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Verfahren zur Gewinnung eines antibiotischen Wirkstoff es Diese Erfindung
bezieht sich auf eine neue Chein ische Verbindung 1-#j,- 1
cliloracetamidopropaii-i,3-diol,
die als therapetitisches Nlittel auf Grund ihrer antihiotischen Eigensch- aften
wertvoll ist.
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Die neue Verbindun- hat die enipirisclie Formel CI1H1205N2C1, und
besitzt ein Molekulargewicht voll 321,1. Sie enthält nach der Analyse 41,00/0
KohlenStOff, 3,740/0 Wasserstoff, 8,640/0 Stickstoff und 21,7"lo Chlor. Diese 'Verbindung
wird in einer optisch aktiven Form erhalten, welche vereinbarungsgernäß als die
1- oder Linksform bezeichnet wird. Ihre o )tische Drehung [a125 ist -25,5-'
in 1 D
Ättivlacetat und + iK# in Äthanol. Der chemische Name dieser
neuen Verbindung ist pheiiyl-2-didliloracetamidopropaii-i. 3-diol und hat die folgende
Strukturformel
Sie ist ein fester KÖrper und wird als farblose 'Kadeln oder längliche Platten mit
-einem Schmelzpunkt
i5o bis 151' (unkorrigiert) erhalten. Die Verbindung
ist weiter durch die Tatsache gekennzeichnet, daß sie ein A,."" bei 27811,u
und ein EI% 1 c. von 312 (o,i n-HCI) bei der Analyse des Ultraviolettabsorptionsspektrums
zeigt.
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1 -ip-i-p-Nitrophenyl-2-dichloracetamidopropan-1, 3-diol ist
in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur bis zu einem Ausmaß von etwa
2,5 mg/Ccm löslich. Es ist verhältnismäßig unlöslich in kaltem
5 0/eigem Natriumbicarbonat, aber löst sich langsam in 5 0/0 Natronlauge.
Es kann aus Wasser oder organischen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen,
wie Methylendichlorid, Äthylendichlorid und Ärherpetroläther umkristallisiert werden.
Es ist in einer Vielzahl organischer Lösungsmittel löslich und kann aus wässerigen
Lösungen durch viele der mit Wasser weniger mischbaren organischen Lösungsmittel
extrahiert werden. Zum Beispiel ist es in Cyclohexanon, Methylisobutylketon, n-Butanol,
Amylacetat, Äthylacetat, Nitrobenzol, Nitromethan und Äther löslich und kann mit
diesen aus wässerigen Lösungen extrahiert werden. jedoch ist diese Verbindung in
aromatischen und aliphatischen Kohlenwasserstoffen, wie Benzol, Toluol, Pentan und
Petroläther praktisch unlöslich.
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Im Gegensatz zu den meisten antibiotischen Stoffen besitzt das Antibiotikum
dieser Erfindung eine bemerkenswerte Stabilität gegen Wärme, Säure und Alkalien.
Zum Beispiel wurde gefunden, daß es in destilliertem Wasser auf 37' für mirrdestens
i Monat und auf ioo' für etwa 5- Stunden ohne merklichen Verlust an antibiotischer
Wirksamkeit erhitzt werden kann. Unter ähnlichen Bedingungen werden gut bekannte
Antibiotika, wie Penicillin, Streptothricin und Streptomycin, vollständig inaktiviert.
Die Verbindung ist in wässerigen Lösungen innerhalb eines PH-Bereichs von 0,4 bis
etwa io für wenigstens 24 Stunden bei Raumtemperatur stabil. Versuche haben ergeben,
daß es in sauren Lösungen viel stabiler ist als Streptomycin, eines der stabilsten
der bekannten Antibiotika. Zum Beispiel wird Streptornycin innerhalb 24 Stunden
durch i n-Salzsäure bei Raumtemperatur zu go% inaktiviert, während das Produkt nach
der Erfindung unter den gleichen Bedingungen seine antibiotische Wirksamkeit voll
beibehält.
