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Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Sistomycosin Die Erfindung
bezieht sich auf eine neue chemische Verbindung mit einzigartigen antibiotischen
Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung. Insbesondere betrifft die Erfindung
ein neues Antibiotikum, dem der Name Sistomycosin gegeben wurde, und mikrobiologische
Verfahren zu seiner Herstellung.
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Sistomycosin ist eine neutrale organische Verbindung, die nur die
Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff enthält. Es ist ein
büffellederfarbener oder hellgelber fester Körper, der unter dem Polarisationsmikroskop
mikrokristallin zu sein scheint. Beim Erhitzen beginnt die Verbindung bei etwa i30°
braun zu werden, schmilzt aber nicht unter 23o°. Sistomycosin ist in Wasser und
Methanol leicht löslich, etwas weniger löslich in feuchtem Aceton und wäBrigen Gemischen
höherer aliphatischer Alkohole und praktisch unlöslich in weniger polaren Lösungsmitteln,
wie Chloroform, Diäthyläther, Äthylacetat, Benzol, Petroläther und ähnlichen. Es
wird aus wäBrigen Lösungen im ps-Bereich von 2 bis 9 durch n-Butanol und ähnlichen
höheren aliphatischen Alkoholen extrahiert.
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Sistomycosin reduziert kalte wäBrige Kaliumpermanganatlösung und siedende
Benedictsche Lösung schnell, gibt eine positive Molisch-Probe für Kohlehydrate,
aber eine negative Beilstein-Probe für Halogen und einen negativen Ferrichloridtest.
Ein Zusatz einer sehr geringen Menge des Antibiotikums, i bis 2 mg zu warmer konzentrierter
Schwefelsäure, erteilt der Lösung eine tiefkirschrote bis schokoladebraune Färbung.
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Die Zugabe einer kleinen Menge Antibiotikum zu warmer konzentrierter,
mit Thymol gesättigter Salpeter- oder Salzsäure ergibt keine Farbänderung.
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Das Antibiotikum nach der Erfindung ist ferner durch ein eigenes Ultraviolett-
und Infrarotspektrum gekennzeichnet. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum (Fig. i)
hat ein Maximum in der Nähe von 300 mA
und ein anderes bei
218 ni,@ Das Maximum in der Nähe von 300 m,u ist aus drei getrennten Absorptionsspitzen
bei 292,5, 3o6 und 32o,5 MA und 2 Minima zwischen diesen Spitzen bei
298 und 314 m,u zusammengesetzt. Das größere Minimum im Ultraviolettabsorptionsspektrum
liegt bei 253 mu. Die in Fig. i gezeigte Kurve der Absorption ist die in Wasser
erhaltene. Kennzeichnend für Sistomycosin ist, daß dieses Spektrum durch mäßige
Variation des Säuregehaltes oder der Basizität der Lösung, d. h. von dem Neutralpunkt
bis etwa 0,05 n-Säure oder Base, nicht merklich verändert wird.
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Fig.2 zeigt die sogenannte Fingerabdruckregion, d. h. die charakteristische
Region des Infrarotspektrums in einer neutralen Mineralölemulsion. Die Spitzen bei
oder nahe 6,88 und 7,30 mu sind dem Mineralölträger zuzuschreiben. Die stärksten
Absorptionsbanden, die für Sistomycosin charakteristisch sind, sind diejenigen bei
oder nahe 6,34 und 9,44 ,u. Banden von schwacher bis mäßiger Intensität befinden
sich bei oder nahe 7,7o, 7,86, 8,55, 11,16, 11,85, 12,4,u mit anderen auf den Flanken
oder vorhergehenden Banden erscheinenden bei oder nahe 7,o8, 7,i6, 8,95,
9,89, 10,25 und 1o,6 ,u. Eine andere für Sistomycosin charakteristische Bande, die
außerhalb der Fingerabdruckregion liegt, findet sich bei oder nahe 2,96 ,u. Sistomycosin,
insbesondere seine Lösungen, unterliegt einer fotochemischen Zersetzung, wenn es
dem Licht ausgesetzt ist. Es wird durch Säure und Alkali zerstört, ist aber in neutralen
oder schwach basigen Lösungen, d. h. bei- pA 7 bis 9, beständiger als in sauren
Lösungen. Es ist in Wasser unter 25° sehr beständig, und seine wäßrigen Lösungen
können sogar i Stunde auf 5o° erhitzt werden, ohne ihre antibiotische Wirksamkeit
zu verlieren. In wäßrigen Lösungen bei ioo° bleiben nach i Stunde noch mehr als
5o °/o der antibiotischen Wirksamkeit zurück.
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Im Gegensatz zu bekannten Antibiotika besitzt Sistomycosin eine hohe
Wirksamkeit gegen zahlreiche Hefe- und Schimmelpilze, ist aber, praktisch genommen,
wirkungslos gegen gramnegative und grampositive Bakterien. Zum Beispiel ist das
Produkt nach der Erfindung wirkungslos gegen Bakterien, wie Escherichia coli, Salmonella
schottmuellerie, Shigella Bonnei, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus pyogenes var.
aureus und Streptococcus haemolyticus, ist aber außerordentlich wirksam und von
großem Wert bei Behandlung von Pilzinfektionen, die verursacht werden durch Blastomyces
dermatitidis, Candida albicans, Histoplasma capsulatum, Microsporum canis, Sporotrichum
schenckii, Trichophyton interdigitale und Trichophyton rubrum. Die folgende Tabelle
erläutert eingehender das einzigartige Spektrum des antibiotischen Sistomycosins
im Vergleich zu den Spektren bekannter Antibiotika, die durch Actinomyceten erzeugt
werden, einschließlich solcher, die durch eine antifungale Wirksamkeit gekennzeichnet
sind.
