DE899247C

DE899247C - Verfahren zur Herstellung der Antibiotika C und D

Info

Publication number: DE899247C
Application number: DEP7627A
Authority: DE
Inventors: Quentin Royal Bartz; John Ehrlich; Roger Philip Frohardt; Theodore Herbert Haskell; Mildred Penner Knudsen
Original assignee: Parke Davis and Co LLC
Current assignee: Parke Davis and Co LLC
Priority date: 1951-05-11
Filing date: 1952-05-10
Publication date: 1954-01-18
Also published as: CH314485A

Description

AUSGEGEBEN AM 18. JANUAR 1954

P 7627 IVa j 30h

Die Erfindung bezieht sich auf neue chemische Verbindungen, die wegen ihrer antibiotischen Eigenschaften als Heilmittel wertvoll sind. Insbesondere betrifft die Erfindung die beiden Antibiotika, denen willkürlich die Namen Antibiotikum C und Antibiotikum D gegeben wurden.

Antibiotikum C ist eine kristalline basische Verbindung, die bei etwa 182 bis 184⁰ schmilzt und nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff enthält. Sie hat eine optische Drehung, [α] f, von etwa + 180,9° ^m Methanol, ein Molekulargewicht von etwa 552 in Kampferlösung und auf Grund der analytischen Daten 56,85% Kohlenstoff, 6,96 "/„Wasserstoff und 12,82 °/o Stickstoff, eine wahrscheinliche empirische Formel von C₂₆ H₃₇ O₈ N₅. Sie ist weiter charakterisiert durch Absorptionsmaxima im Ultraviolett bei 256 und 311, 5 τημ mit E₁ ¹,.^ 358 und 291 in 0,1 n-Salzsäure, bei 250 und 420,5 τημ mit E₁ ¹^₁ 270 und 536 in einem Phosphatpuffer von pn 7,0 und bei 330 πιμ mit E₁ ¹^ 626 in 0,1 η-Natronlauge. Die kräftigsten Absorptionsbanden im Infrarot-Absorptionsspektrum des Antibiotikum C sind diejenigen, die bei oder nahe 5,98, 6,09, 6,24, 7,99, 9,16, 9,50 und 9,62 μ liegen. Eine andere Gruppe von charakteristischen Absorptionsbanden von mäßiger Intensität tritt im Gebiet von 9,8 bis 12,7 μ auf. Als freie Base ist das Antibiotikum C in kaltem Wasser ziemlich spärlich löslich, aber leicht löslich in heißem Wasser, aus dem es sich beim Abkühlen ausscheidet. Es kann aus wäßrigen Lösungen mit n-Butanol extrahiert werden. Es ist in diesem Alkohol leicht löslich, ebenso wie auch in anderen niederen aliphatischen Alkoholen, aber unlöslich in Äthyläther.

Das Antibiotikum C bildet ein Hydrochlorid, das in Wasser und Methanol leicht löslich ist. Es wird aus dem Jetztgenannten Lösungsmittel durch Zugabe von

Äthyläther gefällt. Bei einer Konzentration von 3,12 bis 15,6 /xg/ccm hemmt das kristalline Antibiotikum C das Wachstum von Mycobacterium tuberculosis var. hominis H 37 Rv. vollständig.

Das Antibiotikum C gibt negative, Molisch-, Biuret, Sakaguchi-, Ninhydrin-, Eisenchlorid- und Fehling-Teste. Es gibt einen positiven Test für die Arylaminogruppe mit Ehrlichs Reagens und einen positiven Bratton-Marshall-Test für die gleiche Gruppe. Der Rf-Wert (bei aufsteigender Technik) in Äthylacetat (3), Wasser (3) und Essigsäure (1) beträgt für das Antibiotikum C 0,16. Der Rf-Wert in n-Butanol (10), Essigsäure (1) und Wasser (4) beträgt 0,28.

Das Antibiotikum C wird aus wäßrigen Lösungen durch viele übliche Fällungsmittel für Basen gefällt, z. B. durch p-Oxoazobenzol-p-sulfonsäure, Pikrinsäure, Orange II, Flaviansäure, p-Nitrobenzolazochromotropsäure, Kongorot, Milling-Gelb 3 G (Milling Zellow [3 G]). Die sich bildenden Fällungen sind wasserunlösliche feste Stoffe oder Harze, die größtenteils in niederen Alkoholen oder Methyl-Cellosolve löslich sind.

Das Antibiotikum D ist ein amorpher lohgelber basischer fester Stoff, der nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff enthält. Es ist in Wasser und Methanol stark löslich und in warmem Äthanol löslich, aus welchem Lösungsmittel es sich beim Abkühlen abscheidet. Es ist in Aceton, Äthyläther, Äthylacetat und Benzol unlöslich. Es ist weiter charakterisiert durch Absorptionsmaxima im Ultraviolett bei 314 ταμ mit E ^ 123 in o,in-Salzsäure, bei 302 τημ mit E₁ ¹,*, 125 in einem Phosphatpuffer pn 7,0 und bei 321,5 ταμ mit E₁ ¹,.* 143 in 0,1 η-Natronlauge. Bei einer Konzentration von 12,5 jtig/ccm hemmt das Antibiotikum D das Wachstum von Mycobacterium tuberculosis var. hominis H 37 Rv. Das Antibiotikum D hat einen Rf-Wert von 0,0 in Äthylacetat (3), Wasser (3) und Essigsäure (1) und einen Rf-Wert von 0,19 in n-Butanol (10), Essigsäure (1) und Wasser (4). Das Antibiotikum D gibt auch negative Teste mit Ehrlichs- und Bratton-Marshalls Reagens. Es wird aus wäßriger Lösung durch viele übliche Fällungsmittel für Basen gefällt, z. B. durch p-Oxyazobenzol-p-sulfonsäure, Pikrin-

Tabelle I

Antibakterielle Wirksamkeit der Antibiotika C und D und der klinisch untersuchten durch Actinomyceten erzeugten Antibiotika

Bakterienarten

Anti biotikum C	Anti biotikum D	Aureo- mycin	Chlor amphe nicol	Neo mycin	Strepto mycin	Strepto- thricin	Terra mycin
ΐ,ο	1,0	0,05	1,0	100,0	25,0	2,5—25	1,0
25,Ο	5,ο	0,1	5,ο	°,75	2,5	5,ο—ΐο	ο,75
5,0	2,5	ο, ι	¹⁾⁰	5ο,ο	50,0	50—·>ΐοο	°,75
3,1 —15,6	12,5	25—>ΐοο	6,25—12,5	6,25—12,5	6,25	12,5—50	25,0
25,0	12,5	12,5 -	5ο,ο	ο,39	ο,39	3,12	ο₎₇8
25,0	12,5	20Ο,0		ο,39	0,39	6,25	25,0
25,0	^Ι2,5	12,5.		> 12,5	ο,39	3,12	ΐ,56
-50,0	25,0	25,0		ο,ΐ9	> 100,0	6,25	0,7«
25,0	25,0	6,25		ο,39	6,2₅	25,0	!,56
50,0	12,5	20Ο,0		ο,39	ο,39	6,25	5θ,ο
25,0	12,5'	25,0		ο,ΐ9	• 3,ΐ2	6,2₅	3.Ϊ2
> 100,0	25,0	ο, ι	ο,5	ο,5	2,5	ο,75—2,5	ΐ,ο
> ΙΟΟ,Ο	ΙΟΟ,Ο	°,75	2,5	2,5	ΙΟ,Ο	5,ο	5,0
5,ο	ΐ,ο	Ο,2	0,2	> 2,Ο	> 2,0	7,5	ο,3
> 100,0	> ΙΟΟ,Ο	°,5	¹J⁰	ο,25	' °,5	°,5	2,5
100,0	5θ,ο	Ο,ΐ	ΐ,ο	ΙΟ,Ο	25,Ο	IO—25	Ι,Ο

