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Verfahren zur Herstellung von O-Diazoacetyl-seünen Die Erfindung bezieht
sich auf Verfahren zur Herstellung von neuen Aminosäureverbindungen, die sich von
Serin ableiten, nämlich auf die Herstellung von O-DiazcRcetvl-serinen.
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O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin besitzen einzigartige
therapeutische Eigenschaften, wie aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich
ist. Da diese zwei Verbindungen sich in chemischem Sinne voneinander nur dadurch
unterscheiden, daß die eine die optisch aktive l-Form und die andere die razemische
Form von O-Diazoacetyl-serin sind, sind die chemischen Eigenschaften der beiden
Verbindungen identisch und ebenfalls viele ihrer physikalischen Eigenschaften. Beide
Verbindungen können durch die Strukturformel
dargestellt werden.
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O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin, auf welche beiden
Isomeren sich die folgenden Ausführungen ausschließlich beziehen, sind gegen Wärme
verhältnismäßig. unbeständig und zersetzen sich vor
dem Schmelzen.
Bei Verwendung des Schmelzpunktapparates von Fisher Johns bei einer Temperatursteigerung
mit einer Geschwindigkeit von I" je Minute verhält sich ein Muster beider Verbindungen
bei Behandlung in der Nähe des Schmelzpunktes wie folgt: I50 bis I52° = beginnendes
Braunwerden, I55" = Sintern und Aufschäumen, I58 bis 1590 = klare Schmelze mit leichtem
Schäumen.
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Bei Verwendung eines Kupferblockes und ansteigender Temperatur um
I" je Minute waren die mit einem Muster, das in einem zugeschmolzenen Kapillarröhrchen
eingeschlossen war, erhaltenen Resultate gewöhnlich wie folgt: I46" = beginnendes
Sintern, I50" = beginnendes Braunwerden, 1540 = vollständig braun, I58" = lebhafte
Zersetzung mit Gasentwicklung, I62" = klare Schmelze mit etwas Schäumen.
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Die zwei Verbindungen sind in Wasser stark löslich, aber unlöslich
in den üblichen nicht polaren organischen Lösungsmitteln. Sie sind in der Kälte
nur sehr wenig löslich in absolutem Methanol, absolutem Äthanol und Aceton, aber
sind in warmen wäßrigen Lösungen dieser Lösungsmittel löslich.
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O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin liefern mit Alkali-
oder Erdalkahhydroxyden, -carbonaten, -bicarbonaten, -oxyden-, -alkoxyden, -amiden
Salze.
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O-Diazoacetyl-l-serin zeigt eine sehr geringe optische Drehung. Eine
8,4601obige Lösung in Wasser bei Pn 5,18 zeigt ein [a]275 = - 0,5°.
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O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin sowie ihre nicht
toxischen Metallsalze besitzen einzigartige therapeutische Eigenschaften, indem
sie einen Hemmungseffekt auf das Wachstum von Neoplasma bei Tieren und Menschen
ausüben, und aus diesem Grunde sind sie außerordentlich wertvoll für die Behandlung
solcher Krankheiten bei Tier und Mensch.
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O-Diazoacetyl-dl-serin besitzt nur etwa die halbe biologische Wirksamkeit
wie O-Diazoacetyl-l-serin.
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Die biologische Inaktivität des d-Isomeren wurde durch Herstellung
und Erprobung von O-Diazoacetyl-dl-serin bestätigt.
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O-Diazoa.cetyl-l-serin wird auch »Azaserìn« genannt.
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O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin werden erfindungsgemäß
auf chemischem wie auch biologischem Wege gewonnen.
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Bei der Herstellung von O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin
durch chemische synthetische Verfahren werden die entsprechenden 1- und dl-Isomeren
von O-Glycylserin mit einem Diazotierungsmittel umgesetzt.
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Die Umwandlung, die bei der oben beschriebenen Diazotierung verläuft,
kann wie folgt
dargestellt werden, wobei AHO-, Alkyl-O-, HOdSoder Halogen bedeutet.
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Zur Herstellung von O-Diazoacetyl-l-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin
wird ein Säureadditionssalz des O-Glycyl-serins bei etwa 30° und einem Wert des
Reaktionsgemisches von 3 bis 6, vorzugsweise von 4 und 5,5, diazotiert. Als Reaktionsmedium
dienen hierbei Wasser oder wäßrige Lösungen von mit Wasser mischbaren organischen
Lösungsmitteln, wie Alkohole.
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Bei Durchführung der Diazotierung können salpetrige Säure, Alkylnitrite
und Nitrosylverbindungen verwendet werden. Bei Verwendung von salpetriger Säure
als Diazotierungsmittel kann eine Lösung von salpetriger Säure, die durch Umsetzung
von Stickstoffdioxyd mit Wasser hergestellt wurde, verwendet werden, oder die salpetrige
Säure kann in situ durch Einwirkung von Mineralsäure auf ein anorganisches Nitrit,
wie Alkalinitrite, Erdalkalinitrite und Schwermetallnitrite hergestellt werden.
Spezielle Beispiele solcher anorganischer Nitrite sind Natriumnitrit, Kaliumnitrit,
Bariumnitrit, Silbernitrit. Da das als Ausgangsmaterial verwendete O-Glycylserin
in Form des Säureadditionssalzes vorliegt, wird zweckmäßig keine Mineralsäure zum
Reaktionsgemisch zugegeben, sondern das Säuresalz wird mit dem anorganischen Nitrit
versetzt, wobei salpetrige Saure in situ entsteht.
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Die salpetrige Säure kann auch in situ erzeugt werden, indem man Stickstofftrioxyd
durch das wäßrige Reaktionsgemisch perlen läßt oder das Nitrat von O-Glycylserin
verwendet und eine reduzierende Verbindung, wie arsenige Säure, zum Reaktionsgemisch
zugibt. Ferner sind als Diazotierungsmittel Äthylnitrit, Butylnitrit, Amylnitrit,
Nitrosylchlorid, Nitrosylbromid und Nitrosylschwefelsäure verwendbar.
