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Verfahren zur Herstellung und Gewinnung eines Antibiotikums und dessen
Salzen Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen
antibiotisch wirkenden Stoffes durch Züchten eines Actinomyceten der Gattung Streptomyces
(Streptomyces bottropensis) und Gewinnen des Antibiotikums aus der Kulturflüssigkeit.
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Dieser Mikroorganismus könnte gemäß Bergey »Manual of determinative
bacteriology«, 1948, der Gruppe IA6 der Streptomyces-Gattung zugeordnet werden,
zu der auch Streptomyces erythreus gehört. Seine Eigenschaften sind jedoch von denen
dieses Mikroorganismus so verschieden, daß er zu einer anderen Spezies gerechnet
werden muß. Die kulturellen Eigenschaften dieses nach seiner Isolierungsnummer als
»Streptomyces bottropensis« bezeichneten Mikroorganismus sind in Tabelle I mit denen
eines von dem Centraal Bureau voor Schimmelcultures in Baarn erhaltenen authentischen
Stamms des Streptomyces erythreus (Waksman und Curtis) verglichen. In dieser Tabelle
ist das vegetative Myzel die Kolonie genannt, während das sporogene Myzel mit Äromyzel
bezeichnet ist.
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Mit Hilfe von Streptomyces bottropensis kann nun, wie gefunden wurde,
ein neuer und ausgezeichnet brauchbarer antibakterieller Stoff hergestellt werden,
der sowohl nach seiner Zusammensetzung als auch seinen antibiotischen Eigenschaften
von den bis jetzt
bekannten Antibiotika, wie Oxytetracyclin, Chlortetracyclin,
Chloramphenicol, Erythromycin und Carbomycin, völlig verschieden ist.
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Unter Streptomyces böttropensis sind außer Actinomyceten, die sterotyp
und genau der gegebenen Beschreibung entsprechen, auch alle verwandten Stämme, die
im wesentlichen dieselben Arteigenschaften haben und das Antibiotikum B-Mycin produzieren,
die man als Subspezien, Varietäten, Rassen, Formen, Gruppen von serologischen oder
anderen Typen, Varianten, Phasen, spontane Mutanten, Modifikationen u. dgl. dieser
Sorte bezeichnen kann. Hierzu gehören auch die Streptomyces-bottropensis-Mutanten,
die hieraus mit Hilfe von Mutation verursachenden Mitteln, wie Strahlung oder Behandlung
mit toxischen Stoffen, erhalten werden. ,
| Tabelle I |
| Kulturmedium Streptomyces bottropensis Streptomyces erythreus |
| (Waksman und Curtis) |
| Malzpepton Agar .............. gutes Wachstum, gutes Wachstum, |
| sternförmig gefaltete, gelbliche Ko- sternförmig gefaltete,
gelbliche Ko- |
| lonien (Farbe oben: Raffia, ii-E5; lonien (Farbe oben: Maple,
11-E4; |
| unten: Sunstone, i2-Fi2'), unten: Raffia, ri-E5), . |
| - braunes lösliches Pigment, kein lösliches Pigment, |
| ziemlich gut entwickeltes, grau- viel weißes Luftmyzelium. |
| weißes Luftmyzelium. |
| Emerson Agar (Waksman Nr.23") gutes Wachstum, gutes Wachstum, |
| feine strahlenförmige, gefaltete, kleine, runde, grauweiße
Kolonien |
| gelbliche Kolonien, die im Agar (Farbe: Amberwhite, ii-Ci;
ein- |
| weiterwachsen (Farbe oben: Raf- zelne größere Kolonien stark
ge- |
| fia, 11-E5; unten: Buff, ii-K 7), falten), |
| kein lösliches Pigment, kein lösliches Pigment, |
| reichliches weißes bis graues Luft- sehr viel weißes Luftmyzelium, |
| myzelium. |
| Glukose-asparagin Agar (Waksman gutes Wachstum, ziemlich gutes
Wachstum, |
| Nr. 2) runde, glatte, gelbe Kolonien runde, glatte Kolonien,
die später |
| (Farbe oben: Pinardy Golden auswachsen und wellig gefaltet |
| Glow, 9-J2, 9-L6; unten: Jon- werden; Farbe gelbgrün (io-Ei), |
| 4uil, 9-J5), |
| " kein lösliches Pigment, kein lösliches Pigment, |
| wenig weißes bis hellgraues Luft- wenig weißes Luftmyzelium. |
| myzehum. |
| Stärke Agar (Waksman Nr. i9- gutes Wachstum, gutes Wachstum, |
| + 2 °/o Agar) glatte runde Kolonien mit einzelnen glatte runde
Kolonien mit konzen- |
| konzentrischen Ringen; wächst trischen Ringen, |
| im Agar weiter, |
| Farbe Kolonie: anfangs rosa,. spä- Farbe: grau, |
| terhindunkler (Mindoro + 13-A8); |
| die Farbe ist pH-empfindlich, |
| sauer: rosa; alkalisch: blau), |
| produziert Amylase produziert Amylase, |
| lösliches Pigment (anfangs wenig, kein lösliches Pigment, |
| späterhin Mindoro +13-A8), |
| verhältnismäßig wenig weißes bis sehr viel hellgelbes (Marguerit
Y, |
| graues Luftmyzelium. io-C i) Luftmyzelium. |
| ') Die in Klammern aufgeführten Daten sind die Farben laut
"A dictionary- of Color" von A. Maerz und M. Rea- |
| Paul, 2. Aufl. 1950. |
| ") Die Bezeichnung Waksman mit einer Nummer bedeutet die Nummer
des Nährbodens gemäß S. A. Waksman in |
| seinem Buch "The Actinomycetes", 195o. |
| Kulturmedium Streptomyces bottropensis Streptomyces erythreus |
| (Waksman und Curtis) |