Viomycin

Grampositive Arten
Diplococcus pneumoniae
Micrococcus pyogenes

var. aureus

Streptococcus

hämolyticus .

Säurefeste Arten

Mycobacterium tuberculosis var. hominis
H 37 Rv

Mycobacterium sp.

ATCC 607

Stammkultur

Aureoraycin

beständig ...

Neomycin

beständig

Streptomycin

beständig

Streptothricin

beständig

Terramycin

beständig

Viomycin

beständig

Gramnegative Arten
Aerobacter aerogenes ..

Escherichia coli

Hämophilus pertussis ..
Klebsieila pneumoniae..

Vibrio comma

Den in dieser Tabelle nicht erwähnten Antibiotika fehlt eine 'kennzeichnende Anti-Tuberkulose-Wirkung.

50,0

> 100,0

6,25—12,5 1,56

6,25

1,56

0,78 3.12

115 6,25

12,5

25,0

> 10O₁O

50,0

10,0 ΐοο,ο

Tabelle II

Aussehen von Glukose-Tripton-Agar* und Actinophage-Empfindlichkeit von Streptomyces C 1730
und anderen antibiotischen Streptomyces-Arten

	Erzeugtes Antibiotikum	Mycel	Form des	Farbe von	Farbe der	Substrat Farbe im	Empfind
Streptomyces- Arten		Luftmycel	Luftmycel und Sporen	Rückseite	Agar	lichkeit gegen S.
	Antibiotika	gewellt, Schleifen	weiß bis grau	farblos bis	keine	Griseus " phage
C 1730 . . ....	C und D	und Spiralen		gelblich bis grau		0
	Actinomycin	gerade	weiß bis grau	schwarz	schwarz
Antibiotikum	Aureomycin	gerade	weiß bis grau	gelb bis lohgelb	keine	0
Aureofaciens	Viomycin	gerade bis	weiß bis lavendel	rot-violett	keine	0
Floride		leicht gewellt	bis grau-grün			!
	Neomycin	gerade, manchmal	weiß bis	farblos	keine
Fradiae	Fradicin	Schleifen	Seemuschelrosa	bis lohgelb		O
		und Spiralen
	Streptomycin	gerade bis	weiß bis hellrosa	farblos	keine
Griseus	Actidion	leicht gewellt	bis hellgraugrün	bis hellbraun		+
				bis lavendel
	Grisein	gerade bis	weiß bis hellrosa	farblos	keine
Griseus ... ...		leicht gewellt	bis hellgraugrün	bis lohgelb		_o
	Streptothricin,	gerade, manchmal	weiß bis rosa	schwarz	schwarz
Lavendulae	Lavendulin,	Schleifen	bis lavendel			O
	- Streptolin	und Spiralen
	Terramycin	Spiralen	weiß	gelb	keine
Rimosus	Actinorubin	Spiralen	" weiß bis rosa	rosa bis rot	keine	O
Sp. A 105			bis grau			O
	Chloramphenicol	gerade	weiß bis grau	schwarz	schwarz
Venezulae		O

*) Selman A. Waksman, J. Bact. 46, 300 (1943).
+ = empfindlich
ο = nicht empfindlich

säure, Orange II, Flaviansäure, p-Nitrobenzolazochromotropsäure, Kongorot oder Milling-Gelb 3 G.

Die sich bildenden Fällungen sind wasserunlösliche Teststoffe oder Harze, die zum größten Teil in niederen Alkoholen und in Methyl-Cellosolve löslich sind.

Die Antibiotika C und D sind gegen gewisse säurefeste Bakterien, die die auslösenden Stoffe für die Tuberkulose sind, sehr wirksam. Die Wirksamkeit von Antibiotikum C und D gegen Mycobacterium tuberculosis var. hominis H 37 Rv ist etwa gleich derjenigen von verschiedenen bekannten Antibiotika, wie Viomycin, Streptothricin, und Neomycin und größer die von Aureomycin. Diese neuen Antibiotika sind auch sowohl gegen grampositive als auch gegen gramnegative Bakterien stark bakteriostatisch wirksam. Einige Beispiele der krankheitserregenden grampositiven Bakterien sind Diplococcus pneumoniae, Streptococcus hämolyticus, und Micrococcus pyogenes var. aureus. Unter den gramnegativen Bakterien, gegen welche diese Produkte ihre bakteriostatische Wirkung zeigen, befinden sich solche pathogene Bakterien, wie Hämophüus pertussis und Escherichia coli. Die Tabelle I (S. 2) erläutert eingehender die charakteristischen antibiotischen Eigenschaften (spectra) der Antibiotika C und D im Vergleich dieser Eigenschaften von bekannten durch Actinomyceten erzeugten Antibiotika.

Nach der Erfindung werden die Antibiotika C und D durch aerobische Züchtung von Kulturen von Actinomyceten der Art Streptomyces mit der Laborations-

nummer C 1730 erzeugt. Dieser Mikroorganismus kommt unter anderem in Böden vor. Die Kulturen können durch Mischung von Kulturen der spezifischen Bakterien, die durch die Antibiotika C und D gehemmt werden, mit wäßrigem Agar und Zugabe eines Bodens erhalten werden, der das gewünschte Streptomyces C1730 enthält. Nach Züchtung des Gemisches während 1 bis 10 Tage erscheinen Kolonien der gewünschten Actinomyceten und anderen Antagonisten. Das Streptomyces-C-1730-Wachstum wird ausgewählt, auf ein neues Nährmedium übertragen und später als Reinkultur nach üblichem Verfahren isoliert. Eine lebende Kultur dieses Mikroorganismus wurde beim Parke-D avis-&-Co. -Kultur-Bureau, Detroit, Mich, unter der Nummer 04818 eingereicht. Mikroskopisch ist der Organismus eine aerobe Actinomycete, die verzweigte schlanke Luftmycel bildet, die selten oder garnicht unterteilt sind, und aufsteigende Ketten einzelliger Konidien bilden und ist daher ein Glied der Genus Streptomyces. Bei Züchtung auf einem Glukose-Tryptone-Agar-Medium erscheint das feuchte junge primäre Mycel farblos bis gelblich, später grau werdend. Das sekundäre Luftmycel ist zuerst weiß und wird später grau. Im Agar erscheint wenig oder kein Pigment. Die Oberflächenkolonien sind kreisförmig, nach oben gewölbt, gewinkelt oder radial mit Rippen versehen, mit einer vollständigen oder gewellten Grenzlinie. Das feuchte Primärmycel ist glasklar und stark verzweigt. Das sekundäre Luftmycel ist ebenfalls stark verzweigt.

