DE1957980B2

DE1957980B2 - Verfahren zur herstellung von daunorubicin durch zuechtung eines streptomyces

Info

Publication number: DE1957980B2
Application number: DE19691957980
Authority: DE
Inventors: Denise Charenton Val-de-Marne; Florent Jean; Preud'Homme Jean; Paris; Mancy geb. Courtillet (Frankreich)
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1968-11-18
Filing date: 1969-11-18
Publication date: 1977-09-29
Also published as: FI46079C; IE33857B1; NL6916898A; IL33371A0; JPS5218279B1; FR1593235A; US3875010A; AT290729B; BR6914251D0; SE351864B; DE1957980A1; IE33857L; FI46079B; BE741814A; IL33371A; GB1241750A; NO128618B; DK124138B; ES373632A1; DE1957980C3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Gewinnung des mit der Nummer 13 057 R.P. bezeichneten Antibioticums, das den Namen Dauno- i.s rubicin (früher: Rubidomycin) erhalten hat.

In der französischen Patentschrift 15 33 151 sind das mit der Nummer 9 865 R.P. bezeichnete Antibioticum, seine drei Hauptbestandteile, die mit den Nummern 13 213 R.P., 13 057 R.P. (oder Daunomycin) und 13 330 R.P. bezeichnet werden, die Herstellung des Antibioticums 9 865 R.P. durch Züchtung von Streptomyces 8 899 oder Streptomyces 31 723 in. geeignetem Medium und die Fraktionierung des Antibioticums 9 865 R.P. in seine drei Bestandteile beschrieben.

In der französischen Patentschrift 15 51 195 ist ebenfalls die Herstellung des Antibioticums 13 057 R.P. oder Daunorubicins durch Züchtung eines neuen Streptomyces-Stammes beschrieben, der mit Streptomyces griseus, Varietät Rubidofaciens, Stamm DS 32 041 (NRRL 3383) bezeichnet wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Daunomycin durch Züchtung eines im folgenden näher identifizierten Mikroorganismus, der dem Genus Streptomyces angehört und mit »Streptomyces bifurcus, DS 23 219 (NRRL 3539) bezeichnet wird, unter aeroben Bedingungen. Dieser neue Mikroorganismus wurde aus einer in Frankreich im Departement Val-de-Marne, entnommenen Erdprobe erhalten.

Die Isolierung dieses Stammes wurde unter Anwendung der folgenden üblichen Methode vorgenommen: Die Erdprobe wird in sterilem destilliertem Wasser suspendiert, die Suspension wird dann auf verschiedene Konzentrationen verdünnt, und kleine Volumina jeder Verdünnung werden auf die Oberfläche von Petrischalen verteilt, die ein geeignetes Agarnährmedium enthalten. Nach einer Inkubation von 15 Tagen bei 26 C werden die Kolonien von Mikroorganismen, die man isolieren will, auf Schrägagar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten.

Aus den im folgenden dargelegten Gründen muß der Stamm Streptomyces DS 23 219 als Repräsentant einer neuen Species angesehen werden, die mit Streptomyces bifurcus aufgrund der Tatsache bezeichnet wird, daß man in seinen Kulturen sehr häufig eine recht besondere Form von Sporophoren antrifft, die am Ende eine Dichotomie aufweisen und dann zwei längliche Äste aufweisen, die am Ende eines Hauptfadens sitzen.

Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, bildet zy- fio lindrische Sporen mit Abmessungen von 0,4 bis 0,5/1,0 bis 1,2 μ. Seine geraden oder schwach gebogenen Sporenfäden sind auf Luft-ausgesetzten Fäden angeordnet, die sie isoliert oder als Trauben tragen, die eine beschränkte Anzahl von Elementen umfassen. Häufig bildet der Hauptfaden an seinem Ende nur ?wei längliche Fäden, was den Sporophoren ein ganz besonderes gespaltenes Aussehen gibt.