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Die anzuwendende Menge Diazotierungsmittel ist nicht besonders kritisch,
aber aus Gründen der Wirtschaftlichkeit sollte mindestens ein Äquivalent für jedes
Äquivalent O-Glycylserin-Ausgangsmaterial angewendet werden. Die besten Ergebnisse
werden erhalten, wenn ein Überschuß des Diazotierungsmittels angewendet wird und,
obgleich nur eine der beiden Aminogruppen des O-Glycylserin-Ausgangsmaterials zu
diazotieren ist, können bis 3 oder 4 Äquivalente Diazotierungsmittel ohne nachteilige
Wirkung auf die Ausbeute des gewünschten Produktes angewendet werden.
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Beispiel I 2,6 g Natriumnitrit, gelöst in 25 ccm Wasser, werden zu
einer Lösung von 2,9 g O-Glycyl-l-serinmonohydrochlorid in 200 ccm Wasser gegeben,
wobei die Temperatur bei o" gehalten wird. Die Lösung wird 1/2 Stunde bei o bis
5° und dann 5 Stunden bei Raumtemperatur (20 bis 30°) stehengelassen. Die Lösung
wird gefroren und das Eis aus der Lösung unter hohem Vakuum sublimiert. Die so erhaltene
lohgelbe feste Masse wird in 40 ccm Wasser gelöst und in eine Adsorptionssäule mit
40 g Aktivkohle und 40 g Diatomeenerde gegossen. Die Adsorptionssäule wird mit Wasser
gewaschen, bis der Ablauf etwa 400 ccm beträgt. Der Ablauf wird verworfen und die
Säule
mit angenähert 200 ccm wäßriger 2%iger Acetonlösung gewaschen. Das wäßrige Acetoneluat
wird aufgefangen und im Vakuum eingedampft. Das gewonnene O-Diazoacetyl-l-serin
stellt eine hellgelbgrüne feste Masse dar, die in wäßriger Lösung bei einem Wert
7 ein Maximum der Ultraviolettabsorption E1cm1% = II64 bei 250 µ aufweist. Es hat
die Formel
| N2CH- CO-O-CH2-CH-COOH |
| (l-Form) |
| NH2 |
und ist chemisch rein. Es kann aus einem Pyridin-Wasser-Äthanol-Gemisch umkristallisiert
werden.
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Beispiel 2 863 mg Natriumnitrit, gelöst in 20 ccm Wasser, werden
zu einer Lösung von ggo mg O-Glycyl-dl-serinmonohydrochlorid in 30 ccm Wasser zugegeben,
wobei die Temperatur bei 0° gehalten wird. Die Lösung wird 30 Minuten bei o bis
5° stehengelassen, gefroren und das Eis aus der gefrorenen Masse unter hohem Vakuum
absublimiert. Die Aufarbeitung geschieht wie im Beispiel 1. Das wäßrige Acetoneluat
wird gefroren und das Eis aus der gefrorenen Masse unter hohem Vakuum unter Gewinnung
des gewünschten O-Diazoacetyl-dl-serins absublimiert. Die Verbindung hat gleichfalls
die Formel
| N2GH- CO-O-CH2-CH-COOH |
| (dl-Form) |
| NH2 |
und wird durch Umkristallisation aus einem Gemisch aus Pyridin, Wasser und Äthanol
gereinigt. Die Verbindung weist ein Maximum der Ultraviolettabsorption von E1cm1%
= 1140 bei 250,5 µ und pH-Wert 7 auf.
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B e i s p i e l 3 6,8 g Silbernitrit werden unter Rühren zu einer
Lösung von 8,8 g O-Glycyl-dl-serin-monohydrochlorid in 440 ccm Wasser gegeben. Die
Lösung wird bei Raumtemperatur (etwa 250) 4 Minuten gerührt, und dann wird das Silberchlorid
abfiltriert. Das Filtrat wird gefroren, das Eis aus der gefrorenen Masse unter hohem
Vakuum absublimiert und der Rückstand in 100 ccm Wasser gelöst. Die Aufarbeitung
geschieht wie oben. Der Rückstand wird aus einem Pyridin-Wasser-Äthanol-Gemisch
unter Gewinnung des O-Diazoacetyl-dl-serins in reiner Form umkristallisiert; E11
= II40 bei 250,5 y und p-Wert 7.
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Beispiel 4 Angenähert 20 ccm kalte wäßrige Lösung von I g salpetriger
Säure werden unter Rühren zu einer Lösung von 1 g O-Glycyl-dl-serin-monohydrochlorid
in 50 ccm Wasser gegeben, wobei die Temperatur bei 0° gehalten wird. Der Wert der
Lösung wird während der Zugabe auf 4 bis 5,5 eingestellt. Das ReaktionsgemisCh wird
bei 5° 4 Stunden stehengelassen. Die Aufarbeitung geschieht wie oben. Umkristallisation
der Substanz aus einem Pyridin-Wasser-Äthanol-Gemisch ergibt die Verbindung in reiner
Form; E1cm1% = angenähert II40 bei 250,5 j Beispiel 5 1 g Amylnitrit in 15 ccm Äthanol
werden zu einer Lösung von I g O-Glycyl-l-serin-monohydrochlorid in 50 ccm Wasser
gegeben, wobei die Temperatur nahe o° gehalten wird. Der pE-Wert der Lösung wird
mit verdünnter Natronlauge auf 4 bis 5,5 eingestellt, und die Lösung wird 4 Stunden
bei 5° gerührt. Die Aufarbeitung geschieht wie oben.
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Das Eis wird aus der gefrorenen Masse unter hohem Vakuum unter Gewinnung
von O-Diazoacetyl-l-serin in Form einer schwach gelb grünlichen festen Kristallmasse
absublimiert, die durch Umkristallisation aus einem Pyridin-Wasser-Äthanol-Gemisch
gereinigt wird; E1cm1% = angenähert 1140 bei 250,5,z und pE-Wert 7.
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Beispiel 6 2 g rohes O-Glycyl-dl-serin-disulfat werden in 50 ccm
Wasser gelöst, und der pH-Wert der Lösung wird mit 5%iger Natronlauge auf 5 eingestellt.