Es treten primäre, sekundäre und manchmal tertiän Verzweigungen auf und können wechselweise, entgegengesetzt angeordnet oder gelegentlich gelock sein. Das Luftmycel ist gewellt und bildet oft am Ende Schleifen oder lose Spiralen. Die Außenenden dieser Lufthyphen unterteilen sich in Konidienketten und 15 bis 55 Mikronlänge. Die Konidien sind glasklar, kugel- bis eiförmig und im Durchschnitt von 0,85 Mikrondurchmesser (Bereich von 0,5 bis 1,2) und 1,3 Mikronlänge (Bereich0,8bis 1,8). DieTabellell (S.3) erläutert die charakteristischen Unterschiede zwischen " Streptomyces C1730 und anderen Actinomyceten, die Antibiotika erzeugen, in der Erscheinungsform und in der Empfindlichkeit gegen Actinophage. Der Organismus verflüssigt Gelatine langsam ohne Pigmentbildung und peptonisiert Lackmusmilch gewöhnlich mit einer basischen Reaktion. In einem synthetischen Medium (Gottlieb) verwertet der Organismus zahlreiche Kohlenstoffquellen einschließlich 1-Arabinose, Dextrose, d-Fruktose, d-Galaktose, 1-Inosit, Laktose, Maltose, d-Mannit, Rhamnose, Stärke und d-Xylose, weniger leicht Inulin, Raffmose, d-Sorbit und Sacharose und verwertet aber nicht Dulcit. Der Organismus verwertet anorganische und organische Stickstoffverbindungen.

Tabelle III (S. 5) gibt einen Vergleich der Fähigkeit von Streptomyces C 1730 und der verschiedenen bekannten Actinomyceten, die Antibiotika erzeugen, verschiedene Kohlenstoffverbindungen beim Wachstum auf einem Medium aus Agar, anorganischen Salzen und der zu prüfenden Kohlenstoffverbindung zu verwerten. Wie oben angegeben, werden die Antibiotika C und D durch aerobische Züchtung einer Kultur von Streptomyces C 1730 erzeugt. Dies wird gewöhnlich erreicht, indem man ein geeignetes Nährmedium mit Streptomyces C 1730 beimpft und das Gemisch unter aeroben Bedingungen bei etwa 20 bis 40° etwa 2 bis 15 Tage lang züchtet. Bei wäßrigen Medien wird das feste Material, das im Kulturgemisch vorhanden ist, entfernt, und die gewünschten Antibiotika werden aus der Kultur durch die hernach beschriebenen Verfahren isoliert. Bei Verwendung fester Nährmedien wird das Kulturgemisch gut mit einem Lösungsmittel für die Antibiotika, wie Wasser oder Methanol, gewaschen und die gewünschten Antibiotika werden aus dem Extrakt isoliert. Während der Züchtung wird die Temperatur vorzugsweise in der Nähe von 22 bis 29° gehalten. Bei Verwendung wäßriger Nährmedien soll der Anfangs-pH-Wert zwischen 6 und 8,2, vorzugsweise auf der alkalischen Seite zwischen Ph 7,3 und J₁J, liegen. Bei Beimpfung der Nährmedien können Sporensuspensionen, Nachkulturen oder Strichkulturen (culture slants) von Streptomyces C 1730 verwendet werden.

Die Züchtung des Mikroorganismus in dem wäßrigen Nährmedium kann in einer Reihe von verschiedenen Wegen erfolgen. Zum Beispiel kann der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen auf der Oberfläche des Mediums oder er kann unter der Oberfläche, d. h. submers, gezüchtet werden, wenn gleichzeitig Sauerstoff zugeführt wird. Die bevorzugte Arbeitsweise für die Herstellung der Antibiotika C und D in großen Massen umfaßt die Verwendung von submersen oder Tiefkulturen von Streptomyces C1730. Nach dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein steriles wäßriges Nährmedium" mit Streptomyces C 1730 beimpft und unter Rühren und Belüftung bei einer Temperatur zwischen 20 und 40⁰, vorzugsweise in der Nähe von 25 bis 35 °, etwa 1 bis 4 Tage lang gezüchtet. Unter diesen Bedingungen entwickelt der Organismus zahlreiche mehr oder weniger voneinander getrennte Teilchen, die im Gegensatz zu den mehr oder weniger zusammenhängenden Häutchen, die auf der Oberfläche des Mediums beim Oberflächenkulturverfahren vorhanden sind, im Medium verteilt sind. Dank dieser Verteilung des Organismus im Medium, können große Volumina des beimpften Nährmediums zur gleichen Zeit in großen Behältern oder Fässern gezüchtet werden, wie sie gewöhnlich in der Gärungsindustrie verwendet werden. Ortsfeste Gärfässer, die mit geeigneten Rühr- und Belüftungseinrichtungen versehen sind, sowie auch horizontale Drehtrommelgärbehälter sind, wie gefunden wurde, hierfür besonders wertvoll. Jedoch kann für die Herstellung kleinerer Mengen des Antibiotikums oder von Kulturen des Mikroorganismus dieses submerse Kulturverfahren auch in kleinen Kolben durchgeführt werden, die durch geeignete mechanische Mittel geschüttelt oder gerührt werden.

Das Rühren und Belüften des Kulturgemisches kann auf einer Reihe von Wegen erfolgen. Das Rühren kann mit Hilfe eines Propellers oder ähnlicher mechanischer Rühreinrichtungen oder durch Rotierenlassen oder Schütteln des Gärbehälters, durch verschiedene Pumpeinrichtungen oder durch das Hindurchleiten von Luft oder anderen sauerstoffhaltigen Gasen durch das Medium erfolgen. Die Belüftung kann durch Einleiten von Luft oder anderen sauerstoffhaltigen Gasen in das Gärgemisch durch offene oder perforierte Rohre, durch poröse Diffusionsmedien, wie Kohle-Stückchen, Carborund oder Sinterglas, bewirkt werden oder das Belüften kann durch Zerstäuben, Zersprühen oder Zerspritzen der Maische in oder durch eine sauerstoffhaltige Atmosphäre geschehen.

