DE954423C

DE954423C - Verfahren zur Herstellung von O-Diazoacetyl-serinen

Info

Publication number: DE954423C
Application number: DEP9690A
Authority: DE
Inventors: Quentin Royal Bartz; John Raymold Dice; John Ehrlich; Salvatore Anthony Fusari; Theodore Herbert Haskell; Mildred Penner Knudsen; James Alexander Moore; Ernest D Nicolaides; Roger Dean Westland
Original assignee: Parke Davis and Co LLC
Current assignee: Parke Davis and Co LLC
Priority date: 1953-05-01
Filing date: 1953-05-01
Publication date: 1956-12-20

Description

Verfahren zur Herstellung von O-Diazoacetyl-seünen Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung von neuen Aminosäureverbindungen, die sich von Serin ableiten, nämlich auf die Herstellung von O-DiazcRcetvl-serinen.
O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin besitzen einzigartige therapeutische Eigenschaften, wie aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich ist. Da diese zwei Verbindungen sich in chemischem Sinne voneinander nur dadurch unterscheiden, daß die eine die optisch aktive l-Form und die andere die razemische Form von O-Diazoacetyl-serin sind, sind die chemischen Eigenschaften der beiden Verbindungen identisch und ebenfalls viele ihrer physikalischen Eigenschaften. Beide Verbindungen können durch die Strukturformel dargestellt werden.
O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin, auf welche beiden Isomeren sich die folgenden Ausführungen ausschließlich beziehen, sind gegen Wärme verhältnismäßig. unbeständig und zersetzen sich vor dem Schmelzen. Bei Verwendung des Schmelzpunktapparates von Fisher Johns bei einer Temperatursteigerung mit einer Geschwindigkeit von I" je Minute verhält sich ein Muster beider Verbindungen bei Behandlung in der Nähe des Schmelzpunktes wie folgt: I50 bis I52° = beginnendes Braunwerden, I55" = Sintern und Aufschäumen, I58 bis 1590 = klare Schmelze mit leichtem Schäumen.
Bei Verwendung eines Kupferblockes und ansteigender Temperatur um I" je Minute waren die mit einem Muster, das in einem zugeschmolzenen Kapillarröhrchen eingeschlossen war, erhaltenen Resultate gewöhnlich wie folgt: I46" = beginnendes Sintern, I50" = beginnendes Braunwerden, 1540 = vollständig braun, I58" = lebhafte Zersetzung mit Gasentwicklung, I62" = klare Schmelze mit etwas Schäumen.
Die zwei Verbindungen sind in Wasser stark löslich, aber unlöslich in den üblichen nicht polaren organischen Lösungsmitteln. Sie sind in der Kälte nur sehr wenig löslich in absolutem Methanol, absolutem Äthanol und Aceton, aber sind in warmen wäßrigen Lösungen dieser Lösungsmittel löslich.
O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin liefern mit Alkali- oder Erdalkahhydroxyden, -carbonaten, -bicarbonaten, -oxyden-, -alkoxyden, -amiden Salze.
O-Diazoacetyl-l-serin zeigt eine sehr geringe optische Drehung. Eine 8,4601obige Lösung in Wasser bei Pn 5,18 zeigt ein [a]275 = - 0,5°.
O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin sowie ihre nicht toxischen Metallsalze besitzen einzigartige therapeutische Eigenschaften, indem sie einen Hemmungseffekt auf das Wachstum von Neoplasma bei Tieren und Menschen ausüben, und aus diesem Grunde sind sie außerordentlich wertvoll für die Behandlung solcher Krankheiten bei Tier und Mensch.
O-Diazoacetyl-dl-serin besitzt nur etwa die halbe biologische Wirksamkeit wie O-Diazoacetyl-l-serin.
Die biologische Inaktivität des d-Isomeren wurde durch Herstellung und Erprobung von O-Diazoacetyl-dl-serin bestätigt.
O-Diazoa.cetyl-l-serin wird auch »Azaserìn« genannt.
O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin werden erfindungsgemäß auf chemischem wie auch biologischem Wege gewonnen.
Bei der Herstellung von O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin durch chemische synthetische Verfahren werden die entsprechenden 1- und dl-Isomeren von O-Glycylserin mit einem Diazotierungsmittel umgesetzt.
Die Umwandlung, die bei der oben beschriebenen Diazotierung verläuft, kann wie folgt dargestellt werden, wobei AHO-, Alkyl-O-, HOdSoder Halogen bedeutet.
Zur Herstellung von O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin wird ein Säureadditionssalz des O-Glycyl-serins bei etwa 30° und einem Wert des Reaktionsgemisches von 3 bis 6, vorzugsweise von 4 und 5,5, diazotiert. Als Reaktionsmedium dienen hierbei Wasser oder wäßrige Lösungen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Alkohole.
Bei Durchführung der Diazotierung können salpetrige Säure, Alkylnitrite und Nitrosylverbindungen verwendet werden. Bei Verwendung von salpetriger Säure als Diazotierungsmittel kann eine Lösung von salpetriger Säure, die durch Umsetzung von Stickstoffdioxyd mit Wasser hergestellt wurde, verwendet werden, oder die salpetrige Säure kann in situ durch Einwirkung von Mineralsäure auf ein anorganisches Nitrit, wie Alkalinitrite, Erdalkalinitrite und Schwermetallnitrite hergestellt werden. Spezielle Beispiele solcher anorganischer Nitrite sind Natriumnitrit, Kaliumnitrit, Bariumnitrit, Silbernitrit. Da das als Ausgangsmaterial verwendete O-Glycylserin in Form des Säureadditionssalzes vorliegt, wird zweckmäßig keine Mineralsäure zum Reaktionsgemisch zugegeben, sondern das Säuresalz wird mit dem anorganischen Nitrit versetzt, wobei salpetrige Saure in situ entsteht.
Die salpetrige Säure kann auch in situ erzeugt werden, indem man Stickstofftrioxyd durch das wäßrige Reaktionsgemisch perlen läßt oder das Nitrat von O-Glycylserin verwendet und eine reduzierende Verbindung, wie arsenige Säure, zum Reaktionsgemisch zugibt. Ferner sind als Diazotierungsmittel Äthylnitrit, Butylnitrit, Amylnitrit, Nitrosylchlorid, Nitrosylbromid und Nitrosylschwefelsäure verwendbar.
Die anzuwendende Menge Diazotierungsmittel ist nicht besonders kritisch, aber aus Gründen der Wirtschaftlichkeit sollte mindestens ein Äquivalent für jedes Äquivalent O-Glycylserin-Ausgangsmaterial angewendet werden. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn ein Überschuß des Diazotierungsmittels angewendet wird und, obgleich nur eine der beiden Aminogruppen des O-Glycylserin-Ausgangsmaterials zu diazotieren ist, können bis 3 oder 4 Äquivalente Diazotierungsmittel ohne nachteilige Wirkung auf die Ausbeute des gewünschten Produktes angewendet werden.
Beispiel I 2,6 g Natriumnitrit, gelöst in 25 ccm Wasser, werden zu einer Lösung von 2,9 g O-Glycyl-l-serinmonohydrochlorid in 200 ccm Wasser gegeben, wobei die Temperatur bei o" gehalten wird. Die Lösung wird 1/2 Stunde bei o bis 5° und dann 5 Stunden bei Raumtemperatur (20 bis 30°) stehengelassen. Die Lösung wird gefroren und das Eis aus der Lösung unter hohem Vakuum sublimiert. Die so erhaltene lohgelbe feste Masse wird in 40 ccm Wasser gelöst und in eine Adsorptionssäule mit 40 g Aktivkohle und 40 g Diatomeenerde gegossen. Die Adsorptionssäule wird mit Wasser gewaschen, bis der Ablauf etwa 400 ccm beträgt. Der Ablauf wird verworfen und die Säule mit angenähert 200 ccm wäßriger 2%iger Acetonlösung gewaschen. Das wäßrige Acetoneluat wird aufgefangen und im Vakuum eingedampft. Das gewonnene O-Diazoacetyl-l-serin stellt eine hellgelbgrüne feste Masse dar, die in wäßriger Lösung bei einem Wert 7 ein Maximum der Ultraviolettabsorption E1cm1% = II64 bei 250 µ aufweist. Es hat die Formel