| Glukose Agar (Waksman Nr. 16) gutes Wachstum, gutes Wachstum, |
| sternförmig gefaltete, gelbliche Ko- stark strahlenförmig gefaltete |
| lonien (Raffia, II-E5), schmutziggelbe Kolonien (Farbe |
| oben: 01d Ivory, 22-C3; unten: |
| Mustard, II-J4), |
| kein lösliches Pigment, kein lösliches Pigment, |
| viel weißes Luftmyzelium. viel weißes bis hellgelbes Luft- |
| myzelium. |
| Haferflocken Agar ............. gutes Wachstum, gutes
Wachstum, |
| runde Kolonien mit eingesunkenem glatte runde, grauweiße Kolonien |
| Zentrum (Farbe: gelb, Golden - mit Ringen, wächst im Agar |
| Glow, 9-L6), weiter .(Farbe: Amberwhite, |
| II-C I), |
| kein lösliches Pigment, kein lösliches Pigment, |
| viel weißes bis graues Luftmyzelium. viel weißes bis gelbliches
Luft- |
| myzelium. |
| Calciummalat Agar (Krainski). . gutes Wachstum, gutes Wachstum, |
| kleine, runde, braungelbe Kolonien schwach gefaltete, grüngelbe
Kolo- |
| mit erhöhtem Kern (Farbe oben: nien ; wächst stark im Agar
weiter |
| IndiaBuff, 12-E5; unten: Cinna- (Farbe Chartreuse, Y-, ii-Ii), |
| mon, i2-E7), |
| kein lösliches Pigment, kein lösliches Pigment, |
| wenig grauweißes Luftmyzelium, viel weißes Luftmyzelium, |
| starker erdiger Geruch. sehr schwacher Geruch. |
| Kartoffel Agar ................. gutes Wachstum, gutes
Wachstum, |
| große, glatte, braungelbe Kolonien runde, strahlenförmig gefaltete, |
| mit erhöhtem Zentrum; wächst grünliche Kolonien (Farbe unten: |
| stark im Agar weiter (Farbe II-FI), |
| oben: Buff, ii-K 7, mit dunklerem |
| Zentrum; unten: ii-G6bisBurnt |
| Amber, 15-Ai2), |
| in jungem Zustand kein Pigment, kein lösliches Pigment, |
| späterhin Dunkelfärbung des |
| Agars, |
| reichliches weißes bis blaugraues viel weißgraues Luftmyzelium
(bil- |
| Luftmyzelium, det »fairy rings«), |
| starker erdiger Geruch. sehr schwacher erdiger Geruch. |
| Glukosenatriumnitrat Agar (Anti- mäßiges Wachstum, praktisch
kein Wachstum. |
| bioticsandChemotherapy2[1952], runde, glatte, gelbliche, wenig
ge- |
| 399) faltete Kolonien (Farbe: Daffodil- |
| Sunray, io-J6), |
| anfangs kein lösliches Pigment, |
| späterhin schwachrot. |
| »plain« Gelatin ................ Ausstrichkultur: gutes
Oberflächen- Ausstrichkultur: gutes Oberflächen- |
| wachstum mit starker Verfiüssi- wachstum mit starker Verflüssi- |
| gung, gong, |
| dunkelbraunes Pigment, hellgelbes Pigment. |
| weißes Luftmyzelium. |
| Kulturmedium Streptomyces bottropensis Streptomyces erythreus |
| (Waksman und Curtis) ' |
| Kartoffelscheiben .............. gutes Wachstum, sehr gutes
Wachstum, |
| kleine, stark gefaltete Kolonien; stark gefaltete Kolonien;
infolge |
| Farbe: braun bis schwarz, baldiger und reichlicher Bildung |
| . von Luftmyzelium war die Farbe |
| ' der Kolonien nicht zu beurteilen. |
| - eunkeibraunes bis schwarzes Pig- |
| ment, |
| kein Luftmyzelium. |
| Lackmusmilch ................. mäßiges Wachstum, mäßiges Wachstum, |
| keine Stremmung, keine Reduk : keine Säurebildung, wohl Peptoni- |
| , tion, keine Peptonisierung, keine sierung. |
| Säurebildung. |
| Czapek Agar (Waksman Ni. i) . gutes Wachstum, sehr gutes Wachstum, |
| kleine, strahlenförmig gefaltete, stark ausgewachsene grauweiße
Ko- |
| rötliche Kolonien (Farbe: Min- lonien mit konzentrischen Ringen; |
| doro, +- 13-A 8 bis Raffia, Ti-E 5), Farbe unten: Amberwhite,
ii-C i, |
| braunes, lösliches Pigment, kein lösliches Pigment, |
| wenig Luftmyzelium, viel graues bis gelbliches Luft- |
| myzelium(bildetsogenannte fairy |
| rings«, |
| produziertaufverschiedenenMedien der Stamm M5-12559 (vgl. kanadi- |
| das Antibiotikum B-Mycin. sches Patent 495410) produziert |
| das Antibiotikum Erythromycin. |
Der Mikroorganismus wurde aus einer aus dem Ruhrgebiet stammenden Erdprobe isoliert.
Auf Kartoffelagar bildet er ein weißes bis graublaufarbiges, verzweigtes Luftmyzel,
das spiralförmige, kurze, offene Windungen hat. Diese Spiralen sind nicht kompakt,
so daß das neu entdeckte Streptomyces bottropensis in Gruppe 3 der Einteilung Waksman
und Henrici- (vgl. S. A. Waksman, »The- Actinomycetes«, 1950, S.30) gehört. Der
Durchmesser des Luftmyzels auf Kartoffelagar variiert von o,6 bis 1,2,u. Bei der
Färbung gemäß Gram reagiert das Myzelpositiv; bei der Färbung gemäß Ziehl-Neelsen
ist es nicht säurefest. Die gebildete Conidia haben einen Durchmesser von o,6 bis.
i,2ß, während die Länge von i bis 4,u variiert. Die Form der Sporen ist gewöhnlich
zylindrisch, stabförmig, obgleich auch elliptische bis fast runde Formen . neben
einigen gebogenen Formen vorkommen.
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Das neue Antibiotikum B-Mycin, das aus Streptomyces-bottropensis-Kulturen
zu gewinnen ist, ist hauptsächlich aktiv gegen die sogenannten grampositiven Bakterien.