Das sauerstoffhaltige Gas soll vor dem Einleiten in das Kulturgemisch von Sporen, Bakterien und anderen Giftstoffen befreit werden. Dies kann sehr zweckmäßig durch Filtrieren durch eine Schicht aktiver Kohle erreicht werden. Die Geschwindigkeit der Luftzuführung für die optimale Erzeugung von Antibiotikum C und D hängt natürlich etwas von der Art des verwendeten Behälters, der Geschwindigkeit und Art des Rührens, dem pH-Wert, der Temperatur und anderen Bedingungen der Umgebung ab. In jedem Fall soll das sauerstoffhaltige Gas mit einer ausreichenden Geschwindigkeit zugeführt werden, um einen schwachpositiven Druck im Gärbehälter aufrechtzuerhalten und somit die Möglichkeit einer Vergiftung der Kultur durch Verunreinigungen aus der Luft auszuschließen. Es wurde gefunden, daß in iao inem 30-l-Gärtank eine Geschwindigkeit von 10 bis 1 je Minute gute Ergebnisse bei Verwendung eines sechsschaufeligen mechanischen Turbinenrührers mit etwa 10 cm Durchmesser 100 bis 200 Umdrehungen je Minute gegen vier im Umkreis angeordnete, senkrechte Prallflächen von 2,5 χ 40 cm ergibt.

Tabelle III

Kohlehydratverwertung durch Streptomyces C 1730 und andere antibiotische Streptomyces-Arten,

die aus synthetischem Agar**) gezüchtet wurden

= kein Wachstum, -f- = geringes Wachstum, -)-+== mittleres Wachstum, + + + ⁼ gutes Wachstum

+ + + + = sehr starkes Wachstum

unter

»

Kohlenstoffverbindung

1-Ara-

DuI-

d-Fruk-

O

cn

d-Galak-

1-Inu-

Q

Inu

Lak

0

'Mal

d-Man-

00

Raffi-

Rham-

d-Sor-

Suc

O

d-

Streptomyces-

suchtes

O

binose

cit

tose

sit

O

lin

tose

nit

nose

bit

rose

Xylose

Arten

Anti

4.4.4.4.

0

4-4.4-4-

4.4-4-4-

4-4-4-

0

4-4-

4-4-4.4-

4-4-4.

cn

0

4-4-4-4-

0

+++

biotikum

bis

C1730

Anti

++++

etwa

++++

++

etwa

++

++++

biotika

4-

O

4.4.4.

4.4.4.4.

O

++++

4.4.4.4.

0

4.4.4.

0

4.4.

C und D

Antibioticus . .

Acti-

4-4-4-4-

O

4-4.4-4-

4-4-4.4-

O

++

4-4-4-

0

++++

++

nomycin

Aureofaciens ..

Aureo-

Q

O

4-4.4.4-

4.4.4.4.

O

4.

4.4.4-4-

4-4-4-4-

0

++++

mycin

bis

Floridae

Viomycin

++++

O

0

4-4-4-4-

O

0

etwa

4-4-

0

+++

bis

T Tr 1

bis

Fradiae . . .

Neo

+

bis

+++

etwa

mycin,

0

O

4-4-4.4.

J I L_l_

O

0

4-4-4-4.

++++

0

++++

Fradicin

bis

T ! r~

bis

Griseus ......

Strepto

+

etwa

+++

etwa

mycin,

4-4-4-4-

O

4-4-4-4-.

4-4-4-4-

O

0

4-4-4-4.

4-4-4-4-

0

4-4-4-4-

0

++++

Actidione

T I i Γ

bis

Griseus

Grisein

etwa

4-4-4-

etwa

etwa .

+

4-

-Ι

O

etwa

O

0

4-4-4-4-

0

ο

0

bis

-t-

bis

Lavendulae ...

Strepto-

++++

bis

etwa

4.4.4-

4-

++++

thricin,

4-

Laven-

dulin,

Strepto-

4.4.4-4-

O

4.4.4.4.

++++

4.4.4.4.

O

4-4.4.4.

4.4.4.4.

4.

0

4.4.4.4.

O

etwa

Un

+

Rimosus

Terra-

4-4-4-4-

O

4-4.4.4-

4-4.4.4.

4-4-4-

4-4-4-4.

4-4-4.4-

4-4-4-4-

4.4.4.4.

4.4.4-4-

etwa

++++

mycin

4-

Sp. A 105 ....

Actino-

4-4.4.4.

O

4.4.4.4.

++++

O

4.

4.4.4.4.

0

4.4.4.4.

0

O

4.4.4.4.

rubin

Venezulae

Chlor

amphe

David Gottlieb, J. Bact. 56,

108 (1948)

nicol

10 to

00

-α

**) J. G. Pridham und

on

Cn

0

cn

OO CD CD

Eine Vielzahl von Nährmedien kann für die Wachstumsstufe des Verfahrens verwendet werden. Solche Medien sollen assimilierbare; Kohlenstoffverbindungen, eiweißhaltige Stoffe, Mineralsalze und Spuren von verschiedenen Nährstoffen,- Vitaminen und anderen Wachstumsstimulanzien enthalten, die sie gewöhnlich als Verunreinigungen in den anderen Bestandteilen des Mediums finden. Für die optimale Erzeugung der Antibiotika C und D soll das Nährmedium auch Fettstoffe enthalten. Assimilierbare Kohlenstoffverbindungen müssen, wie hier gesagt, werden soll, mehrwertige Alkohole und Mono-, Di- und Polysaccharide umfassen, während der Begriff eiweißhaltige Stoffe nichtmodifizierte Proteine und Eiweißabbaustoffe umfaßt, insbesondere solche... Stoffe, wie sie bei der Hydrolyse von Proteinen entstehen. Diese Eiweißabbauprodukte umfassen Proteasen, Peptone, Polypeptide, Peptide und Aminosäuren.

Als assimilierbare Kohlenstoffverbindungen können Arabinose, Fruktose, Galaktose, Laktose, Maltose, Rhamnose, Xylose, Glycerin, Mannit, Rhamnit u. dgl.

verwendet werden. Auch komplexe Kohlehydrate, wie Stärke, Dextrine, Gäfungs- und Des'tillationsnachläufe, Feststoffe aus Maiseinweichwasser, Maiseinweichwasser oder getrocknete Gärrückstände, können verwendet werden.

Unter den verwendbaren eiweißhaltigen Stoffen für die verschiedenen Medien befinden sich: Rindfleischextrakt, mit Säure hydrolisiertes Kasein, Rindfleischpepton, gemahlene Sojabohnenölkuchen, getrocknete Gärrückstände, wasserlösliches entfettetes und teilweise hydrolysiertes Sojabohnenmehl, Aminosäuregemische natürlicher oder synthetischer Herkunft, Harnstoff, Purine u. dgl. Die Verwendung von gemahlenen Sojabohnenölkuchen oder Sojaeiweißderivaten als Bestandteil des Nährmediums ist wünschenswert, da sie eine kleine Menge Fett für die Ausnutzung durch den Mikroorganismus enthalten. Die Haupterfordernisse des Mediums an Mineralstoffen können durch Zugabe von 0,1 bis 0,5 % von einem oder mehreren anorganischen Salzen, wie Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Dikaliumphosphat oderMonokaliumphosphat, erfüllt werden·. Die anderen Bestandteile des Nährmediums, d. h. Vitamine, Wachstumsstimulanzien u. dgl., sind gewöhnlich in hinreichender Menge in derrunreinen assimilierbaren Kohlenstoff- und bzw. oder Eiweißstoffen vorhanden. Die Isolierung der Antibiotika C und D aus der rohen "Kultur kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. Bei Verwendung eines festen Kulturmediums in der Wachstumsphase wird das Mycel mit einem Lösungsmittel für die Antibiotika C und D wie Wasser extrahiert, und die Produkte werden aus dem Extrakt, wie hernach beschrieben wird, isoliert. Bei Verwendung eines flüssigen Kulturmediums in der Wachstumsphase, kann das Gemisch zur Entfernung des Mycels nitriert werden, oder der pn-Wert des Gemisches kann mit" Säure auf etwa 2 bis 4 eingestellt werden, worauf dann das. Mycel durch Filtration entfernt wird.