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Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß nur das Antibiotikum Actidion
dem Sistomycosin in seiner Wirkungslosigkeit-gegen Bakterien und seiner Wirksamkeit
gegen Eumyceten ähnelt. Actidion ist jedoch gegen Cryptococcus neoformans wirksam,
während Sistomycosin dies nicht ist. Sistomycosin ist gegen die übrigen unten angegebenen
Eumyceten wirksam, während Actidion dies nicht ist. Hieraus ist ersichtlich, daß
die beiden deutlich verschiedene Stoffe sind.
| Antibiotische Wirksamkeit |
| Mikroorganismen Sisto- Aureo- Chloram- Strepto- Strepto- Terra- |
| mycosin Actidion mycin phenicol mycin thricin mycin |
| Bakterien |
| grampositive (die meisten) ...... - - -f- -f- |
| Bakterien |
| gramnegative (die meisten) .... - - -E- |
| Bakterien |
| säurefeste (die meisten) ........ - - -1- |
| Actinomyceten |
| Nocardia asteroides ........... - - -E- ZL -I- |
| Eumyceten |
| (Hefe- und Schimmelpilze) |
| Blastomyces dermatitidis ........ - - - - -E- - |
| Candida albicans . .. . . . . . . . . . .. . . - - - - -
- |
| Cryptococcus neoformans ........ - - - - - |
| Histoplasma capsulatum ......... -f- - - - - -f- - |
| Microsporum canis ... ... ........ -f- - - - - - - |
| Sporotrichum schenckii .......... - - - - - - |
| Trichophyton rubrum ........... T - - - - - - |
| -{- Das Wachstum wird durch weniger als 25 #tg Antibiotikum
je Kubikzentimeter Fleischbrühe oder Agar gehemmt. |
| - Das Wachstum wird durch ioo gg Antibiotikum je Kubikzentimeter
Fleischbrühe oder Agar nicht gehemmt. |
Die Toxizität von Sistomycosin ist fast zu vernachlässigen. Bei
Mäusen beträgt die intravenöse tödliche Dosis 50 (LDfio) 9o mg/kg und die mittlere
Erträglichkeitsdosis (M. T. D.) 8o mg/kg.
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Gemäß der Erfindung wird Sistomycosin durch aerobe Züchtung von Kulturen
einer neuen Actinomycete der Genus Streptomyces, der der Name Streptomyces viridosporus
gegeben wurde, hergestellt. Diese Mikroorganismen kommen unter anderem in Böden
vor. Die Kulturen können durch Vermischen der bestimmten Eumycetenkulturen, die
durch Sistomycosin gehemmt werden, mit wäßrigem Agar und Zufügen einer Bodenprobe,
welche den gewünschten Streptomyces viridosporus enthält, erhalten werden. Nach
Züchtung des Gemisches während i bis 1o Tagen erscheinen Kolonien der gewünschten
Actinomyceten. Die Gewächse von Streptomyces viridosporus werden ausgewählt, auf
ein neues Nährmedium übertragen und später als reine Kulturen nach üblichen Arbeitsweisen
isoliert. Eine lebende Kultur dieses Mikroorganismus wurde dem Kulturbüro der Parke
Davis & Co., Detroit, Michigan, unter der Nummer 0q.889 eingereicht.
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Mikroskopisch ist das feuchte primäre Mycel von Streptomyces viridosporus
glasklar und überreich verzweigt. Die Außenenden sind gebogen und etwas wellenförmig.
Das sekundäre Luftmycel ist ebenfalls außerordentlich verzweigt. Primäre, sekundäre
und tertiäre Zweigteile sind ebenfalls vorhanden und können abwechselnd in entgegengesetzter
Richtung oder nur gelegentlich gewunden sein. Die Außenenden des Luftmycels unterteilen
sich in Ketten von Fruchtträgern (Konidien). Die konidialen Ketten erscheinen als
kurze offene Spiralen von etwa 1o bis 2o ,u axialer Länge. Die Fruchtträger sind
glasklar, kugel- bis eiförmig und haben 1,3 bis 1,9,u Durchmesser, aber im Mittel
angenähert 1,5 bis 1,6,u. Bei Züchtung auf Glukose-Trypton-Agar-Nährmedium erscheint
das junge Primärmycel von Streptomyces viridosporus farblos, nimmt aber später eine
dunkelgelbe Farbe an. Das Luftmycel ist weiß und trägt Sporen, die in der Masse
dunkelolivgrün erscheinen. In dem Agar erscheint wenig oder kein Farbstoff. Die
Oberflächenkolonien sind kreisförmig, hervorgewölbt, mit Falten versehen oder radial
gerippt, mit runder bis gewellter Grenzlinie. Die folgende Tabelle erläutert die
charakteristischen Unterschiede zwischen dieser neuen Actinomycete und anderen Antibiotika
erzeugenden Antimyceten bei Züchtung auf einem Glukose-Trypton-Agar-Nährboden.