Die Tabelle II zeigt eine Aufstellung der antibiotischen Eigenschaften des B-Mycins,
wobei für jede Bakteriensorte die Menge B-Mycin in pg/ml Nährmedium; die gerade
völlige Hemmung des Wachstums verursacht, aufgeführt,-ist- -Aus dieser Tabelle geht
die auffallende Wirkung gegen Staphylococci hervor. Alle untersuchten Stämme dieser
Bakterien stammten aus einer Klinik, und verschiedene waren resistent gegen Penicillin,
Streptomycin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin und Chloramphenicol.
| Tabelle II |
| Konzentration |
| ' Test-Organismus B-Mycin in |
| yg/ml |
| Staphylocoecus albus (13 Stämme) o,12 bis o,2o |
| Staphylococcus aureus (22 Stämme) o,2o - i,oo |
| Streptococcus ß-haemolyticus ' |
| (12 Stämme) ................. 0,03 - 0,13 |
| Streptococcus a=haemolyticus |
| (viridans, =2 Stämme) ........ 0,02 - 4,50 |
| Streptococcus Faecalis (4 Stämme) 0,50 - 1,20 |
| Sarcina lutea .................. o,12 |
| Pneumococcus (io Stämme) ..... o,o2 bis i,oo |
| Bacillus subtilis ATCC 6633 ..... o,o6 |
| Bacillus subtilis (Stamm Marburg) 0,25 |
| Pseudomonas aeruginosa ........ 5o bis 500 |
| Salmonellä (2 Stämme) ........ e >50 |
| Bacterium 'coli (6 Stämme) ...... >5 bis 500 |
| Proteus vulgaris (2 Stämme) .... 125 bis >500 |
| Klebsiella pneumoniae (3 Stämme) 9 bis >50 |
| Aerobacter aerogenes ........... >50 |
| Mycobacterium phlei ............ 0,03 |
| Konzentration |
| Test-Organisation B-Mycin in |
| Mg/ml |
| Mycobacterium tuberculosis |
| H 37 Rvl) ................... 1,00 |
| Mycobacterium tuberculosis |
| resistent gegen Streptomycin)1). 3,00 |
| Neisseria meningitidis ........... 1,00 |
| Bäcillus anthracis .............. 0,15 |
| Corynebacterium diphteriae ...... 0,015 |
| Vibrio cholerae ................. 40,00 |
| Haemophilus influenzae ......... 1,00 |
| Neisseria ...........'........... 10,00 |
| Clostridium tetani ...'........... 3,00 |
| Haemophilus pertussis .......... 3,00 |
| Brucella abortus Bang .......... 3,00 |
| i) Auf Nährboden laut Proskauer-Beck bestimmt. |
Da resistente Staphylococci in größeren Kliniken in beunruhigendem Maße aufzutreten
beginnen, ist das neue Antibiotikum B-Mycin eine wichtige therapeutische Ergänzung.
Auch ist die Aktivität des B-Mycins in vitro Mycobakterien gegenüber - unter ihnen
auch die für den Menschen pathogene Formen -auffallend. B-Mycin zeigt keine vcross-resistance«
mit Carbomycin oder Erythromycin.
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Eine andere wichtige Eigenschaft des B-Mycins ist, daß der Stoff äußerst
wenig giftig ist, im tierischen Körper gut resorbiert und auf normalem Wege ausgeschieden
wird.
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Das B-Mycin ist ein weißer, amorpher Stoff mit basischem Charakter.
Die Wasserlöslichkeit ist ziemich gering. Merkwürdigerweise löst sich der Stoff
in Nälte besser als in Wärme. In Wasser von o° C ist die Löslichkeit 2,3 mg %m1,
in Wasser von 30° C 1,3 mg/ ml. Dahingegen löst sich B-Mycin gut in organischen
Lösungsmitteln, wie Alkoholen, z. B. Methanol, Äthanol, Butanol, Amylalkohol, Cyclohexanol,
Estern, z. B. Äthylacetat, Butyacetat, Amylacetat, aromatischen Kohlenwasserstoffen,
z. B. Benzol, Tolucl, Xylol, substituierten aromatischen Kohlenwasserstoffen, z.
B. Chlorbenzol, Nitrobenzol, Äthern, z. B. Diäthyläther, Dioxan, Ketonen, z. B.
Aceton, Methylisobutylketon und weiterhin in Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und
Dichloräthan. In aliphatischen Kohlenwasserstoffen, wie Pentan, Cyclohexan u. dgl.,
ist der Stoff jedoch wenig löslich.
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Der Stoff ist sehr stabil sowohl in fester, trockener Form wie in
wäßrigen Lösungen. So kann eine Lösung in Wasser in ehiem pH-Gebiet von 2 bis g
während 15 Minuten auf go° C erhitzt werden, ohne ihre biologische Aktivität zu
verlieren.
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Bei längerem Erhitzen stellt es sich heraus, daß die Lösung im pIi-Gebiet
von 2 bis 7 beständiger ist als in alkalischem Medium.
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Der Schmelz- oder Zersetzungspunkt des B-Mycins beträgt 143 bis 155°
C, .die spezifische Drehung [a]" ist -14° ':z in einer 5°/oigen Lösung in 96o/oigem
Äthanol. Das Molekulargewicht des Stoffes ist ungefähr 770. Die vermutliche empirische
Formel ist C38 H57-- 60 N7 07-8 S.
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Die Elementaranalyse ergab: C 5958%, H 7,690/0 N i2,790/0, S 4,20°/o
und O z5,740/0 (berechnet).
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Bei der Feststellung des ultravioletten Absorptionsspektrums ergab
es sich, daß B-Mycin ein Absorptionsmaximum bei 2030 Ä und eine Spitze bei
ungefähr 2400 Ä zeigt. Bei der Feststellung des infraroten Spektrums wurden bei
einer Suspension von B-Mycin in Nujol (Abb. i) und Hexachlorbutadien (Abb.2) die
nachfolgenden Absorptionsbänder gemessen: N (cm-1) : 3333 (ziemlich stark), 2985
(ziemlich stark), 1739 (ziemlich stark), 1650 (sehr stark), 15o2 (schwach), 1366
(schwach), 1312 (schwach), 1258 (ziemlich stark), 1171 (schwach), 1145 (schwach),
iiig (schwach), 976 (schwach), 8o6 bis 80o (schwach).