N2CH- CO-O-CH2-CH-COOH

(l-Form)

NH2

und ist chemisch rein. Es kann aus einem Pyridin-Wasser-Äthanol-Gemisch umkristallisiert werden.
Beispiel 2 863 mg Natriumnitrit, gelöst in 20 ccm Wasser, werden zu einer Lösung von ggo mg O-Glycyl-dl-serinmonohydrochlorid in 30 ccm Wasser zugegeben, wobei die Temperatur bei 0° gehalten wird. Die Lösung wird 30 Minuten bei o bis 5° stehengelassen, gefroren und das Eis aus der gefrorenen Masse unter hohem Vakuum absublimiert. Die Aufarbeitung geschieht wie im Beispiel 1. Das wäßrige Acetoneluat wird gefroren und das Eis aus der gefrorenen Masse unter hohem Vakuum unter Gewinnung des gewünschten O-Diazoacetyl-dl-serins absublimiert. Die Verbindung hat gleichfalls die Formel

N2GH- CO-O-CH2-CH-COOH

(dl-Form)

NH2

und wird durch Umkristallisation aus einem Gemisch aus Pyridin, Wasser und Äthanol gereinigt. Die Verbindung weist ein Maximum der Ultraviolettabsorption von E1cm1% = 1140 bei 250,5 µ und pH-Wert 7 auf.
B e i s p i e l 3 6,8 g Silbernitrit werden unter Rühren zu einer Lösung von 8,8 g O-Glycyl-dl-serin-monohydrochlorid in 440 ccm Wasser gegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur (etwa 250) 4 Minuten gerührt, und dann wird das Silberchlorid abfiltriert. Das Filtrat wird gefroren, das Eis aus der gefrorenen Masse unter hohem Vakuum absublimiert und der Rückstand in 100 ccm Wasser gelöst. Die Aufarbeitung geschieht wie oben. Der Rückstand wird aus einem Pyridin-Wasser-Äthanol-Gemisch unter Gewinnung des O-Diazoacetyl-dl-serins in reiner Form umkristallisiert; E11 = II40 bei 250,5 y und p-Wert 7.
Beispiel 4 Angenähert 20 ccm kalte wäßrige Lösung von I g salpetriger Säure werden unter Rühren zu einer Lösung von 1 g O-Glycyl-dl-serin-monohydrochlorid in 50 ccm Wasser gegeben, wobei die Temperatur bei 0° gehalten wird. Der Wert der Lösung wird während der Zugabe auf 4 bis 5,5 eingestellt. Das ReaktionsgemisCh wird bei 5° 4 Stunden stehengelassen. Die Aufarbeitung geschieht wie oben. Umkristallisation der Substanz aus einem Pyridin-Wasser-Äthanol-Gemisch ergibt die Verbindung in reiner Form; E1cm1% = angenähert II40 bei 250,5 j Beispiel 5 1 g Amylnitrit in 15 ccm Äthanol werden zu einer Lösung von I g O-Glycyl-l-serin-monohydrochlorid in 50 ccm Wasser gegeben, wobei die Temperatur nahe o° gehalten wird. Der pE-Wert der Lösung wird mit verdünnter Natronlauge auf 4 bis 5,5 eingestellt, und die Lösung wird 4 Stunden bei 5° gerührt. Die Aufarbeitung geschieht wie oben.
Das Eis wird aus der gefrorenen Masse unter hohem Vakuum unter Gewinnung von O-Diazoacetyl-l-serin in Form einer schwach gelb grünlichen festen Kristallmasse absublimiert, die durch Umkristallisation aus einem Pyridin-Wasser-Äthanol-Gemisch gereinigt wird; E1cm1% = angenähert 1140 bei 250,5,z und pE-Wert 7.
Beispiel 6 2 g rohes O-Glycyl-dl-serin-disulfat werden in 50 ccm Wasser gelöst, und der pH-Wert der Lösung wird mit 5%iger Natronlauge auf 5 eingestellt. Das O-Glycyldl-serin-disulfat wird hierdurch in das Monosulfat ubergeführt. Das Volumen der Lösung wird auf 70 ccm eingestellt, die Lösung wird auf o bis 5° abgekühlt. Eine kalte Lösung von I,I7 g Natriumnitrit in 130 ccm Wasser wird in Teilen unter Rühren zugegeben, wobei die Temperatur in der Nähe von 0° gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird bei o bis 5° weitere 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur (250) 41/2 Stunden stehengelassen. Die Aufarbeitung geschieht wie oben. Das wäßrige Acetoneluat wird im Vakuum zurTrockene eingedampft und das zurückbleibende O-Diazoacetyl-dl-serin durch Umkristallisation aus einem Äthanol-Wasser-Gemisch gereinigt. Maximum der Ultraviolettabsorption E1cm1% = angenähert 1125 bei 250 µ bei pH-Wert 7.
Beispiel 7 3,5 g Butylnitrit in 25 ccm kaltem Äthanol werden unter Rühren zu einer Lösung von 3,5 g O-Glycyll-serin-monohydrochiorid in 100 ccm Wasser gegeben, wobei die Temperatur bei 0° gehalten wird. Der pE-Wert der Lösung wird auf 3,5 eingestellt und die Lösung 4 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Während dieser Zeit wird der p11-Wert der Lösung zwischen 4 und 5,5 gehalten. Die Aufarbeitung geschieht wie oben. O-Diazoacetyl-l-serin wird als hellgelblichgrüne feste Masse gewonnen.
Maximum der Ultraviolettabsorption im Wasser bei PE-7 von E:, = 1160 bei 250 µ.
Beispiel 8 Eine Lösung aus 2,2 g O-Glycyl-l-serin-monohydrochlorid in 100 ccm Wasser wird auf 0° abgekühlt und Stickstofftrioxyd durch die Lösung perlen gelassen, bis ein großer Überschuß an salpetriger Säure vorhanden ist, was durch Jodstärkepapier angezeigt wird. Die Lösung läßt man auf Raumtemperatur erwärmen und bei dieser Temperatur 5 Stunden stehen. Der pn-Wert wird während dieser Zeit zwischen 3,5 und 5 gehalten und weiteres Stickstofftrioxyd zugegeben, wenn eine Jodstärkeprobe negativ wird. Der pn-Wert der Lösung wird auf 6 eingestellt, die Lösung wird ge- froren und das Eis wird aus der gefrorenen Masse unter hohem Vakuum absublimiert. Die Aufarbeitung geschieht wie oben. O-Diazoacetyl-l-serin wird durch Umkristallisation aus einem Pyridin-Wasser-Äthanol-Gemisch gereinigt; E1cm1% = II34 bei 250 und pB-Wert 7.
Statt die Monohydrochloride oder Monosulfate der O-Glycyl-serine zu verwenden, können auch das Monohyrdrobromid, Monohydrofluorid, Monophosphat und ähnliche Monosalze verwendet werden. Die Disalze von O-Glycyl-serinen können bei dem Verfahren wegen des begrenzten pE-Bereichs, in dem die Diazotierung durchgeführt werden muß, nicht verwendet werden. Wenn daher ein Disalz als Ausgangsmaterial vorliegt, wird es in situ zum Monosalz neutralisiert, wenn der pE-Wert des Reaktionsgemisches für die Diazotierung eingestellt wird. O-Diazoacetyl-1-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin können auch in Form ihrer Alkali- und Erdalkalisalze durch geringfügige Abänderung der obigen Arbeitsweisen isoliert werden, indem man eine wäßrige Lösung mit einem Äquivalent Alkali- oder Erdalkalihydroxyd, -bicarbonat oder -carbonat zu dem wäßrigen Acetoneluat fügt, bevor dieses der Gefriertrocknung unterworfen wird. Die auf dieser Weise erhaltenen Salze sind weiße wasserlösliche Pulver. Diese Salze können auch durch Lösen der freien Säure in Wasser und Zugabe einer äquivalenten Menge einer der vorgenannten alkalischen Stoffe erhalten werden, z. B. können die Natrium-, Kalium- und Calciumsalze in der folgenden Weise erhalten werden.
1,7 g O-Diazoacetyl-l-serin werden in 30 ccm Wasser gelöst, und es wird eine wäßrige Lösung von 0,84 g Natriumbicarbonat zugegeben. Die klare Lösung wird gefroren, und das Eis wird aus der gefrorenen Masse unter hohem Vakuum unter Gewinnung des Natriumsalzes von O-Diazoacetyl-l-serin als weißes Pulver absublimiert.
Analog erhält man das Kaliumsalz von O-Diazoacetyl-dl-serin und das Calciumsalz von O-Diazoacetyl-1-serin als weißes Pulver.
Wie oben erwähnt, kann O-Diazoacetyl-l-serin erfindungsgemäß auch durch ein biologisches Verfahren hergestellt werden, und zwar durch Züchtung eines Mikroorganismus Streptomyces fragilis, unter künstlichen Bedingungen in einem geeigneten Nährmedium.
Streptomyces fragilis ist ein bisher unbekannter Mikroorganismus, der in Bodenarten vorkommt.
Streptomyces fragilis besitzt die folgende Charakteristik: Bei Züchtung in Reinkultur auf einem Medium mit 1% Dextrose, 0,5 0/o Pepton (Tryptonart), 0,05 0/o Dikaliumphosphat, 0,050/0 Natriumchlorid, 0,01% Ferrosulfat-Heptahydrat und 20/0 Agar erscheint das feuchte, junge primäre Mycel farblos bis gelb, das später etwas grau wird. Das sekundäre Luftmycel ist zunächst weiß und wird später rosa bis lohfarben.
In Agar erscheint wenig oder kein Pigment. Streptomyces fragilis besitzt die folgenden mikroskopischen Charakteristiken: Das feuchte primäre Mycel ist glasklar und verzweigt. Das sekundäre Luftmycel ist verzweigt. Primäre, sekundäre und manchmal tertiäre Verzweigungen treten auf und können abwechselnd entgegengesetzt gerichtet und gelegentlich lockenförmig sein. Das Luftmycel ist kurz, gerade oder schwach gebogen und bildet gelegentlich Endschleifen oder Spiralen. Die Außenenden dieser Lufttypen unterteilen sich in konidische Ketten von 8 bis 20 Mikron Länge. Die Konidien sind glasklar, sphäroid bis eiförmig, im Mittel mit 1,2 Mikron Durchmesser (Bereich von o,8 bis I,5 Mikron).
Der Mikroorganismus Streptomyces fragilis verflüssigt Gelatine langsam ohne Pigmentbildung und peptonisiert Lackmusmilch langsam, gewöhnlich unter geringer Änderung des p-Wertes. Der Mikroorganismus wächst bei Ernährung mit l-Arabinose, Cellobiose, Dextrin, Dextrose, d-Galaktose, Maltose, Stärke, Trehalose und d-Xylose und wächst langsam bei Ernährung mit Adonit, Äsculin, Dulcit, d-Fruktose, Glycerin, i-Inosit, Inolin, Laktose, d-Mannit, d-Magnose, Melizitose, Melibiose, Raffinose, Ramnose, Salicin, d-Sorbit und Sucrose in einem Medium, das 0,2460/0 Ammoniumsulfat, 0,238 0/o Monokaliumphosphat, o,565°/O Dikaliumphosphat, o,I°/o Maguesiumsulfat, Heptahydrat, 0,00064 0/o Cuprisulfat-Pentahydrat, O,OOOII 01o Ferrosulfat-Heptahydrat, o,ooo7g°/O Manganchlorid-Tetrahydrat, 0,OOOI5 °/0 Zinksulfat-Pentahydrat und 1,5 % Agar enthält.
Eine Kultur von Streptomyces fragilis wird in der Dauersammlung der Parke, Davis & Company, Kultur Bureau, Detroit, Michigan unter Nr. o4g26 aufbewahrt.