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Das Lebewesen verflüssigt Gelatine ohne Pigmentbildung und peptonisiert
Lakmusmilch mit geringer Änderung im px-Wert. In einem synthetischen Medium (Gottliebs)
wertet das Lebewesen leicht zahlreiche Kohlenstoffquellen aus, wie Arabinose, Fruktose,
Galaktose, Inosit, Laktose, Maltose, Mannit, Rhamnose, Xylose. Weniger leicht wertet
es Natriumacetat, Natriumcitrat, Natriumsuccinat und Sucrose aus. Dagegen werden
nicht ausgewertet Dulcit, Inulin, Raffinose und Sorbit. Im synthetischen Medium
verwertet der Organismus anorganische Stickstoffquellen, wie Ammoniumsalze und Nitrate,
organischen Stickstoff, wie Harnstoff, Glycin, Alanin, ß-Alanin, Valin, Leucin,
Serin, Threonin, Phenyl-
| Mycel Substrat |
| Mikroorganismen Antibiotikum Form des Farbe des Luftm Gels
Farbe der Farbe in |
| Luftmycels und der Rückseite Glukose- |
| Sporen Trypton-Agar |
| Streptococcus Sistomycosin Spiralen weiß gelb keine |
| viridosporus olivgrün gelbbraun |
| Streptococcus Actinomycin gerade weiß schwarz schwarz |
| antibioticus grau |
| Streptococcus Aureomycin gerade weiß gelb keine |
| aureofaciens grau gelbbraun |
| Streptococcus Viomycin gerade, weiß rotviolett nichts |
| floridae leicht gewellt lavendel himbeer- |
| blau farben |
| graugrün |
| Streptococcus Neomycin gerade, weiß farblos , keine |
| fradiae und Fradicin gelegentlich seemuschel- gelbbraun |
| Schleifen rosa |
| und Spiralen |
| Streptococcus Griseoviridin gerade, weiß gelbgrau keine |
| griseoviridus Viridogrisein leicht gewellt hellrosa |
| hellgrau |
| grün , |
| Streptococcus Streptomycin gerade, weiß farblos keine |
| griseus und Actidion leicht gewellt hellrosa lavendel |
| hellgrau blau |
| grün hellbraun |
| Mycel Substrat |
| Mikroorganismen Antibiotikum Form des Farbe des Farbe der Farbe
in |
| Luftm cels |
| Luftmycels und der Rückseite Glukose- |
| Sporen Trypton-Agar |
| Streptococcus Grisein gerade, weiß farblos keine |
| griseus leicht gewellt hellrosa gelbbraun |
| hellgrau |
| grün |
| Streptococcus Streptothricin, gerade mit weiß schwarz schwarz |
| lavendulae Lavendulin gelegent- rosa |
| und Streptolin lichen Lavendel |
| Schleifen blau |
| und Spiralen |
| Streptococcus Terramycin Spiralen weiß gelb keine |
| rimosus |
| Streptococcus sp. Actinorubin Spiralen weiß rosa keine |
| rosa rot |
| grau |
| Streptococcus Chloramphenicol gerade weiß schwarz schwarz |
| venezuelae grau |
alanin, Tyrosin, Tryptophan, Cystin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Asparagin, Lydin,
Arginin, Histidin und Adeninsulfat, aus.
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Die folgende Tabelle ist ein Vergleich über die Fähigkeit von Streptomyces
viridosporus und anderer Antibiotika erzeugender Actinomyceten, verschiedene Kohlenstoffquellen
bei Züchtung auf einem aus Agar, anorganischen Salzen und der untersuchten Kohlenstoffquelle
zusammengesetzten Nährmedium zu verwerten.
| M |
| Angewendetes |
| Carbon Source |
| kroorganismen Antibiotikum Ara- Fruk- Galak- Inosit
I Inulin I Lak I Mal- I IMannit Rham- |
| I I X lose |
| binose tose tose tose tose ` pose y |
| Streptococcus Sistomycosin -E-- -f- + o -j- + -r- -i- -E- |
| viridosporus |
| Streptococcus Actinomycin etwas -E- + o -f- -E- -f- -f- -f- |
| antibioticus |
| Streptococcus Aureomycin -j- o o etwas + o o |
| aureofaciens -f - |
| Streptococcus Viomycin o bis -E- o o . etwas -f- o -f- |
| floridae etwas |
| Streptococcus Fradicin und -R- etwas -f-- 0 0 0 -f- o o |
| fradiae Neomycin -f- |
| Streptococcus Griseoviridin und -[- -f- o o etwas -E- -f- -f- |
| griseoviridus- Viridogrisein -f- |
| Streptococcus Grisein -E- 0 0 etwas .+ -f- |
| griseus2) -E- |
| Streptococcus Streptomycin o 0 0 o bis a |
| griseusl) und Actidion |
| Streptococcus Streptothricin, o bis o bis etwas o 0 o bis -j--
0 0 o bis |
| lavendulae Lavendulin und -r-. -f- +. etwas |
| Streptolin bis |
| Streptococcus sp. Actinorubin -f- -f- -f- -i-
-@- -f- -r-- -r- -E- |
| Streptococcus Chloramphenicol -@- -f- -f- 0 0 etwas -t- o -f-
-f- |
| venezuelae |
| o = kein oder sehr geringes Wachstum. -f- - gutes Wachstum.
') oder z) Die Unterschiede in den Nährbedürfnissen |
| beruhen auf einem Unterschied der Stämme. |
Wie oben festgestellt, wird Sistomycosin durch aerobe Züchtung
einer Kultur von Streptomyces viridosporus hergestellt. Dies wird gewöhnlich durch
Impfung eines geeigneten Nährmediums mit Streptomyces viridosporus und Züchtung
des Gemisches unter aeroben Bedingungen bei etwa 2o bis 35° während i bis 8 Tagen
erreicht. Bei wäßrigen Nährmedien wird das feste Material aus dem Kulturgemisch
entfernt und das gewünschte Antibiotikum durch die späterhin beschriebenen Verfahren
aus der Kulturflüssigkeit entfernt. Wenn ein festes Nährmedium verwendet wird, wird
das Kulturgemisch gut mit einem Lösungsmittel für das Antibiotikum, wie Wasser oder
Methanol, gewaschen und das gewünschte Sistomycosin aus dem Extrakt isoliert. Während
des Züchtens wird die Temperatur vorzugsweise in der Nähe von 25 bis 28° gehalten.