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Das B-Mycin kann an verschiedenen Adsorbentien adsorbiert werden,
wie an aktiver Kohle, wovon es beispielsweise mit Hilfe eines Gemisches von Aceton
und Salzsäure eluiert werden kann. An Aluminiumhydroxyd und pulverisierter Zellulose
findet keine Adsorption statt.
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Die schwach sauren Ionenaustauscher zeigten eine zu geringe Kapazität,
um für die Adsorption des B-Mycins brauchbar zu sein. An den stark sauren Ionenaustauschern
wird B-Mycin gebunden. Die Elution kann mit einer io°/oigen Kochsalzlösung geschehen.
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Gefunden wurde, daß Magnesiumsilikate z. B. in einer chromatographischen
Säule geeignete Adsorbentien für B-Mycin sind. Die Elution des an adsorbierten B-Mycins
kann mit einem Benzol-Methanol-Gemisch geschehen.
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Bei der Papierchromatographie wurde gefunden, daß bei Verwendung von
Eaton-Dikeman-Papier Nr. H 613 bei 26° C mit Hilfe eines Elutionsmittels (mit Wasser
gesättigtes Butanol mit 2,5 °/o Essigsäure) der Rf-Wert des B-Mycins ungefähr 0,94
ist.
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Als basischer Stoff ist B-Mycin imstande, mit verschiedenen anorganischen
und auch organischen Säuren Salze zu bilden, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure,
Essigsäure, Phenylessigsäure (Schmelzpunkt 125 bis 127° C), 3-Nitrophthalsäure (Schmelzpunkt
153 bis i55° C), Salicylsäure, Acetylsalicalsäure (Schmelzpunkt 142 bis 145° C),
p-Aminosalicylsäure, 3, 5-Dibromsalicylsäure, Pikrinsäure (Schmelzpunkt 158 bis
163° C), Benzoesäure (Schmelzpunkt 13o bis 132° C), 3, 5-Dinitrobenzoesäure, Penicillin
und Anthranilsäure (Schmelzpunkt 133 bis 135° C). Verschiedene dieser Salze wurden
kristallin erhalten. Herstellung und Eigenschaften werden im folgenden eingehend
beschrieben.
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Zur Herstellung des neuen Antibiotikums B-Mycin züchtet man den Streptomyces
bottropensis aerob entweder in stationären Kulturen oder submers in einem flüssigen
Nährmedium unter sterilen Verhältnissen in geschlossenen Gefäßen, die mit Rührvorrichtungen
versehen sind und denen zwecks Belüftung während der Zucht steriler Sauerstoff oder
Luft zugeführt wird.
Der Nährboden soll einen Kohlenstofflieferanten
und einen Lieferanten für organischen und/öder anorganischen Stickstoff enthalten,
die Anwesenheit von Mineralsalzen, wie Phosphaten, Kalium- oder Natriumsalzen, und-
Spuren verschiedener Metalle ,ist erwünscht. Oft sind die in der Praxis gebrauchten
Grundstoffe genügend mit diesen Mineralsalzen verunreinigt, so daß eine Hinzufügung
sich erübrigt.
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Als Kohlenstofflieferanten können sowohl lösliche als unlösliche Kohlehydrate,
wie Glukose, Saccharose, Laktose, oder Stärke gebraucht werden. Auch Zuckeralkohole,
wie Glycerin, sind brauchbar. Die Menge an Kohlenstofflieferanten im Medium kann
stark variieren und hängt von der Art des verwendeten Kohlehydrats und von der sonstigen
Zusammensetzung des Mediums ab: sie liegt im allgemeinen ungefähr zwischen
0,5 und 5 °/o des Gewichts des Mediums. Als Stickstofflieferanten zur Herstellung
des Antibiotikums gemäß der Erfindung. kommen eine große Reihe von Stoffen in- Betracht.
Zu erwähnen sind hydrolisiertes oder nicht hydrolysiertes Kasein, Maisquellwasser,
Pepton, Fleischextrakt, .Sojamehl, Erdnußmehl, Fischmehl, Nitrate. Die Wahl des
Stickstofflieferanten hängt von der sonstigen Zusammensetzung des Mediums ab; das
Medium wird so gewählt, daß das Antibiotikum in ökonomischer Weise hergestellt wird.
In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, daß geringe Mengen stickstoffhaltiger Grundstoffe,
wie Hefeextrakt, lösliche Schlempebestandteile, Fischpreßwasser usw., in gewissen
Medien eine beträchtliche Steigerung der Ausbeute an Antibiotikum ergeben.
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Die Dauer der Fermentation hängt stark von der Zusammensetzung des
Nährmediums ab. Sie variiert gewöhnlich zwischen 72 und 168 Stunden; die Fermentation
kann aber gewünschtenfalls auch länger fortgesetzt werden,-falls die in dieser Weise
erhaltene Steigerung der Ausbeute an Antibiotikum die höheren Kosten eines längeren
Fermentationszyklus ausgleicht.
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Die Temperatur, bei welcher die Fermentation ausgeführt wird, kann
zwischen 2o und 35° C variieren; vorzugsweise werden Temperaturen von 26 bis 28°
C angewendet.
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Für ein optimales Wachstum des Organismus und der Ausbeute an Antibiotikum
soll das p$, zumal während der ersten Phase der Fermentation, zwischen ziemlich
engen Grenzen gehalten werden, z. B. zwischen 5 und B. Nach der Sterilisation wird
das Nährmedium auf ein pH zwischen 6 und 7 eingestellt. Vorzugsweise wird die Fermentation
bei einem p$ zwischen 6,5 und 8 ausgeführt, da die Erfahrung gezeigt hat, daß bei
diesem p$ die höchsten Ausbeuten erzielt werden. Man kann das p$ während der Fermentation
konstant halten, indem man in regelmäßigen Zeitabständen. Lauge oder Säure unter
sterilen Bedingungen hinzufügt. Gewöhnlich verwendet man jedoch als Pufferstoff
festes Calciumcarbonat, in Mengen variierend von z. B: o,2 bis i Gewichtsprozent
des Mediums.
