyceticus, die
von einem typischen natürlichen Stamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus abstammen, selbst dann
eine stärkere Fähigkeit zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin aufweisen, wenn sie in einem
üblichen Kulturmedium mit üblichen Kohlehydrat- und Stickstoffquellen und in Abwesenheit der erwähnten
Aminoglukosen und deren Dcoxystrentaminderivaten unter aeroben Bedingungen kultiviert werden. f>5
Diese neuen Mutanten mit der ihnen eigenen erhöhten Fähigkeit zur Bildung von 2'-Amino-2'-deoxykanamycin
wurden durch Behandeln des bekannten natürlichen Stammes 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus
mit einem Mutationsmittel, wie Methylbis-{/i(-chloräthyl)-amin
oder Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen und spezielle Auslese der überlebenden
Mycele oder Sporen erhalten.
Diese neuen Mutanten mit der ihnen eigenen erhöhten Fähigkeit zur Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxykanamycin
schließen vier Mutantenarten mit den Laborbezeichnungen A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 ein.
Diese neuen Mutanten haben nur eine geringe oder gar keine Fähigkeit Xylose zu verbrauchen und sind
dadurch von dem ursprünglichen Stamm, der eine größere Fähigkeit zur Verwendung von Xylose aufweist,
unterscheidbar.
Eine Variation oder Mutanten von Streptomyces kanamyceticus ist zu erwarten, da dies eine allgemeine
Eigenschaft der Actinomyceten ist. Wenn daher irgendein bekannter Stamm von Streptomycetices
kanamyceticus mit einem bekannten Mutationsmittel, wie Methyl- bis-(/i-chloräthyl)-amin behandelt wird,
kann man erwarten, daß neben den obenerwähnten Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 auch andere
Mutanten erhalten werden, denen eine erhöhte Fähigkeit zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin
eigen ist.
Bei beiden Verfahren kann das Kulturmedium als Kohlenstoffquelle Stärke, Sucrose, Maltose oder Glycerin
enthalten und als Stickstoffquelle z. B. Sojabohnenmehl, lösliche Pflanzenproteine, Maisquellwasser,
Pepton, Fleischextrakt, Nitrate und Ammoniumsalze. Das Kulturmedium kann gegebenenfalls
auch andere geeignete anorganische Salze, wie NaCl, MgSO4 und solche Mittel enthalten, die das Wachstum
von Streptomyces kanamyceticus fördern.
Zur Herstellung von 2'-Atnino-2'-deoxy-kanamycin ist die Kultivierung auf einem festen Medium möglich,
aber für die großtechnische Herstellung bevorzugt man die Kultivierung in einem flüssigen Medium
unter aeroben Bedingungen. Insbesondere bevorzugt man für die großtechnische Herstellung des Antibiotikums
die Methode einer stark belüfteten Tauchkultivierung. Es ist auch möglich, mit Schüttelkulturen
und belüfteten Kulturen in flüssigen Medien, die gerührt werden, zu arbeiten. Die Kultivierungstemperatur liegt gewöhnlich zwischen 25 und 35° C,
insbesondere bei oder um 28° C. Es wurde festgestellt, daß die sich in der Kultur anreichernde Menge an
2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin 3 bis 7 Tage nach Beginn der Kultivierung ein Maximum erreicht.
2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin, das sich in der Kultur angereichert hat, kann daraus nach irgendeiner
an sich bekannten Methode isoliert werden, z. B. unter Anwendung von Ionenaustauscherharzen, durch
Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und durch Verwendung eines Fällungsmittels, wie sie gewöhnlich
zur Einigung der bekannten wasserlöslichen basischen Antibiotika angewandt werden. Bei der
großtechnischen Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxykanamycin nimmt man dessen Isolierung bevorzugt
nach der Methode der Adsorption an und Eluierung von Ionenaustauschern, vorzugsweise einem Kationenaustauscher vom Carbonsäuretyp, oder nach der
Hxlraktionsmethode mit einem organischen Lösungsmittel,
das einen geeigneten Träger, wie p-Toluolsulfonsäure
oder Laurinsäure enthält, vor. Beispielsweise läßt sich 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin isolieren,
indem man die Feststoffe, d. h. den Mycelkuchen
von der ?'-Amino-2'-deoxy-k;inamycin ent-
haltenden Gärbrühe abfiltriert, das Filtrat an einem schwach sauren Methacrylsäure-Divinylbenzol-Mischpolymerisat
mit funktionellen Carbonsäuregruppen adsorbiert, das Ionenaustauscherharz mit wäßrigem
Ammoniak eluiert, die aktiven Fraktionen sammelt, einengt und die konzentrierte Fraktion mit einem
stark basischen Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisat mit funktionellen tertiären Amingruppen chromatographisch
auftrennt und die aktiven Fraktionen erneut sammelt und einengt. Die konzentrierte Fraktion
wird wiederum einer chromatographischen Trennung unterworfen, und zwar durch Adsorption an
einem schwach sauren Ionenaustauscher, wie er vorstehend erwähnt wurde, und allmähliches Eluieren
mit Wasser/wäßrigen Ammoniak.
Es läßt sich eine Einzelfraktion, die 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin enthält, erhalten. Diese Fraktion
wird der Gefriertrocknung unterworfen, das erhaltene Pulver ergibt beim Umkristallisieren aus
Wasser/Dimethylformamid kristallines 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin.
2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin kann in Form von farblosen, nadeiförmigen Kristallen mit einem
Schmelzpunkt von 183 bis 186° C erhalten werden, die basisch und in Wasser, wäßrigem Methanol,
wäßrigem Äthanol und wäßrigem Aceton löslich, aber unlöslich in absolutem Methanol, absolutem
Äthanol, Äthylacetat, Butylacetat, Äthyläther, Chloroform und Benzol sind, und eine positive Reaktion
mit Ninhydrin, Elson-Morgan- und Molisch-Reagens zeigen, aber eine negative Reaktion mit Sakaguchi-.
Tollens-, Fehling-, Millon- und Benedict-Reagens. Eine wäßrige l%ige Lösung dieser Substanz zeigt
eine spezifische optische Drehung [a]i?° = 118°.
Ein durch Acetylierung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin mit Methanol/Essigsäureanhydrid erhaltenes
N-Acetyderivat mit der Bruttoformel
C18H32N5O10 · 5(CH3CO) · H2
schmilzt bei 290 bis 300° C unter Zersetzung und zeigt eine spezifische Drehung von [a]2° = 118°.
Die antibakterielle Aktivität des 2'-Amino-2'-deoxykanamycins
ist wärmestabil. Wenn eine Lösung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin in 6n-Salzsäure durch
40minutiges Erwärmen auf 100° C abgebaut wird, beträgt die antibakterielle Aktivität der abgebauten
Lösung gegen Bacillus subtilis noch 60 bis 80% der ursprünglichen. Die abgebaute Lösung wird in Form
eines Tupfens auf ein 40 χ 40 cm-Toyo-Filterpapier
Nr. 50-Blatt aufgebracht und aufsteigend mit einem
Lösungsmittel aus Butanol - Essigsäure - Wasser (4:2:1) entwickelt Auf diesem Papierchromatogramin
erscheinen zwei Tupfen, die eine positive Reaktion mit Ninhydrin zeigen, wobei einer der
Tupfen auch positiv auf ammoniakalisches Silbernitrat reagiert
2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin zeigt eine hohe antibakterielle Aktivität gegen grampositive, gramnegative und säurebeständige Bakterien sowie auch gegen
solche Bakterien und Stämme, die gegen Kanamycin A und andere bekannte Antibiotika und Chemotherapeutika resistent sind. Die Toxizität von
2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin ist sehr niedrig: der
LD50-Wert beträgt nur 190 rag/kg bei Mäusen (intravenös).
Das antibakterielle Spektrum von 2'-Amino-2' -deoxy- kanamycin ist in Tabelle I zusammengestellt
Untersuchte Mikroorganismen
Aerobacter aerogenes IAM 1102
Alcaligenes faecalis
Bacillus agri
Bacillus subtilis ATCC 6633
Bacillus subtilis PCI 219
Diplococcus pneumoniae Typ 311D
Escherichia coli IAM 1253
Klebsiella pneumoniae 607
Lactobacillus arabinosus ATCC 8014 ....