Die folgende Tabelle gibt einen Vergleich des Aussehens von Streptomyces fragilis und von bekannten Streptomycesarten, die Antibiotika erzeugen, wenn man sie auf einem Dextrose-Pepton-Salz-Agar-Medium züchtet, wie oben beschrieben ist:

Streptomyces Auf einem geeigneten Mycel

Medium erzeugtes Farbe von Farbe der Farbe

Arten Form des Luftmycels

Antibiotikum Luftmycel und Sporen Rückseite im Ager

fragilis O-Diazoacetyl- kurz, gerade bis Weiß, Hellrosa, farblos, Gelb, keine

l-senn schwach gewellt, Lohfarben Lohfarben

manchmal

Schleifen und

Spiralen

antibiotikus Aktinomycin gerade Weiß bis Grau Schwarz Schwarz

aureofaciens Aureomycin gerade bis leicht Weiß, Grau Gelb, Lohgelb keine

gewellt

Mycel

Auf einem geeigneten

Streptomyces

Medium erzeugtes Farbe von Farbe der Farbe

Arten From des Luftmycels

Antibiotikum Luftmycel und Sporen Rückseite im Agar

fioridae Viomycin gerade, leicht Weiß, Lavendel, Purpurrot keine

gewellt Gräulichgrün

fradiae Neomycin gerade, manchmal Weiß, Seemuschel- farblos, Gelb, keine

Schleifen und rosa Lohgelb

Spiralen

griseus Streptomycin gerade, leicht leicht Hellrosa, farblos, Hell- keine

Aktidion gewellt Hellgräulichgrün braun,

Lavendel

griseus Grisein gerade, leicht Weiß, Hellrosa, farblos, Loh- keine

gewellt Hellgräulichgrün gelb

lavendulae Streptothrizin gerade, manchmal Weiß, Rosa, Schwarz Schwarz

Lavendulin Schleifen und Lavendel

Streptolin Spiralen

rimosus Terramycin Spiralen Weiß Gelb keine

sp. A 105 Aktinorubin Spiralen Weiß, Rosa, Grau Rosa, Rot keine

venezuelae Chloramphe- gerade Weiß, Grau Schwarz Schwarz

nicol

Die folgende Tabelle gibt einen Vergleich der Verwertung von Kohlehydraten durch Streptomyces fragilis und bekarinten Streptomycesarten, die bei der Züchtung auf dem oben beschriebenen synthetischen Agarmedium, in dem die jeweils angegebene Kohlehydratart enthalten ist, Antibiotika erzeugen.

Kohlenstoffgrundsubstanz

d- d-Ga- d-

Streptomyces 1-Ara- Dul- i-Ino- Mal- Rafl- Rham- d-Sor- d-Xy-

Fruk- lak- Inulin Laktose Man- Suorose

Arten binose cit sit tose nose nose bit lose

tose tose nit

fragilis ++++ -o 0 +++ 0 o etwa + ++++ o o0 0 0

antibioticus . @ + o +++ +++ ++++ 0 ++++ ++++ ++++ 0 +++ 0 0 ++

aureofaciens .. ++++ 0 ++++ ++++ 0 0 ++ +++ 0 0 0 0 ++++ ++

floridae ...... 0 bis 0 ++++ ++++ 0 0 bis + bis ++++ ++++ 0 0 0 bis 0 bis ++++

++ + ++ + +

fradiae ....... ++++ 0 0 bis ++++ 0 0 bis etwa + ++ bis 0 0 0 bis

+ + bis + +++ etwa +

griseus ...... 0 bis 0 ++++ ++++ 0 0 bis 0 bis ++++ ++++ 0 0 0 bis 0 bis ++++

etwa + etwa + etwa +++ etwa + etwa +

griseus ...... ++++ 0 ++++ ++++ 0 0 bis 0 bis ++++ ++++ 0 ++++ 0 bis 0 bis ++++

etwa + etwa ++ + etwa + etwa +

lavendulae..... 0 bis 0 0 bis etwa + 0 0 bis 0 bis ++++ 0 0 0 bis 0 0 0 bis

++++ ++++ bis etwa + +++ + ++++

rimosus ....... ++++ 0 ++++ ++++ ++++ 0 ++++ ++++ ++++ 0 bis 0 ++++ 0

bis ++

sp-A I05 ++++ O ++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ o bis ++ + ++++-

etwa +

venezuelae.... ++++ o 0 ++++ ++++ o o + ++++ 0 o ++++ o 10

o = kein Wachstum ++ = einiges Wachstum ++++ = sehr kräftiges + = schlechtes Wachstum +++ = gutes Wachstum Wachstum Aus den beiden oben wiedergegebenen Tabellen ist ersichtlich, daß Streptomyces fragilis dem Streptomyces fradiae in seiner Erscheinung auf Glucose-Trypton-Agar und in seiner Kohlehydratverwertung sehr ähnlich ist. Jedoch sind diese beiden Mikroorganismen durch die Länge ihrer Sporenketten, Größe der Sporen, Farben der Sporeumasse und der Produkte, die sie erzeugen können, leicht zu unterscheiden. Diese Unterschiede sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Eigenschaft @ Streptomyces fragilis | Streptomyces fradiae

Länge der Sporenketten (üblicher

Bereich) ................. 8 bis 20 Mikron 25 bis 70 Mikron

Sporengröße (Mittel) . 1,2 bis I,5 Mikron o,8 bis I,4 Mikron

Farbe der Sporenmasse . Hellrose bis Lohfarben Seemuschelrosa

Erzeugte Produkte .............. O-Diazoacetyl-l-serin Neomycin, Fradicin.