Um die Antibiotika aus den obigen Extrakten zu gewinnen, können eine Lösungsmittelextraktion mit niederen, mit Wasser nicht mischbaren Alkoholen, wie n-Butanol, als Lösungsmittel oder ein Absorptionsund Eluierungsverfahren unter Verwendung von aktiver Kohle oder Ionenaustauschern als Adsorbientien und angesäuertem Methanol oder wäßrigem Ammoniak als Eluierungsmittel verwendet werden.

Die obigen Verfahren führen zu einem rohen Konzentrat, das durch Fraktionierung mit organischen Lösungsmitteln weiter gereinigt werden kann, z. B. durch Lösung in Methanol und fraktionierte Fällung mit Äthyläther oder durch Fällung mit einer Arylsulf onsäure mit nachfolgender Regenerierung aus dem hierbei gebildeten Farbstoffsalz.

Die Trennung der Antibiotika C und D aus dem gereinigten Rohkonzentrat kann auf einer Reihe von Wegen erreicht werden. Zum Beispiel kann das Antibiotikum C als kristalline feste Masse durch Umkristallisation des Konzentrationsrückstandes der wäßrigen Abläufe erhalten werden. Nach einer anderen Methode kann eine wäßrige Lösung des Rohkonzentrates, die Antibiotika C und D beide enthält, mit Ammoniak behandelt werden, um das Antibiotikum C fraktioniert zu fällen. Schließlich kann das Antibiotikum C aus einer wäßrigen Lösung der beiden Antibiotika durch Zugabe von Kaliumacetat als Fällung durch Einstellung des pn-Wertes und Aussalzen erhalten werden. Die Mutterlaugen, die bei einer der obigen Trennungsmethoden anfallen, werden mit Erfolg zur Gewinnung des Antibiotikums D verwendet. Eine Chromatographie mit Cellulose stellt eine geeignete Isolierung des Antibiotikums D dar. Das letztgenannte Produkt wird durch Cellulose aus seiner Lösung in einem Gemisch von Essigsäure, Äthylacetat und Wasser adsorbiert. Die Eluierung mit Wasser ergibt eine Ablauf flüssigkeit, aus der das Antibiotikum D nach Konzentrierung leicht erhalten werden kann.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1

Ein Gemisch aus 180 g gepulverter Maisstärke, 180 g mit säurehydrolysiertem Kasein, 90 g gemahlenem Sojabohnenölkuchen, 90 g Natriumchlorid und hinreichend Wasser zur Auffüllung auf ein Volumen von 18 1 wird in.einem ortsfesten 30-I-Gärgefäß aus Glas eingebracht, das mit einem Kopf aus rostfreiem Stahl und einem Turbinenrührer ausgerüstet ist. Der Gärbehälter ist mit Glas umkleidet und besitzt vier innere senkrechte Prallflächen von 2,5 X 40 cm. Der Gärbehälter ist auch für das Einleiten von drei Luftströmen in das Kielwasser des Rührers eingerichtet.

Der pH-Wert des Gemisches in dem Gärbehälter wird mit 10 η-Natronlauge auf 7,5 eingestellt. Zum Gemisch in dem Gärbehälter werden 72 g eines Gemisches aus rohem Schweineschmalz und Mineralöl zugegeben, das Mono- und Diglyceride und 18 g' "alciumcarbonat enthält. Der Gärbehälter und die Gärflüssigkeit werden 2 Stunden unter etwa 1,4 at Dampf sterilisiert. Der Gärbehälter und sein Inhalt werden abgekühlt und dann aus dem Autoklav entfernt. Die Gärflüssigkeit wird aseptisch mit 10 ecm Sporensuspensionen von Streptomyces C1730 be-

impft, die durch Schütteln eines 7 Tage alten Glukose-Trypton-Agarabstriches (slant) von Streptomyces C 1730 mit 10 ecm o,oi°/₀iger wäßriger Lösung von Marseiller Seife hergestellt wurde.
Nach der Beimpfung wird das Kulturgemisch 64 Stunden bei 24 bis 26° gezüchtet. Während der Züchtung wird durch den Diffusionsring sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,09 bis 1,161 Luft je Liter Flüssigkeit und Minute zugeleitet und der Rührer mit einer Geschwindigkeit von etwa 200 Umdrehungen je Minute laufen gelassen.

Die Erzeugung der Antibiotika während der Züchtung wird durch Entnahme von Proben und deren Untersuchung gegen Escherichia coli verfolgt. Nach 64 Stunden entspricht jeder Kubikzentimeter der Kultur 920/^g Standardlösung bei der Erprobung gegenüber Escherichia coli. Die Standardlösung ist ein Konzentrat der Antibiotika C und D von einer solchen Wirksamkeit, daß eine Lösung von 2,5 ^g

ao des Standards je Kubikzentimeter eine 5o°/₀ige Hemmung von Escherichia coli hervorruft.

Am Ende der Züchtungszeit werden die Flüssigkeiten von mehreren Gärungen der oben beschriebenen Art vereinigt. Der pm-Wert des Gemisches wird mit Schwefelsäure auf 2,47 eingestellt und das Mycel durch Filtration entfernt und gründlich mit Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate und Waschwässer (41,11) werden auf den pH-Wert 7,10 eingestellt und mit 6 Anteilen von je 101 n-Butanol extrahiert. Die vereinigten n-Butanolextrakte werden in einem Schnellverdampfer bei einer Temperatur unter 29° auf 10,6 1 konzentriert. Ein im wesentlichen inerter hellgelber Niederschlag, der sich während des Konzentrierens bildet, wird entfernt, das Filtrat wird achtmal mit je 1,51 wäßriger 0,01 η-Salzsäure extrahiert. Die vereinigten Säureextrakte werden mit einer hinreichenden Menge Ionenaustauscher-Harz (basische Stufe) zur Entfernung von überschüssiger Säure behandelt, und die Lösung in einem Schnellverdampfer bei 30⁰ auf 1,5 1 konzentriert. Diese Lösungsmenge wird im gefrorenen Zustande getrocknet, und der Rückstand 20,08 g entspricht 452 μξ Standard je Milligramm gegenüber Escherichia coli.