Das O-Glycyldl-serin-disulfat wird hierdurch in das Monosulfat ubergeführt. Das
Volumen der Lösung wird auf 70 ccm eingestellt, die Lösung wird auf o bis 5° abgekühlt.
Eine kalte Lösung von I,I7 g Natriumnitrit in 130 ccm Wasser wird in Teilen unter
Rühren zugegeben, wobei die Temperatur in der Nähe von 0° gehalten wird. Das Reaktionsgemisch
wird bei o bis 5° weitere 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur (250) 41/2 Stunden
stehengelassen. Die Aufarbeitung geschieht wie oben. Das wäßrige Acetoneluat wird
im Vakuum zurTrockene eingedampft und das zurückbleibende O-Diazoacetyl-dl-serin
durch Umkristallisation aus einem Äthanol-Wasser-Gemisch gereinigt. Maximum der
Ultraviolettabsorption E1cm1% = angenähert 1125 bei 250 µ bei pH-Wert 7.
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Beispiel 7 3,5 g Butylnitrit in 25 ccm kaltem Äthanol werden unter
Rühren zu einer Lösung von 3,5 g O-Glycyll-serin-monohydrochiorid in 100 ccm Wasser
gegeben, wobei die Temperatur bei 0° gehalten wird. Der pE-Wert der Lösung wird
auf 3,5 eingestellt und die Lösung 4 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
Während dieser Zeit wird der p11-Wert der Lösung zwischen 4 und 5,5 gehalten. Die
Aufarbeitung geschieht wie oben. O-Diazoacetyl-l-serin wird als hellgelblichgrüne
feste Masse gewonnen.
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Maximum der Ultraviolettabsorption im Wasser bei PE-7 von E:, = 1160
bei 250 µ.
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Beispiel 8 Eine Lösung aus 2,2 g O-Glycyl-l-serin-monohydrochlorid
in 100 ccm Wasser wird auf 0° abgekühlt und Stickstofftrioxyd durch die Lösung perlen
gelassen, bis ein großer Überschuß an salpetriger Säure vorhanden ist, was durch
Jodstärkepapier angezeigt wird. Die Lösung läßt man auf Raumtemperatur erwärmen
und bei dieser Temperatur 5 Stunden stehen. Der pn-Wert wird während dieser Zeit
zwischen 3,5 und 5 gehalten und weiteres Stickstofftrioxyd zugegeben, wenn eine
Jodstärkeprobe negativ wird. Der pn-Wert der Lösung wird auf 6 eingestellt, die
Lösung wird ge-
froren und das Eis wird aus der gefrorenen Masse
unter hohem Vakuum absublimiert. Die Aufarbeitung geschieht wie oben. O-Diazoacetyl-l-serin
wird durch Umkristallisation aus einem Pyridin-Wasser-Äthanol-Gemisch gereinigt;
E1cm1% = II34 bei 250 und pB-Wert 7.
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Statt die Monohydrochloride oder Monosulfate der O-Glycyl-serine
zu verwenden, können auch das Monohyrdrobromid, Monohydrofluorid, Monophosphat und
ähnliche Monosalze verwendet werden. Die Disalze von O-Glycyl-serinen können bei
dem Verfahren wegen des begrenzten pE-Bereichs, in dem die Diazotierung durchgeführt
werden muß, nicht verwendet werden. Wenn daher ein Disalz als Ausgangsmaterial vorliegt,
wird es in situ zum Monosalz neutralisiert, wenn der pE-Wert des Reaktionsgemisches
für die Diazotierung eingestellt wird. O-Diazoacetyl-1-serin und O-Diazoacetyl-dl-serin
können auch in Form ihrer Alkali- und Erdalkalisalze durch geringfügige Abänderung
der obigen Arbeitsweisen isoliert werden, indem man eine wäßrige Lösung mit einem
Äquivalent Alkali- oder Erdalkalihydroxyd, -bicarbonat oder -carbonat zu dem wäßrigen
Acetoneluat fügt, bevor dieses der Gefriertrocknung unterworfen wird. Die auf dieser
Weise erhaltenen Salze sind weiße wasserlösliche Pulver. Diese Salze können auch
durch Lösen der freien Säure in Wasser und Zugabe einer äquivalenten Menge einer
der vorgenannten alkalischen Stoffe erhalten werden, z. B. können die Natrium-,
Kalium- und Calciumsalze in der folgenden Weise erhalten werden.
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1,7 g O-Diazoacetyl-l-serin werden in 30 ccm Wasser gelöst, und es
wird eine wäßrige Lösung von 0,84 g Natriumbicarbonat zugegeben. Die klare Lösung
wird gefroren, und das Eis wird aus der gefrorenen Masse unter hohem Vakuum unter
Gewinnung des Natriumsalzes von O-Diazoacetyl-l-serin als weißes Pulver absublimiert.
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Analog erhält man das Kaliumsalz von O-Diazoacetyl-dl-serin und das
Calciumsalz von O-Diazoacetyl-1-serin als weißes Pulver.
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Wie oben erwähnt, kann O-Diazoacetyl-l-serin erfindungsgemäß auch
durch ein biologisches Verfahren hergestellt werden, und zwar durch Züchtung eines
Mikroorganismus Streptomyces fragilis, unter künstlichen Bedingungen in einem geeigneten
Nährmedium.
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Streptomyces fragilis ist ein bisher unbekannter Mikroorganismus,
der in Bodenarten vorkommt.
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Streptomyces fragilis besitzt die folgende Charakteristik: Bei Züchtung
in Reinkultur auf einem Medium mit 1% Dextrose, 0,5 0/o Pepton (Tryptonart), 0,05
0/o Dikaliumphosphat, 0,050/0 Natriumchlorid, 0,01% Ferrosulfat-Heptahydrat und
20/0 Agar erscheint das feuchte, junge primäre Mycel farblos bis gelb, das später
etwas grau wird. Das sekundäre Luftmycel ist zunächst weiß und wird später rosa
bis lohfarben.