Die Herstellung von O-Diazoacetyi-t-serin unter Verwendung von Streptomyces fragilis wird durchgeführt, indem man ein geeignetes steriles, wäßriges Nährmedium mit Streptomyces fragilis beimpft, das resultierende Gemisch unter sterilen aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 35° entwickelt, die im Kulturgemisch vorhandenen festen Teilchen entfernt und das gewünschte O-Diazoacetyl-l-serin aus der wäßrigen Kulturflüssigkeit isoliert.
Als Impfmasse können Sporen oder Conidien von Streptomyces fragilis sowie auch deren wäßrige Suspensionen mit einer geringen Menge Seife oder Netzmittel verwendet werden. Für große Gärungen ist es vorzuziehen, starke junge Kulturen von Streptomyces fragilis zu verwenden.
Geeignete wäßrige Nährmedien sind solche mit einem Wert zwischen 5 und 8,5, die Kohlenstoff-und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze enthalten. Der bevorzugte Bereich nach der Sterilisation des Nährmediums beträgt 6,5 bis 7. Geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen umfassen unter anderem ölhaltiges Sojabohnenmehl, Weizenklebermehl, Brauhefe, Schweinemagen (Salzextrakt), Fleischeiweißhydrolysat, Schlempe und Feststoffe aus Maiseinweichwasser. Verschiedene Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen mit anderen stickstoffhaltigen Stoffen, z. B. ein Gemisch aus ölhaltigem Sojabohnenmehl, mit Säure hydrolysiertem Kasein und entbitterter Hefe, ein Gemisch aus Salzextrakt aus Schweinemagen und Sojabohnenpepton und ein Gemisch aus ölhaltigem Sojabohnenmehl und säurehydrolysiertem Kasein ergeben besonders gute Resultate. Die Optimalkonzentration dieser Bestandteile reicht von I,5 bis 20/0 des Mediums. Die Kohlenstoffquelle kann allein aus den vorgenannten Stoffen bestehen, beste Ergebnisse werden aber erhalten, wenn auch Glucose oder Galactose dem Medium zugesetzt werden. Die Konzentration an Glucose und Galactose kann von o bis 2 0(o schwanken. Konzentrationen oberhalb 20/0 scheinen einen schädlichen Effekt auf die Ausbeute des gewünschten Produktes zu haben. Als anorganische Salze können Natriumchlorid, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat verwendet werden. Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid und Ammoniumnitrat, sind besonders wünschenswerte Bestandteile des Mediums und führen zu höheren Ausbeuten des gewünschten Produktes. Die optimale Konzentration dieser Ammoniumsalze liegt zwischen 0,I bis 0,50/0 des Nährmediums.
Die Entwicklung von Streptomyces fragilis in den wäßrigen Nährmedien kann auf verschiedenen Wegen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen auf der Oberfläche des Mediums entwickelt werden, oder er kann unterhalb der Oberfläche des Mediums gezüchtet werden, d. h. unter submersen Bedingungen, wenn gleichzeitig Sauerstoff zugeführt wird.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von O-Diazoacetyl-l-serin durch Gärung in großem Maßstabe umfaßt die Verwendung von submersen Kulturen von Streptomyces fragilis. Nach dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein steriles wäßriges Nährmedium mit Streptomyces fragilis beimpft und unter Rühren und Belüften bei einer Temperatur zwischen 20 und 35°, vorzugsweise in der Nähe von 23 bis 29°, gezüchtet, bis eine Höchstkonzentration an O-Diazoacetyl-l-serin in der Kulturflüssigkeit erreicht ist. Die für die Höchstausbeute an O-Diazoacetyl-l-serin erforderliche Zeit schwankt mit der Größe und der verwendeten Einrichtung und wird z. B. in Tankgärbehältern in etwa 32 Stunden oder weniger erreicht. Wenn für die Entwicklung Schüttelflaschen verwendet werden, kann die Zeit bis zur Höchstausbeute länger sein und von 3 bis 8 Tagen reichen, also länger als für die Tankgärung in großem Maßstabe erforderlich ist. Unter submersen Kulturbedingungen entwickelt sich der Mikroorganismus mehr oder minder in der ganzen Masse des Nährmediums in mehr oder weniger getrennten Teilchen im Gegensatz zu einer mehr oder minder zusammen hängenden Haut, die bei Oberflächenkulturverfahren auf der Oberfläche des Mediums vorhanden ist. Ortsfeste Gärfässer, die mit geeigneten Rühr- und bzw. oder Belüftungseinrichtungen ausgerüstet sind, sowie auch horizontale Drehtrommelgärbehälter wurden als besonders vorteilhaft gefunden. Jedoch kann für die Herstellung kleinerer Mengen des Antibiotikums oder von Kulturen des Mikroorganismus das submerse Kulturverfahren in kleinen Kolben oder Ballons durchgeführt werden, die entweder geschüttelt oder mittels geeigneter mechanischer Einrichtungen gerührt werden.
Das Rühren und Belüften des Kulturgemisches kann durch Turbinen, Schaufeln, Propeller oder andere Rühreinrichtungen, durch Rotieren oder Schütteln des Gärbehälters, durch Pumpeinrichtungen oder durch Hindurchleiten von Luft oder anderen sauerstoff; haltigen Gasen durch das Medium erzielt werden. Die Belüftung kann durch Einblasen von Luft oder anderen sauerstoffhaltigen Gasen in das Gärgemisch bewirkt werden, oder es kann durch Versprühung, Verspritzen oder Verschäumen der Maische in einer oder durch eine sauerstoffhaltige Atmosphäre erreicht werden.
Das Oberflächenkulturverfahren zur Herstellung von O-Diazoacetyl-l-serin umfaßt das Beimpfen einer flachen Schicht, gewöhnlich weniger als 2 cm, eines sterilen wäßrigen Nährmediums mit Streptomyces fragilis und das Entwickeln des Gemisches unter aeroben Bedingungen bei etwa 20 bis 35°, vorzugsweise in der Nähe von 23 bis 29°. Es ist gewöhnlich eine längere Entwicklungszeit erforderlich als sie beim Tiefenkulturverfahren angewendet wird, @ um die Höchstausbeute an O-Diazoacetyl-l-serin zu erzielen.
Im allgemeinen beträgt die Entwicklungszeit etwa 3 bis 8 Tage. Nach Beendigung der Entwicklungsphase des Verfahrens wird das Mycel von der Flüssigkeit, die das O-Diazoacetyl-l-serin enthält, abgetrennt und das Produkt aus der Kulturflüssigkeit durch die hernach beschriebenen Verfahren isoliert.