Lactobacillus fermenti ATCC 9338
Staphylococcus albus PCI 1200A
Staphylococcus aureus 209 P
Staphylococcus aureus Terashima
Mycobacterium phlei Nr. 56
Mycobacterium phlei Sekiguchi
Mycobacterium 607
Proteus vulgaris
Pseudomonas aeruginosa IAM 1007
Pseudomonas aeruginosa Takasaki
Pseudomonas aeruginosa Masakuro
Salmonella paratyphi A
Salmonella paratyphi B
Salmonella paratyphi C
Sarcina lutea PCI 1001
Saccharomyces cerevisiae IAM 4626
Shigella flexneri EW 10 2a
Streptococcus faecalis ATCC 8043
Staphylococcus aureus 209 P
(resistent gegen Streptomycin)
Staphylococcus aureus 209 P
(resistent gegen Erythromycin)
Escherichia coli K-12 CS-2
Escherichia coli K-12 CS-2
(resistent gegen Antibiotika)
(resistent gegen Antibiotika)
Mindestkonzen tration für vollständige
Hemmung in
0,15 0,031 0,078 0,039 0,078 0,3! 1,25 0.31
1,56 0,15 0,039 0,31 0,015 0,62 0,31 0,78 7.8 0,1 0,78 0,39 0.62 0.62
1,25 0,31 500 0,039 15.6
In den Zeichnungen zeigt
F i g. 1 eine Kurve des Ultraviolett-Absorptions spektrums von 2'-Atnino-2'-deoxy-kanamycin ii Wasser gelöst bei einer Konzentration von 1 mg/ir Wasser,
F i g. 1 eine Kurve des Ultraviolett-Absorptions spektrums von 2'-Atnino-2'-deoxy-kanamycin ii Wasser gelöst bei einer Konzentration von 1 mg/ir Wasser,
F i g. 2 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspek
trums von 2-Amino-2-deoxy^kanamycin in Paraffine
Aus den Fig. 1 und 2 ist ersichtlich, dal
2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin keine Ultraviolett-Ab
sorption von 220 Millimikron bis 340 Millimikror aber charakteristische Absorptionsbanden bei dei
folgenden Wellenlängen in cm"1 zeigt: 3600, 300( 1650, 1600, 1570, 1140, 1110, 1095. 1090, 1060, 103f
960, 900, 895, 880, 845, 815, 790, 780, 765 und 72i
Eine Kultur des Stammes 0-4-1 von Streptomyce
kanamyceticus, der sich zur Durchführung des Vci fahrens nach der Erfindung verwenden läßt ist bc
der A.T.C.C. in Washington, D.C., hinterlegt wordei
und seiner ständigen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer 21 252 eingereiht worden.
Ferner sind Kulturen der Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 von Streptomyces kanamyceticus, die
sich zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung verwenden lassen, bei der A.T.C.C. unter
den Nummern 21260, 21159, 21261 und 21268
hinterlegt worden.
Wie schon erwähnt, besitzen die Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 von Streptomyces kanamyceticus
nur geringe oder gar keine Fähigkeit zur Verwendung von Xylose, was sie von ihrem Elternstamm
0-4-1, der eine starke Fähigkeit zum Verbrauch von Xylose unterscheidet.
Der Mutantenstamm A-4-6 ist weiterhin dadurch
gekennzeichnet, daß er auf einer Sucrose-Czapek-Agarplatte, die kein Deoxysireptamin enthält, im
Gegensatz zum Elternstamm 0-4-1, nicht wächst. Die Mutante 3AG unterscheidet sich vom Elternstamm
ferner dadurch, daß sie auf einer 3-Aminoglukose enthaltenden Czapek-Agarplatte bedeutend
größere Kolonien bildet als der Elternstamm 0-4-1. Die Mutanten 18-8 und 19-2 unterscheiden sich
vom Elternstamm 0-4-1 ferner dadurch, daß sie wenig oder kein Dulcit verbrauchen. Der Elternstamm
weist eine viel höhere Fähigkeit zur Verwendung von Dulcit auf.
Diese Mutanten wurden nach der folgenden Mutations- und Auslesemethode gewonnen. Die Verfahren
Herstellung jeder dieser Mutanten A-4-6, 3AG.
dünnt und dann zum Impfen einer Sucrose-Czapek-Agarplatte,
die zusätzlich 100 μg/ml Deoxystreptamin
enthielt, verwendet. Die Inkubationszeil bei 28° C betrug 10 Tage, in dieser Zeit entwickelten sich
Kolonien.
Von jeder der Kolonien wurde etwas Mycel entnommen, welches zum Impfen von 10 ml Maisquellwasser
in einem 70-ml-Reagensglas diente. Eine Schüttelkultur wurde wiederum bei 28° C 24 Stunden
lang wie oben erwähnt durchgeführt. Die erhaltene Kultur wurde zweimal gewaschen, verdünnt und
dann auf eine Sucrose-Czapek-Agarplatte und eine Sucrose-Czapek-Agarplatte, die zusätzlich 100 μg/ml
Deoxystreptamin enthielt, geimpft. Die Inkubation erfolgte bei 28° C und ergab in 7 Tagen Kolonien.
Ein Stamm, der nicht auf der ersten Platte, sondern nur auf der letzteren wuchs, wurde isoliert und als
Mutante A-4-6 von Streptomyces kanamyceticus bezeichnet. Diese Mutante, die einen notwendigen
Bedarf an Deoxystreptamin zeigte, lag im Verhältnis von etwa einer Kolonie zu 100 gebildeten Kolonien
zur Herstellung jcuw v*.^....
18-8 und 19-2 sind im folgenden eingehend beschrieben.
Die Mutante A-4-6 wurde durch Behandeln des
typischen Stammes 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus
wie folgt gewonnen: Der erwähnte Stamm wurde auf die Oberfläche einer geneigten Sucrose-Czapek-Agarplatte
geimpft, die dann bei 28° C 7 Tage lang bebrütet wurde. Mit einer der Größe einer Platinöse
entsprechenden Menge der entstandenen Kultur wurden 10 ml eines flüssigen Mediums, das 1% Maisquellwasser
und 0,25% getrocknete Hefe enthielt und einen pH-Wert von 7,0 aufwies, in einem 70-ml-Rcagensglas
geimpft. Eine Schüttelkultur wurde bei 28 C 24 Stunden lang in einem Hin- und Herschüttler
mit 350 Perioden pro Minute bei einer Amplitude von 2 cm durchgeführt. Das so erhaltene wachsende
Mycel wurde aus der Gärbrühe in 10 Minuten bei einer Beschleunigung vdn 2000 g abzentrifugiert; die
überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Der Mycelkuchen wurde zweimal mit gleichen Mengen
0,9%iger physiologischer Salzlösung gewaschen. Das nasse Mycel wurde dann in der 0,9%igen physiologischen
Salzlösung suspendiert und auf ein Volumen von 5 ml gebracht; dieser Menge wurden 4 ml einer
'/^molaren Na2HPO4-Lösung und der Mischung
1 ml einer 500 (ig/ml Methyl-bis-(/?-chloräthyl)-ainin
enthaltenden Lösung zugesetzt, dann ließ man das Gemisch 10 Minuten stehen. Anschließend wurde
1 ml der erhaltenen Mischung in 9 ml einer neutralisierten Lösung von 0,2% Glycin und 0.17% NaHCO3
aufgenommen und die Mischung etwa 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur stehengelassen. Der Mycelkuchen
wurde daraus durch Zentrifugieren isoliert, gewaschen und die gesamte Menge des Mycels in
10 ml Maisquellwasser in einem 70-ml-Reagensglas übergeführt. Eine Schüttelkultur wurde dann bei
28° C 24 Stunden lang wie oben beschrieben durcheeführt. Die Kultur wurde zweimal gewaschen, ver-
Die Mutante 3AG wurde durch Behandeln des älteren Stammes 0-4-1 wie folgt hergestellt: Mit einer
Kultur des typischen Stammes 0-4-1 wurde die Oberfläche einer geneigten Sucrose-Czapek-Agarplatte beimpft
und bei 28C C 7 Tage lang bebrütet. Eine Platinöse voll der erhaltenen Kultur wurde daraus entfernt
und in 10 ml eines flüssigen Mediums, das 1% Maisquellwasser und 0,25% getrocknete Hefe enthielt,
beim pH-Wert 7 in ein 70-ml-Probierglas übergeführt.