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In Agar erscheint wenig oder kein Pigment. Streptomyces fragilis besitzt
die folgenden mikroskopischen Charakteristiken: Das feuchte primäre Mycel ist glasklar
und verzweigt. Das sekundäre Luftmycel ist verzweigt. Primäre, sekundäre und manchmal
tertiäre Verzweigungen treten auf und können abwechselnd entgegengesetzt gerichtet
und gelegentlich lockenförmig sein. Das Luftmycel ist kurz, gerade oder schwach
gebogen und bildet gelegentlich Endschleifen oder Spiralen. Die Außenenden dieser
Lufttypen unterteilen sich in konidische Ketten von 8 bis 20 Mikron Länge. Die Konidien
sind glasklar, sphäroid bis eiförmig, im Mittel mit 1,2 Mikron Durchmesser (Bereich
von o,8 bis I,5 Mikron).
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Der Mikroorganismus Streptomyces fragilis verflüssigt Gelatine langsam
ohne Pigmentbildung und peptonisiert Lackmusmilch langsam, gewöhnlich unter geringer
Änderung des p-Wertes. Der Mikroorganismus wächst bei Ernährung mit l-Arabinose,
Cellobiose, Dextrin, Dextrose, d-Galaktose, Maltose, Stärke, Trehalose und d-Xylose
und wächst langsam bei Ernährung mit Adonit, Äsculin, Dulcit, d-Fruktose, Glycerin,
i-Inosit, Inolin, Laktose, d-Mannit, d-Magnose, Melizitose, Melibiose, Raffinose,
Ramnose, Salicin, d-Sorbit und Sucrose in einem Medium, das 0,2460/0 Ammoniumsulfat,
0,238 0/o Monokaliumphosphat, o,565°/O Dikaliumphosphat, o,I°/o Maguesiumsulfat,
Heptahydrat, 0,00064 0/o Cuprisulfat-Pentahydrat, O,OOOII 01o Ferrosulfat-Heptahydrat,
o,ooo7g°/O Manganchlorid-Tetrahydrat, 0,OOOI5 °/0 Zinksulfat-Pentahydrat und 1,5
% Agar enthält.
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Eine Kultur von Streptomyces fragilis wird in der Dauersammlung der
Parke, Davis & Company, Kultur Bureau, Detroit, Michigan unter Nr. o4g26 aufbewahrt.
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Die folgende Tabelle gibt einen Vergleich des Aussehens von Streptomyces
fragilis und von bekannten Streptomycesarten, die Antibiotika erzeugen, wenn man
sie auf einem Dextrose-Pepton-Salz-Agar-Medium züchtet, wie oben beschrieben ist:
| Streptomyces Auf einem geeigneten Mycel |
| Medium erzeugtes Farbe von Farbe der Farbe |
| Arten Form des Luftmycels |
| Antibiotikum Luftmycel und Sporen Rückseite im Ager |
| fragilis O-Diazoacetyl- kurz, gerade bis Weiß, Hellrosa, farblos,
Gelb, keine |
| l-senn schwach gewellt, Lohfarben Lohfarben |
| manchmal |
| Schleifen und |
| Spiralen |
| antibiotikus Aktinomycin gerade Weiß bis Grau Schwarz Schwarz |
| aureofaciens Aureomycin gerade bis leicht Weiß, Grau Gelb,
Lohgelb keine |
| gewellt |
| Mycel |
| Auf einem geeigneten |
| Streptomyces |
| Medium erzeugtes Farbe von Farbe der Farbe |
| Arten From des Luftmycels |
| Antibiotikum Luftmycel und Sporen Rückseite im Agar |
| fioridae Viomycin gerade, leicht Weiß, Lavendel, Purpurrot
keine |
| gewellt Gräulichgrün |
| fradiae Neomycin gerade, manchmal Weiß, Seemuschel- farblos,
Gelb, keine |
| Schleifen und rosa Lohgelb |
| Spiralen |
| griseus Streptomycin gerade, leicht leicht Hellrosa, farblos,
Hell- keine |
| Aktidion gewellt Hellgräulichgrün braun, |
| Lavendel |
| griseus Grisein gerade, leicht Weiß, Hellrosa, farblos, Loh-
keine |
| gewellt Hellgräulichgrün gelb |
| lavendulae Streptothrizin gerade, manchmal Weiß, Rosa, Schwarz
Schwarz |
| Lavendulin Schleifen und Lavendel |
| Streptolin Spiralen |
| rimosus Terramycin Spiralen Weiß Gelb keine |
| sp. A 105 Aktinorubin Spiralen Weiß, Rosa, Grau Rosa, Rot keine |
| venezuelae Chloramphe- gerade Weiß, Grau Schwarz Schwarz |
| nicol |
Die folgende Tabelle gibt einen Vergleich der Verwertung von Kohlehydraten durch
Streptomyces fragilis und bekarinten Streptomycesarten, die bei der Züchtung auf
dem oben beschriebenen synthetischen Agarmedium, in dem die jeweils angegebene Kohlehydratart
enthalten ist, Antibiotika erzeugen.