Bei einem wäßrigen Nährmedium soll der Anfangs-pH-Wert zwischen 6 und 8,2, vorzugsweise
auf der alkalischen Seite zwischen etwa 7,3 und 7,7, liegen. Um die maximale Ausbeute
an Sistomycosin zu erhalten, soll während der Züchtung des Kulturgemisches und der
Isolierung des Antibiotikums Licht so vollständig wie möglich ausgeschaltet sein.
Eine Beimpfung von Nährmedium-Sporensuspensionen, Nachkulturen und Strichkulturen
von Streptomyces viridosporus können verwendet werden.
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Die Züchtung des Mikroorganismus in den wäßrigen Nährmedien kann auf
einer Reihe von verschiedenen Wegen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann der Mikroorganismus
unter aeroben Bedingungen auf der Oberfläche des Mediums gezüchtet werden, oder
er kann unter der Oberfläche des Mediums, d. h. unter submersen Bedingungen, entwickelt
werden, wenn gleichzeitig Sauerstoff zugeführt wird. Das bevorzugte Verfahren zur
Herstellung von Sistomycosin im großen Maßstabe umfaßt die Verwendung von submersen
oder Tiefenkulturen von Streptomyces viridosporus. Nach dieser Ausführungsform der
Erfindung wird ein steriles wäßriges Nährmedium mit Streptomyces viridosporus beimpft
und unter Rühren und Belüftung bei einer Temperatur zwischen 2o und 35°, vorzugsweise
in der Nähe von 25 bis 28°, etwa i bis q. Tage gezüchtet. Unter diesen Bedingungen
entwickelt sich der Organismus in zahlreichen mehr oder weniger getrennten Teilmengen,
die im Nährmedium verteilt sind, im Gegensatz zu dem mehr oder weniger zusammenhängenden
Häutchen, die beim Oberflächenkulturverfahren auf der Oberfläche des Nährmediums
vorhanden sind. Dank dieser Verteilung des Organismus über das ganze Medium können
große Volumina des beimpften Nährmediums gleichzeitig in großen Behältern und Fässern,wie
sie gebräuchlicherweise in der Gärungsindustrie benutzt werden, gezüchtet werden.
Stationäre Gärfässer, die mit geeigneten Rühr- und Belüftungseinrichtungen ausgerüstet
sind, sowie auch horizontale Drehtrommelgärbehälter sind, wie gefunden wurde, in
dieser Hinsicht besonders vorteilhaft, jedoch kann für die Herstellung kleinerer
Mengen des Antibiotikums oder der Kulturen des Mikroorganismus dieses submerse Kulturverfahren
in kleineren Kolben durchgeführt werden, die entweder geschüttelt oder durch mechanische
Mittel gerührt werden. Das Rühren und Belüften des Kulturgemisches kann in einer
Reihe von Wegen durchgeführt werden. Zum Rühren können Propeller oder ähnliche Rühreinrichtungen
vorgesehen oder der Behälter selbst gedreht oder geschüttelt werden oder verschiedene
Pumpeneinrichtungen oder ein Hindurchleiten von Lift oder anderen sauerstoffhaltigen
Gasen durch das Medium vorgesehen sein. Die Belüftung kann durch Einblasen von Luft
oder anderen sauerstoffhaltigen Ga-,en in das Gärgemisch durch offene oder perforierte
Rohre, poröse Diffusionsmedien, wie Kohlestäbe, Carborund oder gesintertes Glas,
bewirkt werden. Oder es kann ein Versprühen, Zerschleudern oder Verspritzen der
Maische in oder durch eine sauerstoffhaltige Atmosphäre hindurch vorgesehen sein.
Das sauerstoffhaltige Gas soll vor dem Einleiten in das Kulturgemisch von Sporen,
Bakterien und anderen Giftstoffen befreit sein. Dies kann sehr zweckmäßig durch
Filtration durch eine Schicht aktiver Kohle erfolgen. Die Geschwindigkeit der Belüftung,
die das Optimum der Sistomycosinbildung fördert, ist naturgemäß etwas von der Art
des verwendeten Behälters, der Geschwindigkeit und der Art des Rührens, dem PH-Wert,
der Temperatur und anderen Bedingungen der Umgebung abhängig. In diesem Fall muß
das sauerstoffhaltige Gas mit ausreichender Geschwindigkeit zugeführt werden, um
einen leichten Überdruck in dem Gärbehälter aufrechtzuerhalten und so die Möglichkeit
einer Vergiftung der Kultur durch eingesaugte Luft zu vermeiden. Bei tankartigen
3o-1-Gärbehältern ergab, wie gefunden wurde, eine Geschwindigkeit von io bis x5
1 Luft je Minute gute Ergebnisse bei gleichzeitiger Anwendung eines sechsblättrigen
mechanischen Turbinenrührers von io cm Durchmesser bei einer Drehzahl von ioo bis
200 gegen vier senkrechte Prallplatten von 2,5 X q.o cm.