Allgemein einwickelt Slreplomyces hil'urcus, St.iinn I)S 23 21'), auf synthetischen Nährmedien ein μcIh liches his hellrosa, hriiunlichrosa oder rütlichbraiiiic vegetatives Mycel und produziert lösliche Pigment von orangerosa bis violellrosa Färbung. Aul dei organischen Medien ist sein vegetatives Mycel gelb braun bis orangebraun, und die löslichen Pigmente die er erzeugt, färben den Agar orangebraun bis rot Hellbraun. Hr erzeugt kein Mclaninpigmcnt auf organischen Medien und kein II,S. Hr bildet aus Ni'.rutcr sowohl auf organischen Medien als auch auf synthetischen Medien Nitrite, verflüssigt Gelatine, peplonisiert Milch langsam und verwertet Cellulose.

In der nachfolgenden Tabelle I sind die Züchtungs-Charakteristiken und die biochemischen Eigenschaften, die Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, auf einer gewissen Anzahl von üblicherweise zur Prüfung des Aussehens von Streptomyces-Stämmen verwendeten Nähragarmedien und Nährbouillons aufweist, angegeben. Ohne genauere Angaben sind diese Eigenschaften diejenigen, die Kulturen von etwa 2 bis 3 Wochen bei 25^: C, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben, aufweisen. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Züchtungsmedien wurde nach den Rezepturen hergestellt, die in »The Actinomycetes« (S. A. Waksman, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA, 1950, Seite 193-197) angegeben sind. In diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W, dem die Nummer folgt, die ihnen in »The Actinomycetes« gegeben wurde, bezeichnet.

Die Literaturstellen für die anderen Züchtungsmedien oder die Zusammensetzungen derselben sind die folgenden:

Anm. A: »Hickey and Tresner's Agar«, T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950,

Anm. B: K. L. Jones, Journal of Bacteriology, 57, 142, 1949,

Anm. C: Rezeptur W-23, versetzt mit 2% Agar,

Anm. D: »Yeast Extract Agar«, T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950,

Anm. E: »Tomato Paste Oatmeal Agar«, T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950,

Anm, F: W. E. Grundy u. Mitarb., Antibiotics and Chem., 2, 401, 1952,

Anm. G: »Inorganic Salts - Starch Agar«, T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 951,

Anm. H: entspricht der Rezeptur W-I, wobei 30g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind,

Anm. I: entspricht der Rezeptur W-I, wobei 30g Saccharose durch 15 g Glycerin ersetzt sind,

Anm. J: »Plain gelatin«, hergestellt nach den Angaben des »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria« der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y., II₅₀-Iβ-.

Anm. K: »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria« der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y., H₅₀-Ie,

Anm. L: »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria« der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y., ΙΙ₅₀.|ΐ),

Anm. M: entspricht der Rezeptur W-18, wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind,

Anm. N: entspricht der Rezeptur W-18, wobei die Saccharose weggelassen und durch kleine Filterpapierstreifen ersetzt ist, die teilweise in die Flüssiskeit

r.ni. A nii' ι

Handelsübliches Magerniilchpiilwi, nach η ties Me isle Hc rs /uhereilel, I¹· The Actinomycetes Hand 2, Seile .ί.ΐ.ί.

Ni. I.¹, S. A. Wa k s in a n. Company, Ballimore, I¹JdI,

Anm. (.): II. I). Tresner und 1 öl Bacteriology, 76, 2.V) 244, 1'J?H.