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Kohlenstoffgrundsubstanz
| d- d-Ga- d- |
| Streptomyces 1-Ara- Dul- i-Ino- Mal- Rafl- Rham- d-Sor- d-Xy- |
| Fruk- lak- Inulin Laktose Man- Suorose |
| Arten binose cit sit tose nose nose bit lose |
| tose tose nit |
| fragilis ++++ -o 0 +++ 0 o etwa + ++++ o o0 0 0 |
| antibioticus . @ + o +++ +++ ++++ 0 ++++ ++++ ++++ 0 +++ 0
0 ++ |
| aureofaciens .. ++++ 0 ++++ ++++ 0 0 ++ +++ 0 0 0 0 ++++ ++ |
| floridae ...... 0 bis 0 ++++ ++++ 0 0 bis + bis ++++ ++++ 0
0 0 bis 0 bis ++++ |
| ++ + ++ + + |
| fradiae ....... ++++ 0 0 bis ++++ 0 0 bis etwa + ++ bis 0 0
0 bis |
| + + bis + +++ etwa + |
| griseus ...... 0 bis 0 ++++ ++++ 0 0 bis 0 bis ++++ ++++ 0
0 0 bis 0 bis ++++ |
| etwa + etwa + etwa +++ etwa + etwa + |
| griseus ...... ++++ 0 ++++ ++++ 0 0 bis 0 bis ++++ ++++ 0 ++++
0 bis 0 bis ++++ |
| etwa + etwa ++ + etwa + etwa + |
| lavendulae..... 0 bis 0 0 bis etwa + 0 0 bis 0 bis ++++ 0 0
0 bis 0 0 0 bis |
| ++++ ++++ bis etwa + +++ + ++++ |
| rimosus ....... ++++ 0 ++++ ++++ ++++ 0 ++++ ++++ ++++ 0 bis
0 ++++ 0 |
| bis ++ |
| sp-A I05 ++++ O ++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
o bis ++ + ++++- |
| etwa + |
| venezuelae.... ++++ o 0 ++++ ++++ o o + ++++ 0 o ++++ o 10 |
o = kein Wachstum ++ = einiges Wachstum ++++ = sehr kräftiges + = schlechtes Wachstum
+++ = gutes Wachstum Wachstum Aus den beiden oben wiedergegebenen Tabellen ist ersichtlich,
daß Streptomyces fragilis dem Streptomyces fradiae in seiner Erscheinung auf Glucose-Trypton-Agar
und in seiner Kohlehydratverwertung sehr ähnlich ist. Jedoch sind diese beiden Mikroorganismen
durch die Länge ihrer Sporenketten,
Größe der Sporen, Farben der
Sporeumasse und der Produkte, die sie erzeugen können, leicht zu unterscheiden.
Diese Unterschiede sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:
| Eigenschaft @ Streptomyces fragilis | Streptomyces fradiae |
| Länge der Sporenketten (üblicher |
| Bereich) ................. 8 bis 20 Mikron 25 bis 70 Mikron |
| Sporengröße (Mittel) . 1,2 bis I,5 Mikron o,8 bis I,4 Mikron |
| Farbe der Sporenmasse . Hellrose bis Lohfarben Seemuschelrosa |
| Erzeugte Produkte .............. O-Diazoacetyl-l-serin Neomycin,
Fradicin. |
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Die Herstellung von O-Diazoacetyi-t-serin unter Verwendung von Streptomyces
fragilis wird durchgeführt, indem man ein geeignetes steriles, wäßriges Nährmedium
mit Streptomyces fragilis beimpft, das resultierende Gemisch unter sterilen aeroben
Bedingungen bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 35° entwickelt, die im Kulturgemisch
vorhandenen festen Teilchen entfernt und das gewünschte O-Diazoacetyl-l-serin aus
der wäßrigen Kulturflüssigkeit isoliert.
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Als Impfmasse können Sporen oder Conidien von Streptomyces fragilis
sowie auch deren wäßrige Suspensionen mit einer geringen Menge Seife oder Netzmittel
verwendet werden. Für große Gärungen ist es vorzuziehen, starke junge Kulturen von
Streptomyces fragilis zu verwenden.
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Geeignete wäßrige Nährmedien sind solche mit einem Wert zwischen
5 und 8,5, die Kohlenstoff-und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze enthalten.
Der bevorzugte Bereich nach der Sterilisation des Nährmediums beträgt 6,5 bis 7.
Geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen umfassen unter anderem ölhaltiges Sojabohnenmehl,
Weizenklebermehl, Brauhefe, Schweinemagen (Salzextrakt), Fleischeiweißhydrolysat,
Schlempe und Feststoffe aus Maiseinweichwasser. Verschiedene Kombinationen dieser
Kohlenstoff- und Stickstoffquellen mit anderen stickstoffhaltigen Stoffen, z. B.
ein Gemisch aus ölhaltigem Sojabohnenmehl, mit Säure hydrolysiertem Kasein und entbitterter
Hefe, ein Gemisch aus Salzextrakt aus Schweinemagen und Sojabohnenpepton und ein
Gemisch aus ölhaltigem Sojabohnenmehl und säurehydrolysiertem Kasein ergeben besonders
gute Resultate. Die Optimalkonzentration dieser Bestandteile reicht von I,5 bis
20/0 des Mediums. Die Kohlenstoffquelle kann allein aus den vorgenannten Stoffen
bestehen, beste Ergebnisse werden aber erhalten, wenn auch Glucose oder Galactose
dem Medium zugesetzt werden. Die Konzentration an Glucose und Galactose kann von
o bis 2 0(o schwanken. Konzentrationen oberhalb 20/0 scheinen einen schädlichen
Effekt auf die Ausbeute des gewünschten Produktes zu haben. Als anorganische Salze
können Natriumchlorid, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat
verwendet werden. Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid und Ammoniumnitrat, sind besonders
wünschenswerte Bestandteile des Mediums und führen zu höheren Ausbeuten des gewünschten
Produktes. Die optimale Konzentration dieser Ammoniumsalze liegt zwischen 0,I bis
0,50/0 des Nährmediums.
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Die Entwicklung von Streptomyces fragilis in den wäßrigen Nährmedien
kann auf verschiedenen Wegen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann der Mikroorganismus
unter aeroben Bedingungen auf der Oberfläche des Mediums entwickelt werden, oder
er kann unterhalb der Oberfläche des Mediums gezüchtet werden, d. h. unter submersen
Bedingungen, wenn gleichzeitig Sauerstoff zugeführt wird.