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Die Menge Luft, welche dem Medium während der Fermentation unter sterilen
Bedingungen zugeführt wird, hängt von der Form des Gefäßes, von der Geschwindigkeit
und der Form der Rührorgane ab. Im allgemeinen variiert diese Menge zwischen
0,5 und 41 pro Liter Nährmedium pro Minute. Als Impfstoff gebraucht man im
Hauptfermentationsgefäß vorzugsweise 48 bis 72 -Stunden alte Vorkulturen von Streptomyces
bottropensis. Um gute Ausbeuten zu erhalten und schwankenden Ergebnissen vorzubeugen,
impft man vorzugsweise mit Mengen einer Kultur, die 3 bis 6 Volumprozent des Nährmediums
im Hauptfermentationsgefäß betragen. Es ist klar, daß bei großen Fermentationsgefäßen
eine Anzahl Stufen von Vorkulturen zu gebrauchen sind. Es ist aber auch möglich,
einen Teil der Kultur, z. B. io °/o, im Hauptfermentationsgefäß, für die Einleitung
einer neuen Kultur, aufzubewahren. Auch kann die Fermentation kontinuierlich ausgeführt
werden.
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Das B-Mycin kann in verschiedener Weise aus der Kulturflüssigkeit
gewonnen werden. Vorteilhaft wird erfindungsgemäß von der guten Löslichkeit des
Antibiotikums in den meisten organischen Lösungsmitteln oder von seinen basischen
und salzbildenden Eigenschaften Gebrauch gemacht. Nach der Entfernung des Myzels
wird die reine Kulturflüssigkeit bei p$ =7 oder höher mit einem nicht oder wenig
mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Gewöhnlich wird man
sich bei der Wahl eines solchen Mittels von ökonomischen Erwägungen führen lassen.
Geeignete Extraktionsmittel. sind z. B. Butylacetat und Diäthyläther. Auf diese
Weise wird eine Lösung von B-Mycin in einem organischen Lösungsmittel erhalten.
Daraufhin wird diese Lösung gegebenenfalls nach Konzentration und Reiniguhg mit
einer wäßrigen Pufferlösung von p$ = i bis q., vorzugsweise von ungefähr 2, extrahiert,
wobei der Stoff in der Wasser-Schicht in die Salzform übergeht. Man wählt, hierbei
die Volumen des organischen Lösungsmittels und der Pufferlösung derart, daß neben
einer Reinigung auch eine Konzentrierung des aktiven Stoffes erreicht wird.
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Daraufhin kann man mittels Alkalisierung der wäßrigen Lösung den aktiven
Stoff aufs neue in einem organische6ri Lösungsmittel aufnehmen. Wenn in dieser Weise
eine genügende Reinigung und Konzentrierung erreicht ist, kann der.Stoff infolge
seiner geringen Löslichkeit in Wasser- bei p$ = 7 bis g gefällt werden.
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Gemäß einer bevorzugten Reinigungsmethode wird das rohe Antibiotikum
an einer Säule Magnesiumsilikat adsorbiert und daraufhin fraktioniert eluiert. Diese
Elution kann vorteilhaft mit Hilfe eines Gemisches von Chloroform und einem Alkohol
geschehen. Die besten Resultate erhält man mit einem Gemisch von 5 bis io °/o, vorzugsweise
7,5 °/o Äthanol. In dieser Weise kann reines B-Mycin erhalten werden.
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Gemäß einer anderen Isolierungsmethode nach der Erfindung wird von
der Eigenschaft des B-Mycins, mit organischen Säuren Salze zu bilden, Gebrauch gemacht.
Besonders geeignet sind im aromatischen Kern` substituierte Derivate von Benzoesäure,
wie 3, 5-Dinitrobenzoesäure, Salicylsäure, p-Aminosalicylsäure und 3, 5-Dibromsalicylsäure,
die kristalline Salze mit B-Mycin bilden. Zu diesem Zweck wird einem B-Mycin enthaltenden
Extrakt der Kulturflüssigkeit, gegebenenfalls nach Reinigung. und Konzentrierung,
eine Lösung der obenerwähnten Säuren oder Salze zugefügt.- Die erhaltenen kristallinen
Fällungen werden durch Umkristallisationen aus geeigneten Lösungsmitteln gereinigt.
Die erhaltenen gereinigten Salze
besitzen ungeminderte biologische
Aktivität. Durch Zersetzung mit sauren oder alkalischen Mitteln wird das B-Mycin
aus diesen Salzen zurückgewonnen.
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Eine besondere interessante Verbindung nach der Erfindung ist das
obenerwähnte Salz des B-Mycins mit Penicillin. Es wird durch doppelte Umsetzung
von z. B. B-Mycinphosphat und Natriumpenicillin erhalten oder einer Lösung von B-Mycin
in einem organischen Lösungsmittel mit in einem organischen Lösungsmittel gelöstem
Penicillin. Als Penicillin kann man verschiedene Sorten gebrauchen, wie die Penicilline
K, F, O und G. Die kristalline Verbindung von B-Mycin und Penicillin G schmilzt
bei 157 bis 159° C (unter Zersetzung) und ist schlecht löslich in Wasser. Der Stoff
kann in wäßriger Suspension intramuskulär oder subkutan injiziert werden und bildet
also ein Präparat mit verzögerter Wirkung sowohl bezüglich Penicillin als auch B-Mycin.
Die therapeutische Wichtigkeit dieses Präparates wird sich bei weiterer klinischen
Prüfung als sehr wertvoll erweisen, zumal wenn man dieses Präparat im Licht der
Untersuchungen über die Resistenzsteigerung der verschiedenen Mikroorganismen, insbesondere
von Staphylococci (vgl. z. B. Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 82 [z953] S. 124 bis
131) betrachtet.
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Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert.
Beispiel I (Herstellung der Impfkultur) Aus einem Röhrchen mit Streptomyces-bottropensis-Kultur
auf z. B. Emersons Agar, auf welcher gute Sporulation stattgefunden hat, bringt
man kleine Mengen Conidia in steriler Weise in Schüttelflaschen mit einer Kapazität
von ungefähr 21, in die 500 ml eines flüssigen Nährmediums eingebracht sind.