he Williams and Wilkins Danga, Journal

Tabelle

Kulturmedium	I-nlwiuk-	V egetati\ es	Lultausgesel/ter	Lösliches Beobachtungen	keines
	lungsgrad	Mycel oder	Teil (umlal.U	l'igment und biochemische
		Unterseite	Gesamtheit von	Higenschaften
		der kullui"	luflausgeset/tem
			My eel und
			Srumilationl		schwach-
(I)	Q)	Oi	(4)	(5) (6)	rosabraun
Agar nach	gut	hellgelb-	hellgrau; sehr	sehr schwach- zylindrische Sporen mit Ab-
H ic key und		braunes vege	mäßig	rosabräunlich messungen von 0,4 bis
Tresner		tatives Mycel;	entwickelt	0,5/1,0 bis 1,2 μ; gerade oder
(Anm. Λ)		gut entwickelt		schwach gebogene Sporen-	hellrötlich-
				faden; häufig Sporophoren von	orangebraun
				zweigeteilter Form
Agar nach	ziemlich	gelbliches bis	keiner
Bennett	gut	hellgelblich-
(Anm. B)		braunes		orangebraun
		vegetatives
		Mycel
Agar nach	ziemlich	gelbliches bis	keiner
Emerson	gut	hellgelblich-
(Anm. C)		braunes		schwach rosa-
		vegetatives		orangebraun
		Mycel
Agar mit	gut	hellorange-	hellblaugrau;
Hefeextrakt		braunes	mäßig	keines
nach		vegetatives	entwickelt
P r i d h a m		Mycel
(Anm. D)
Agar mit	gut	hellorange-	blaugrau;	hellgräulich- gute Löslichmachung von
Hafer und		braunes	ziemlich gut	rosa Calciummalat
Tomate nach		vegetatives	entwickelt
Pridham		Mycel
(Anm. E)
Glucose-	ziemlich	bräunlich	keiner	keines
Pepton-Agar	gut	oranges
(W-6)		vegetatives
		Mycel
Nähragar	sehr	hellbräunlich-	keiner	hellrötlich-
(W-5)	mäßig	gelbes		orange
		vegetatives
		Mycel
Agar mit	mäßig	farbloses bis	keiner
Calcium-		hellbräunlich-
malat nach		rosa
Krainsky		vegetatives
(Anm. F)		Mycel
Agar mit	schlecht	farbloses bis	keiner
Ovalbumin		hellrosa
(W-12)		vegetatives
		Mycel
Glucose-	ziemlich	hellorange-	blaugrau;
Asparagin-	gut	braunes bis	sehr mäßig
Agar		hellrotbraunes	entwickelt
(W-2)		vegetatives
		Mycel

Kulturmedium

ntwicklungsgrad

(2)

Vegetatives Mycel oder I Inieiseile der Ku'iuf

l.ul'UiusKesel/ler I ei! (umlaHt (iesamtlieil von lutlausgeset/teni M>L'el und nsliche·! Pigment

Ιίι.'οΙι.αΊιΗιημι/ιι und biochemie. Iu-

(4)

Glycerin- ziemlich

Asparagin- gut Agar
(W-3)

Stärke- mäßig

Nilrat-Agar

Agar mit ziemlich

Stärke nach gut P r i d h a m (Anm. G)

Synthetischer gut Agar nach Czapek mit Saccharose (W-I)

Synthetischer gut Agar nach Czapek mit Glucose (Anm. H) Synthetischer gut Agar nach Czapek mit Glycerin (Anm. I)

Kultur gut

Kartoffeln

Reine mäßig

Gelatine mit 12% (Anm. J)

Nitrat- ziemlich

Nähragar gut

(Anm. K)

Glucose- mäßig

Nitrat-Bouillon nach Dimm ick (Anm. L) Bouillon nach mittel Czapek mit Saccharose

rosabraungelb rosagrau bis bis rot

rosagrau bis orangerosa blaugrau; /iem- bis rot lieh spärlich
entwickelt

rötlichrosa bis hellrosabraunes vegetatives Mycel

rötlichorange-

braune

Unterseite

hellgelbliches bis rötlichrosa vegetatives Mycel

hellgelbliches

bis hellrosabraunes vegetatives Mycel

violettrotes vegetatives Mycel

hellgräulich;

spärlich

entwickelt hellvioleltrosabraun

hellbläulichgrau hellrötlich-

bis hell- braun

rosagrau;

mäßig

entwickelt

keiner

rosagrau bis violettgrau; mäßig entwickelt

keiner

sehr gut entwickeltes, sehr dickes und atark gefaltetes vegetatives Mycel; hellbräunlich bis hellrötlichbraun

weißliches keiner

vegetatives

Mycel

gelblicher keiner

Ring

kleine grau- keiner liehe Kolonien, die sich an der Oberfläche agglomerieren

rosa Schleier, keiner

dick, gut

entwickelt

violcttrosa blaßrosa bis blaSorange

intensiv purpurviolett; reichlich

rötlichbraun

keines

Hydrolyse von Stärke: positiv

zylindrische Sporen mil Abmessungen von 0,4 bis 0,5/1,0 bis 1,2 μ; gerade oder schwach gebogene Sporenfaden; häufig Sporophoren von zweigeteilter Form; Hydrolyse von Stärke: positiv