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Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von O-Diazoacetyl-l-serin
durch Gärung in großem Maßstabe umfaßt die Verwendung von submersen Kulturen von
Streptomyces fragilis. Nach dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein steriles
wäßriges Nährmedium mit Streptomyces fragilis beimpft und unter Rühren und Belüften
bei einer Temperatur zwischen 20 und 35°, vorzugsweise in der Nähe von 23 bis 29°,
gezüchtet, bis eine Höchstkonzentration an O-Diazoacetyl-l-serin in der Kulturflüssigkeit
erreicht ist. Die für die Höchstausbeute an O-Diazoacetyl-l-serin erforderliche
Zeit schwankt mit der Größe und der verwendeten Einrichtung und wird z. B. in Tankgärbehältern
in etwa 32 Stunden oder weniger erreicht. Wenn für die Entwicklung Schüttelflaschen
verwendet werden, kann die Zeit bis zur Höchstausbeute länger sein und von 3 bis
8 Tagen reichen, also länger als für die Tankgärung in großem Maßstabe erforderlich
ist. Unter submersen Kulturbedingungen entwickelt sich der Mikroorganismus mehr
oder minder in der ganzen Masse des Nährmediums in mehr oder weniger getrennten
Teilchen im Gegensatz zu einer mehr oder minder zusammen hängenden Haut, die bei
Oberflächenkulturverfahren auf der Oberfläche des Mediums vorhanden ist. Ortsfeste
Gärfässer, die mit geeigneten Rühr- und bzw. oder Belüftungseinrichtungen ausgerüstet
sind, sowie auch horizontale Drehtrommelgärbehälter wurden als besonders vorteilhaft
gefunden. Jedoch kann für die Herstellung kleinerer Mengen des Antibiotikums oder
von Kulturen des Mikroorganismus das submerse Kulturverfahren in kleinen Kolben
oder Ballons durchgeführt werden, die entweder geschüttelt oder mittels geeigneter
mechanischer Einrichtungen gerührt werden.
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Das Rühren und Belüften des Kulturgemisches kann durch Turbinen,
Schaufeln, Propeller oder andere Rühreinrichtungen, durch Rotieren oder Schütteln
des Gärbehälters, durch Pumpeinrichtungen oder durch
Hindurchleiten
von Luft oder anderen sauerstoff; haltigen Gasen durch das Medium erzielt werden.
Die Belüftung kann durch Einblasen von Luft oder anderen sauerstoffhaltigen Gasen
in das Gärgemisch bewirkt werden, oder es kann durch Versprühung, Verspritzen oder
Verschäumen der Maische in einer oder durch eine sauerstoffhaltige Atmosphäre erreicht
werden.
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Das Oberflächenkulturverfahren zur Herstellung von O-Diazoacetyl-l-serin
umfaßt das Beimpfen einer flachen Schicht, gewöhnlich weniger als 2 cm, eines sterilen
wäßrigen Nährmediums mit Streptomyces fragilis und das Entwickeln des Gemisches
unter aeroben Bedingungen bei etwa 20 bis 35°, vorzugsweise in der Nähe von 23 bis
29°. Es ist gewöhnlich eine längere Entwicklungszeit erforderlich als sie beim Tiefenkulturverfahren
angewendet wird, @ um die Höchstausbeute an O-Diazoacetyl-l-serin zu erzielen.
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Im allgemeinen beträgt die Entwicklungszeit etwa 3 bis 8 Tage. Nach
Beendigung der Entwicklungsphase des Verfahrens wird das Mycel von der Flüssigkeit,
die das O-Diazoacetyl-l-serin enthält, abgetrennt und das Produkt aus der Kulturflüssigkeit
durch die hernach beschriebenen Verfahren isoliert.
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Nach Beendigung der Gärphase des Verfahrens wird das feste Material
aus der Kulturflüssigkeit, z. B. durch Filtration oder Zentrifugierung, entfernt,
und das O-Diazoacetyl-l-serin wird aus der Kulturflüssigkeit isoliert. Die Isolierung
kann durch Konzentrieren der Kulturfiüssigkeit auf ein kleines Volumen, z. B. 1/5
bis 1/ze des ursprünglichen Volumens von 3 bis 10 Volumen eines mit Wasser mischbaren
organischen Lösungsmittels, wie Aceton, Äthanol, Methanol, Äthanol-Diäthyläther-Gemisch
oder Äthanol-Diisopropyläther-Gemisch und Abtrennen der ausgefällten Verunreinigungen
aus der Lösung durchgeführt werden. Nach einem anderen Verfahren wird die geklärte
Kulturflüssigkeit zur Trockene eingedampft und der trockene Rückstand mit einem
mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, das weniger als 50 0/o Wasser enthält, extrahiert.
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Das so erhaltene Konzentrat oder der Extrakt wird durch eine Adsorptionssäule
geleitet, die einen neutralen Adsorbenten mit einem p,-Wert zwischen 5 und 8 enthält.
Das gewünschte Produkt wird aus dem Adsorbent mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung
eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels mit mehr als 50 0/o Wasser
eluiert. Geeignete Adsorbentien sind Tonerde (eingestellt auf einen p11-Wert 5 bis
8), Tonerde nach Brockmann (eingestellt auf einen pn-Wert 5 bis 8) und feste Natriumalu-
-miniumsilikate. Das Eluat wird zu einem feinen Pulver getrocknet, das bis zu 20
Gewichtsprozent des gewünschten O-Diazoacetyl-l-serin enthält. Infolge der ziemlich
unbeständigen Natur -des Produktes ist es vorzuziehen, das Wasser aus dem Eluat
durch Gefrieren und Absublimieren des Eises unter hohem Vakuum zu entfernen.
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Das wie oben beschrieben hergestelIte Pulver wird in wenig Wasser
gelöst, und eine Lösung mit3 bis 30 mg O-Diazoacetyl-l-serin je ccm wird zugegeben.
Der p-Wert der Lösung wird vorzugsweise auf 6,5 bis 7 eingestellt. Die Lösung wird
durch eine Adsorptionssäule mit Aktivkohle geleitet, die das gewünschte Produkt
adsorbiert. Die zur Adsorption des gesamten Produktes aus der Lösung erforderliche
Menge Aktivkohle schwankt mit der Konzentration des Produktes in dem getrockneten
Pulver. Zum Beispiel erfordert ein rohes Material, das 60/o O-Diazoacetyl-l-serin
enthält, etwa 4 g Aktivkohle je g, während ein Material mit 120/0 O-Diazoacetyl-l-serin
etwa 5 bis 6 g Aktivkohle je g erfordert. Die besten Ergebnisse werden erhalten,
wenn die Aktivkohle mit Diatomeenerde vermischt wird, die als Filterhilfe dient.