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Eine große Vielzahl von Nährmedien kann in der Wachstumsstufe des
Verfahrens verwendet werden. Solche Nährmedien sollen Kohlenstoffverbindungen, eiweißhaltige
Stoffe, Mineralsalze und Spuren von verschiedenen Nährstoffen, Vitamine und andere
Wachstumsstimulantien enthalten, die gewöhnlich als Verunreinigungen in den anderen
Bestandteilen des Mediums gefunden werden. Für die optimale Herstellung von Sistomycosin
soll das Nährmediun auch Fettstoffe enthalten. Es sei verstanden, daß die assimilierbaren
Kohlenstoffverbindungen hier mehrwertige Alkohole und Mono-, Di- und Polysaccharide
umfaßt, während unter eiweißhaltigen Stoffen nichtmodifiziertes Eiweiß und Eiweißabbauprodukte,
insbesondere solche Produkte, wie sie bei der Hydrolyse von Eiweißstoffen entstehen,
verstanden werden. Diese Eiweißabbauprodukte umfassen Proteasen, Peptone, Polypeptide,
Peptide und Aminosäuren.
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Als assimilierbare Kohlenstoffverbindungen können Arabinose, Fruktose,
Galaktose, Laktose, Maltose, Rhamnose, Xylose, Glyzerin, Mannit, Rhamnit u. dgl.
verwendet werden. Komplexe Kohlenstoffhydrate, wie Stärke, Dextrine, Gär- und Destillationsschlempe,
Feststoffe aus Maiseinweichwasser, Ma.iseinweichwasser, getrocknete Gärrückstände
u. dgl., können ebenfalls verwendet werden. Unter den in den verschiedenen Nährmedien
verwendbaren eiweißhaltigen
Stoffen sind Rindfleischextrakt, mit
Säure hydrolysiertes Kasein, Rindfleischpepton, gemahlener Sojabohnenölkuchen, getrocknete
Gärrückstände, wasserlösliches, entfettetes und teilweise hydrolysiertes Sojabohnenmehl,
Aminosäuregemische natürlicher oder synthetischer Herkunft, Harnstoff, Purine u.
dgl.
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Die Verwendung von gemahlenem Sojabohnenölkuchen oder Sojabohneneiweißderivaten
als Bestandteil des Nährmediums ist wünschenswert, da sie eine geringe ' Menge Fett
für die Verwertung durch den Mikroorganismus bereitstellen.
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Die hauptsächlichsten Mineralerfordernisse des Mediums können durch
Zugabe von o,1 bis o,50/, von einem oder mehreren anorganischen Salzen, wie Natriumchlorid,
Calciumcarbonat, Dikaliumphosphat oder Monokaliumphosphat, befriedigt werden. Die
anderen Bestandteile des Nährmediums, d. h. Vitamine, Wachstumsstimulantia u. dgl.,
sind gewöhnlich in den unreinen assimilierbaren Kohlenstoffquellen und bzw. oder
den eiweißhaltigen Stoffen in hinreichender Menge vorhanden.
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Die Isolierung von Sistomycosin aus dem rohen Kulturgemisch kann in
einer Reihe von verschiedenen Wegen erfolgen. Wenn in der Wachstumsphase ein festes
Kulturmedium verwendet wird, wird das Mycel mit einem Lösungsmittel für Sistomycosin,
z. B. Wasser, extrahiert und das Produkt aus dem Extrakt, wie hernach beschrieben,
isoliert. Aus flüssigen Kulturen wird das Mycel abgetrennt, gut mit Wasser gewaschen,
und das Filtrat und die Waschwässer werden in den nachfolgenden Isolierungsstufen
aufgearbeitet. Ein Verfahren zur Isolierung von Sistomycosin aus der rohen Kulturflüssigkeit
oder aus Kulturextrakten umfaßt folgende Arbeitsgänge: Das Extrahieren der Lösung
mit einem mit Wasser nicht mischbaren Alkohol, wie n-Butanol, die Entfernung des
Lösungsmittels durch Destillation, die Extraktion des Rückstandes mit einem Fettlösungsmittel,
wie Chloroform, das Verwerfen des Extraktes, die Extraktion des in Chloroform unlöslichen
festen Anteiles mit Chloroform, das etwa 1o01, eines niedrigen aliphatischen Alkohols,
wie Methanol, enthält und das Gießen des anfallenden Extraktes auf einen Ionenaustauscher
aus einem anorganischen Silikat (Permutit). Das ionenaustauschende Material wird
zunächst mit Chloroform, das fortschreitend höhere Konzentrationen an niederen aliphatischen
Alkoholen, wie Methanol, enthält, gewaschen, und dann wird das Antibiotikum mit
dem erwähnten Alkohol eluiert. Die alkoholischen Eluate werden zur Trockne eingedampft,
und der Rückstand wird mit Wasser extrahiert. Der wäßrige Extrakt wird filtriert,
das Filtrat gefroren und das Eis daraus im Vakuum unter Gewinnung des gewünschten
Antibiotikums heraussublimiert.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert Beispiel
1 Ein- Gemisch aus 18o g käuflicher Glukose, 18o g partiell hydrolysiertem Sojabohneneiweiß,
go g Maiseinweichwasser, go g Natriumchlorid, 18 g Calciumcarbonat und eine hinreichende
Menge heißes Wasser, um das Volumen auf z81 zu bringen, werden in einen ortsfesten,
faßartigen 3o-1-Gärbehälter aus Glas eingebracht, der mit einem rostfreien Stahlkopf,
einem Propellerrührer, vier inneren senkrechten Prallblechen von 2,5 X 40 cm und
einem perforierten kreisförmigen Luftdiffusionsring versehen ist.