Dieses Medium besteht aus: Pepton ........................... 0,50/0 eingeengtes
Maisquellwasser (45 0/0 trockener Stoff) .................. o,60/, Glukose
.......................... i,o% Kochsalz ......................... 1,o00 (mit Kalilauge
auf p$ = 7 eingestellt). Nach 48 Stunden Inkubation unter fortwährendem Schütteln
bei 26°C ist die Kultur geeignet, um im Hauptfermentationsmedium durchgeimpft zu
werden. Beispiel II (Herstellung der Kultur) i 1 der nach Beispiel I hergestellten
Impfkultur wird in steriler Weise in ein Fermentationsgefäß gegeben, das mit einem
Rührorgan und einer Vorrichtung zum Einblasen steriler Luft versehen ist, und 151
eines Kulturmediums der nachfolgenden Zusammensetzung enthält: Erdnußmehl
...................... 2,o 0/0 Laktose .......................... 3,0% eingeengtes
Maisquellwasser (45 0/0 trockener Stoff).................. 1,o0% Calciumcarbonat
................... 0,5% Nach 12o Stunden Inkubation bei 27°C unter fortwährender
Belüftung und fortwährendem Rühren sind pro ml der Kulturflüssigkeit 12o yg B-Mycin
gebildet.
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Andere Medien, mit denen Ausbeuten derselben Größenordnung erhalten
werden können, haben die nachfolgende Zusammensetzung: A. Zuckerrübenmelasse (ungefähr
50 0/0 Zuckergehalt) ................... 4,00/0 Laktose ..........................
1,o0% eingeengtes Maisquellwasser (45 0/0 trockener Stoff).................. 2,o0%
Natriumsulfat 1o aq ................ o,i 0/0 Calciumcarbonat ...................
0,5% Hiermit wurden bei einer Impfung von 40% und bei Inkubation und Belüftung während
144 Stunden bei 26°C 135,ug B-Mycin pro ml Fermentationsflüssigkeit erhalten.
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B. Sojamehl ......................... 2,o0/0 Laktose ..........................
3,0% eingeengtes Maisquellwasser (45 0/0 trockener Stoff) ....................
r,o 0/0 Calciumcarbonat ................... o,50/0 Mit diesem Medium wurden
bei einer Impfung von 6 % und bei Inkubation und Belüftung während 12o Stunden bei
26°C 1o5 ,ug B-Mycin pro ml Fermentationsflüssigkeit erhalten.
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C. Pepton ........................... 0,50/0 Fleischextrakt
..................... o,50/, Glukose .......................... r,00/0 Kochsalz
......................... 0,5% Bei Impfung mit 5 % der Impfkultur in diesem Medium
wurden durch Inkubation und Belüftung bei 25°C während 168 Stunden g5,ug B-Mycin
pro ml Fermentationsflüssigkeit erhalten. Beispiel III (Isolierung des rohen B-Mycins)
6o l einer ausfermentierten Kulturflüssigkeit, die ioo,ug B-Mycin pro ml enthält,
wurden mit Hilfe eines Filtrierhilfsmittels filtriert. Das Filtrat wurde bei p$
= 7,8 mit 8,71 Butylacetat extrahiert. (Extrakt I). Dieser Extrakt wurde im Vakuum
bis 2,71 eingedampft (Extrakt II). Daraufhin wird es mit 0,41 Phosphatpuffer von
pg = 2 geschüttelt. Hierbei geht der aktive Stoff in die Wasserschicht über (Extrakt
III). Diese Lösung wurde daraufhin mit starker Natronlauge auf p$ = 9 eingestellt
und mit ioo ml Äther extrahiert (Extrakt IV) und schließlich mit 250 ml Phosphatpuffer
von p$ = 2 (Extrakt V) geschüttelt. Bei Alkalisierung auf p$ = 9 fällt das noch
unreine B-Mycin aus. Das Gewicht war 8,4 g, während die Anzahl Mikrogramme aktiven
Stoffes pro mg 515 betrug. Das bedeutet also eine Isolierungsausbeute von 72 0/0,
berechnet auf die Menge aktiven Stoffes der ausfermentierten Kulturflüssigkeit.
Beispiel IV (.Reinigung des. rohen B-Mycins) 8 g des nach Beispiel III erhaltenen
rohen Antibiotikums wurden in 45 m1 Chloroform gelöst und
über eine
Säule Aluminiumoxyd geführt (Durchmesser i cm, Höhe io cm). Die Säule wurde nachgewaschen
mit 5 ml Chloroform.
-
Die durchgelaufene Flüssigkeit wurde nunmehr über eine Säule mit 83
g Magnesiumsilikat geführt (Durchmesser 2,7 cm, 28 cm).
-
Die durchgeflossene Flüssigkeit enthält keinen aktiven Stoff. Das
Antibiotikum wurde eluiert mit einem Gemisch von Chloroform und 7,5 % Äthanol. Das
Eluat wurde. in sechs Fraktionen aufgefangen. Während der Eltion zeichneten sich.
drei gelb- bis braunfarbige Bänder auf dem weißen Adsorbens ab, die sich langsam
nach unten verschoben. Nachdem das erste Eluat aufgefangen war, befand das niedrigste
Band sich gerade unten an der Säule. Mit Eluatfraktion N1. 2 wurde -dieses Band
ausgewaschen. Nachdem die Eluatfraktion Nr. 3 durchgelaufen war,, ist das mittelste
Band gerade aus der Säule verschwunden. Während der Elution mit Eluatfraktion Nr.
4 verschiebt sich das dritte Band bis unten an der Säule. Das Eluat Nr. 5 enthält
den größten Teil dieses Bandes. Der aktive Stoff war wie folgt über die Eluate verteilt
Eluat Nr.
-
o = 8o ml, i = ioo ml, die keinen aktiven Stoff enthielten, 2 = 12
ml, die nur eine Spur des aktiven Stoffes enthielten, 3 = io ml, die ungefähr 2%
des aktiven Stoffes enthielten, 4 = 6o ml, die ungefähr 6o % des aktiven Stoffes
enthielten, 5 = 2o ml, die ungefähr io % des aktiven Stoffes enthielten, 6 = 150
ml, die ungefähr 25 % des aktiven Stoffes enthielten.