Verflüssigung: positiv

Reduktion von Nitraten zu Nitriten: Stark positiv

Reduktion von Nitraten zu Nitriten: positiv

Fortsetzung

Kulturmedium	Entwick	Vegetatives	Luftausgesetzter	Lösliches	Beobachtungen
	lungsgrad	Mycel oder	Teil (umfalJt	Pigment	und biochemische
		Unterseite	Gesamtheit von		Eigcnschal'ten
		der Kultur	luftausgesctztem
			Mycel und
			Sporulation)
(1)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)

Bouillon nach Czapek mit Glucose (Anm. M) Bouillon nach Czapek mit Cellulose (Anm. N)

Magermilch (Anm. O)

Tyrosin-Hefeextrakt-Agar zur Bildung von Melanin (Anm. P) Agar nach Tresner und Danga (Anm. Q)

mittel

gut

mäßig

gut

rosaviolett

kleine rosaweiße Kolonien auf dem aus der Bouillon herausragenden Papier

gelblicher Ring

keiner

rosa we iß

keiner

hellbräunlichrosa

rosaweiß bis rosagrau; mäßig entwickelt

hellbräunlich- keiner gelb keines

keines

hellbräunlichrosa

hellbräunlichgelb

Reduktion von Nitraten zu Nitriten: positiv

Reduktion von Nitraten zu Nitriten: positiv;
Verwertung von Cellulose: positiv

keine Koagulation; langsame Peptonisation, erst nach 1 Monat Züchtung beginnend; pH unverändert in 1 Monat

Bildung von Melanin: negativ

Produktion von H₂S: negativ

Die Fähigkeit von Strcptomyccs bilurcus. Stamm DS 23 219, verschiedene Kohlenstoffqucllen und Stickstoffquellen zur Gewährleistung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb (J. of Bact. 56, 107-114,1948) bestimmt. Der Entwicklungsgrad wurde auf dem von diesen Autoren angegebenen Grund-Tabelle II medium beobachtet, wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Kohlcnstoffquellen oder das (NII₄J₂SO₄ durch die verschiedenen jeweils untersuchten Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle Il angegeben.

Geprüfte Kohlcnstolftiuellcn

Verwertung Geprüfte Stickstoffiiucllcn

Verwertung

D-Xylose	H-	NaNO.,
L-Arabinose	H-	NaNO₂
L-Rhamnose	H-	(NII.,)₂SO.,
D-Glucose	-I	(NII.,),HPO.,
D-Galaclosc	H-	Adenin
D-Fruetose	H-	Adenosin
D-Mannose	-I	Uracil
L-Sorbose		Harnstoff
Lactose	H-	L-Asparagin
Maltose	I	(ilykokoll
Saccharose	1-	Sarcosin
TrehalosL·	I aber langsam	DL-Alanin
Cellobiose	H-	Dl.-Valin
HiilTinose	-I	I)I.-Asparaginsäure.

(ο

10

Fortsetzuim

Geprüfte Kohlenstoff	Verwertung	-	+	Geprüfte Stickstoff-ucllen	Verwertung	-	P 19 57 980.7
quellen		-	+			-
Dextrin	+	-	+	L-Glutaminsäure	+	+ aber langsam	S. bifurcus
Inulin	+	+	L-Arginin	+	+
Stärke	+		L-Lysin	+	+	NRRL 3539
Glykogen	+	DT 12 15 863	DL-Serin	+	+
Glycerin	+		DL-Threonin	+	+
Erythrit	S. coeruleorubidus	DL-Methionin
Adonit		Taurin
Dulcit	NRRL 3045 NRRL 3046	DL-Phenylalanin
D-Mannit		L-Tyrosin
D-Sorbit	DL-Prolin
Inosit	L-Hydroxyprolin
Salicin	! i Betain
Vergleichstabelle III
Verwertung von	BE-PS 6 39897 DT 18 09187
	(FARMITALIA)
	S. peucetius S. griseus,
	var. rubido
	IM 3868 (Rutgers faciens -
	Institute) NRRL 3383

Stärke positiv positiv

L-Arabinosc positiv positiv

L-Rhamnose positiv positiv

Lactose positiv positiv

Saccharose ± ± Trchalosc

Ruffinose positiv positiv

Inulin negativ ±

Adonit positiv positiv

D-Sorbit positiv positiv

Inosit ± positiv

llracil
Sareosin
Be ta in

Produktion v. Daimorubicin

a) berechnet auf
ti ie Brühe

b) an kristallisier- 0,210 μ/ΙιΙ 0,051 g/hl tem Produkt (Beispiel ! 7) (Beispiel '' I (I lydroi'hlorid)

Die Gesamtheil der Charakteristiken, die StrepUirnyees bifuicus. Slamin I)S 23 .¹I¹', aufweist, hai nicht ermöglicht, ihn als eine der bereits beschriebenen Species /u identifizieren. Ii muH daher als Repräsentant einer neuen Species angesehen werden.