Nachdem die Lösung des getrockneten Pulvers durch die Adsorptionssäule gelaufen
ist, wird die Säule mit dem Volumen Wasser, das von der Säule zurückgehalten wird,
gewaschen, d. h. der Menge Wasser, die notwendig ist, um die Säule zu benetzen.
Das Waschwasser wird verworfen, und das Produkt wird durch Auswaschen der Adsorptionssäule
mit Wasser mit I bis 25 0/o eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels,
wie Aceton, Methanol, Äthanol oder Methyläthylketon, eluiert. Das Eluat wird auf
ein kleines Volumen, gewöhnlich einer Lösung mit 30 bis 80 mg des gewünschten Produktes
je ccm, konzentriert, und das O-Diazoacetyl-l-serin durch Zusatz eines mit Wasser
mischbaren organischen Lösungsmittels, wie wasserfreies Äthanol, Aceton oder Isobutanol,
gefällt. Das Gemisch wird erwärmt bis die Lösung vollständig ist und dann abgekühlt.
Das so erhaltene O-Diazoacetyll-serin ist eine kristalline feste Masse, die nahezu
rein ist, aber, falls gewünscht, weiter durch Umkristallisation aus einem Gemisch
aus Wasser, Pyridin und Äthanol gereinigt werden kann. Das Produkt ist in jeder
Hinsicht mit dem Material, das durch chemische Synthese hergestellt wurde, identisch.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von O-Diazoacetyl-l-serin
auf biologischem Wege.
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Beispiel 9.
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37,8 1 Nährmedium der folgenden Zusammensetzung: Glucose ...................
1,0% ölhaltiges Sojabohnenmehl 1,0 0/o säurehydrolisiertes Kasein 0,5 0/o entbitterte
Hefe ............. 0,5 01, Natriumchlorid ............ 0,5% Wasser bis zur Auffüllung
auf . . Io0,0°/o werden in- einem Gärbehälter aus rostfreiem Stahl von -etwa II3,41
eingebracht, der p,-Wert wird mit 6 n-Natronlauge auf 7,5 eingestellt, und es werden
0,1% Calciumcarbonat zugegeben. Das Medium wird durch 1/2stündiges Erhitzen auf
I2I° sterilisiert, wonach der p-Wert des Mediums 6,85 beträgt. Das Medium wird abgekühlt
und mit Sporen aus zwei 14 Tage alten Kulturen nach Moyer's Sporen-Agar-Strichkultur
von Streptomyces fragilis, suspendiert in 20 ccm o,o10/0iger steriler Marseiller
Seifenlösung, beimpft. Das Kulturgemisch wird 24 Stunden bei 27° entwickelt, während
welcher Zeit eine Belüftung durch einen Sprenkler mit einer Geschwindigkeit von
I Volumen Luft je Volumen Medium und Minute erfolgt. Die so erhaltene entwickelte
Kultur wird zum Beimpfen der Haupt-
kultur, wie unten beschrieben,
verwendet. Etwa 557 1 eines Mediums folgender Zusammensetzung: Glucose I,O 1 0 °/0
ölhaltiges Sojabohnenmehl . 1 0 0/o säurehydrolysiertes Kasein ........ o,5 5 01o
entbitterte Hefe ............... 0,5 % Natriumchlorid ................. 0,5 % Ammoniumnitrat..................
0,25% Rest Wasser 6 n-Natronlaugelösung hinreichend, um den pH-Wert auf 7,5 zu bringen
Calciumcarbonat, zugegeben nach der pH-Einstellung................. 0,1% werden
in einen Gärbehälter aus rostfreiem Stahl von etwa 760 1 eingebracht und durch 1/2stündiges
Erhitzen auf 1210 sterilisiert. Das Medium wird abgekühlt und mit der 37,8-1-Kultur
von Streptomyces fragilis, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, beimpft und
44 Stunden bei 26° entwickelt.
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Während der Entwicklungszeit wird durch ein Sprenkelrohr Luft mit
einer Geschwindigkeit von I,5 Volumina Luft je Volumen Medium und je Minute zugeführt,
und das - Gemisch wird in den ersten 12 Stunden mit einer Geschwindigkeit von I50
Umdrehungen je Minute und mit 300 Umdrehungen je Minute in den letzten 32 Stunden
gerührt, wobei etwa 5,67 1 sterilisiertes Gemisch aus rohem Schweineschmalz und
Mineralölen, das Mono- und Diglycerine enthält, zugefügt wurde, die zur Bekämpfung
des Schäumens notwendig waren.
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Am Ende der Entwicklungszeit wurde ein kleines Probemuster des Kulturgemisches
entnommen und einer Seitz-Filtration unterworfen. 5 ccm dieses Filtrates, - zweimal
täglich über 7 Tage intraperitoneal appliziert, enthält hinreichend O-Diazoacetyl-l-serin,
um das Wachstum von unter der Haut implantierten Sarcom-I8o-Tumoren bei Mäusen in
einem solchen Ausmaß zu verhindern, daß ihre Größe weniger als 25 0/o der Größe
von Tumoren bei nicht behandelten Mäusen beträgt.
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Das in dem entwickelten Gärgemisch vorhandene feste Material wird
abfiltriert, und der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen. Die Waschwässer werden
mit dem Hauptfiltrat vereinigt, und etwa 4I6 1 dieser Lösung wurden mit 2079 g Aktivkohle
I Stunde gerührt. Die Kohle wird abfiltriert, und der Filterkuchen wird mit entionisiertem
Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate und Waschwässer (etwa 5I4 1) werden im
Vakuum auf ein Volumen von etwa 76 1 eingedampft. Es werden zum Konzentrat etwa
3 Volumina Aceton unter Rühren zugegeben, die sich bildende Fällung wird abfiltriert,
und der Filterkuchen wird mit 75%igem wäßrigem Aceton gewaschen. Die vereinigten
wäßrigen Acetonfiltrate und Waschwässer werden im Vakuum auf ein Volumen von etwa
74 1 (19,5 Gallonen) eingedampft. Das so erhaltene Konzentrat wird gefroren und
in gefrorenem Zustand unter hohem Vakuum getrocknet. Eine wäßrige Lösung des so
erhaltenen trockenen Pulvers, Mäusen intraperitoneal zweimal täglich über 7 Tage
in einer Dosis von IOOO mg je kg Körpergewicht appliziert, enthält hinreichend O-Diazoacetyl-l-serin,
um das Wachstum von Sarcom-8o-Tumoren in einem Ausmaß zu verhindern, daß ihre Größe
weniger als 25 0/o der Tumorgröße bei unbehandelten Tieren betrug.