Nach Beendigung der Gärphase des Verfahrens wird das feste Material aus der Kulturflüssigkeit, z. B. durch Filtration oder Zentrifugierung, entfernt, und das O-Diazoacetyl-l-serin wird aus der Kulturflüssigkeit isoliert. Die Isolierung kann durch Konzentrieren der Kulturfiüssigkeit auf ein kleines Volumen, z. B. 1/5 bis 1/ze des ursprünglichen Volumens von 3 bis 10 Volumen eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, wie Aceton, Äthanol, Methanol, Äthanol-Diäthyläther-Gemisch oder Äthanol-Diisopropyläther-Gemisch und Abtrennen der ausgefällten Verunreinigungen aus der Lösung durchgeführt werden. Nach einem anderen Verfahren wird die geklärte Kulturflüssigkeit zur Trockene eingedampft und der trockene Rückstand mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, das weniger als 50 0/o Wasser enthält, extrahiert.
Das so erhaltene Konzentrat oder der Extrakt wird durch eine Adsorptionssäule geleitet, die einen neutralen Adsorbenten mit einem p,-Wert zwischen 5 und 8 enthält. Das gewünschte Produkt wird aus dem Adsorbent mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels mit mehr als 50 0/o Wasser eluiert. Geeignete Adsorbentien sind Tonerde (eingestellt auf einen p11-Wert 5 bis 8), Tonerde nach Brockmann (eingestellt auf einen pn-Wert 5 bis 8) und feste Natriumalu- -miniumsilikate. Das Eluat wird zu einem feinen Pulver getrocknet, das bis zu 20 Gewichtsprozent des gewünschten O-Diazoacetyl-l-serin enthält. Infolge der ziemlich unbeständigen Natur -des Produktes ist es vorzuziehen, das Wasser aus dem Eluat durch Gefrieren und Absublimieren des Eises unter hohem Vakuum zu entfernen.
Das wie oben beschrieben hergestelIte Pulver wird in wenig Wasser gelöst, und eine Lösung mit3 bis 30 mg O-Diazoacetyl-l-serin je ccm wird zugegeben. Der p-Wert der Lösung wird vorzugsweise auf 6,5 bis 7 eingestellt. Die Lösung wird durch eine Adsorptionssäule mit Aktivkohle geleitet, die das gewünschte Produkt adsorbiert. Die zur Adsorption des gesamten Produktes aus der Lösung erforderliche Menge Aktivkohle schwankt mit der Konzentration des Produktes in dem getrockneten Pulver. Zum Beispiel erfordert ein rohes Material, das 60/o O-Diazoacetyl-l-serin enthält, etwa 4 g Aktivkohle je g, während ein Material mit 120/0 O-Diazoacetyl-l-serin etwa 5 bis 6 g Aktivkohle je g erfordert. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn die Aktivkohle mit Diatomeenerde vermischt wird, die als Filterhilfe dient. Nachdem die Lösung des getrockneten Pulvers durch die Adsorptionssäule gelaufen ist, wird die Säule mit dem Volumen Wasser, das von der Säule zurückgehalten wird, gewaschen, d. h. der Menge Wasser, die notwendig ist, um die Säule zu benetzen. Das Waschwasser wird verworfen, und das Produkt wird durch Auswaschen der Adsorptionssäule mit Wasser mit I bis 25 0/o eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, wie Aceton, Methanol, Äthanol oder Methyläthylketon, eluiert. Das Eluat wird auf ein kleines Volumen, gewöhnlich einer Lösung mit 30 bis 80 mg des gewünschten Produktes je ccm, konzentriert, und das O-Diazoacetyl-l-serin durch Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, wie wasserfreies Äthanol, Aceton oder Isobutanol, gefällt. Das Gemisch wird erwärmt bis die Lösung vollständig ist und dann abgekühlt. Das so erhaltene O-Diazoacetyll-serin ist eine kristalline feste Masse, die nahezu rein ist, aber, falls gewünscht, weiter durch Umkristallisation aus einem Gemisch aus Wasser, Pyridin und Äthanol gereinigt werden kann. Das Produkt ist in jeder Hinsicht mit dem Material, das durch chemische Synthese hergestellt wurde, identisch.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von O-Diazoacetyl-l-serin auf biologischem Wege.
Beispiel 9.
37,8 1 Nährmedium der folgenden Zusammensetzung: Glucose ................... 1,0% ölhaltiges Sojabohnenmehl 1,0 0/o säurehydrolisiertes Kasein 0,5 0/o entbitterte Hefe ............. 0,5 01, Natriumchlorid ............ 0,5% Wasser bis zur Auffüllung auf . . Io0,0°/o werden in- einem Gärbehälter aus rostfreiem Stahl von -etwa II3,41 eingebracht, der p,-Wert wird mit 6 n-Natronlauge auf 7,5 eingestellt, und es werden 0,1% Calciumcarbonat zugegeben. Das Medium wird durch 1/2stündiges Erhitzen auf I2I° sterilisiert, wonach der p-Wert des Mediums 6,85 beträgt. Das Medium wird abgekühlt und mit Sporen aus zwei 14 Tage alten Kulturen nach Moyer's Sporen-Agar-Strichkultur von Streptomyces fragilis, suspendiert in 20 ccm o,o10/0iger steriler Marseiller Seifenlösung, beimpft. Das Kulturgemisch wird 24 Stunden bei 27° entwickelt, während welcher Zeit eine Belüftung durch einen Sprenkler mit einer Geschwindigkeit von I Volumen Luft je Volumen Medium und Minute erfolgt. Die so erhaltene entwickelte Kultur wird zum Beimpfen der Haupt- kultur, wie unten beschrieben, verwendet. Etwa 557 1 eines Mediums folgender Zusammensetzung: Glucose I,O 1 0 °/0 ölhaltiges Sojabohnenmehl . 1 0 0/o säurehydrolysiertes Kasein ........ o,5 5 01o entbitterte Hefe ............... 0,5 % Natriumchlorid ................. 0,5 % Ammoniumnitrat.................. 0,25% Rest Wasser 6 n-Natronlaugelösung hinreichend, um den pH-Wert auf 7,5 zu bringen Calciumcarbonat, zugegeben nach der pH-Einstellung................. 0,1% werden in einen Gärbehälter aus rostfreiem Stahl von etwa 760 1 eingebracht und durch 1/2stündiges Erhitzen auf 1210 sterilisiert. Das Medium wird abgekühlt und mit der 37,8-1-Kultur von Streptomyces fragilis, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, beimpft und 44 Stunden bei 26° entwickelt.
Während der Entwicklungszeit wird durch ein Sprenkelrohr Luft mit einer Geschwindigkeit von I,5 Volumina Luft je Volumen Medium und je Minute zugeführt, und das - Gemisch wird in den ersten 12 Stunden mit einer Geschwindigkeit von I50 Umdrehungen je Minute und mit 300 Umdrehungen je Minute in den letzten 32 Stunden gerührt, wobei etwa 5,67 1 sterilisiertes Gemisch aus rohem Schweineschmalz und Mineralölen, das Mono- und Diglycerine enthält, zugefügt wurde, die zur Bekämpfung des Schäumens notwendig waren.
Am Ende der Entwicklungszeit wurde ein kleines Probemuster des Kulturgemisches entnommen und einer Seitz-Filtration unterworfen. 5 ccm dieses Filtrates, - zweimal täglich über 7 Tage intraperitoneal appliziert, enthält hinreichend O-Diazoacetyl-l-serin, um das Wachstum von unter der Haut implantierten Sarcom-I8o-Tumoren bei Mäusen in einem solchen Ausmaß zu verhindern, daß ihre Größe weniger als 25 0/o der Größe von Tumoren bei nicht behandelten Mäusen beträgt.