Nach der in liergeys Manual ul'Determinative Bacteriology (7. Auflage, 1 he Williams anti W ilk ins Comlangsam und
schwach

negativ
negativ
negativ
positiv
positiv

positiv

negativ
negativ

positiv

negativ
negativ
positiv
negativ
negativ

negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ

1.25 g/hl 1,K¹'g/hl

(Beispiel S und ⁽') (Beispiel 2 5)

positiv

positiv positiv positiv positiv

positiv jedoch langsam

positiv positiv negativ positiv positiv positiv positiv positiv

22,5 iAg/i 0,775 g/l

pany, Baltimore, l'»57) angegebenen Klassifikation vi Streptoinyces machen ihn seine üigenschaften, a organischen Medien kein Mclaninpigmenl /u bilde auf Kartoffeln ein lösliches röllichbraunes Pigment einwickeln und aiii.·Ii auf Kartoffeln ein hellrötlic braunes vegclalives Mycel /u entwickeln, dem Strepl myecs iHHirsei ähnlich. Ir steh! ieiloeh mit diese

letzteren in keinem Verhältnis, der spiralige Sporophoren bildet und dessen sporuliertes luftausgesetztes Mycel eine rosa Farbe annimmt, während er nur nichtspiralige Sporenfäden bildet und ein hellblaugraues sporuliertes luftausgesetztes Mycel aufweist.

In The Actinomycetes (Band 2, S. A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, Seite 158) befindet sich eine Beschreibung von drei anderen Species, die mit Streptomyces noursei die Eigenschaft teilen, auf organischen Medien kein Melaninpigment zu bilden, auf Kartoffeln ein rötliches lösliches Pigment freizusetzen und auf Kartoffeln ein rosa bis rötliche.·; vegetatives Mycel zu bilden, nämlich Streptomyces albogriseolus, Streptomyces spiralis und Streptomyces fragilis. Diese drei Species weisen jedoch gegenüber dem Stamm Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, wesentliche Unterschiede auf, die zeigen, daß sie unbestreitbar Species sind, die ihm nicht entsprechen können: Streptomyces albogriseolus und Streptomyces spiralis bilden spiralige Sporophoren und gehören daher in die Sektion Spira der Klassifikation von Pridham, während Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, der nur gerade oder schwach gebogene Sporenfäden bildet, in die Sektion Rectus-Flexibilis dieser gleichen Klassifikation gehört. Was Streptomyces fragilis anbetrifft, so zeigt die rosa Farbe, die sein luftausgesetztes Mycel bei Erreichung der Sporulation annimmt, daß er in keiner Beziehung zu Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, steht, dessen luftausgesetztes Mycel, wie bereits ausgeführt wurde, sich hellblaugrau färbt, wenn er sporuliert ist.

Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, kann daher nicht als einer der am nächsten kommenden Stämme identifiziert werden.

Das neue Verfahren zur Gewinnung von Daunorubicin besteht im wesentlichen darin, Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, oder seine Mutanten in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Antibioticum abzutrennen.

Die Züchtung durch Fermentation von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, ergibt im wesentlichen Daunomycin, jedoch auch die anderen Bestandteile des Antibioticums 9 865 R.P., die von dem Daunorubicin im Verlaufe von Extraklions- und Rcinigungsarbeitsgängen abgetrennt werden und gegebenenfalls isoliert werden können. Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist jedoch die Herstellung von Daunorubicin.

Die /üchtung von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, kann nach jeder beliebigen aeroben Oberfiächenziichtungsinethode oderSubmersziichtungsme-ΙΙκμΙο erfolgen, doch ist diese let/.tere aus Gründen der Bequemlichkeit /u bevorzugen. Man verwendet /u diesem /weck die verschiedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise in der l'ermentationsinduslnc verwende! werden.

Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:

Stamm DS λΐ .¹I¹) Stammansat/

K iillui au! Agar

Kultur im Kolben unter Bewegung

Impfkultur im Fermenter

Produktionskultur im Fermenter

Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Maltose, Dextrine, Stärke, oder andere Kohlehydratsubstanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, z. B. Mannit und dgl., oder gewisse organische Säuren, wie beispielsweise Milchsäure oder Citronensäure, verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche Öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können diese verschiedenen Kohlehydratquellen mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise Nitrate, anorganische oder organische Ammoniumsalze, Harnstoff oder Aminosäuren, sein. Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in protidischer Form enthalten, zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lactalbumin, Gluten oder deren Hydrolysaten, Sojamehl, Arachismehl, Fischmehl, Fleischextrakten, Hefeextrakten, Distillers' Solubles und Maisquellwasser.

.Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder Calcium- und Magnesiumcarbonat.

Andere führen zu dem zur Entwicklung des Streptomyces bifurcus. Stamm DS 23 219, und zur Erzeugung des Antibioticums erforderlichen lonengleichgewicht, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse in speziellerer Weise als Aktivatoren der Stoffwcchselrcaktioncn des Streptomyces DS 23 219. Es sind dies die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze.

so Der pH-Wert des Eermentationsmediums soll zu Beginn der Züchtung zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise /wischen 6,5 und 7,5, liegen. Die zur Fermcnlation optimale Temperatur beträgt 25 bis 30 C, doch wird auch bei Temperaturen /wischen 23 und 3.V¹C

ss eine zufriedenstellende Produktion erhallen. Die Belüftung der Züchtung kam¹ in ziemlich weiten Grenzen variieren. Es wurde jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,3 bis 3 1 l.ufl je I Bouillon und je Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute

<>o an Antibioticum wird nach 2- bis Xtägiger Züchtung erhallen, wobei diese /eilspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.

Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich, daß die zur Produktion von Daunomycin ;mgewen-

Cs delcn allgemeinen Bedingungen der Züchtung von Streptomyces bifurcus. Stamm DS 23 219, in ziemlich weilem Maße variieren und jedem besonderen Erfordernis angepaßt weiden können.

Das Daunorubicin kann aus den Fermentationsmaischen nach verschiedenen Methoden isoliert werden.

Man kann die Kulturmaische bei einem pH-Wert zwischen 1,5 und 9 filtrieren. Unter diesen Bedingungen geht der Hauptteil der Aktivität in das Filtrat. Nach Waschen mit Wasser enthält der Filterkuchen praktisch keine Aktivität mehr. Es ist vorteilhaft, diesen Arbeitsgang in saurem Medium und insbesondere unter Ansäuern mit Oxalsäure auf einen pH-Wert zwischen 1,5 und 2 durchzuführen. Es ist auch möglich, die Filtration bei einem pH-Wert zwischen 2 und 7, vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von 2, in Anwesenheit eines aliphatischen Alkohols mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen vorzunehmen.

Bei d«n obengenannten Extraktionsarbeitsgängen wird das Daunorubicin in wäßriger oder wäßrig-alkoholischer Lösung erhalten, und man führt es anschließend durch Extraktion mit einem mit Wasser nichtmischbaren organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanoi, Methylisobutylketon, Äthylacetat oder Chloroform, bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von 7,5, in eine organische Lösung über. Gegebenenfalls nimmt man vor dieser Extraktion eine Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz vor. In diesem Falle wird die wäßrige Lösung auf einen pH-Wert in der Nähe von 4 eingestellt und das Antibioticum dann an ein Kationenaustauscherharz gebunden. Das Daunorubicin wird vorzugsweise mit Methanol, das 10% Wasser und 1 % Natriumchlorid enthält, eluiert. Das Eluat wird dann eingeengt, um den Alkohol zu entfernen, und dann wie oben angegeben extrahiert.

Man kann die Fermentationsmaische auch einer Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanoi, Äthylacetat oder Chloroform, bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von 7,5, unterziehen. In diesem Falle geht die gesamte Aktivität in die organische Phase, die von der wäßrigen Phase nach üblichen Verfahren abgetrennt wird.