Eine Schüttelkultur wurde bei 28r C 24 Stunden in einem Hin- und Herschüttler mit 350 Perioden
pro Minute bei einer Amplitude von 2 cm durchgeführt. Die Kultur wurde zweimal mit physiologischer
Salzlösung gewaschen und dann mit einer Lösung von 50 μg ml Methyl-his-(,^-chloräthyl)-amin
behandelt. Mit Mycelien des so behandelten Stammes wurde dann ein 3-Aminoglukose-haltiges Czapek-Medium
beimpft, das 3° ο 3-Aminoglukose an Stelle
von 3% Sucrose enthielt, und eine Schüttelkultur bei 28 C 24 Stunden wie oben durchgeführt. Aus der
Kultur wurden die wachsenden Mycelien durch Zentrifugieren abgetrennt und zur Förderung des Wachstums
in ein Maisquellwassermedium übergeführt. Eine Schütteikultur wurde abermals bei 28 C
24 Stunden in der beschriebenen Weise durchgeführt. Danach wurde die Kultur gewaschen, die entstandene
Suspension homogenisiert, verdünnt und auf eine 3-Aminoglukose-Czapek-Agarplatte geimpft, die anschließend
bei 28° C 14 Tage lang zur Bildung von
Kolonien bebrütet wurde. Als Ergebnis bildeten sicr kleine, mittlere und große Kolonien. Mycelien wur
den nur von den großen Kolonien entnommen unc auf Maisquellwasser geimpft. Eine Schüttelkultui
wurde wiederum bei 28° C 24 Stunden wie ober erwähnt durchgeführt. Nach dem Waschen wurdi
die Suspension homogenisiert und verdünnt. ein< damit geimpfte 3-Aminoglukose-Czapek-AgarplaU!
wurde bei 28° C 14 Tage lang zur Bildung von KoIo nien bebrütet. Als Resultat konnte man einen Stamm
der nur große Kolonien bildete, daraus isolieren, <Je
als Mutante 3AG von Streptomyces kanamyccticu: bezeichnet wurde.
Die Mutanten 18-8 und 19-2 wurden durch Be handlung des Elternstammes 0-4-1 folgendcrmaßei
hergestellt: Eine Kultur des Eitcrr.stiVmmcs 0-4-wurdc
auf die Oberfläche einer s?onauk-n Stärke
ίο
Czapek-Agarplatte geimpft und bei 28'C 7 Tage lang bebrütet. Eine Platinöse voll der entstandenen
Kultur wurde in 1 ml sterilem Wasser suspendiert. Nach dem Aufschlämmen der Suspension wurde sie
in eine Stärke-Czapek-Agar enthaltende Schale überführt und dann bei 28° C 10 Tage bebrütet. Nach dem
Bebrüten wurde die Schale unter eine Ultraviolett-Lampe (19-W-Sterilisierlampe, hergestellt von der
Toshiba Company, Japan) gebracht und dann mit Ultraviolett-Strahlen 10 Minuten lang im Absland
von 30 cm bestrahlt. Nach dieser Mutationsbehandlung wurde das Mycel von der Agaroberfläche abgekratzt
und in 10 ml sterilem Wasser suspendiert. Die Suspension wurde homogenisiert und dann auf
ein Stärke-Dulcit-Czapek-Agar (ein 0,1% Stärke und 3% Dulcit enthaltendes Czapek-Agar) gebracht und
bei 28° C 7 Tage bebrütet. Das Mycel wurde nur von den kleinen Kolonien, die mäßig auf dem Agar
gewachsen waren, entfernt. Mit dem Mycel wurden dann geneigte Stärke-Czapek-Agarplatten beimpft
und bei 28° C .7 Tage inkubiert. Auf diesen Stärke-Czapek-Agarplatten zeigten alle Kolonien ein gutes
Wachstum. Platinösen große Mengen des Mycels wurden von jeder der Platten entfernt und Dulcit-Mineralsalz-Agarplatten
(enthaltend 1% Dulcit, 0,264% Ammoniumsulfat, 0.565% Dikaliumhydrogenphosphat, 0.238% Monokaliumdihydrogenphosphat,
0,1% Magnesiumsulfat-Heptahydrat. 0.00064% Kupfersulfat-Pentahydrat, 0.00079% Manganchlorid-Tctrahydrat,
0,00011% Eisensulfat -Heptahydrat. 0.00015% Zinksulfat-Heptahydrat und 1.5% Agar,
pH-Wert 7,0) damit beimpft. Die Bebrütung bei 28 C innerhalb von 14 Tagen ergab eine vorherrschende
Anzahl von Stämmen mit normalem Wachstum und nur zwei Stämme, die nicht merklich wachsen konnten.
Diese zwei Stämme, die wohl auf Stärke-Czapek-Agar, aber nicht auf Dulcit-Mineralsalz-Agar wachsen
konnten, zeigten die Fähigkeit zur Bildung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin mit erhöhter Ausbeute.
Diese Mutanten wurden als 18-8 und 19-2 von Streptomyces kanamyceticus bezeichnet.
Die Mutanten 3AG, A-4-6, 18-8 und 19-2 von Streptomyces kanamyceticus zeigen die folgenden
Eigenschaften:
Sie sind einander morphologisch ähnlich, die Luft-Mycelien
bilden verhältnismäßig grobe Äste und gewöhnlich keine Spiralen und Wirbel, die Sporen bilden
sich an den Enden der Luft-Mycelien und haben gewöhnlich eine ovale oder zylindrische Form mit
allgemein 1,0 bis 1,5 Mikron Durchmesser und eine glatte Sporenoberfläche. Sie sind allerdings voneinander
unterscheidbar bezüglich ihrer Wachstumsbedingungen auf Nährmedien, ihrer physiologischen
Wirkungen und ihrer Fähigkeit, Kohlenstoffquellen zu verwenden, welche Eigenschaften in den Tabellen
II, III und IV aufgeführt sind. Ferner sind die Unterschiede zwischen dem typischen Stamm 0-4-1
von Streptomyces kanamyceticus und seinen Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 bezüglich ihrer Wachstumsbedingungen,
physiologischen Wirkungen und Verwendbarkeit von Kohlenstoffquellen in Tabelle W
zusammengefaßt.