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Die neue Verbindung 1-V-i-p-Nitrophenyl-2-dichloracetamidopropan-I,
3-,diol ist stark bakteriostatisch wirksam gegen gramnegative Bakterien als sowohl
gegen die säurefesten wie auch gegen die nicht säurefesten Arten der grampositiven
Bakterien. Es ist auch wirksam gegen die Mikroorganismen, die für Typhusfieber verantwortlich
sind, z. B. Rickettsia prowazelki. Einige Beispiele der grampositiven Bakterien,
gegen die die neue Verbindung wirksam ist, sind Streptococcus hämolyticus, Streptococcus
aureus, Bacillus subtilis und mycobacterium tuberculosis. Unter den vielen gramnegativen
Bakterien, gegen welche die Verbindung ihre bakteriostatische Wirksamkeit zeigt,
sind Bakterien, wie Escherichia coli, Salmonella schottmuelleri, Klebsiella pneumoniae
und Shigella paradys-enteriae (Sonne). Im allgemeinen ist die bakteriostatische
Wirkung dieses neuen Antibiotikums ähnlich derjenigen von Streptomycin, aber in
einigen Fällen, besonders in-i Fall von Shigella paradysenteriae ist es sehr viel
wir - ksamer als Streptomycin. Es ist im allgemeinen wirksamer gegen gramnegativ-e
Bakterien als gegen grampositive Bakterien.
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Die Toxicität des Antibiotieums nach der Erfindung ist viel geringer
als die solcher wohlbekannter Antibiotika, wie Tyrothricin, Actinomycin, Clavicin
und ähnlicher, aber etwa die gleiche wie diejenige von Streptomycin.
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Das neue Antibioticum gibt, wie gefunden wurde, therapeutische Blutspiegel,
sowohl wenn es auf parenteralem wie auch auf oralem Wege appliziert wird. Diese
Tatsache, daß es eine günstige Wirkung ausübt, wenn es oral angewandt wird, ist
im Hinblick auf die Tatsache, daß im Augenblick Penicillin fast das einzige Antibioticum
ist, welches bei oraler Anwendung therapeutische Blutspiegel gibt, überraschend.
Sogar in diesem Falle macht die Zerstörung des Penicillins durch die Verdauungssäfte
es notwendig, etwa das Drei- bis Vierfache der intramuskularen Menge. von Penicillin
anzuwenden, um therapeutische Blutspiegel zu erhalten. Die Antibiotica, welche am
wirksamsten gegen gramnegative Bakterien sind, wie Streptornycin, sind vollständig
wirkungslos, wenn sie oral gegeben werden, auf Grund der Tatsache, daß sie vom Verdauungstraktus
nicht absorbiert werden. Es ist also zu beachten, daß dieses neue Antibioticurn
das erste Antibioticurn darstellt, das einen hohen Grad von Aktivität gegen gramnegative
Bakterien zeigt und das bei oraler Anwendung therapeutisch wirksam ist. Die übliche
orale oder parenterale Dosierung dieses neuen Antibioticums bei der Beharidlung
von Infektionen der Harnwege oder des gastro-intestinalen Tractus beträgt i bis
iog täglich, natürlich in Abhängigkeit der Art und des Ausmaßes der Infektion.
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Die neue antibiotische Verbindung nach der Erfindung 1-ip-i-p-NitrOplIelly1-2-dichloracetamidoj)ropan-i,
3-diol kann aus Kulturen einer Aetinomycete,.g,enannt Streptomyces venezuelae, gewonnen
werden. Dieser Mikroorganismus kommt u. a. im Erdboden vor und ist charakterisiert
durch verzweigte, zarte Mycelien, selten oder nicht mit Klumpen versehen (septate),
durch in die Luft greifende Hyphen, die ein anscheinend endogenes Wachsen durch
Glieder einzelliger Sporen geben, die nicht normal unterteilt sind wie bei Oidia,
und durch unverzweigte Sporenträger und Sporenglieder.
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Kulturen dieses Organismus können durch Mischen von Kulturen spezifischer
Bakterien, die durch den Mikroorganismus gehemmt werden, mit wässerigem Agar und
Zufügung einer Bodenprobe, die das gewünschte Streptornyces venezuelae enthält,
erhalten werden, Nach Bebrüten des Gemisches für i bis io Tage erscheinen Kolonien
der gewünschten Actinomycete und anderer Antagonisten. Die Streptomyces-venezuelae-Gewächse
werden ausgelesen,
auf einen neuen Nährboden übertragen und später
als Reinkulturen nach üblichen Verfahren isoliert.