-
Die Eluate wurden nach Ansäuern mit o,i n-Schwefelsäure im Vakuum
von dem organischen Lösungsmittel befreit. In den restlichen wäßrigen Flüssigkeiten
wurde der aktive Stoff durch Alkalisierung auf pH = g gefällt. Aus dem'vierten Eluat
wurden 2,r g reinen B-Mycins gewonnen, ein weißer amorpher Stoff, der pro mg ungefähr
iooo ßg aktiven Stoffes enthielt: Der Schmelz- (Zersetzungs-) Bereich beträgt 142
bis 153° C. Beispiel V (Reinigung des rohen B-Mycins) ,7;;4-g. rohen B-Mycins mit
einer Aktivität von ungefähr goa,ug/mg wurden in 2o ml Butylacetat gelöst. Nach
Filtration wurden 1,54 g in 50 ml Butylacetat gelöster p-Aminosalicylsäure
hinzugefügt. Nach 2q. Stunden bei Zimmertemperatur wurde der gebildete Niederschlag
abgesaugt. Nach. Trocknen wog der feste Stoff 6,57 g. Nach Aufbewahrung des Filtrats
im Eisschrank wurden noch 546 mg erhalten, wodurch die Gesamt-Gewichtsausbeute auf
79,6 % stieg. Zur weiteren Reinigung wurde das zuerst erhaltene Produkt aus i7o
ml Butylacetat umkristallisiert. Man erhält 3,1 g eines kristallinen Salzes, das
bei i8o bis 182° C schmilzt. Die Aktivität dieses Salzes betrug ungefähr 830 ,ug/mg.
- Eine Elementaranalyse des p-aminosalicylsauren Salzes des B-Mycins ergab die nachfolgenden
Werte: C 59,717 0/0,H 7,110/0, N 122,25 O/o, S 3,64%, 0 r7,230/0 (berechnet).
-
Von diesem reinen Salz wurden 1,674 g in ioo-ml Wasser, auf das ioo
ml Äther gebracht war, suspendiert. Unter Rühren wurde das p$ mit Natronlauge auf
ii eingestellt. Nach kräftigem Schütteln wurde die Ätherschicht abgetrennt. Die
Wasserschicht wurde noch zweimal mit 50 ml Äther extrahiert.- Nach dein Trocknen
wurde die ätherische Lösung eingedampft; man erhielt einen weißen amorphen Rückstand,
der 0,75 g wog und einen Schmelz- (Zersetzungs-) Bereich von 143 bis 155°
C hatte. Dieses Produkt enthielt gemäß der mikrobiologischen Prüfung ungefähr iooo
yg B-Mycin pro mg. Beispiel VI (Herstellung des B-Mycinsalicylats) 7,4 g rohes B-Mycin
mit einer Aktivität von ungefähr goo yg/mg wurden in 2o ml Butylacetat gelöst. Nach
Filtration wurde eine Lösung von 1,38 g Salicylsäure in 2o ml Butylacetat hinzugefügt.
Nach dem Stehen während einiger Zeit bei Zimmertemperatur fing das Salicylat des
B-Mycins an zu kristallisieren.
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Nach 24stündiger Aufbewahrung bei 5° C wurde der Stoff filtriert und
getrocknet. Das Gewicht betrug 7,35 g. Dieses Salz wurde aus 40 ml Butylacetat umkristallisiert.
Hierbei erhielt man 5,2 g eines reinweißen kristallinischen Produkts, das bei 16o
bis 161° C schmilzt. Die Aktivität betrug ungefähr 850,ug pro mg. Die Elementaranalyse
ergab die nachfolgenden Werte: C 59950/0 H 7,300/0 N 11,170/0, S 3,490/0 0 18,o9
0/-, (berechnet). Beispiel VII (Herstellung des B-Mycins-3, 5-Dinitrobenzoats)
7,4g rohen B-Mycins mit einer Aktivität von ungefähr goo,ug/mg wurden in
2o ml Butylacetat gelöst. Nach Filtration wurde eine Lösung von 2,i1 g in 70m1 Butylacetat
gelöster 3, 5-Dinitrobenzoesäure hinzugefügt. Nach einigen Tagen Aufbewahren wurden
3,5g hellgelbgefärbtes kristallines Salz abfiltriert. Dieses Produkt wurde aus 35
ml Butylacetat umkristallisiert.
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Es wurden 1,6 g des 3, 5-Dinitrobenzoats des B-Mycins erhalten. Der
Schmelzpunkt war 156 bis 158° C. Die Aktivität betrug ungefähr 780 ,ug/mg. Die Elementaranalyse
ergab die nachfolgenden Resultate: C 56,o50/0, H 6,7o0/0, N 12,720/p, S 2,9o0/0,
0 21,630/0 (berechnet).
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Beispiel- VIII (Isolierung des B-Mycins über p-Aminosahcylat) Von
der gemäß Beispiel III erhaltenen wäßrigen Lösung des B-Mycins in Phosphatpuffer
vom p$ = 2 (Extrakt III) wurden ioo'ml (r,2 g B-Mycin) mit 3%iger Natronlauge auf
p$ = 9,1 eingestellt und dreimal mit insgesamt 30 ml Butylacetat ausgeschüttelt.
Nach dem Trocknen mit Hilfe von Natriumsulfat wurden dieser Lösung o,3 g iruio rril
Butylacetat gelöster p-Aminosalicylsäure zugefügt.
Nachdem die
Lösung einige Zeit gestanden hatte, trat Kristallisation ein. Erhalten wurden
0,95 g eines braunfarbigen Produktes, das ungefähr 81o pg B-Mycin pro mg
enthielt. Durch wiederholtes Umkristallisieren aus Butylacetat wurden
0,52 g reines p-Aminosalicylat des B-Mycins erhalten. . Beispiel IX (Isolierung
von B-Mycin über p-Anllnosalicylat) 25 ml des nach Beispiel III erhaltenen Extrakts
IV, der 1,15 g in Äther gelöstes B-Mycin enthielt, wurden 0,3 g in 35 ml Äther gelöster
p-Aminosahcylsäure hinzugefügt. Nach 24stündiger Aufbewahrung bei 5° C wurden die
gebildeten Kristalle abfiltriert. Das Gewicht betrug 0,7 g. Die Aktivität
betrug ungefähr 8oo ,ug B-Mycin pro mg. Durch Umkristallisieren aus Butylacetat
konnten 0,4 g reines p-Aminosalicylat des B-Mycins erhalten werden.