Wachstumsbedingungen von Mutanten des Streptomyces kanamyceticus auf verschiedenen Nährmedien
(beobachtet nach 14tägiger Bebrütung, Gärtemperatur 28°C)
| Nährmedium | Beobachtungen | Streptomyces kanamyceticus Mutante A-4-6 |
Streptomyces kanamyceticus Mutante 3 AG |
Slreptomyces kanamyceticus Mutame 18-8 |
Streptomyces kanamyceticus Mutante 19-2 |
| Sucrose- Czapek-Agar |
Wachstum | feines Wachstum, blaßgelb gefärbt |
feines Wachstum, tiefgelb gefärbt |
feines Wachstum, tiefgelb gefärbt |
feines Wachstum, dunkelgelb gefärbt |
| Luft-Mycel | keines | keines | keines | keines | |
| lösliches Pigment |
blaßgelb | blaßgelb | gelb | blaßgelb | |
| Rückseite | schwach gräulichgelb gefärbt |
gräulichgelb gefärbt |
|||
| Glycerin-Agar | Wachstum | sehr schwaches farbloses Wachstum |
feines Wachstum, gelblichgrau gefärbt |
feines Wachstum, gelblichgrau gefärbt |
feines Wachstum, hellbraun gefärbt |
| Luft-Mycel | keines | keines | keines | stark olivgrau gefärbt |
|
| lösliches Pigment |
keines | keines | keines | schwach gelblichbraun gefärbt |
|
| Rückseite | — | schwachgrau gefärbt |
schwachgrau gelb gefärbt |
gelblichbniun gefärbt |
| Glycerin- calciummalat- Agar |
11 | 1 793 | 403 j | Streptomyces kanamyceticus Mutante 3 AG |
12 | I | Streplomyces kanamyceticus Mutante 19-2 |
|
| Fortsetzung | tiefgelblich- braun bis braun gefärbt |
gelb gefärbt | ||||||
| T Nährmedium |
Beobachtungen | Streptomyces kanamyceticus Mulante A-4-6 |
keines | Streptomyces kanamyceticus Mutante 18-8 |
keines | |||
| Glucose- Asparagin-Agar ! (Krainsky) |
Wachstum | gelblichbraun bis tiefgelb gefärbt |
keines | leuchtend tiefgelb gefärbt |
keines | |||
| j | Luft-Mycel | keines | schwachgelb gefärbt |
|||||
| lösliches | keines | schwachbraun | keines | — | ||||
| Bouillon-Agar | Pigment | gefärbt | ||||||
| Rückseite | schwachgrau | tiefgelb bis gelb gefärbt |
— | tiefgeib gefärbt |
||||
| gefärbt | ||||||||
| '; Glucose- ; Asparagin-Agar |
Wachstum | tiefgelb bis gelb gefärbt |
keines | tiefgelb gefärbt |
keines | |||
| ; (Uschinsky) | keines | keines | ||||||
| Glucose- Nährstoff- |
Luft-Mycel | keines | keines | |||||
| Agar | lösliches | keines | gelb bis | keines | — | |||
| Pigment | schwachgelb | |||||||
| Rückseite | gelb bis | gefärbt | — | |||||
| schwachgelb | weiß bis schwachgelb |
weiß bis seh schwachgelb |
||||||
| gefärbt | gefärbt | gefärbt | ||||||
| j Calciummalat- | Wachstum | schwachgelb bis gelb |
keines | weiß bis sehr schwachgelb |
keines | |||
| j Agar | gefärbt | keines | gefärbt | keines | ||||
| i | Luft-Mycel | keines | keines | |||||
| lösliches | schwachgelb | weiß gefärbt | keines | |||||
| Pigment | gefärbt | braun bis gelblichbraun gefärbt |
gutes Wachstum, gelb gefärbt |
|||||
| Rückseite | — | keines | weiß gefärbt | keines | ||||
| Wachstum | gelblichbraun braun gefärbt |
gelb | gutes Wachstum, gelb gefärbt |
blaßgelb | ||||
| Luft-Mycel | keines | keines | ||||||
| lösliches | gelb | braun | gelb | — | ||||
| Pigment | gefärbt | |||||||
| Rückseite | blaßgelb | farblos bis graugelb |
— | farblos bis graugelb |
||||
| gefärbt | gefärbt | gefärbt | ||||||
| Wachstum | farblos bis graugelb |
keines | farblos bis graugelb |
keines | ||||
| gefärbt | keines | gefärbt | keines | |||||
| Luft-Mycel | keines | keines | ||||||
| lösliches | keines | feines runzeliges Wachstum, |
keines | feines runzeliges Wachstum |
||||
| Pigment | weißlich | weißlich | ||||||
| Wachstum | feines runzeliges Wachstum. |
schwachgelb | feines runzeliges- Wachstum. |
schwachge | ||||
| T T %+^^Λ U U % V* KmBr^ weißlich |
gefärbt | weißlich | gefärbt | |||||
| schwachgelb | keines | schwachgelb | keines | |||||
| gefärbt | keines | gefärbt | keines | |||||
| Luft-Mycel | keines | keines | ||||||
| lösliches | keines | keines | ||||||
| Pigment |
| Näihrmedium | Beobachtungen | 1 793 403 |
Streptomyccs
Jcanamyccticus Mutanle 3 AG |
14 ' |
Streptomycin
kaaamyceticus M utan te 19-2 |
|
| 13 | Stärke- | Wachstum | Fortsetzung | gelb bis | schwachgelb | |
| Ammonkimsulfat- Agar |
Strepiomyres
kanamyccticus MutanteA-4-6 |
gelblichbraun gefärbt |
Streptomyces
kanamycelicus Muiante 18-8 |
bis gelb gefärbt |
||
| Luft-Mycel | gelb bis | keines | sch wachgelb | keines | ||
| lösliches | gelblichbraun gefärbt . |
keines | bis gelb gefärbt |
keines | ||
| Pigment | keines | keines | ||||
| Rückseife | keines | keines | sch wach gelb | |||
| gefärbt | ||||||
| Kartoffel pfropf | Wachstum | runzeliges Wachstum, |
schwachgelb | runzeliges Wachstum. |
||
| kernige | gefärbt | kernige | ||||
| erhabenes gutes |
Oberfläche, sch wach- |
runzeliges Wachstum, |
Oberfläche, schwach- |
|||
| Wachstum, | gelblichbraun | kernige | gelblichbraun | |||
| ockerfarbig | gefärbt | Oberfläche, schwach - |
gefärbt | |||
| Luft-Mycel | schwach weiß | gelblichbraun | keines | |||
| gefärbt | gefärbt | |||||
| lösliches | weiß gefärbt | keines | sch wach weiß | keines | ||
| Pigment | gefärbt | |||||
| Karottenpfropf | Wachstum | keines | runzeliges | keines | schwaches | |
| Wachstum, | Wachstum | |||||
| runzeliges | schwächer als | runzeliges | ||||
| Wachstum, | aufdem | Wachstum, | ||||
| schwächer als | Kartoffel- | schwächer als | ||||
| auf dem | pfropf, | aufdem | ||||
| Kartoflel- | kösnigc | Kartoffel | ||||
| pfropf, | Oberfläche | pfropf, | ||||
| Luft-Mycel | körnige | keines | körnige | keines | ||
| lösliches | Oberfläche | keines | Oberfläche | keines | ||
| Pigment | keines | schwachweiß gefärbt |
||||
| Wachstum | keines | kein | keines | — | ||
| bei 37° C | Wachstum | |||||
| Loefflers- | Wachstum | kein | grau bis creme | — | grau bis creme | |
| Blutserum | Wachstum | gefärbtes | gefärbtes | |||
| grau bis creme | Wachstum | grau bis creme | Wachstum | |||
| Luft-Mycel | gefärbtes | keines | gefärbtes | keines | ||
| lösliches | Wachstum | keines | Wachstum | keines | ||
| Pigment | keines | keines | ||||
| Wachstum | keines | gleich wie | keines | — | ||
| bei 3TC | bei 28°C | |||||
| Ei | Wachstum | gleich wie | runzeliges | gleich wie | runzeliges | |
| bei 28°C | Wachstum, | bei 280C | Wachstum, | |||
| runzeliges | gelb gefärbt | runzeliges | gelb gefärbt | |||
| Luft-Mycel | Wachstum, | keines | Wachstum, | keines | ||
| lösliches | gelb gefärbt | keines | gelb gefärbt | keines | ||
| Pigment | keines | keines | ||||
| Magermilch | Wachstum | keines | kein | keines | Ring | |
| Wachstum | wachstum | |||||
| Luft-Mycel | kein | - | Ring- | keines | ||
| lösliches | Wachstum | wachsfum | keines | |||
| Pinment | ■- | keines | ||||
| — | keines | |||||
Physiologische Wirkung der Mutante von Streptomyces kanamyceticus (beobachtet nach Mtägiger Bebrütungszeit bei 28° C)
| Physiologische Wirkungen |
Streptomyces
kanamyceticus Mutante A-4-6 |
Streptomyces
kanamyceticus Mutante 3 AG |
Streptomyces
kanamyceticus Mutante 18-8 |
Streptomyces
kanamyceticus Mutanlc 19-2 |
| Nitratreduktion | positiv | positiv- | positiv | positiv |
| Stärkehydrolyse | positiv | positiv | positiv | positiv |
| Schwefelwasserstofibildung | negativ | negativ | negativ | negativ |
| Tyrosinasebildung | negativ | negativ | negativ | negativ |
| Gelatineverfliissigung bei 15° C während 14 Tagen |
stark verflüssigt |
verflüssigt | verflüssigt | verflüssigt |
| Verflüssigung von Loefllers Blut serum bei 28° C und 37° C innerhalb von 14 Tagen |
keine beobachtet |
keine beobachtet |
keine beobachtet |