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Gemaß der Erfindung wird 1-V-i-p-Nitrophenyl-2-dicliloracctamidopropan-I,
3-diol durch Impfen eines geeigneten Nährbodens mit Streptomyces venezuelae und
durch Bebrüten des Gemisches unter aeroben Bedingungen bei etwa 2o bis 40' für etwa
2 bis 15 Tage erzeugt. Nach Entfernung der Feststoffe aus den Kulturgemischen
wird das gewünschte Antibioticum aus der Kulturflüssigkeit isoliert.
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Die Züchtung des Organismus in dem Nährmedium kann in einer Reihe
verschiedener Wege durchgeführt werden. Zum Beispiel kann der Mikroorganismus unter
aeroben Bedingung-en auf der Oberfläche des Mediums gezüchtet werden, oder man kann
ihn unterhalb der Oberfläche des Mediums, d. h. unter Tauchbedingungen züchten,
wenn gleichzeitig Sauerstoff zugeführt wird.
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Kurz gesagt, die Herstellung dieses neuen Antibioticums nach der Oberflächenkulturmethode
beinhaltet die Impfung einer dünnen Schicht, gewöhnlich weniger als etwa 2 cm, eines
sterilen wässerigen Nährrnediums mit Streptomyces venezuelae und Bebrüten des Gemisches
unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen etwa 2o bis 40', vorzugsweise
bei Raumtemperatur (etwa 25') für eine Zeit von etwa io bis 15 Tagen. Das
Mycel wird dann von der Flüssigkeit, die das gewünschte 1-V-i-p-Nitrophenyl-2-dichloracetamidopropan-I,
3-diol enthält, entfernt, und das Produkt wird aus der Kulturflüssigkeit durch die
nachfolgend beschriebenen Methoden isoliert.
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Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von 1-V-i-p-Nitrophenyl-2-dichloracetamidopropan-i,3-diol
in großem Maßstabe besteht in der Verwendung von getauchten oder tiefen Kulturen
des Organismus. Gemäß dieser Ausführung der Erfindung wird ein steriles wässeriges
Nährmedium mit Streptomyces venezuelat beimpft und unter Rühren und Belüftung bei
einer Temperatur von etwa 20 bis 4o', vorzugsweise in der Nähe von 25c1, etwa 2
bis 7 Tage bebrütet. Unter diesen Bedingungen entwickelt sich der Organismus
als eine Anzahl mehr oder weniger getrennter Partikel, die im Nfedium dispergiert
sind im Gegensatz zu der mehr oder minder kontinuierlichen Haut, die an der Oberfläche
des Mediums beim Oberflächenkulturverfahren vorhanden ist. Dank dieser Verteilung
des Organismus innerhalb des Mediums können große Volumen des beimpften Nährmediums
zu gleicher Zeit in den großen Tanks und Fässern, wie sie üblidherweise in der Gärungsindustrie
verwendet werden, gezüchtet werden. Stationäre Gärfässer, ausgerüstet mit geeigneten
Rühr- und Belüftungseinrichtungen sowie auch horizontale Drehtrommelgärbehälter
wurden als besonders zweckmäßig in dieser Hinsicht gefunden. jedoch kann für die
Herstellung kleinerer Mengen des -\ntibioticurns oder von Kulturen des Mikroorganismus
diese Tauchkulturmethode auch in kleinen Flaschen durchgeführt werden, welche entweder
geschüttelt oder durch geeignete mechanische Vorrichtungen gerührt werden.
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Das Rühren und die Belüftung des Kulturgemisches kann auf einer Reihe
von Wegen durchgeführt werden. Das Rühren kann durch einen Propeller oder ähnliche
mechanische Rührvorrichtung durch Rotierenlassen oder Schütteln des Gärbehälters
selber, durch zahlreiche Pumpvorrichtungen oder durch das Durchleiten von Luft oder
anderen sauerstoffhaltigen Gasen durch das Medium bewirkt werden. Die Belüftung
kann durch Hineindrücken von Luft oder anderen saüerstoffhaltigen Gasen in das Gärgemisch
durch offene Rohre, perforierte Rohre, poröse Diffusionsmedien, wie Kohlestäbchen,
Karborundum, gesintertes Glas o. dgl., erfolgen, oder sie kann durch Versprühen,
Verspritzen oder Ausgießen der Maische in oder durch eine sauerstoff haltige Atmosphäre
erreicht werden.