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Der Gärbehälter wird in einen Autoklav eingebracht und der Inhalt
mit Dampf bei 121° 1 Stunde sterilisiert. Gärbehälter und Inhalt werden abgekühlt
und dann aus dem Autoklav herausgenommen. Das Medium wird aseptisch mit goo ccm
einer in 72 Stunden in einer Schüttelflasche gewonnenen Nachkultur von Streptomyces
viridosporus beimpft, die auf dem gleichen Medium, wie oben beschrieben, gezüchtet
wurde und aus einem mit Sporen versehenen Glukose-Trypton-Agar-Kulturstamm von Streptomyces
viridosporus stammt.
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Nach der Beimpfung wird die Kultur 88 Stunden bei 23 bis 27° gezüchtet.
Während der Züchtung wird sterile Luft durch den Diffusionsring mit einer Geschwindigkeit
von x5,6 bis 17,81/min hindurchgeleitet und der Rührer mit einer Geschwindigkeit
von etwa 150 Umdr./min rotieren gelassen.
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Die Herstellung des Antibiotikums während der Züchtung wird von Zeit
zu Zeit durch Abziehen von Proben untersucht, wobei diese gegen Candida albicans
nach der Zylinderplatten-Agar-Diffusionsmethode untersucht wurden. Der Gehalt an
Antibiotikum wird durch den Durchmesser der Hemmzone in Millimeter angezeigt. Die
folgende Tabelle erläutert die Erzeugung des Antibiotikums durch die oben beschriebene
Arbeitsweise.
| Entwicklungszeit |
| . Hemmung von Candida albicans |
| Stunden Zonendurchmesser in |
| mm |
| 40 16,6 |
| 47 19,2 |
| 64 22,1 |
| 71 21,9 |
| 88 23,4 |
Am Ende der Entwicklungszeit werden 25 g Silikatfilterhilfe je Liter zugegeben,
und das Kulturgemisch wird filtriert. Der Filterkuchen wird zweimal mit je 25 ccm
Wasser je Liter Kulturgemisch gewaschen, und die Waschflüssigkeiten werden zum Hauptfiltrat
gegeben.
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31,461 Kulturfiltrat oder -flüssigkeit, hergestellt wie oben beschrieben,
die gegenüber Candida albicans bei einer Verdünnung von 1 : 2 eine Hemmzone von
18,5 mm Durchmesser ergeben, werden zweimal mit 1o 1 n-Butanol extrahiert. Die wäßrige
Lösung wird verworfen und die Extrakte im Dunkeln und unter Vakuum unterhalb 45°
fast bis zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wird viermal mit 50 ccm
und einmal mit Zoo ccm Chloroform bei ioo° extrahiert, und die Extrakte werden verworfen.
Der in Chloroform unlösliche Rückstand wird mit 3oo ccm Wasser geschüttelt und unter
Gewinnung von 3,39 g Feststoffen (Feststoffe A) und einem Filtrat (Filtrat
A) filtriert. Das Filtrat A wird gefroren und das Eis daraus im Vakuum unter Gewinnung
von 3,725 9
Sistomycosin heraussublimiert. 5oo y dieses Materials
ergeben in i ccm Wasser gegen Candida albicans bei Verdünnungen von i : i bzw. 1
: 2 Hemmzonen von 16,8 und 11,5 mm.
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Der Feststoff A (3,39 g) wird zweimal mit ioo ccm und sechsmal mit
i5o ccm Wasser extrahiert. Die Extrakte werden filtriert, gesondert untersucht,
und diejenigen mit ähnlichen Titern werden vereinigt und zu Muscheln gefroren. Das
Eis wird aus den sublimierten Extrakten im Vakuum unter Gewinnung von insgesamt
3,5 g rohem Sistomycosin sublimiert. Die Ausbeuten und die Reinheit der einzelnen
rohen Fraktionen werden in der folgenden Tabelle wiedergegeben.
| Konzentration Probenergebnisse gegen Candida albicans |
| Gewicht Rohprodukt |
| Feststoffe Verdünnung 1:1 1:2 1:4 1:8 |
| Rohprodukt in der |
| untersuchten |
| Durchmesser der |
| Lösung Hemmzone mm mm mm , mm |
| B 1623 200 17,1 14,1 io,6 - |
| C 1613 400 20,1 17,5 14,4 12,0 |
| C 114 200 15,9 11,3 -I-;- -1-- |
| E ioo 330 16,o 13,5 11,6 |
| F 6o 550 13,9 ii.9 ++ , + |
| Hemmung innerhalb des Zylinders. ++ Leichte Hemmung unmittelbar
um den Zylinder herum. |
995 mg Feststoffe B werden 1/Z Stunde mit igg ccm Chloroform, das io Volumprozent
Methanol enthält, extrahiert, und das Gemisch wird filtriert. Der unlösliche Rückstand
wiegt
770,5 mg. Der Extrakt wird in eine Chromatographiesäule gegossen, die
21,1 g Silikataustauscher, käuflich unter dem Handelsnamen »FlorisiLc, enthält,
der vorher gründlich mit Chloroform, das io Volumprozent Methanol enthielt, gewaschen
wurde. Man läßt die folgenden Lösungsmittelgemische in der angegebenen Reihenfolge
durch die Säule laufen: Chloroform mit 10, 20,
30 und 4o Volumprozent Methanol.
Die Eluate werden verworfen und 5o ccm Methanol durch die Säule fließen gelassen.