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Beispiel X (Herstellung des B-Mycins 3, 5-Dibromsalicylats) Zu o,74
g in 2 ml Butylacetat gelösten reinen B-Mycins wurde eine Lösung von 0,3
g 3, 5-Dibromsalicylsäure in 1o ml Butylacetat zugefügt. Nach einigen Stunden trat
eine weiße kristalline Fällung ein. Das Gewicht betrug o,83, g., Nach Umkristallisieren
aus Butylacetat war der Schmelzpunkt 171 bis 172° C. Die Aktivität des Stoffes betrug
ungefähr 720 Pg/mg. Eine Elementaranalyse des 3, 5-Dibromsalicylats von B-Mycin
ergab die nachfolgenden Werte: C 51,280/0, H 5,980/0 N 9#320/0, S 304%, Br z5,190/0
(berechnet). Beispiel XI (Herstellung des B-Mycinacetats) o,74 g reinen B-Mycins
wurden in 2 nil Butylacetat gelöst. 0,79, g in 5 ml Butylacetat gelöste Essigsäure
(980/0) wurden zugefügt, wobei spontan eine weiße Fällung auftrat. Nach 12 Stunden
Aufbewahren bei 5° C wurde das Salz abfiltriert und in 8 ml warmen Butylacetats
gelöst. Nach Abkühlen präzipitierten 0,35 g B-Mycinacetat. Der Stoff ist
amorph, wenig löslich in Wasser und hat einen Schmelz- (Zersetzungs-) Bereich von
138 bis 148° C.
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Beispiel XII (Herstellung des B-Mycinchlorhydrats) 5 g reinen B-Mycins
wurden in 21 Äther gelöst. In diese Lösung wurde Salzsäuregas geführt, bis keine
Fällung mehr entstand. Daraufhin wurde der Äther verdampft und der Rückstand zwecks
Entfernung des Salzsäureüberschusses einige Male in ein wenig Äthanol -aufgenommen
und der Äthylalkohol abgedampft. Schließlich wurde der Stoff in Äthanol gelöst,
filtriert und mit Hilfe von Äther gefällt. Dies wurde noch einmal wiederholt und
der Stoff getrocknet.
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Das in dieser Weise erhaltene Chlorhydrat des B-Mycins (3,5 g) ist
ein cremefarbener amorpher Stoff, der in Wasser wenig löslich ist und einen Schmelz-(Zersetzungs-)
Bereich von igo bis 21o° C hat. Die Elementaranalyse ergab die nachfolgenden Resultate:
C 57,230/0, H 7,420/0, N r235°/0. S 3,730/0, Cl 4,75% und O i4,520/0 (berechnet).
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Beispiel XIII (Herstellung des B-Mycinsulfats) 1,48 g reinen B-Mycins
wurden in 4 ml Butylacetat gelöst. Dieser Lösung wurden zunächst 40 ml Äther und
dann einige Tropfen konzentrierte Schwefelsäure zugefügt. Die Fällung wurde durch
Filtrieren abgetrennt, mit Äther nachgewaschen und getrocknet. Das Produkt wurde
gereinigt durch wiederholtes Lösen in 2o ml Äthanol und Fällen nach Filtration mit
Äther. Auf diese Weise wurden nach Abtrennen durch Filtrieren und Trocknen 1,o2
g des schwefelsauren Salzes von B-Mycin erhalten: Es ist ein amorpher Stoff von
Cremefarbe; er ist leichter in Wasser löslich als das Chlorhydrat. Der Schmelz-(Zersetzungs-)Bereich
ist 189 bis 1g6° C. Beispiel XIV (Herstellung des B-Mycinphosphats) Wie im Beispiel
XIII wird aus 1,48 g reinem B-Mycin mit Hilfe von Phosphorsäure das phosphorsaure
Salz des B-Mycins erhalten. Es ist ein cremefarbiger, amorpher Stoff, der ziemlich
gut löslich in Wasser ist, mit einem Schmelz- (Zersetzungs-) Bereich von 174 bis
178° C. Beispiel XV (Herstellung des B-Mycins-p-Aminosalicylats) 1 g B-Mycinphosphat
wurde unter schwachem Erhitzen in 2o cmg Wasser, dem ungefähr 2o0/0 Äthanol hinzugefügt
waren, gelöst. Dieser Lösung wurden 0,25 g in 5 ml Wasser gelöstes Natriumsalz
der p-Aminosalicylsäure zugefügt. Das p-Axninosalicylat des B-Mycins fällt sofort
aus. Nach dem Trocknen betrug das Gewicht o,89 g. Der Stoff wurde aus Butylacetat
umkristallisiert, wobei 0,55 g@ des reinen Salzes mit einem Schmelzpunkt
von 18o bis 182° C erhalten wurden. Beispiel XVI (Herstellung des B-Mycinbenzylpenicillinats)
0,75 g reinen Natriumpenicillins G (164o E/mg) wurden in 5 ml Wasser von
o° C gelöst. Unter Rühren und Kühlen wurde diese Lösung behutsam mit 2 n-Phosphorsäure
auf p$ = 2 eingestellt und daraufhin zweimal mit je 5 ml auf o° C gekühlten Butylacetats
ausgeschüttelt. Der Extrakt wurde kurze Zeit mit Hilfe von Natriumsulfat getrocknet
und nach Entfernung dieses Stoffes zu einer Lösung von 1,48 g reinen B-Mycins in
5 ml Butylacetat zugefügt. Das sogleich ausfallende, zum Teil kristalline Salz von
B-Mycin und Penicillin G wurde, nachdem es einige Zeit gestanden hatte, durch Filtrieren
abgetrennt, mit Butylacetat gewaschen und getrocknet. Das Gewicht betrug 1,83 g.
-
Der Stoff wurde durch Kristallisieren aus Äthylacetat gereinigt. Auf
diese Weise wurden 1,2 g reinen
Salzes des B-Mycins mit Penicillin
G erhalten. Der weiße kristalline Stoff schmilzt bei 157 bis z69° C, (unter Zersetzung).
Eine Elementaranalyse ergab: C 5935°%# H 7,Ioo/o, N 11,50%, S 5,760/, und O 16,29°/o
(berechnet).