Für die weitere Reinigung des Rohkonzentrates werden 5 g in 25 ecm absolutes Methanol gegeben. Ungefähr 1,4 g unlösliche weiße feste Masse werden abgetrennt und viermal mit 5 ecm absolutem Methanol gewaschen. Die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten werden auf 50 ecm mit absolutem

Methanol verdünnt. Dann werden 100 ecm Äthyläther zugegeben, und der sich bildende gelbbraune Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Äthyläther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 2,4 g und das Produkt entspricht 900 μg Standard je Milligramm gegen Escherichia coli. Dieses gereinigte rohe Produkt besteht aus einem Gemisch der Hydrochloride der beiden Antibiotika und ist in Wasser leicht löslich.

Um das Antibiotikum C aus dem gereinigten rohen Konzentrat zu isolieren, werden 500 mg von diesem, gelöst in 65 ecm Wasser (pH 4,9), durch eine Kolonne geleitet, die ein Ionenaustauscher-Harz in der basischen oder Hydroxylstufe enthält. Die Säure wird dann mit Wasser gewaschen, bis die ablaufende Flüssigkeit keinen Test mehr mit Ehrlichs Reagens gibt. Die ablaufende Flüssigkeit wird durch Trocknen im gefrorenen Zustande konzentriert unter Gewinnung eines Produktes, das in 25 ecm warmem Wasser löslich ist. Ein Abkühlen dieser Lösung auf" ο bis i° ergibt einen gelatinösen Niederschlag, der aus heißem Wasser unter Gewinnung einer kristallinen Masse von Antibiotikum C in Form von Nadeln, F. 180 bis 182⁰, umkristallisiert wird. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum ergibt das Folgende:

ληιμ

ο,ΐ η-Salzsäure

Ph 7,0 Phosphatpuffer ...
0,1 η-Natronlauge

257

249 321 329

El 1

1% cm

368 292 266

535 639

Der Rf-Wert (aufsteigende Technik) für das Antibiotikum C in Äthylacetat (3) Wasser (3), Essigsäure (1) beträgt 0,16, in n-Butanol (10), Essigsäure (1), Wasser (4) 0,28.

Das Antibiotikum C gibt einen positiven Bratton-Marshall-Test und ebenfalls einen positiven Test mit Ehrlichs Reagens. Es entspricht 8i4_ittg/mg Standard gegenüber Escherichia coli.

Zur Isolierung des Antibiotikums D werden 150 mg gereinigtes rohes Konzentrat in einem Gemisch von 3 Teilen Äthylacetat, 3 Teilen Wasser und einem Teil Essigsäure gelöst. Diese Lösung wird mit einer Geschwindigkeit von 3 bis 4 ecm je Stunde auf eine Säule aufgegeben, die 35 g Cellulose (Solka-Floc) enthält. Die Säule wird dann mit frischem Lösungsmittel entwickelt, und Fraktionen von 3 ecm werden in Zwischenräumen von je 1 Stunde gesammelt. Wenn die ablaufenden Fraktionen gegenüber Ehrlichs Reagens negative werden, wird die Säule mit 100 ecm Lösungsmittel und dann mit Wasser eluiert. Das Wassereluat (etwa 100 ecm) wird in gefrorenem Zustande unter Gewinnung eines braunen Pulvers getrocknet. Ein Lösen dieses Produktes in Methanol und Fällung mit Äthyläther ergibt ein hellgelbes Pulver, das 1070 μg/τag Standard gegenüber Escherichia coli entspricht. Der Rf-Wert in Äthylacetat (3), Wasser (3) und Essigsäure (1) ist 0,0, während der Rf-Wert in n-Butanol (10), Essigsäure (1) und Wasser (4) 0,19 beträgt. Das feste Antibiotikum D zeigt eine hervorragende Aktivität bei der Erprobung gegen Mycobacterium tuberculosis var. hominis H 37 Rv. Das Absorptionsspektrum des Antibiotikums D bei verschiedenen pH-Werten zeigt nur ein Maximum, bei 314 ταμ E₁ ¹^ 123 in 0,1 n-Salzsäure, bei 302 ταμ E₁ ¹,*, 125 iⁿ Phosphatpuffer pn 7,0 und bei 321,5 ταμ E¹OT 143 in 0,1 n-Natronlauge.

Beispiel 2

In einer Reihe von i-1-Erlenmeyer-Kolben wurde ein Gemisch aus 1,5 g Cerelose, 1,5 g Glycerin, 0,9 g teilweise hydrolysiertes Kasein, 0,7 g Pepton, 0,3 g Brauhefe, 0,75 g Feststoffe aus Maiseinweichwasser, 0,75 g gemahlenen Sojabohnen Ölkuchen, 1,5 g Rück-

ständen der Butanol-Acetongärung, 1,5 g Natriumchlorid, 0,3 g Calciumcarbonat und hinreichend Wasser zur Auffüllung auf ein Volumen von 300 ecm einge- - bracht. Die Kolben wurden mit Baumwollgaze bedeckt und 20 Minuten unter etwa 1,3 at Dampf sterilisiert. Dann wurde jeder Kolben aseptisch mit ι ecm Sporensuspension von Streptomyces C1730 beimpft, die aus einer 30 Tage alten Glukose-Trypton-Agar-Strichkultur hergestellt wurde. Die Kolben wurden 4 Tage auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 115 Umdrehungen je Minute geschüttelt. Die Temperatur während der Züchtungsperiode wird bei 22 bis 24° gehalten. Am Ende der Züchtungszeit hat die Kulturflüssigkeit einen pH-Wert von etwa 6,7. Bei der Erprobung gegenüber Staphylococcus aureus enthält die Kulturflüssigkeit, wie gefunden wurde, hinreichend Antibiotikum C und D, um eine 63^D/„ige Hemmung des Wachstums des untersuchten Organismus bei einer Verdünnung von 1 zu 100 zu verursachen. Das Mycel wird aus der in den Kolben enthaltenen Brühe abfiltriert und der pH-Wert des Filtrates mit 3 η-Schwefelsäure auf 8,6 bis 7,17 eingestellt. Das Antibiotikum wird aus 100 ecm Filtrat durch viermalige Extraktion mit 25 ecm n-Butanol entfernt. Die vereinigten Alkoholextrakte werden bei weniger als 45° unter Gewinnung der Antibiotika C und D in Form eines rohen Konzentrates zur Trockene eingedampft.

ι g rohes Konzentrat wird in 20 ecm Wasser gelöst. Eine Lösung von 500 mg p-Oxyazobenzolp-sulfonsäure in 11 ecm Wasser werden zugegeben und verursachen sofort die Bildung einer harzartigen Fällung. Das Gemisch wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit dekantiert. Der harzartige Rückstand wird mit Wasser gewaschen und aus 6 ecm absolutem Äthanol und 9 ecm Wasser umkristallisiert. Die beim Abkühlen auftretende Fällung wird durch Zentrifugieren entfernt, gut mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet (Gewicht 570 mg). Der Farbstoffkomplex wird dann in 10 ecm Äthanol gelöst und als orangegelbes Pulver durch Zugabe von 30 ecm Äthyläther gefällt (Gewicht 470 mg).