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Eine große Anzahl von Nährmedien kann in der Wachstumsstufe des Verfahrens
benutzt werden. jedoch wurde gefunden, daß die besten Ergebnisse erhalten werden,
wenn ein wässeriges Medium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und ein eiweißhaltiges
Material enthält, verwendet werden. Die assimilierbare Kohlenstoffquelle soll hier
umfassen mehrwertige Alkohole und Mono-, Di- und Polysacharide, während der Begriff
eiweißhaltiges Material unveränderte Eiweißstoffe und Eiweißabbauprodukte, besonders
solche Produkte, die bei der Hydrolyse von Eiweißstoffen entstehen, umfaßt. Diese
Eiweißabbauprodukte umfassen Proteosen, Peptone, Polypeptide, Peptide und Aminosäuren.
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Als assirnilierbare Kohlenstoffquellen seien Glycerin, Sorbit, Glucose,
Fructose, Rohrzucker, Inulin, Dextrine und Stärke erwähnt. Diese Kohlenstoff
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quellen können in reiner Form oder als Konzentrate, wie.Molkekonzentrate,
verflüssigte oder modifizierte Stärke, Waschflüssigkeiten aus Getreidemaische, Melasse,
Maissyrup, Getreidemaische u. ä. vorhanden sein. Einigt der Getreidemaischen
wie auch einige Molkekonzentrate sind hinreichend eiweißreich, so daß gesonderte
Eiweißzusätze zu dem Medium nicht gemacht werden brauchen. Diese letztgenannten
Stoffe enthalten auch beträchtliche Mengen von Mineralien und Wachstumsfaktoren,
welche für die Herstellung des Antibioticums günstig sind. Zuckeralkohole und insbesondere
Glycerin wurden als sehr wünschenswerte Bestandteile des Mediums gefunden, da sie
zu bewirken scheinen, daß ein Teil des Antibioticums in einer für die Reaktion leicht
zugänglichen Form gebildet wird und somit die aus einem gegebenen Medium erhältliche
Menge, des Antibioticums erhöhen.
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Einige Beispiele für eiweißhaltige Stoffe, die in der Nährlösung verwendet
werden können, sind: mit Säure oder Enzymen hydrolysiertes Kasein, Getreideschlempe,
lösliche Stoffe der Getreidemaische, Mais- oder Weizenwaschflüssigkeit-en, Molke
oder Molkekonzentrate, Sojabohnenmehl, mit Säure hydrolysierter Mais, Weizenkleie,
Pepton, Brauhefe, obergärige Hefe und synthetische Gemische von Aminosäuren. Diese
eiweißhaltigen
Stoffe brauchen nicht in reiner Form zugeführt werden,
da die weniger reinen Stoffe, welche Wachstumsfaktoren und beträchtliche Mengen
von Mineralnährstoffen enthalten, für die Verwendung geeignet sind. Ein Gemisch
von Pepton oder Aminosäuren mit getrockneter Getreideschlempe oder Waschflüssigkeiten
der Getreidemaische ist als eiweißhaltiges Material für das Medium besonders geeignet.