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1 kg trockenes Pulver wurde mit 10 1 90 volumprozentigem Äthanol
extrahiert und nachfolgend nochmals mit 21 des gleichen Lösungsmittels ausgezogen.
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Die vereinigten Extrakte, etwa 12 1, wurden mit hinreichend Wasser
verdünnt, um die Alkoholkonzentration auf 75 Volumprozent herabzusetzen, und diese
alkoholische Lösung passierte eine Adsorptionssäule, die wie unten beschrieben hergestellt
war.
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3 kg Tonerde wurden mit verdünnter Salzsäure gerührt, bis der pH-Wert
bei 7,7 konstant bleibt. Die Tonerde wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen und
durch 4stündiges Erhitzen auf 2000 aktiviert. Die Tonerde wurde mit 75 0/0igem wasserhaltigem
Äthanol gewaschen und in eine Adsorptionssäule mit einem Durchmesser von etwa 10
cm eingefüllt. Das gesamte eingefüllte Volumen beträgt angenähert 3500 ccm.
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Die oben hergestellte älkoholische Lösung wird der Adsorptionssäule
mit einer Geschwindigkeit von 6 i je Stunde zugeführt und das therapeutisch uuwirksame
Perkolat verworfen. Die Säule wird mit 35 1 75 volumprozentigem Äthanol gewaschen,
die Waschwässer werden verworfen, und die Säule wird schließlich mit 21 1 5o0/0igem
Äthanol gewaschen. In der letzten Waschlösung kann eine geringe therapeutische Wirksamkeit
festgestellt werden. Nach Beendigung des Auswaschens wird das adsorbierte O-Diazoacetyl-1-serin
aus der Adsorptionssäule durch Hindurchleiten von I7,51 destilliertem Wasser eluiert.
Das wäßrige Eluat wird konzentriert und gefroren, und das Konzentrat wird in gefrorenem
Zustand unter hohem Vakuum getrocknet. Eine wäßrige Lösung des so erhaltenen Pulvers
zeigt bei dem Standard Mäusetest gegen Sarcom I80 einen Gehalt an O-Diazoacetyl-l-serin
von 5,8°/o oder hinreichend O-Diazoacetyl-l-serin, um bei zweimal täglicher intraperitonealer
Dosis von 25 mg je kg Körpergewicht das Wachstum von Tumoren in den so behandelten
Mäusen so weit zu unterdrücken daß die Größe der Tumore weniger als 250/0. der Größe
von Tumoren bei unbehandelten Mäusen beträgt.
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500 g Material mit 5,8 0/o O-Diazoacetyl-l-serin werden in I,3201
Wasser gelöst.. Es wird eine Säule aus Aktivkohle wie folgt bereitet. Ein Gemisch
aus 2 kg Aktivkohle und 2 kg Diatomeenerde werden als dicker Schlamm in eine I5-cm-Säule
eingefüllt. Der pH-Wert des Wassers beträgt 5,2 bis 5,5. Bei dieser Schicht ist
ein Druck von I20 cm Lösungsmittel erforderlich, um eine geeignete Strömungsgeschwindigkeit
zu erreichen. Nach dem Einfüllen wird die Säule mehrere Stunden mit Wasser gewaschen,
um sich zu setzen und um lösliche Anteile zu entfernen. Die Lösung wird der Säule
mit einem Überdruck von etwa 120 cm Wasser zugeführt. Ein Volumen von 9 1 Wasser,
das in der Säule zurückgehalten .wird, wurde dann der Säule zugeführt. Hierauf folgte
eine 5%ige Acetonlösung. Der gesamte Durchfluß von Lösungsmitteln beträgt 36 1.
Das farblose Eluat wird verworfen. Die Eluierungsspitze, die leicht beobachtet werden
kann, ist eine hellgelblichgrüne Lösung. Diese Lösung wird aufgefangen. Die Lösung
wird durch
Vakuumdestillation konzentriert, bis eine Konzentraktion
von 20 bis 25 mg/ccm erreicht ist. Die Lösung wird in eine Säule eingebracht, die
auf die gleiche Weise wie beschrieben hergerichtet ist und nach der gleichen Behandlungsweise
wie die primäre Adsorption behandelt. Das Perkolat wird durch Vakuumdestillation
konzentriert, bis eine Konzentration von 60 bis 70 mg je ccm erreicht ist. Die Lösungsmenge
beträgt nun angenähert 300 ccm. Es wird wasserfreier Alkohol (etwa 450 ccm) zugefügt.
Die Lösung wird mäßig erwärmt, um die Lösung vollständig zu machen und dann mehrere
Stunden bei 5° gelagert.
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Das sich in kristalliner Form abscheidende O-Diazoacetyl-l-serin wird
gesammelt und durch Umkristallisation aus 60- bis 7001,igem Äthanol gereinigt; =
196m = II40 bei 250,5 leu in einem wäßrigen Phosphatpuffer vom p-Wert 7. Eine wäßrige
Lösung der Kristalle wurde Mäusen intraperitoneal zweimal täglich über 7 Tage in
einer Dosis von 3,1 mg je kg Körpergewicht verabreicht und verhindert das Wachstum
von Sarcom-i8o-Tumoren in solchem Ausmaß, daß ihre Größe weniger als 25 0/o der
Tumorgröße bei unbehandelten Tieren beträgt.
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PATENTANSPROCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von O-Diazoacetyl-l-serin
und O-Diazoacetyl-dl-serin und deren Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein
Säureadditionssalz von O-Glycyl-l-serin bzw. O-Glycyf-dl-serin mit einem Diazotierungsmittel
behandelt und das Reaktionsprodukt gegebenenfalls i ein Salz überführt.