450 mg dieses Farbstoffkomplexes werden in 20 ecm 5°°/oig^em Methanol gelöst, und eine wäßrige Bariumacetatlösung wird hinzugefügt, bis die Fällung von Barium-p-oxyazobenzol-p-sulfonat vollständig ist. Die Fällung wird abzentrifugiert und zur überstehenden Flüssigkeit wird 1 ecm überschüssiger 2 n-Schwefel· säure zugegeben, wodurch alle Bariumionen als Bariumsulfat gefällt werden. Dieses wird durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende klare gelbe Flüssigkeit wird dann durch eine Säule von einem Ionenaustauscher aus Kunstharz (basische Stufe) geleitet. Die ablaufende klare gelbe Flüssigkeit hat einen p_H-Wert von 7,6. Die Säule wird mit Wasser gewaschen, bis die Waschwässer mit Ehrlichs Reagens keinen Test mehr geben. Die Abläufe und Waschwässer ergeben beim Trocknen in gefrorenem Zustand ein hellgelbes Pulver (Gewicht 173 mg), das nso^g Standard je Milligramm gegenüber Escherichia-coli entspricht.

Zu 4g mg des gereinigten rohen Konzentrates, das beide Antibiotika C und D enthält, wird 1 ecm Wasser und genügend 1 η-Ammoniak zugegeben, um den PH-Wert auf 9,0 zu bringen. Ein weißer Niederschlag scheidet sich ab und wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Niederschlag wird mit kaltem Wasser gewaschen und aus io°/₀igem wäßrigem Methanol umkristallisiert und ergibt hellgelb gefärbte Nadeln, F. 180 bis 182°, die mit dem Antibiotikum C, wie im Beispiel 1 erhalten, identisch sind.

Das Antibiotikum D kann aus der überstehenden wäßrigen ammonialkalischen Flüssigkeit durch Chromathographie mit Cellulose, wie im Beispiel 1 beschrieben ist, isoliert werden.

Beispiel 3

Ein Gemisch aus 180 g Glycerin, 90 g gemahlenem Sojabohnenölkuchen, 180 g mit Säure hydrolysiertem Kasein, 90 g Natriumchlorid und einer hinreichenden Menge Wasser zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 181 wird in einem ortsfesten, 301 fassenden Gärbehälter aus Glas eingebracht, der mit einem Kopf aus rostfreiem Stahl und einem Turbinenrührer ausgerüstet ist. Der Gärbehälter ist mit Glas ausgekleidet und hat vier innere senkrechte Prallbleche von 2,5 χ 40 cm. Der Gärbehälter ist so eingerichtet, daß drei Luftströme in den Kielraum des Rührers einmünden.

Der pH-Wert des Gemisches im Gärbehälter wird mit 10 η-Natronlauge auf 7,5 eingestellt. Zum Gemisch in dem Gärbehälter werden 180 g Schweineschmalz als ■ schaumverhütendes Mittel und 18 g Calciumcarbonat zugegeben. Der Gärbehälter und die Gärlösung werden bei etwa 1,4 at Dampf 2 Stunden sterilisiert. Der Gärbehälter und sein Inhalt werden abgekühltunddann ausdemAutoklav herausgenommen. Die Gärflüssigkeit wird aseptisch mit 10 ecm Sporensuspension von Streptomyces C1730 beimpft, die durch Schütteln einer 7 Tage alten Glukose-Trypton-Agar-Strichkultur von Streptomyces C 1730 mit 10 ecm o,oi°/₀iger wäßriger Lösung von Marseiller Seife erhalten wurde.

Nach der Beimpfung wird das Kulturgemisch 88 Stunden bei 25° gezüchtet. Während der Züchtung wird sterile Luft, durch den Diffusionsring mit einer Geschwindigkeit von 0,3 bis 1,01 Luft je Liter Flüssigkeit je Minute zugeleitet, und der Rührer mit einer Geschwindigkeit von etwa 200 Umdrehungen in der Minute laufen gelassen.

Die Erzeugung des Antibiotikums während der Züchtung wird durch Entnahme von Proben von Zeit zu Zeit und deren Erprobung gegen Escherichia coli verfolgt. Nach 40 Stunden entspricht jeder Kubikzentimeter der Kultur 188^g Standard bei Erprobung gegen Escherichia coli. Nach 64 Stunden entspricht jeder Kubikzentimeter 410 μζ und nach Stunden entspricht jeder Kubikzentimeter 636/tg Standard.

Die angesäuerte rohe Kulturflüssigkeit wird zur Entfernung des Mycels filtriert, und das Filtrat mit verdünnter Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt. Auf eine Kolonne, die 600 ecm Kationsaustauscher-Harz in der Wasserstoffstufe enthält, werden 7,5 1 Filtrat mit pH-Wert 7,0 aufgegeben. Nach dem Waschen der

Kolonne mit Wasser werden die Antibiotika aus der Kolonne quantitativ durch Eluierung mit 5 n-Ammoniaklösung entfernt. Aus dem Eluat können die Antibiotika als rohes Konzentrat gewonnen werden, das nach den in Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahren gereinigt werden kann.

Aus diesem gereinigten rohen Konzentrat kann das Antibiotikum C nach folgender Arbeitsweise isoliert werden.

Zu 500 mg gereinigtem, rohem Konzentrat in 7 ecm Wasser wird eine konzentrierte Kaliumacetatlösung (50 g in 25 ecm Wasser) gegeben, bis der pH-Wert der Gesamtlösung 8,1 beträgt.

Es bildet sich ein harzartiger Niederschlag, der sich in kurzer Zeit beim Stehen verfestigt. Der feste Körper wird durch Filtration abgetrennt und durch Behandeln unter Wasser gründlich gewaschen. Dieser feste Körper wiegt nach dem Waschen und Trocknen im Vakuum 160 mg und ergibt nach Umkristallisation

so aus wäßrigem Methanol einen Haufen von Nadeln, F. 178 bis 179⁰, die mit dem Antibiotikum C identisch sind.

Das Antibiotikum D wird aus dem gereinigten rohen Konzentrat nach der im Beispiel 1 ausgeführten

a$ Arbeitsweise erhalten.

Beispiel 4

Ein Gemisch aus 180 g Glycerin, 90 g gemahlenem Sojabohnenölkuchen, 180 g mit Säure hydrolysiertem Kasein, 90 g Natriumchlorid und hinreichend Wasser zur Auffüllung von einem Gesamtvolumen von 181 wird in einem ortsfesten 301 fassenden Gärbehälter aus Glas eingebracht, der mit einem Kopf aus rostfreiem Stahl und einem Turbinenrührer ausgerüstet ist. Der Gärbehälter ist mit Glas ausgekleidet und besitzt vier innere, senkrechte Prallbleche von 2,5 X 40 cm. Der Gärbehälter ist so eingerichtet, daß drei Luftströme in den Kielraum des Rührers einmünden.