keine beobachtet |
| Magermilchmedium | keine Koagulierung, rasche Petonisierung |
keine Koagulierung, rasche Petonisierung |
keine Koagulierung, langsame Petonisierung |
keine Koagulierung, langsame Petonisierung |
Tabelle IV Unterschiede zwischen dem typischen Stamm 0-4-1 und den Mutanten von Streptomyces kanamyceticus
| Streptomyces | Slreptomyces | Slreptomyces | Streptomyces | V | Slreptomyces | |
| Beobachtungen | kanarayceticus | kanamyceticus | kanamyceticus | kanamyceticus | runzeliges | kanamyceticus |
| Stamm 0-4-1 | Mutante A-4-6 | Mutanle ? AG | Mutante 18-8 | Wachstum, | Mutante 19-2 | |
| Wachstum auf | körnige | |||||
| Sucrose- | *** | * | ** | Oberfläche, | * | |
| Czapek- | schwach | |||||
| Agarplatte | gelbbraun | |||||
| Deoxystrept- | * | * | * | gefärbt | ||
| amin-Czapek- | ||||||
| Agarplatte | ||||||
| 3-Amino- | * | *** | * | + | ||
| glucose- | ||||||
| Czapek- | langsame | |||||
| Agarplatte | Peptonisierung | |||||
| Dulcit-Czapek- | *** | *** | ** | * | ||
| Agarplatte | ||||||
| Kartoffelpfropf | runzeliges | erhabenes | runzeliges | runzeliges | ||
| Wachstum, | gutes | Wachstum. | + | Wachstum, | ||
| körnige | Wachstum, | körnige | ± | körnige | ||
| Oberfläche, | ockerfarbig | ' Oberfläche, | + + + | Oberfläche, | ||
| leicht braun | schwach | schwach- | ||||
| gefärbt | gelbbraun | gelbbraun | ||||
| gefärbt | gefärbt | |||||
| Physiologische | ||||||
| Wirkung | ||||||
| Gelatine | + | + + | + | + | ||
| verflüssigung | ||||||
| Magermilch | langsame | rasche | rasche | langsame | ||
| medium | Peptonisierung | Peptonisierung | Peptonisierung | Peptonisierunj | ||
| Verwendbarkeit | ||||||
| von Kohlenstoff- | ||||||
| quellen | ||||||
| Sucrose | + + + | ± | + + | + | ||
| Xylose | + + | - | - | ± | ||
| Natriumacetat | + + | — | ± | + |
Fortsetzung
Ii
| Streplomyces | Streptomyces | Streptomyces | Streplomyces | Streptomyces | |
| Beobachtungen | kanamyceiicus | kanamyceiicus | kanamyceiicus | kanamyceticus | kanamyceticus |
| Stamm 0-4-1 | Mutante A-4-6 | Mutante 3 AG | Mutante 18-8 | Mutante 19-2 | |
| Verwendbarkeit | |||||
| von Kohlenstoff | |||||
| quellen | 4- | ||||
| Natriumeitrat | + + + | + | + + | + | I \ |
| Natrium- | + | ± | + + | + | *T |
| succinat | _L | ||||
| Dulcit | + + + | + + | + + + | ± | ZU |
Die Antibiotika NK-1001 und NK-1003, die als
Zusatz beim erfindungsgemäßen Verfahren dienen können, sind neue antibiolische Substanzen und
lassen sich durch Züchten eines Stammes von Streptomyces kanamyceticus in einem Nährmedium herstellen,
das einen besonderen Zusatz enthält.
Das Antibiotikum NK-1001 ist eine solche neue antibiotische Substanz, die das Wachstum grampositiver
und gramnegativer Bakterien, wie Bacillus subtilis, Lactobacillus fermenti und Shigella dyscnteriae
wirksam hemmt, basisch und löslich ist in Wasser, wäßrigem Methanol, wäßrigem Äthanol, aber unlöslich
in absolutem Methanol, absolutem Äthanol, Äthylacetat, Butylacetat und Benzol, die eine positive
Reaktion mit Ninhydrin, Elson-Morgan- und Molisch-Reagens,
aber eine negative Reaktion mit Sakaguchi-, Tollens-, Fehling-, Millon- und Benedict-Reagenzien
zeigt, die die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff, aber keinen Schwefel, Halogene
und Asche enthält, die4 Bruttoformel
C18H35N3O12 · H2O
aufweist und farblose nadelförnvge Kristalle bildet,
die sich bei 238 bis 242 C zersetzen, in l%igcr wäßriger
Lösung eine spezifische Drehung [«] i/' = +132'
zeigt, keine Absorption im Ultraviolett-Licht von 220 bis 340 Millimikron zeigt, wie in Fig. 3, und
charakteristische Absorptionsbanden, wie in F i g. 4, im Infrarot-Gebiet des Spektrums in Paraffinöl aufweist.
Wenn man das Antibiotikum NK-1001 durch Erwärmen in 6n-Salzsäure auf 100 C innerhalb von
40 Minuten hydrolysiert, verliert es seine antibakterielle Aktivität. Die entstandene hydrolysierte Lösung
wird in Form eines Tupfens auf ein Blatt (40 χ 2 cm) Toyo-Filterpapier Nr. 50 aufgebracht
und dann fallend mit einem Lösungsgemisch von Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:1:3) entwickelt.
Auf dem so erhaltenen Papierchromatogramm haben sich drei Tupfen gebildet, nämlich einer,
der mit Ninhydrin und ammoniakalischem Silbernitrat, ein anderer, der nur mit Ninhydrin, und ein
weiterer, der mit ammoniakalischem Silbernitrat positiv reagiert. Verglichen mit bekannten Proben wurde
festgestellt, daß diese drei Tupfen Deoxystreptamin bzw. o-Amino-o-deoxy-n-glucose, bzw. D-Glucose,
entsprechen. Angesichts dieser Tatsache und des für das Antibiotikum NK-1001 bestimmten Molekulargewichts
hält man es für wahrscheinlich, daß das Antibiotikum NK-1001 eine neue Verbindung ist, die
aus einem Molekül Deoxyslreptamin. einem Molekül 6-Amino-6-deoxy-D-glukose und einem Molekül
D-Glukose besteht. Antibiotikum NK-1001 ist praktisch ungiftig, da seine LD50 3050 mg/kg bei intravenöser
Injektion an Mäusen beträgt.
Die Herstellung von Antibiotikum NK-1001 kann durch Züchten des obenerwähnten typischen Stammes
0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium erfolgen,
das Kohlehydrate und eine stickstoffhaltige Nährstoffquelle sowie eine Menge Streptidin enthält, bis
sich das Antibiotikum NK-1001 in der Kultur anreichert und daraus isoliert werden kann. Oie Methode
zur Durchführung der fermentaliven Herstellung von
Antibiotikum NK-1001 wie auch die Kohlenstoff- und SlickstoiTqucllcn dafür können "die gleichen sein
wie die zur Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxykanamycin
früher erwähnten. Demnach ist die Anwendung der Schüttelkultur und der Tankkultur
möglich. Die Kulturtemperatur kann zwischen 25 und 35 C, insbesondere um 28°C liegen. Die dem
Nährmedium zugegebene Streptidinmenge ist nicht kritisch, aber wirtschaftlich sind 0,05 bis 1,0 Gewichtsprozent,
insbesondere 0,1 bis 0,5 Gewichtsprozent,
bezogen auf das Medium. Streptidin kann sowohl zu Beginn als auch während der Kultur zugegeben
werden.
Die Isolierung und Reinigung des Antibiotikums NK-1001 läßt sich in ähnlicher Weise wie für 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin
erwähnt durchführen.
Das Antibiotikum NK-1003, das wie das Antibiotikum NK-1001 als Zusatz dienen kann, ist ebenfalls
eine neue antibiolische Substanz, die eine brauchbare aritibakterielle Aktivität gegen grampositive.
gramnegative u >d säurebeständige Bakterien, wie
Bacillus subtiii:* lactobacillus fermenti und Shigella
dysenteriae zeigt. Das Antibiotikum NK-1003 ist eine antibiotische Substanz, die das Wachstum von
grampositiven, gramnegativen und säurebeständigen Bakterien wirksam hemmt, basisch und löslich ist in
Wasser, wäßrigem Methanol, wäßrigem Äthanol, aber unlöslich in absolutem Methanol, absolutem
Äthanol, Äthylacetat, Butylacetat und Benzol, mit Ninhydrin, Elson-Morgan- und Molisch-Reagenzien
positiv, aber mit Sakaguchi-, Tollens-, Fehling-, Millon- und Benedict-Reagenzien negativ reagiert, die
Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff, aber keinen Schwefel, Halogen und Asche
enthält, die Bruttoformel C12H25N3O7 besitzt und
farbloses nadeiförmige Kristalle bildet, die sich bei 202 bis 2050C zersetzen, in wäßriger l%iger Lösung
eine spezifische Drehung [h]o° = +95° zeigt, keine
Absorption von Ultraviolett-Licht von 220 bis 340 Millimikron, wie in I i g. 5, aber charaktcristische
Absorptionsbanden im Infrarotabsorptionsspektrum in Paraffinöl, wie in Fig. 6. aufweist.