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Die Isolierung des reinen kristallinen Antibioticums aus dem Kulturmedium
kann auf eine Anzahl verschiedener Wege erreicht werden. jedoch besteht im allgemeinen
das bevorzugte Verfahren im Klären der rohen Kulturflüssigkeit bei einem PH unter
etwa io, Extraktion der Lösung mit einem organischen Lösungsmittel, das einen Verteilungskoeffizienten
zwischen Lösungsmittel und Wasser für das Antibioticum über etwa 9 aufweist,
wie Cyclohexanon, Butanol, Äthylacetat und Butylacetat, im Entfernen des organischen
Lösungsmittels aus dem Extrakt, im Extrahieren des Rückstandes mit einem organischen
Lösungsmittel, das ein Verteilungskoeffizient zwischen Lösungsmittel und Wasser
für das Antibioticum zwischen etwa i und 9 aufweist, wie Nitrobenzol, Nitromethan,
t)iäthyläther und Äthylendichlorid, im Waschen des Extraktes mit verdünnter Mineralsäure
und Wasser oder gegebenenfalls, wenn ein Lösungsmittel, wie ein niederer Dialkyläther
(Diäthyläther o. dgl.) oder Äthylendichlorid als Extraktionslösungsmittel verwendet
wurden, im Leiten des Extraktes durch eine Aluminiumoxydadsorptionssäult, im Zufügen
von Wasser zum organischen Lösungsmittelextrakt, im Verdampfen des organischen Lösungsmittels
aus dem Gemisch, in der Extraktion der wässerigen Lösung mit einem organischen Füttlösungsmittel,
in dem das Antibioticum praktisch unlöslich ist, wie Benzol- oder Petroläther, im
Verdampfen der wässerigen Lösung bis zum Kristallisationspunkt und in der Gewinnung
des kristallin-eriAntibioticums aus der Lösung. Wenn die Säureextraktionsmethode
verwendet wird, ist es vorteilhaft, den organischen Extrakt auch mit, verdünntem
Alkali, wie Natriumbicarbonat, zu extrahieren, um saure Verunreinigungen zu entfernen.
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Eine Modifizierung des obigen Verfahrens besteht im Fortlassen der
ersten Extraktion der geklärten Kulturflüssigkeit mit einem organischen Lösungsmittel
und der nachfolgenden Verdampfung des Lösungsmittels aus dem Extrakt. Bei dieser
modifizierten Arbeitsweise wird die geklärte Extraktflüssigkeit mit einem organischen
Lösungsmittel mit einem #lerteilungskoeffizienten zwischen Lösungsmittel und Wasser
für das Antibioticum zwischen etwa i und 9 extrahiert und der Rest des Verfahrens,
wie oben beschrieben, ausgeführt.
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Ein anderes Verfahren, das zur Isolierung des gewünschten 1-V-i-p-Nitrophenyl-2-dichloracetamidopropan-i.
3-diol aus der geklärten Kulturlösung umfaßt die Adsorption des Antibioticums an
aktivierter Holzkohle und seine Eluierung mit Äther oder So%igem Aceton. Das Antibiotieum
wird aus dem
| Eluat durch Zugabe \-on Wasscr. (les |
| organischen Lösungsinittuls, .\])trennen liarzarti,#cr |
| Stoffe, die sich ausscheiden, und Konzentration der |
| wässerigen Lösung bis ziiiii Kristallisationspunkt |
| isoliert. |
| Die Erfindung wird durch die folgendcli Beispiele |
| erläutert. |
| B e i s p i e 1 1 |
| Ein Gemisch aus i 8o g GINIcerin, go g Peptoil, |
| go g Getreideschlempe, go g Natriumchlorid und |
| eine ausreichende '.Menge destilliertem Wasser, uni |
| das Volumen auf 18 1 zu bringen, wird in einen |
| 3o-I-Glasballon der stationären Gärtype, versehen |
| mit einem Verschluß aus rostfreiem Stahl und |
| ,einem Propellerrührerelrigebracht. Der Gärbehälter |
| enthält auch senkrechte Prallplatten und in der |
| Nähe des Bodens einen perforierten kreisförmigen |
| Ring zum Hineindiffundieren von Luft. |
| Der pri-Wert dieses Nährniediums wird mit |
| Natronlauge auf etwa 7,5 eingestellt und der Gär- |
| behälter in einen "'#utok-la#-eii eitigesetzt. Der Gär- |
| behälter und das Meditirn werden mit Dampf bei |
| 120' 1 Stunde sterilisiert, der G'ir»ehälter wird ab- |