Das in dem entwickelten Gärgemisch vorhandene feste Material wird abfiltriert, und der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen. Die Waschwässer werden mit dem Hauptfiltrat vereinigt, und etwa 4I6 1 dieser Lösung wurden mit 2079 g Aktivkohle I Stunde gerührt. Die Kohle wird abfiltriert, und der Filterkuchen wird mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate und Waschwässer (etwa 5I4 1) werden im Vakuum auf ein Volumen von etwa 76 1 eingedampft. Es werden zum Konzentrat etwa 3 Volumina Aceton unter Rühren zugegeben, die sich bildende Fällung wird abfiltriert, und der Filterkuchen wird mit 75%igem wäßrigem Aceton gewaschen. Die vereinigten wäßrigen Acetonfiltrate und Waschwässer werden im Vakuum auf ein Volumen von etwa 74 1 (19,5 Gallonen) eingedampft. Das so erhaltene Konzentrat wird gefroren und in gefrorenem Zustand unter hohem Vakuum getrocknet. Eine wäßrige Lösung des so erhaltenen trockenen Pulvers, Mäusen intraperitoneal zweimal täglich über 7 Tage in einer Dosis von IOOO mg je kg Körpergewicht appliziert, enthält hinreichend O-Diazoacetyl-l-serin, um das Wachstum von Sarcom-8o-Tumoren in einem Ausmaß zu verhindern, daß ihre Größe weniger als 25 0/o der Tumorgröße bei unbehandelten Tieren betrug.
1 kg trockenes Pulver wurde mit 10 1 90 volumprozentigem Äthanol extrahiert und nachfolgend nochmals mit 21 des gleichen Lösungsmittels ausgezogen.
Die vereinigten Extrakte, etwa 12 1, wurden mit hinreichend Wasser verdünnt, um die Alkoholkonzentration auf 75 Volumprozent herabzusetzen, und diese alkoholische Lösung passierte eine Adsorptionssäule, die wie unten beschrieben hergestellt war.
3 kg Tonerde wurden mit verdünnter Salzsäure gerührt, bis der pH-Wert bei 7,7 konstant bleibt. Die Tonerde wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen und durch 4stündiges Erhitzen auf 2000 aktiviert. Die Tonerde wurde mit 75 0/0igem wasserhaltigem Äthanol gewaschen und in eine Adsorptionssäule mit einem Durchmesser von etwa 10 cm eingefüllt. Das gesamte eingefüllte Volumen beträgt angenähert 3500 ccm.
Die oben hergestellte älkoholische Lösung wird der Adsorptionssäule mit einer Geschwindigkeit von 6 i je Stunde zugeführt und das therapeutisch uuwirksame Perkolat verworfen. Die Säule wird mit 35 1 75 volumprozentigem Äthanol gewaschen, die Waschwässer werden verworfen, und die Säule wird schließlich mit 21 1 5o0/0igem Äthanol gewaschen. In der letzten Waschlösung kann eine geringe therapeutische Wirksamkeit festgestellt werden. Nach Beendigung des Auswaschens wird das adsorbierte O-Diazoacetyl-1-serin aus der Adsorptionssäule durch Hindurchleiten von I7,51 destilliertem Wasser eluiert. Das wäßrige Eluat wird konzentriert und gefroren, und das Konzentrat wird in gefrorenem Zustand unter hohem Vakuum getrocknet. Eine wäßrige Lösung des so erhaltenen Pulvers zeigt bei dem Standard Mäusetest gegen Sarcom I80 einen Gehalt an O-Diazoacetyl-l-serin von 5,8°/o oder hinreichend O-Diazoacetyl-l-serin, um bei zweimal täglicher intraperitonealer Dosis von 25 mg je kg Körpergewicht das Wachstum von Tumoren in den so behandelten Mäusen so weit zu unterdrücken daß die Größe der Tumore weniger als 250/0. der Größe von Tumoren bei unbehandelten Mäusen beträgt.
500 g Material mit 5,8 0/o O-Diazoacetyl-l-serin werden in I,3201 Wasser gelöst.. Es wird eine Säule aus Aktivkohle wie folgt bereitet. Ein Gemisch aus 2 kg Aktivkohle und 2 kg Diatomeenerde werden als dicker Schlamm in eine I5-cm-Säule eingefüllt. Der pH-Wert des Wassers beträgt 5,2 bis 5,5. Bei dieser Schicht ist ein Druck von I20 cm Lösungsmittel erforderlich, um eine geeignete Strömungsgeschwindigkeit zu erreichen. Nach dem Einfüllen wird die Säule mehrere Stunden mit Wasser gewaschen, um sich zu setzen und um lösliche Anteile zu entfernen. Die Lösung wird der Säule mit einem Überdruck von etwa 120 cm Wasser zugeführt. Ein Volumen von 9 1 Wasser, das in der Säule zurückgehalten .wird, wurde dann der Säule zugeführt. Hierauf folgte eine 5%ige Acetonlösung. Der gesamte Durchfluß von Lösungsmitteln beträgt 36 1. Das farblose Eluat wird verworfen. Die Eluierungsspitze, die leicht beobachtet werden kann, ist eine hellgelblichgrüne Lösung. Diese Lösung wird aufgefangen. Die Lösung wird durch Vakuumdestillation konzentriert, bis eine Konzentraktion von 20 bis 25 mg/ccm erreicht ist. Die Lösung wird in eine Säule eingebracht, die auf die gleiche Weise wie beschrieben hergerichtet ist und nach der gleichen Behandlungsweise wie die primäre Adsorption behandelt. Das Perkolat wird durch Vakuumdestillation konzentriert, bis eine Konzentration von 60 bis 70 mg je ccm erreicht ist. Die Lösungsmenge beträgt nun angenähert 300 ccm. Es wird wasserfreier Alkohol (etwa 450 ccm) zugefügt. Die Lösung wird mäßig erwärmt, um die Lösung vollständig zu machen und dann mehrere Stunden bei 5° gelagert.
Das sich in kristalliner Form abscheidende O-Diazoacetyl-l-serin wird gesammelt und durch Umkristallisation aus 60- bis 7001,igem Äthanol gereinigt; = 196m = II40 bei 250,5 leu in einem wäßrigen Phosphatpuffer vom p-Wert 7. Eine wäßrige Lösung der Kristalle wurde Mäusen intraperitoneal zweimal täglich über 7 Tage in einer Dosis von 3,1 mg je kg Körpergewicht verabreicht und verhindert das Wachstum von Sarcom-i8o-Tumoren in solchem Ausmaß, daß ihre Größe weniger als 25 0/o der Tumorgröße bei unbehandelten Tieren beträgt.
PATENTANSPROCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin und deren Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Säureadditionssalz von O-Glycyl-l-serin bzw. O-Glycyf-dl-serin mit einem Diazotierungsmittel behandelt und das Reaktionsprodukt gegebenenfalls i ein Salz überführt.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion bei einer Temperatur unterhalb etwa 30° in einem wäßrigen Medium bei einem pE-Wert zwischen 3 und 6, vorzugsweise zwischen 4 und 5,5, durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Diazotierungsmittel salpetrige Säure verwendet, die gegebenenfalls in situ durch Einwirkung von Mineralsäure auf ein anorganisches Nitrit erzeugt wird.