Wird Antibiotikum NK-1003 durch Erwärmen in 6n-Salzsäure auf 1000C innerhalb von 40 Minuten hydrolysiert,
so verliert es seine antibaktericlle Aktivität.
Die entstandene Hydrolyselösung wird in Form eine? Tupfens auf ein Blatt (40 χ 2 cm) Toyo-Filtcrpapier
Nr. 50 aufgebracht und dann absteigend mit einem Lösungsmitlelgcmisch von Butanol-Pyridin-F.ssig-
«jure-Wasser (6:4:1:3) entwickelt. Das erhaltene
Papierchromatogramm weist zwei Tupfen auf, die mit Ninhydrin positiv reagieren, wobei der eine
auch auf ammoniakalisches Silbernitrat positiv reagiert. Durch Vergleich mit bekannten Proben
hat man festgestellt, daß diese zwei Tupfen Deoxystreptamin, bzw. 6-D-Glukosamin, entsprechen. Angesichts
dieser Tatsache und des ermittelten Molekulargewichtes scheint das Antibiotikum N K-1003
eine Verbindung zu sein, die aus einem Molekül Deoxystreptamin und einem Molekül 6-o-Glukosamin
besteht. Das Antibiotikum NK-1003 ist praktisch ungiftig, da seine LD50 1550 mg/kg beträgt,
bei intravenöser Injektion an Mäusen.
Das Antibiotikum NK-1003 läßt sich durch Züchten tines Stammes von Streptomyces kanamyceticus
in einem Nähmiedium, das Kohlehydrate und eine stickstoffhaltige Nährstoffquelle sowie eine Menge
Antibiotikum NK-1001 enthält, unter aeroben Bedingungen
herstellen, bis sich Antibiotikum NK-1003 in der Kultur anreichen und daraus isoliert werden
kann. Die Methode zur Durchführung der fermentativen
Herstellung von Antibiotikum NK-1003. wie auch die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen dafür,
sind gleich denen zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin. Man bevorzugt die Anwendung
der belüfteten Tieftankkultur. Die Kulturtemperatur liegt gewöhnlich bei 25 bis 30" C, insbesondere bei
oder um 28°C. Die dem Nährmedium zugesetzte Menge Antibiotikum NK-1001 ist unkritisch, kann
aber 0,05 bis 1,0 Gewichtsprozent, vorzugsweise von 0,1 bis 0,5 Gewichtsprozent, bezogen auf das Medium,
betragen. Das Antibiotikum NK-1001 kann entweder zu Beginn oder während der Kultur zugesetzt werden.
Die Isolierung und Reinigung von Antibiotikum NK-1003 läßt sich in ähnlicher Weise wie für 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin
beschrieben durchführen.
In den Zeichnungen zeigt
F i g. 3 eine Kurve des Ultraviolett-Absorptionsspektrums
von Antibiotikum NK-1001, gelöst in Wasser, bei einer Konzentration von 1 mg/ml Wasser,
F i g. 4 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums
von Antibiotikum NK-1001 in Paraffinöl,
Fig. 5.eine Kurve des Ultraviolett-Absorptionsspektrums
von Antibiotikum NK-1003, gelöst in Wasser, bei einer Konzentration von 1 mg/ml Wasser,
und
F i g. 6 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums von Antibiotikum NK-1003 in Paraffinöl.
Die antibakteriellen Spektren der Antibiotika NK-1001 und NK-1003, die als Zusatz beim erfindungsgemäßen
Verfahren dienen können, sind in Tabelle V zusammengestellt.
Untersuchter Mikroorganismus
Aerobacter aerogenes
IAM 1102
Alcaligenes faecalis
Bacillus agri
Bacillus subtilis ATCC 6633
Mindestkonzentration
für vollständige Hemmung
in μg/ml
Antibiotikum
NK-1001
NK-1001
31.2
7,8
6.25
6.25
Antibiotikum
NK-1003
NK-1003
55
60
15,6
3,9
2.0
3,9
2.0
3,125
| * 20 | ■ | _ | Anti |
| Mindestkonzentration | biotikum | ||
| für vollständige Hemmung ;— — /«*i |
NK-1003 | ||
| Untersuchter Mikroorganismus |
in μ
AnIi- |
über | |
| /Ul U biotikum |
500 | ||
| NKlOOI | |||
| Candida albicans | über | 2^0 | |
| 500 | 125 | ||
| Diplococcus pneumoniae | 31,2 | ||
| Typ 31ID | 500 | ||
| Escberichia coli IAM 1253 | 125 | 3,9 | |
| Klebsieila pneumoniae 607 | 31,2 | ||
| Lactobacillus fermenli | 7,8 | ||
| ATCC 9338 | 3,9 | 62,5 | |
| Staphylococcus albus | |||
| PCI 1200A | 15,6 | 3,125 | |
| Staphylococcus aureus 209 P | 62,5 | 25 | |
| Staphylococcus aureus | 50 | ||
| Terashima | 6,25 | 62,5 | |
| Mycobacterium phlei MS .. | 15,6 | 250 | |
| Mycobacterium 607 | 62,5 | ||
| Salmonella paratyphi A .... | 62,5 | über | |
| Sarcina lutea PCI 1001 .... | 500 | 500 | |
| Saccharomyces cerevisiae | 3,125 | ||
| IAM 4626 | über | ||
| 500 | 500 | ||
| Shigella flexneri EW 10 2 a | 6,25 | ||
| Streptococcus haemdlyticus | |||
| D-90 | 500 |
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in den Beispielen 1 bis 7 erläutert.
15 1 eines flüssigen Nährmediums, das 3,0 Gewichtsprozent Stärke, 2,0 Gewichtsprozent Maltose,
2,5 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl, 1,2 Gewichtsprozent Natriumnitrat und 0,5 Gewichtsprozent Natriumchlorid
enthielt, wurde mit dem typischen Stamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus beimpft
und bei 28° C unter Belüftung und Rühren bebrütet. Nach 22 Stunden wurden dem Nährmedium
50 g 3-Aminoglukose zugefügt; danach wurde die Bebrütung fortgesetzt. Die in der Kultur erzeugte
Menge 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin erreichte ein Maximum nach 150 Stunden. Die Flüssigkultur wurde
dann filtriert und das Filtrat mit 4 1 eines schwach sauren Methacrylsäure - Divinylbenzol - Mischpolymerisats
mit funktioneilen Carbonsäuregruppen behandelt. Die am Harz adsorbierten Antibiotika wurden
danach mit 0,5-n wäßrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und zu
einem Sirup konzentriert. Der Sirup wurde in 500 rnl Wasser gelöst und die Lösung durch Behandeln mit
6 g Aktivkohle entfärbt. Zur Entfernung der Aktivkohle filtrierte man die Lösung und chromatographierte
das Filtrat mit 600 ml eines stark basischen Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisats mit funktioneilen
tertiären Amingruppen. Die das 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin enthaltenden Fraktionen wurden
zuerst eluiert vor der Abtrennung von Kanamycin A. Die an 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin hochkon?.en-
trierten Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert und ergaben gefriergetrocknet 2,2 g rohes Pulver
von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin. Diese Rohsubstanz (2,2 g) wurde in 50 ml Wasser gelöst und die
Lösung mit einem schwach sauren Ionenaustauscher, wie er vorstehend erwähnt wurde, behandelt. Das
Harz wurde mit 0,1-n bis 0,5-n wäßrigem Ammoniak chromatographisch eluierl und das als Nebenprodukt
in geringer Menge vorhandene Kanamycin A zuerst eluiert. 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin wurde danach
getrennt als Einzelfraktion eluiert, konzentriert und zu einem rohen Pulver gefriergetrocknet. Durch Umkristallisieren
des Pulvers aus Wasser-Dimethylformamid erhielt man 1,1 g 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin
in Form von farblosen nadelartigen Kristallen. Eine Elementaranalyse des Produktes ergab 42,62% C,
7,52% H und 12,30% N (gefunden). Das Molekulargewicht des Produktes wurde mit 435 bestimmt.