| gekühlt und dann aus dein Autoklaveii entfernt. Das |
| Medium wird mit etwa 900 ccin einer geschüttelten |
| Flaschenkulttir von Streptonlyces N-enezuelae ge- |
| impft, die durch Impfung von ioo ccrn einer sterilen |
| Nährlösung, wie oben beschriehen, mit Sporen des |
| Pilzes und Bebrüten des Gernisches in einem |
| 5oo-ccm-Erlenmeyerl#oll)eii. der auf einer Schüttel- |
| maschine etwa 72 Stunden bei Raumtemperatur |
| geschüttelt wurde, hergestellt wurde. |
| Nach der Beimpfung wird die Kultur bei 24 |
| biS 25,5' 65 bis 70 Stunde" 1)el)i-iitet, \\ährend
der |
| Bebrütung wird sterile Luft durch den Diffusions- |
| ring in das -Medium mit einer Geschwindigkeit von |
| o,8 bis i Volumen je '\"oltiiiieii Medium in der |
| Minute eingeleitet und der Rührei- mit einer Ge- |
| schwindigkeit von etwa 2oot'ni(Ire]iLingen je Minute |
| rotieren gelassen. |
| Die folgende Tabelle illustriert die Erzeugung an |
| Antibioticum, die bei dem (-)hen beschriebenen Ver- |
| fahren erhalten wurde. |
| Brützeit #likrolgramin Aritibioticum |
| Stunden je Kubikzentimeter Kulturflüssigkeit |
| 23 44 |
| 40 io6 |
| 47 116 |
| 64 133 |
| 71 132 |
Das gewünschte acetamidopropan-i, 3-di01 wird aus dem Kulturgemisch, enthaltend
132 ;'\111,rogriiiiiii Antibioticum
je Kubikzentimeter. in der folgenden
Weise isoliert.
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Die Kulturflüssigkeit wird init verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert
Von 2 angesäuert und dann mit ioSog -,#liiiiiiiiiurn-silicat Filterhilfe
behandelt. Nachdem IA-, bis i Stunde gerührt wurde, werden weitere io5o
g Filterhilfe zugefügt, und das
Gutnisch wird durch ein Aluminiumsilicatfilterbett
filtriert. Nach dem Waschen mit Wasser wird der Filterkuchen verworfen, und die
geklärte Flüssigkeit und die Waschwässer werden mit 1/4Volumen Äthylacetat extrahiert.
Die Äthylacetatschicht wird entfernt, die Extraktion nochmals wiederholt und die
zurückbleibende wässerige Lösung verworfen. Die vereinigten Äthylacetatextrakte
werden über Natriumsulfat getrocknet, und dann wird das Äthylacetat im Vakuum abdestilliert,
wobei die Temperatur des Rückstandes unter etwa 30- gehalten wird. Das gewünschte
Antibioticum wird aus (lern braunen Rückstand mit kleinen Mengen Äther extrahiert,
wobei eine Gesamtmenge von etwa 450 ccm benutzt wird.
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Der vereinigte Ätherextrakt wird durch eine trockene Aluntiniumoxydsäule
für chromatographische Zwecke, die vorlier auf einen PH-Wert von etwa 4,7 eingestellt
war, gegossen. Die in dieser Stufe verwendete Säule kann verhältnismäßig kurz sein,
aber sie sollte etwa 15 g Aluminiumoxyd je
ioo ccm Ätherextrakt enthalten.
Nach Auswaschen der Säule mit etwa 1250 ccm Äther zur Entfernung von etwa
zurückgebliebenem Antibioticum werden die abfließenden Ätherlösungen vereinigt und
der Äther wird im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird wiederholt mit einer Gesamtmenge
von etwa 2200 ccm destilliertem Wasser ausgezogen und der unlösliche Rückstand verlyorfen.
Die wässerigen Extrakte werden vereinigt, Mit 2'/2 Volumen Petroläther extrahiert,
und die Petrolätherextrakte werden verworfen. Gegebenenfalls kann Wasser zur Ätherlösung,
die nach dem Passieren der Adsorptionssäule erhalten wurden, zugefügt werden. Der
Äther wird von dem Zweiphasengemisch abdestilliert und die zurückbleibende wässerige
Lösung mit Petroläther extrahiert. Die wässerige Lösung oder der Extrakt, die bei
einem der vorhergehenden Verfahren erhalten wurden, werden im Vakuum bis zum Kristallisationspunkt
konzentriert, das Konzcntrat wird gekühlt, und das weiße kristalline 1-ip-i-p-.NTitrophenyl-2-#dichloracetamidopropan-I,
3-diol wird gesammelt. Etwa I,54g Antibioticum, schmelzend in der Nähe von 144 bis-
145' werden an dieser Stelle erhalten.