4. Verfahren nach Anspruch I ünd 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Diazotierungsmittel ein Alkylnitrit oder eine Nitrosylverbindung verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säureadditionssalz ein Monohydrochlorid oder Monosulfat verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das O-Diazoacetyl-l-serin oder O-Diazoacetyl-dl-serin mit einem Hydroxyd, Carbonat, Bicarbonat, Oxyd, Alkoxyd oder Amid von Alkali- oder Erdalkalimetallen in das entsprechende Salz überführt.

7. Verfahren zur Herstellung von O-Diazoacetyl-1sein, dadurch gekennzeichnet, daß man ein steriles wäßriges Nährmedium bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8,5, das vorzugsweise I,5 bis 2 °/0 mindestens einen der folgenden Nährstoffe enthält: ölhaltiges Sojabohnenmehl, Weizenld ebermehl, Brauhefe, Salzextrakte aus Schweinemagen, Fleischeiweißhydrolysat, Maisschlempe, Feststoffe aus Maiseinweichwasser, weniger als 20/o Glucose oder Galactose und Mineralsalze, vorzugsweise zwischen 0,I und 0,50/0 anorganisches Ammoniumsalz, mit Streptomyces fragilis beimpft, das Gemisch unter aeroben Bedingungen bei etwa 20 bis 35° entwickelt, feste Teilchen entfernt und das O-Diazoacetyl-l-serin isoliert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kulturgemisch während der Entwicklung rührt und unter Durchleiten von Luft bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 7 unter submersen aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 23 und 29° entwickelt.