Das erste Eluat wird verworfen, und dann werden etwa ?o5o ccm Methanol in kleinen
Anteilen durch die Säule laufen gelassen. Insgesamt werden acht Fraktionen gesammelt,
von denen die ersten fünf im Vakuum zur Trockne eingedampft werden. Der gelbe Rückstand
wird mit einer Gesamtmenge von 35 ccm Wasser extrahiert. Der Extrakt wird gefroren
und das Eis daraus unter Gewinnung von 85,4 mg Sistomycosin als hellgelber fester
Körper absublimiert. 400 y von diesem Feststoff werden in i ccm Wasser gelöst und
ergeben bei einer Verdünnung von i : i eine Hemmzone von 22 mm Durchmesser gegenüber
Candida albicans.
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Die anderen drei Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne eingedampft
unter Gewinnung von 131 mg Sistomycosin als heller gelber, fester Körper. 400 y
dieses Materials in i ccm Wasser ergeben eine Hemmzone von 16 mm beim Versuch gegen
Candida albicans bei einer Verdünnung von i : i. Bei der turbidometrischen Versuchsmethode
verursachten 7,14 y/ccm eine 5o°/oige Hemmung des Wachstums bei Candida albicans.
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1435 g Feststoff wurden mit 287 ccm Chloroform mit io Volumprozent
Methanol 1/a Stunde extrahiert. Der unlösliche Rückstand (Feststoff G) wiegt 1,o84
g. Der Extrakt wird auf eine Absorptionssäule mit 32 g Silikationenaustauscher,
käuflich unter dem Handelsnamen »Decalso«, der vorher gründlich mit Chloroform mit
io Volumprozent Methanol gewaschen wurde, gegossen. Die folgenden Lösungsmittelgemische
wurden in Anteilen von je 7oo ccm durch die Säule in der angegebenen Reihenfolge
laufen gelassen: Chloroform mit 10, 20, 30, 40 und 5o Volumprozent Methanol. Die
Perkolate werden verworfen. Die Säule wird mit 84o ccm Methanol, geteilt in sechs
Portionen, eluiert, und die Eluate werden vereinigt. Die Lösung wird im Vakuum zur
Trockne eingedampft und der Rückstand mit einer Gesamtmenge von 30 ccm Wasser
extrahiert. Der wäßrige Extrakt wird gefroren und das Eis unter vermindertem Druck
unter Gewinnung von Sistomycosin als büffellederfarbener fester Körper absubliniert.
Dieses Material gibt gegenüber Candida albicans eine Hemmzone von 23,6 mm bei einer
Konzentration von 400 y/ccm.
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Die Säule wird nochmals fünfmal mit je 700 ccm Methanol eluiert,
und die vereinigten Extrakte werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand
wird mit Wasser extrahiert, der Extrakt gefroren und im gefrorenen Zustand unter
Gewinnung von 85 mg Sistomycosin als hellgelber fester Körper getrocknet, der beim
Versuch gegen Candida albicans bei einer Konzentration von 400 y/ccm eine Hemmzone
von 20,3 mm ergab. Beim turbidometrischen Versuch ergaben 3,47 y/ccm des
Produktes eine 5oo°/oige Hemmung des Wachstums von Candida albicans.
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Der Feststoff G wird mit Chloroform mit io Volumprozent Methanol extrahiert
und der Extrakt auf eine Chromatographiesäule mit dem Silikationenaustauscher »Decalsoa
gegossen. Die Säule wird mit Chloroformanteilen mit 10, 20, 30, 40, 50 Volumprozent
Methanol gewaschen, und die Waschlösungen werden verworfen. Die Säule wird mit 66o
ccm Methanol, geteilt in sechs gleiche Teilmengen, eluiert. Die ersten
50 ccm werden verworfen und die restlichen vereinigt und im Vakuum zur Trockne
eingedampft. Der Rückstand wird mit Wasser extrahiert, der Extrakt gefroren und
das Eis daraus unter vermindertem Druck unter Gewinnung von 92 mg reinem Sistomycosin
absublimiert. 4oo y/ccm dieses
hellgelben festen Materials ergeben
gegen Candida albicans bei einer Verdünnung von i : x eine Hemmzone von 23,8 mm.
Weitere 6o mg Sistomycosin können durch Waschen der Adsorptionssäule mit weiterem
Methanol und Aufarbeitung des Eluats, wie oben beschrieben, erhalten werden.