Gleichgültig, welche Extraktionsweise gewählt wird, wird das Daunorubicin schließlich in organischer Lösung erhalten. Es kann zu diesem Zeitpunkt vorteilhaft sein, eine Reinigung durch aufeinanderfolgende Überführung des Antibioticums in wäßrige Lösung und dann in organische Lösung durch Änderung des pH-Werts vorzunehmen. Das rohe Antibioticum kann anschließend aus der zuletzt erhaltenen organischen Lösung durch Einengen oder durch Ausfällen mit einem schlechten Lösungsmittel, wie beispielsweise Hexan, isoliert werden.

Zur Herstellung von reinerem Dnunorubidn kann man die üblicherweise angewendeten Methoden, wie beispielsweise Chromatographie an verschiedene Adsorbcnticn, Gegenstromverteilung oiler Verteilung zwischen verschiedenen Lösungsmitteln, anwenden.

Das Daunorubicin kann auch in Additionssalz.e mit Säuren, wie beispielsweise ChlorwasserstolTsäurc, übergeführt werden. Diese Salze können durch Anwendung üblicher Methoden gereinigt werden.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Daunorubicin und dessen Salze weisen Eigenschaften auf, die mit denjenigen des Aiitihiolicums 13 057 R.P. und seiner Salze, die in der französischen Patentschrift 15 33 151 beschrieben sind, identisch Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

In einen 170-1-Fermenter bringt man die folgenden Bestandteile ein:

Pepton

Fleischextrakt
Hydratisierte Glucose
Agar
Leitungswasser, ad

1200 g
600 g

1200 g
240 g

Der pH-Wert wird mit 120 cm¹ 10 η-Natronlauge auf 7,20 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durch 40minütiges Durchleiten von Dampf von 122"C. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 1201 und der pH-Wert 6,65. Man beimpft dann mit 200 cm¹ einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219. Die Kultur wird bei 27°C während 30 Stunden unter Bewegen und unter Belüftung mit steriler Luft entwickelt. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.

Die Produktionskultur wird in einem 800-1-Fermenter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

Distillers' Solubles	4 kg
Gekörnte Bohnen	12 kg
Sojaöl	8 1
Natriumchlorid	2 kg
Kobaltchlorid-Hexahydrat	8g
Leitungswasser, ad	330 1

VS Nach Einstellen des pH-Werts mit 400 cm¹ 10 n-Natronlauge auf 7,70 wird das Medium bei 122"C während 40 Minuten sterilisiert. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 360 1. Es wird durch Zugabe von 401 einer sterilen wäßrigen Lösung, die 6 kg hydra· tisiertc Glucose enthält, auf 4001 aufgefüllt. Dci pH-Wert beträgt dann 6,80.

Man beimpft mit 40 1 der Impfkultur aus dem ober beschriebenen 170-1-Fermenter. Die Züchtung wire bei 27"C 170 Stunden unter Bewegen mittels eine:

Turbincnrührers, der mit 260 U/min betrieben wire und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 30mVStundc durchgeführt. Der pH-Wert de: Züchtungsmediums beträgt dann 7,30 und das VoIu men der Maische 305 1. Die vorhandene Menge ar

so Daunorubicin (13 057 R.P.) beträgt 22,5 |j.g/cm\

Beispiel 2

2001 der während der in Beispiel 1 beschriebenei

ss Fermentation erhaltenen Züchtungsmaische werdci

in einen mit einem Rührer und einer llciz.schlangi mit Dampf ausgestatteten Bottich eingebracht. Mm

setzt 6 kg Oxalsäure zu und erhitzt die Masse au 50'C. Man rührt bei dieser Temperatur l'/₇Stundei

im weiler. Nach dieser Zeitspanne wird die Suspensioi auf einer Filterpresse nach Zugabe von 30 kg Filter

hilfe nitrierl. Der Filierkuchen wird auf dem F'ilte mit 100 1 Wasser gewaschen. Das F'iltrat, clessu Volumen 2601 beträgt, wird auf I 15'C ,ibgckühll, um

<>s der pll-Werl wird mil 10%iger Natronlauge auf 4, eingestellt.