9. Verfahren nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung des O-Diazoacetyl-l-serins das Kulturgemisch auf ein kleines Volumen einengt, drei bis zehn Volumina eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, vorzugsweise Äthanol, zum Konzentrat gibt, die nicht löslichen Verunreinigungen von der Lösung abtrennt, die Lösung durch eine Absorptionssäule leitet, die auf einen pH-Wert 5 bis 8 eingestellte Tonerde oder festes Natriumaluminiumsilikat enthält, die ablaufende Lösung verwirft, dann das adsorbierte O-Diazoacetyl-l-serin mit Wasser oder einem wäßrigen Gemisch eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels mit mehr als 50°/O Wasser eluiert, die Lösungsmittel aus dem Eluat entfernt, den Rückstand in wenig Wasser aufnimmt, die Lösung durch eine Adsorptioqssäule mit Aktivkohle leitet, die ablaufende Lösung verwirft, das adsorbierte O-Diazoacetylserin mit Wasser, das I bis 25 01o eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, vorzugsweise Aceton, enthält, herauslöst, dieses Eluat auf ein kleines Volumen einengt und das O-Diazoacetyl-l-serin in praktisch reiner Form durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels ausfällt.

IO. Verfahren nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung des O-Diazoacetyl-l-serins das Kulturgemisch zur Trockene eindampft, den Rückstand mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Äthanol mit weniger als 50010 Wasser auszieht, den Extrakt durch eine Adsorptionssäule leitet, die auf einen pH-Wert 5 bis 8 eingestellte Tonerde oder Natriumaluminiumsilikat enthält, die ablaufende Lösung verwirft, das adsorbierte O-Diazoacetyl-l-serin mit Wasser oder einem wäßrigen, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel mit mehr als 50°/O Wasser eluiert, die Lösungsmittel aus dem Eluat entfernt, den Rückstand in etwas Wasser aufnimmt, die Lösung durch eine Adsorptionssäule mit Aktivkohle leitet, die ablaufende Lösung verwirft, das adsorbierte O-Diazoacetyl-l-serin mit Wasser, das I bis 25 °/0 eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels, vorzugsweise Aceton, enthält, eluiert, das Eluat auf ein kleines Volumen einengt und das O-Diazoacetyl-l-serin in praktisch reiner Form durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels ausfällt.