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Sistomycosin, insbesondere seine Lösungen, unterliegen photochemischer
Zersetzung, wenn sie dem Licht ausgesetzt werden. Es wird durch Säure und Alkali
zersetzt, ist aber in neutralen oder schwach basischen Lösungen, d. h. pH 7 bis
9, stabiler als in sauren Lösungen. Es ist völlig stabil in Wasser unter 25°, und
seine wäßrigen Lösungen können sogar i Stunde auf 50° erhitzt werden ohne Verlust
der antibiotischen Wirksamkeit. In wäßrigen Lösungen bleiben bei ioo° nach i Stunde
noch mehr als 50% der antibiotischen Wirksamkeit zurück. Beispiel 2 Ein Nährmedium,
bestehend aus 5 g käuflicher Glukose, 2,5 g Rindfleischextrakt, 2,5 g Pepton, 2,5
g Natriumchlorid und hinreichend Wasser, um die Lösung auf 500 ccm zu bringen,
wird mit io n-Natronlauge bis zum pH-Wert 7,7 alkalisch gemacht. Das Medium wird
in einen Fernbachkolben eingebracht, mit einem Baumwollpfropfen verschlossen und
bei etwa 1,3 at Dampfdruck ao Minuten sterilisiert. Das Medium wird mit i ccm einer
Suspension von Streptomyces-viridosporus-Sporen aus einem io Tage alten Glukose-Trypton-Agar-Kulturstamm
beimpft. Das resultierende Gemisch wird 8 Tage bei 24° gezüchtet. Am Ende dieser
Zeit hat die Kulturflüssigkeit unter dem Mycel an der Oberfläche einen pH-Wert von
6,8 und ergibt beim Versuch für Sistomycosin gegen Candida albicans nach der Tischplattenmethode
eine Hemmzone von 22 mm Durchmesser. Das in der Kulturflüssigkeit vorhandene Sistomycosin
kann nach dem im Beispiel i beschriebenen Verfahren isoliert werden. Beispiel 3
Ein Gemisch aus i80 g technischer Maltose, i80 g Maiseinweichwasser, 9o g Natriumchiorid,
36 g Dikaliumphosphat und hinreichend Wasser zur Auffüllung auf i81 werden in einen
Gärbehälter von 1141 der im Beispiel i beschriebenen Art eingebracht. Der pH-Wert
der Lösung wird mit io n-Natronlauge auf 7,5 eingestellt, 18 g Calciumcarbonat werden
zugegeben und Gärbehälter und Medium 2 Stunden bei 25o° sterilisiert. Das Nährmedium
wird abgekühlt und aseptisch mit io ccm einer Sporendispersion von Streptomyces
viridosporus beimpft, die durch Schütteln eines 7 Tage alten Glukose-Trypton-Agar-Stammes
von Streptomyces viridosporus mit io ccm o,oi°/oiger wäßriger Marseiller Seifenlösung
hergestellt wurde.
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Das Kulturgemisch wirkt 136 Stunden, bei 28 bis 29° entwickelt, -während
welcher Zeit der Rührer mit einer Umlaufgeschwindigkeit von 15o Umdr./min laufen
gelassen und sterile Luft in das Gemisch mit einer Geschwindigkeit von 7,2 bis 181/min
eingeführt werden. Am Ende der Entwicklungszeit wird das Mycel aus dem Gemisch entfernt
und die klare Kulturflüssigkeit auf seinen Sistomycosingehalt nach der turbidometrischen
Methode gegen Candida albicans untersucht. Bei dem beschriebenen Versuch ergab die
Kulturflüssigkeit, wie gefunden wurde, bei der Verdünnung von 1 : 135 eine 5o°/oige
Wachstumshemmung von Candida albicans. Das in der Kulturflüssigkeit vorhandene Sistomycosin
kann unter Verwendung des im Beispiel i beschriebenen Isolierverfahrens in reinem
Zustand isoliert werden. Beispiel 4 In mehrere Erlenmeyerkolben werden je 125 ccm
Nährmedium aus 0,5% Pepton, o,i°/o Brauhefe, o,25°/0 Feststoffe aus Maiseinweichwasser,
0,25°/o gemahlenem Soj abohnenölkuchen, 0,250/, Butanol-Aceton-Gärrückstand,
0,25 °/o Natriumchlorid, o,i °/o Calciumcarbonat und Restwasser eingebracht.
Die Kolben werden mit mittels Gaze bedeckter Baumwolle verschlossen und bei etwa
1,3 at Druck 25 Minuten sterilisiert, dann wird je ein Kolben aseptisch mit i ccm
Sporensuspension von Streptomyces viridosporus beimpft, die aus einem 7 Tage alten
Glukose-Trypton-Agar-Kulturstamm hergestellt wurde. Die Kolben wurden auf einer
rotierenden Schüttelmaschine mit i50 Umdr./min 4 Tage geschüttelt. Die Temperatur
wurde während der Züchtung bei 22 bis 24° gehalten. Am Ende dieser Zeit hatte die
Kulturflüssigkeit einen pH-Wert von etwa 6,4. Nach der turbidometrischen Probe gegen
Candida albicans enthielt die Kulturflüssigkeit, wie gefunden wurde, hinreichend
Sistomycosin, um bei einer Verdünnung von 1 : 135 eine 5o°/oige Wachstumshemmung
der Versuchsorganismen zu verursachen.
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Wenn gewünscht, können die Kulturgemische in den Kolben vereinigt,
filtriert und das Sistomycosin nach dem im Beispiel i beschriebenen Verfahren isoliert
werden. Beispiel 5 In mehrere Erlenmeyerkolben werden je 125 ccm Nährmedium, bestehend
aus 10/, Maltose, 10/, Maiseinweichwasser, o,2 °/o Dikaliumphosphat, o,5
% Natriumchlorid und Rest Wasser, eingestellt mit io n-Natronlauge auf PH
7,5, eingebracht und die Kolben mit mittels Gaze bedeckter Baumwolle verschlossen.
Die Kolben mit dem Nährmedium werden, wie im Beispiel 4 beschrieben, sterilisiert,
beimpft und gezüchtet. Am Ende wird das Mycel durch Filtration entfernt, und die
Kulturflüssigkeiten werden vereinigt. Die Kulturflüssigkeit hat einen pH-Wert von
etwa 6,35 und erhält, wie gefunden wurde, bei Untersuchung nach der turbidometrischen
Methode hinreichend Sistomycosin, um bei einer Verdünnung von i : 32o eine 5o°/oige
Wachstumshemmung von Candida albicans hervorzurufen. Das reine Sistomycosin kann
aus der Kulturflüssigkeit nach der im Beispiel i beschriebenen Methode isoliert
werden.