15 1 eines flüssigen Nährmediums mit der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 1 wurden mit
demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus wie im Beispiel 1 beimpft und dann bei 28° C unter
Belüftung und Rühren bebrütet. Nach 22stündiger Bebrütung fügte man dem Nährmedium 50g6-Aminoglukose
zu und setzte dann die Bebrütung fort. Die sich in der Kultur anreichernde Menge an 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin
erreichte ein Maximum nach 145 Stunden Bebrütungszeit.
Die Gärfiüssigkeit wurde dann in gleicher Weise behandelt und das Rohprodukt gereinigt wie im Beispiel
1 und ergab 1,0 g 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin in Kristallform.
151 eines flüssigen Nährmediums, das 3,0 Gewichtsprozent
Stärke. 2.5 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl. 1.2 Gewichtsprozent Natriumnitrat und
0,35 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthielt, wurde mit demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus
wie im Reispiel 1 beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28 C bebrütet. Nach 20stündiger
Bebrütung wurden 30 g Antibiotikum NK-1001 dem Nährmedium zugefügt und die Bebrütung fortgesetzt
Die Bildung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin erreichte ein Maximum nach 140stündiger Bebrütung.
Die Gärflüssigkeit wurde dann aufgearbeitet und das erhaltene Rohprodukt wie im Beispiel 1 gereinigt,
wonach man 2.5 g kristallines 2'-Amino-2'-deoxykanamycin erhielt.
151 eines flüssigen Nährmediums derselben Zusammensetzung
wie im Beispiel 3 wurden mit demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus wie im Beispiel 1 beimpft und unter Belüftung und
Rühren bei 28rC bebrütet. Nach 20stündiger Bebrütung
fügte man dem Nährmedium 30 g Antibiotikum N K-1003 zu und setzte die Bebrütung fort. Die sich
in der Kultur anreichernde Menge 2'-Amino-2'-deoxykanamycin erreichte ihr Maximum nach 140stündiger
Inkubation.
Die Gärflüssigkeit wurde dann aufgearbeitet und das erhaltene Rohprodukt wie im Beispiel 1 gereinigt;
die Ausbeute an kristallinem 2'-Amino-2'-deoxykanamyein
betrug 1,5 g.
22
Beispiel 5
Beispiel 5
151 eines flüssigen Nährmediums derselben Zusammensetzung
wie im Beispiel 3 wurden mit demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus wie
im Beispiel 1 beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 280C bebrütet. Nach 20stündiger Bebrütung
wurden dem Nährmedium 45 g Neamin zugeführt und das Bebrüten fortgesetzt. Die sich in der Kultur
ίο anreichernde 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin-Menge erreichte ein Maximum nach 140 Stunden.
Die Kulturbrühe wurde dann aufgearbeitet. Das erhaltene Rohprodukt wurde wie im Beispiel 1 gereinigt;
es wurde eine Ausbeute von 1,2 g kristallinem 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin erzielt.
15 1 eines flüssigen Nährmediums, das 3,0 Gewichtsprozent
Stärke, 2,5 Gewichtsprozent Sojabohnenniehl, 1,2 Gewichtsprozent Natriumnitrat und 0,35 Gewichtsprozent
Natriumchlorid enthielt, wurden sterilisiert, gekühlt und mit einer sterilisierten und gekühlten
Lösung von 30 g Antibiotikum NK-1001 in Wasser vermischt. Die erhaltene Mischung wurde mit
demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus wie im Beispiel 1 beimpft und unter Belüftung und
Rühren bei 28° C bebrütet. Die sich in der Kultur anreichernde Menge 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin
erreichte ihr Maximum nach 140 Stunden.
Die Kulturbrühe wurde dann aufgearbeitet und das erhaltene Rohprodukt wie im Beispiel 1 gereinigt;
man erzielte eine Ausbeute von etwa 2,2 g kristallinem 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin mit einem Schmelzpunkt
von 183 bis 186° C.
Eine Kultivierung von Streptomyces kanamyceticus wurde in Gegenwart von Antibiotikum NK-1001 wie
im Beispiel 3 durchgeführt. Die erhaltene Kulturflüssigkeit wurde filtriert und das Filtrat (141) mit
Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 10 eingestellt.
Das Filtrat wurde dann mit einem Viertel seines Volumens an n-Butanol. das 2 g Benzaldehyd pro
Gramm im Filtrat vorhandener, wasserlöslicher, basischer Antibiotika enthielt, extrahiert. Der n-Butanol-Extrakt
wurde abgetrennt und mit einem Zehntel seines Volumens an Wasser vermischt Nach dem
Einstellen des pH-Wertes mit Schwefelsäure auf 2,0 und Rühren des erhaltenen Gemisches gingen die
wasserlöslichen basischen Antibiotika in die wäßrige Phase über. Die anfallende wäßrige Lösung der Antibiotika
wurde mit Aktivkohle entfärbt und mit einem stark basischen Styrol-Divinylbenzol-Mischpolyrnerisat
mit funktionellen tertiären Amingruppen und einem schwach sauren Ionenaustauscher, wie er vorstehend
erwähnt wurde, wie im Beispiel 1 chromatographiert. Durch Umkristallisieren des Rohproduktes
aus Wasser und Dimethylformamid erhielt man 1,1 g 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin als farblose nadelartige
Kristalle.
Vergleichsbeispiel
In diesem Beispiel wurde eine Anzahl Versuche durchgeführt, um die unerwartete und vorteilhafte
«5 Wirkung des Zusatzes von Aminoglukosen und deren Deoxystreptaminverbindungen zur Herstellung von
2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu zeigen.
In diesen Versuchen führte man die Kultur des typischen Stammes 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus
bei 28° C innerhalb von 150 Stunden wie im Beispiel 1 mit den gleichen Gärungsbehältern und
Kulturmedien gleicher Zusammensetzung durch. Nach verschiedenen, seit Beginn der Kultur verflossenen,
unten aufgeführten Zeitspannen wurden verschiedene nachstehend erwähnte Aminoglukosen und deren
Deoxystreptaminverbindungen dem Kulturmedium zugesetzt. Nach 150stündiger Bebrütung wurden die
Kulturbrühen wie im Beispiel 1 behandelt, so daß sich so viel als möglich 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin und
Kanamycin A isolieren ließen. Die Produktausbeuten und Einzelheiten der Versuche sind in Tabelle VI
zusammengestellt.
| Zusatzmiltel | Tabelle VI | Zeilspanne bis zum Zusatz (Std.) |
Gehalt an 2-Amino- 2'-deoxy- kanamycin ^g/ml) |
Ausbeute von 2'-Amino- 2'-deoxy- kanamycin (g) |
Gehalt an Kanamy cin A (μ&ΛηΙ) |
Ausbeute von Kanamy cin A (g) |
|
| Versuch Nr. |
kein Zusatz 3-Aminoglukose 6-Aminoglukose Antibiotikum NK-1001 Antibiotikum NK-1001 Antibiotikum NK-1003 Neamin |
Zusatzmenge (gl |
22 22 20 0 20 20 |
26 260 225 575 480 345 260 |
0,12 1,10 1,00 2.50 2,20 1.50 1.20 |
2790 1480 1730 1240 1450 1700 1390 |
26,8 12,7 15.2 11.2 13.6 16.0 118 |
| 1 2 3 4 5 6 7 |
50 50 30 30 30 45 |
||||||
Wie aus den Resultaten in Tabelle V ersichtlich ist. bringt der Zusatz von Aminoglukosen und deren
Deoxystreptaminverbindungen zum Kulturmedium eine merkliche Steigerung der Ausbeute an 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin.
Die folgenden Beispiele 8 bis 11 sollen weitere
Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erläutern.