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Eine weitere Menge des gewünschten Produktes kann aus den Mutterlaugen
durch viermaliges Extralhieren mit dem gleichen Volumen Äther, Entfernung des Äthers
im Vakuum, wiederholte Extraktion des Rückstandes mit siedendem Methylendichlorid
und Konzentrierung der Methylendichloridextrakte bis zum Kristallisationspunkt erhalten
werden. Der Methylendichloridextrakt wird auf etwa 5' abgekühlt und das gewünschte
1-V-i-p-Nitrophenyl-2-dichloracetamidopropan-I, 3-diol gesammelt. Ungefähr o,18
g eines Produktes, schmelzend bei etwa 145', werden auf diese Weise gewonnen.
Nach ein oder zwei Umkristallisationen des obigen Materials aus Methylendichlorid,
Äthylendichlorid oder Äther-Petroläther-Gemisch wird das reine 1-V-i-p-Nitrophenyl-:2-dichloracetaraidopropan-i,
3-diol in Form farbloser Nadeln oder länglicher Platten bei i5o bis 151' (unkorrigiert)
und mit einer optischen Drehung [a]" von -25,5' in D
Äthillacetat
und + 181 in Athanol erhalten. Die Analyse des Produktes hat das folgende
Resultat ergeben: C 4i,oll/o, H 3,740/0, N 8,640/0 und organisches
Cl 21,7I%. Bei der Spektralanalyse durch Ultraviolettabsorption zeigte das Produkt
ein A""",
bei 270 Pli und ein EI% von 312 in o,i n-Salzlcm säure.
Es wird naturgemäß von Sachkundigen beachtet werden, daß eine Reihe von Änderungen
in dem oben beschriebenen Verfahren zur Züchtung des Organismus und zur Isolierung
des reinen kristallinen Antibioticunis aus der rohen Kulturflüssigkeit angewendet
werden können. Zum Beispid können beim Verfahren der Isolierung andere Lösungs-Mittel,
wie Amylacylacetat, Cyclohexanon, Butanol oder Methylketon" als Ersatz für Athylacetat,
Nitromethan als Ersatz für Äther und Benzol oder Dicliloräthyläther als Ersatz für
Petroläther verwendet werden. Die Athylacetatextraktion des geklärten Bieres kann
bei einem PH-Wert von etwa 9
an Stelle von etwa 2 durchgeführt werden, in
welchem Falle es nicht nötig ist, die nachfolgend erhaltene Ätherlösung,des Antibioticums
durch eine Aluminiumoxydadsorptionssäule zu leiten. Die Ätherlösung wird gemäß dieser
Abänderung mit verdünnter Salzsäure ausgezogen, dann wird Wasser zur Ätherschicht
gegeben und der Äther aus dem Gemisch verdampft. Das Harz, das sich aus der Lösung
abscheidet, wird entfernt und die ätherfreie, wässerige Lösung zur Gewinnung des
kristallinenAntibioticums konzentriert. Eineweitere ,Methode zur Isolierung des
Antibioticums umfaßt die Absorption des vorhandenen Antibioticums in dem geklärten
Bier an Aktivkohle und seine Eluierung aus dieser mit Äther oder 8o%igem Aceton.