Das Filtnil wird in eine Säule, die 6 1 Amberlit 1KC-50 im Siiurezvklus onlhiilt «;< > ιηΊΐΜΐι-t dnß da

Harzbett vcn oncn nach unten mit einer Rate von 15 I/Slundc durchströmt wird. Die Säule wird anschließend mit 301 Wasser, das in der gleichen Richtung wie das Filtrat und mit tier gleichen Rate durchgeleitet wird, und dann mit 30 1 Methanol mit einem Gehalt von 50% Wasser in einer Rate von 15 l/Stunde von unten nach oben und dann weiterhin mit der gleichen Rate und so η unten nach oben mit 50 1 Methanoi mit einem Gehalt von 10% Wasser gewaschen.

Der Abfluß und die Waschllüssigkeiten werden verworfen, und die Säule wird mit einer von oben nach unten durch das Harz geleiteten Lösung der folgenden Zusammensetzung cluicrt:

Natriumchlorid
Wasser
Methanol, ad

10 g

100 c irr¹
1000 cnr¹

Das Eluat wird ab dem Auftreten einer orangeroten Färbung und bis zum Verschsvinden dieser Färbung gesammelt. Man erhält so ein Volumen von 50 I, die den Hauptteil des Antibioticums enthalten.

Das Eluatwird untei vermindertem Druck (2 mm Hg) bei 35' C auf ein Volumen von 10 1 eingeengt.

Das Konzentrat wird bei pH 8,5 nacheinander dreimal mit je 5 1 Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird bei 30"C unter vermindertem Druck (5 mm Hg) auf ein Volumen von 50 cm³ eingeengt. Das Antibioticum wird in Form der Base mit 500 cm¹ Hexan ausgefällt, abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält schließlich 4,9 g rohe Base mit einem Gehalt von 64% Daunorubicin.

El c i s ρ i e I 3

6,8 g des wie in Beispiel 2 erhaltenen Produkts mit einem Gehalt von 64% Daunorubicin werden in 40 cnr¹ Wasser suspendiert und durch fortschreitende Zugane son 7 cm' 1 n-Sal/säure gelöst. Die Lösung s\ird durch Filtrieren geklärt, und Daiinoruhicin-hydrochlorid svird durch langsame Zugabe von I I Aceton kristallisiert.

^ Die so erhaltenen Kristalle sverden abfiltriert, mit 50 cm¹ Aceton gewaschen und bei 50 C unter vermindertem Druck (5 mm Hg) 15 Stunden getrocknet. Man erhält 3,3 g kristallicrtes llydrochlond mit einem Gehalt von 90% Daunorubicin in einer Ausbeute von

ι,, 68%.

B e i s ρ i e I 4

3 g des gemäß Beispiel 3 erhaltenen Produkts sverden in 10 cnr¹ Methanol gelöst. Dann werden 100 cm Chloroform nach und nach zugegeben, was die Kristallisation von Daunorubicin-hydrochlorid bewirkt. Die so erhaltenen Kristalle sverden abfiltriert, mit 20cm¹ Chloroform gewaschen und unter vermindertem Druck (5 mm Hg) 15 Stunden bei 50 C getrocknet. Man erhält 1,8 g umkristallisiertes Hydrochlorid mit einem Gehalt von 90% Daunorubicin. Die Ausfällung der Kristallisationsmutterlaugen mit 200 cnr Hexan ermöglicht, eine zweite Fraktion Daunorubicin zu erhalten. Nach Filtrieren, Waschen mit 50 cm¹ Hexan und Trocknen bei 50"C unter vermindertem Druck (5 mm Hg) erhält man 1 g Daunorubicin, das in den Arbeitsgang von Beispiel 3 zurückgeführt werden kann.

Beispiel 5

2,4 g des wie in Beispiel 4 beschrieben erhaltenen Daunorubicin-hydrochlorids werden in 40 cnr¹ Butanol suspendiert. Nach 'Astündigem Rühren werden die Kristalle abfiltriert, mit 10 cnr¹ Butanol gewaschen und bei 6O⁰C unter vermindertem Druck (0,5 mm Hg) während 8 Stunden getrocknet. Man erhält 2,1 g reines Daunorubicin-hydrochlorid mit einer Ausbeute von 88 %.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren /ur Herstellung des Daunomycin genannien Antibioticums 13057 R.P. durch I-ermentation, dadurch gekennzeichnet, dai,i man einen neuen »Streptomyces bifurcus. Stamm DS 23 219 (NRRL 3539)« genannten Stamm verwendet.