Beisρiel 8
151 eines flüssigen Kulturmediums, das 3.0 Gewichtsprozent
Maltose. 2.0 Gewichtsprozent Stärke. 3.0 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl. 1.0 Gewichtsprozent
Natriumnitrat und 0.5 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthielt, wurden mit der Mutante A-4-6
von Streptomyces kanamyceticus beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28 C bebrütet. Die sich in
der Kultur anreichernde Menge an 2'-Amino-2'-deoxykanamycin
erreichte nach 6tägiger Bebrütung ihr
Maximum.
Die filtrierte Kulturbrühe ergab 141 Fihrat. das
mit 41 eines schwach sauren Methacrylsäure-Divinylbenzol-Mischpolymerisats
mit funktioneilen Carbonsäuregruppen behandelt wurde. Das Harz wurde anschließend mit 0,5-n wäßrigem Ammoniak eluiert.
Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und zu einem Sirup konzentriert, den man in 500 ml Wasser
löste. Die Lösung wurde durch Behandeln mit 6 g Aktivkohle entfärbt, diese abfiltriert und das Filtrat
einer chromatographischen Eluierung mit 600 ml eines stark basischen Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisats
mit funktionellen tertiären Amingruppen unterworfen. 2'-Amrno-2'-deoxy-kanamycin wurde vor
dem Abtrennen von Kanamycin A eluiert. Die an 2' - Amino - 2' - dcoxy - kanamycin hochkonzentrierten
Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und zu 3.2 g Produkt gefriergetrocknet. Das Rohprodukt
wurde in 50 ml Wasser gelöst und die Lösung mit einem schwach sauren Ionenaustauscher, wie er
■stehend erwähnt wurde, zur Adsorption der Antibiotika behandelt. Das Harz wurde wieder mit
0.1 - bis 0.5-n wäßrigem Ammoniak chromatographisch eluiert. Das als Nebenprodukt in geringer Menge
vorhandene Kanamycin A wurde zuerst eluiert und dann das 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin separat als
Einzelfraktion. Diese Einzelfraktion wurde konzentriert und zu rohem 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin
gefriergetrocknet. Durch Umkristallisieren aus Wasser-Dimethylformamid
erhielt man 1.9 g 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin in Form von farblosen, nadelartigen
Kristallen.
vorst
151 flüssiges Kulturmedium gleicher Zusammensetzung wie im Beispiel 9 wurden mit der Mutante 3 AG
von Streptomyces kanamyceticus beimpft und dann
unter Belüftung und Rühren bei 28" C bebrütet. Die sich in der Kultur anreichernde Menge an 2'-Amino-2-deoxy-kanamycin
erreichte ihr Maximum nach 6tägiger Bebrütung.
Die Kulturflüssigkeit wurde dann wie im Bei·
spiel 9 behandelt und ergab 1.2 g kristallines 2'-Amino
2 '-deoxy-kanamycin.
15 1 eines flüssigen Kulturmediums gleicher Zu
sammensetzung wie im Beispiel 9 wurden mit de
Mutante 18-8 von Streptomyces kanamyceticus be
impft und unter Belüftung und Rühren bei 28" (
bebrütet. Die sich in der Kultur anreichernde Meng
an 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin erreichte ihr Maxi mum nach 7tägiger Bebrütung.
Die Kulturflüssigkeit wurde dann wie im Beispiel behandelt und gab etwa 2„2g kristallines 2'-Amine
2'-deoxy-kanamycin.
B e i s ρ i e 1 11
Das Verfahren nach Beispiel 9 wurde wiederhol unter Verwendung der Mutante 19-2 von Streptomyce
kanamyceticus. Man erhielt ein ähnliches Results
wie im Beispiel 9. Ausbeute: 3,15 g kristallines 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin.
Vergleichsbeispiel
In diesem Beispiel wurden eine Anzahl Versuche durchgeführt, um die unerwartete und vorteilhafte
Wirkung bei Verwendung der Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 aufzuzeigen, die eine erhöhte Fähigkeit
lur Bildung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufweisen, verglichen
mit dem Elternstamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus.
In diesen Versuchen wurden die Kulturen des Elternstammes 0-4-1 und der Mutanten A-4-6, 3AG,
18-8 und 19-2 von Streptomyces kanamyceticus während 150 Stunden bei 280C, wie im Beispiel 9, unter
Verwendung ähnlicher Fermentationsbehälter und Kulturmedien gleicher Zusammensetzung behandelt.
Nach Beendigung der Züchtung wurden die erhaltenen Kulturbrühen auf ihren Gehalt an 2'-Amino-2'-deoxykanamycin
und Kanamycin A untersucht. Die Unter- «uehungsresultate sind in Tabelle VII zusammengestellt.
| Stamm | Gehalt an | Gehalt an | |
| Versuch | 2'-Amino- | Kanamycin A | |
| Nr. | 2'-deoxy- | ||
| Elternstamm | kanamycin | (μΕ/ml) | |
| 0-4-1 | (Kg/ml) | ||
| 1 | MutanteA-4-6 | 2790 | |
| Mutante 3AG | 26 | 1970 | |
| 2 | 430 | 1785 | |
| 3 | 285 | ||
| Stamm | Gehalt an | Gehalt an | |
| Versuch | 2'-Amino- | Kanamycin A | |
| Nr. | 2'-deoxy- | ||
| Mutante 18-8 | kanamycin | (,Mg/ml) | |
| Mutante 19-2 | ^g/ml) | 1900 | |
| 4 | 520 | 1690 | |
| 5 | 700 | ||
Je 151 der erhaltenen Kulturbrühen wurden wie
im Beispiel 8 behandelt, so daß sich so viel 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin und Kanamycin A als möglich
daraus isolieren ließ. Die Produktausbeuten sind in Tabelle VIII zusammengestellt.
| Stamm | Ausbeute von | Ausbeute von | |
| Versuch | 2'-Amino- | Kanamycin A | |
| Nr. | 2-deoxy- | ||
| Elternstamm | kanamycin | (gl | |
| 0-4-1 | (g) | ||
| 1 | MutanteA-4-6 | 26.8 | |
| Mutante 3AG | 0,12 | !9.0 | |
| 2 | Mutante 18-8 | 1,90 | 15.8 |
| 3 | Mutante 19-2 | 1,20 | 17.6 |
| 4 | 2,20 | 16.1 | |
| 5 | 3.15 | ||
Aus dem in Tabelle VIII zusammengestellten Resultat ist klar ersichtlich, daß den Mutanten A-4-6. ? \G.
18-8 und 19-2 die Fähigkeit eigen ist. 2'-Amino-2 -deoxy-kanamycm in merklich höherer Ausbeute zu
erzeugen als der typische Elternstamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus.
Hiereu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (3)
1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 2'-Amino-2'-deoxy-kanamycin durch Züchten
des Stammes von Streptomyces kanamyceticus ATCC 21 252 unter aeroben Bedingungen in
einem üblichen Kulturmedium, welches eine Kohlehydrat- und eine Stickstoffquelle enthält,
und Isolieren des Fermentationsproduktes mit Hilfe einer Kationenaustauscherbehandlung, dadurch gekennzeichnet, daß entweder
das Nährmedium zusätzlich eine Aminoglukose und/oder glukosidartige Verbindung derselben
mit Deoxystreptamin enthält oder an Stelle des Stammes Streptomyces kanamyceticus ATCC
21 252 seine unter den Hinterlegungsnummern ATCC 21 159, 21 260, 21 261 und 2 J 268 hinterlegten Mutanten verwendet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminoglukose 3- oder
6-Aminoglukose zusetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als glukosidartige Verbindung
aus Aminoglucose und Deoxystreptamin Parom
amin, Deoxystreptamin-o-kanosaminid, Neamin
oder die Antibiotika NK-1001 und NK-1003 zusetzt.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19681793403 DE1793403C (de) | 1968-09-12 | Verfahren zur mikrobiolo gischen Herstellung von 2' Amino 2' deoxy kanamycin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19681793403 DE1793403C (de) | 1968-09-12 | Verfahren zur mikrobiolo gischen Herstellung von 2' Amino 2' deoxy kanamycin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1793403B1 DE1793403B1 (de) | 1972-11-23 |
| DE1793403C true DE1793403C (de) | 1973-06-14 |
Family
ID=
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