Beispiel 2 Ein Gemisch aus 134gMaltOse, 72gWaschflüssigkeit der Getreidemaische,
72 g hydrolysiertem Kasein, 72g Kochsalz und einer hinreichenden Menge
Wasser, um das Volumen auf 14 400 cem zu bringen, wird mit io n-Natronlauge auf
einen PH-Wert von 7,5 bis 7,7 eingestellt und in Teile von
je 300 ccm auf 48 weithalsige i-l-Erlenmeyerkolben aufgeteilt. Die Kolben
werden mit zwei Lagen Milchfilterscheiben aus Baumwollgaze überkappt und die Kappen
mit Federklammern gesichert. Die Flaschen werden in einen Autoklaven eingebracht
und bei 121' 20 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die Flaschen geöffnet
und mit 5 ccm je Flasche einer 3 Tage alten, durch unter Schütteln
erhaltenen Flaschenkultur von Streptomyces venezuelae geimpft. Die beimpften Kolben
werden mit Kappen versehen und dann 3 Tage bei 22 bis 2.4' auf einer rotierenden
Schüttelmaschine gezüchtet (150 Umdrehungen je Minute, Radius des Kreises
2 Zoll).
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12 1 der Kultur (PH-Wert 7,39), die eine Gesamtmenge
von 6oo mg gewünschtern Antibioticum enthalten, werden durch Zugabe von igo ccm
von
3 n-Salzsäure auf einen PH-Wert von 2 angesäuert. 304
g Aluminiumsilicatfilterhilfe werden zugefügt, und die Suspension wird 3o
bis 40 Minuten gerührt. Dann werden weitere 304 g Filterhilfe zugegeben und
das Gemisch durch eine Lage von 50 g Aluminiumsilicat filtriert. Der Filterkuchen
wird mit 1212 ccm destilliertem Wasser gewaschen und verworfen. Das Filtrat und
die Waschwässer werden vereinigt und unter Rühren während io Minuten mit 1/4 Volumen
Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird entfernt und die Extraktion
nochmals wiederholt. Die wässerige Schicht wird verworfen, und die vereinigten Äthylacetatextrakte
werden bei 5' über 5o g wasserf reiem , Natriumsulfat getrocknet.
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Das Natriumsulfat wird durch Filtration entfernt und das Äthylacetat
im Vakuum bei einer Backtempera - tur von 3o' abdes;illiert. Der braune Rückstand
wird mit kleinen Mengen Diäthyläther extrahiert, wobei insgesamt 300 ccm
an-gewendet werden. Der Ätherextrakt enthält 504 mg oder 84% des in der Kultur vorhandenen
Antibioticums.
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Der Ätherextrakt wird in drei Teile geteilt und jeder durch eine 5-g-Säule
(6,5 ZOIIXO,75 Zoll) aus Aluminiumoxyd gegossen, die vorher mit Salzsäure
auf einen PH-Wert von 4,7 eingestellt waren. i2occm Diäthyläther werden in Teilen
von je 20 cem durch jede der Säulen perkoliert. Die Auffangbehälter unter den Säulen
werden gewechselt, um insgesamt 5 Fraktionen aus jeder Säule zu sammeln.
Die vereinigten ersten Fraktionen enthalten 4i8mgAntibioticum, die zweiten Fraktionen
65 mg und die übrigen 17 mg.
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Die ersten und zweiten Fraktionen von den Säulen werden vereinigt
und der Äther im Vakuum abdestilliert. Der braune Rückstand wird wiederholt in destilliertem
Wasser extrahiert, wobei eine Gesamtmenge von 625 CCM verwendet wird. Die
vereinigten wässerigen Extrakte werden mit dem halben Volumen Petroläther geschüttelt
und die gxtraktion nochmals' wiederholt. Die Petrolätherextrakte werden verworfen,
und die wässerige Phase wird im Vakuum bei einer Badtemperatur ijon3o'bis zumKristallisationspunkt
(etwa20CCM) konzentriert. Die Lösung wird über Nacht bei 5'
gekühlt, die Kristalle
werden gesammelt, mit einer kleinen Menge kaltem Wasser gewaschen und über Calciunichlorid
im Vakuum getrocknet; Schmelz-1)Unkt 144,5 bis 145##; [2]D" # -2j5"3' in Äthylacetat.
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Weitere Mengen des gewünschten 1-ip-i-p-Nitroph,envl-2-dichloracetarnidopropati-i,
3-diol können aus den Mutterlaugen, wie in Beispiel i beschrieben, gewonnen werden.
Das, wie oben beschrieben, erhaltene kristalline Produkt kann, falls erwünscht,
weiter durch Umkristallisation aus Methyldichlorid oder Äthylendichlorid gereinigt
werden; Schmelzpunkt i 5o bis 15 1',