Der pH-Wert des Gemisches in dem Gärbehälter wird mit 10 η-Natronlauge auf 7,5 eingestellt. Zum Gemisch im Gärbehälter werden 180 g Schweineschmalz als schaumverhütendes Mittel und 18 g Calciumcarbonat hinzugegeben. Der Gärbehälter und die Gärflüssigkeit werden bei etwa 1,4 at 2 Stunden sterilisiert. Der Gärbehälter und sein Inhalt werden abgekühlt und dann aus dem Autoklav herausgenommen. Die Flüssigkeit wird aseptisch mit 10 ecm Sporensuspension von Streptomyces C 1730 beimpft, die durch Schütteln einer 7 Tage alten Glukose-Trypton-Agar-Strichkultur von Streptomyces C 1730 mit 10 ecm einer o,oi°/₀igen wäßrigen Lösung von Marseiller Seife erhalten wurde.

Nach der Beimpfung wird die Kultur 88 Stunden bei 25 ° gezüchtet. Während der Züchtung wird durch den Diffusionsring sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,3 bis 1,01 Luft je Liter Gärflüssigkeit je Minute zugeführt, und der Rührer mit einer Geschwindigkeit von etwa 200 Umdrehungen je Minute laufen gelassen.

Die Erzeugung der Antibiotika während der Züchtung wird durch Probenentnahme von Zeit zu Zeit und deren Erprobung gegen Escherichia coli verfolgt. Nach 40 Stunden entspricht jeder Kubikzentimeter der Kultur 188 μξ Standard bei Erprobung gegen Escherichia coli; nach 64 Stunden entspricht jeder Kubikzentimeter 410 μζ und nach 88 Stunden entspricht jeder Kubikzentimeter 636^ Standard.

100 ecm filtrierte Flüssigkeit werden mit wäßriger Natronlauge auf pn 7,5 eingestellt und 20 Minuten mit 300 mg aktiver Kohle gerührt. Die Suspension wird nitriert, und der Kohlekuchen wird mit 25 ecm ausgesäuertem Methanol gerührt, das 0,05 ecm 5 n-Salzsäure je 100 ecm Methanol enthält. Das Gemisch wird filtriert und die Eluierung wiederholt. Die Methanolextrakte werden vereinigt und im Vakuum konzentriert, und das rohe Konzentrat enthält etwa 50 °/₀ der ursprünglichen Aktivität der Brühe.

Die Antibiotika C und D können aus dem Kulturgemisch nach einer der in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Methoden isoliert werden.

Beispiel 5

In mehrere 500-ccm-Erlenmeyer-Kolben wird je ein Gemisch aus 1,0 g Glycerin, 0,5 g gemahlenem Sojabohnenölkuchen, 0,5 g käuflichem Pepton, 0,5 g Natriumchlorid und hinreichend Wasser für ein Gesamtvolumen von 100 ecm eingebracht. Die Kolbeninhalte werden mit 10 η-Natronlauge auf pn 7,5 eingestellt, und 0,1 g Caliciumcarbonat werden zugegeben. Die Kolben werden mit Baumwollgaze bedeckt und 20 Minuten bei etwa 1 at Dampf sterilisiert, und dann wird jeder Kolben mit 1 ecm Sporensuspension aus einer 24 Tage alten Glukose-Trypton-Agar-Strichkultur beimpft. Die Kolben werden 6 Tage auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 160 Umdrehungen in der Minute geschüttelt. Die Temperatur wird, während der Züchtungszeit bei 24 bis 26⁰ gehalten. Am Ende der Züchtungszeit hat die Kulturflüssigkeit einen pH-Wert von 8,3. Bei Erprobung gegen Escherichia coli entspricht 1 ecm Brühe 800 μζ Standard.

Die Antibiotika C und D können aus der Kulturbrühe nach einem der in den Beispielen 1, 2 und 3 beschriebenen Verfahren isoliert werden.

Beispiel 6

Ein Gemisch aus 1,0 g Glycerin, 0,5 g gemahlenem Sojabohnenölkuchen, 0,5 g entbitterter Brauhefe, 0,5 g Natriumchlorid und hinreichend Wasser zur Auffüllung auf 100 ecm wird mit 10 n-Natronlauge auf pH 7,5 eingestellt, und 0,1 g Calciumcarbonat werden hinzugegeben. Das Gemisch wird in mehrere Soo-ccm-Erlenmeyer-Kolben eingebracht. Die Kolben werden mit Baumwollgaze bedeckt und 20 Minuten bei etwa 1 at Dampf sterilisiert, und dann wird jeder Kolben mit 1 ecm Sporensuspension von Streptomyces C1730 aus einer 35 Tage alten Glukose-Trypton-Agar-Strichkultur beimpft. Die Kolben werden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 160 Umdrehungen je Minute 5 Tage geschüttelt.

Die Temperatur während der Züchtungszeit wird bei 24 bis 26⁰ gehalten. Am Ende der Züchtungszeit hat die Kulturflüssigkeit einen pH-Wert von 8,2. Bei

Erprobung gegen Escherichia coli entspricht ι ecm der Brühe 710 ßg Standard.

Beispiel 7

Ein Nährmedium aus 1,25 g Glycerin, 0,75 g mit Säure hydrolysiertem Kasein, 1,25 g Feststoffen aus Maiseinweichwasser, 1,25 g Natriumchlorid und hinreichend Wasser zur Auffüllung auf 250 ecm wird mit 10 η-Natronlauge alkalisch gemacht bis pn 7,3- Nach Zugabe von 0,25 g Calciumcarbonat wird die Nährflüssigkeit in einen Fernbach-Kolben, der mit einem Baumwollstopfen verschlossen ist, eingebracht und 25 Minuten bei etwa 1,2 at Dampfdruck sterilisiert. Das Nährmedium wird mit 2 ecm Sporensuspension von Streptomyces C1730 aus einer 7 Tage alten Glukosetryptonagar-Strichkultur beimpft. Das resultierende Gemisch wird 11 Tage bei 29° gezüchtet. Am Ende dieser Zeit besitzt die Kulturflüssigkeit eine Aktivität, die 273 ,ag Standard je Kubikzentimeter Flüssigkeit entspricht, wenn sie gegen Escherichia coli erprobt wird.

Claims

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika C und D, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium mit Streptomyces C 1730 beimpft, das beimpfte Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40⁰ etwa 2 bis 15 Tage züchtet und aus dem Kulturmedium die so erzeugten Antibiotika C und D abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung in submersem Zustand durchgeführt wird, und ein wäßriges Nährmedium mit einem pH-Wert zwischen 6 und 9 verwendet wird, das eiweißhaltige Stoffe und assimilierbare Kohlenstoffverbindungen enthält.

I. S4