NO128618B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av antibiotikumet 13 057 R.P., kalt daunorubicin.

Oppfinnelsen vedrører en ny fremgangsmåte for fremstilling av et antibiotikum som betegnes med nummer 13.057 R.P., som har -fått navnet daunorubicin (tidligere: rubidomycin).

I det norske patent nr. 1.18.145 omtales antibiotikumet 9.865 R.P., dets tre hovedsakelige bestanddeler 13-213 R.P., 13-057 R.P. (eller daunorubicin) og 13-330 R.P., fremstillingen av antibiotikumet 9-865 R.P. ved dyrking i egnet medium av Streptomyces . coeruleorubidus 8.899 (NRRL 3046) eller Streptomyces coeruleorubidus 31.723 (NRRL 3045) og fraksjonering av antibiotikumet 9.865 R.P. i dets tre bestanddeler.

I det norske patent nr. 125.396 har det likeledes blitt omtalt 'fremstillingen av antibiotikumet 13.057 R. P; .eller daunorubicin ved dyrkning av en stamme av Streptomyces betegnet med Streptomyces griseus, varieté rubidofaciens, stamme DS 32.041 (NRRL 3383). '■' :/ h ''■/ >■■'- ;

Oppfinnelsen vedrører en ny fremgangsmåte for fremstilling av daunorubicin ved dyrkning ved aerobe betingelser av en hittil ukjent nedenfor mer fullstendig identifisert mikroorganisme, som tilhører slekten Streptomyces.og betegnes med navnet Streptomyces bifurcus, DS. 23.219 og som er oppnådd idet det ble gått ut fra en jordprøve tatt i Frankrike i Val-de-Marne-distriktet.

En prøve av denne stamme er deponert ved United' Department af Agriculture i Peoria, Illinois (USA) under nummer NRRL 3539- Prøver av denne mikroorganisme kan fåes fra dette laboratorium ved henvisning til foreliggende patent;

Isoleringen av denne stamme er utført under anvendelse av følgende vanlige metode: Jordprøver ble suspendert i sterilt destillert vann, hvoretter suspensjonen ble fortynnet til forskjellige konsentrasjoner og små volum av hver fortynning ble bredd ut på overflaten av Petri-skåler inneholdende egnede næringsagar-miljø. Etter inkubasjon i 15 døgn ved 26°C ble det omplantet de kolonier av mikroorganismene som man ville isolere, på skråagar for å oppnå rikeligere kultur.'-

Av grunner som det skal redegjøres nærmere for nedenfor bør stammen Streptomyces DS 23.219 anses som representant for en ny art betegnet Streptomyces bifurcus på grunn av det faktum at man i dets kulturer meget ofte finner en ganske spesiell form av sporoforer, som avsluttes med en dikotomisk deling og da har to forlengede forgreninger festet ved enden av et grunnfilament.

Streptomyces bifurcus, stamme DS 23.219 danner sylind-riske sporer som har én størrelse av 0,4-0,5'm^u/1-1,2 m^u. Disse rette eller svakt bøyede sporedannehde filamenter er innstukket gj ennoin luftfilamentene som bærer dem isolert ellér i knipper inne-holdende et lite antall element. Ofte gir grunnfilamentet i sin endedel grunn til bare to forlengede filamenter, hvilket til sporo-foren gir et ganske spesielt kløvet utseende.

På vanlig måte utvikler Streptomyces bifurcus, stamme DS 23.219 på syntetisk næringsmedium et gulaktig til lyserosa, brun-, aktig rosa eller rødaktig brunt vegetativt mycelium og produserer oppløselig pigment med en farge av orangerosa til fiolettrosa. På organisk medium er dets vegetative mycelium gulbrunt til orangebrunt og de oppløselige pigmenter som den danner farger agaren i orangebrunt til rødaktig brunt. De danner intet melanotisk pigment , på organiske media og danner ikke HgS. De danner nitriter utgående fra nitrater på såvel organiske media som på syntetiske media, smelter gelatin, peptoniserer melk langsomt og utnytter cellulose.

I nedenstående tabell I angis dyrkningskarakteristika og de biokjemiske egenskaper som Streptomyces bifurcus, stamme DS 23.219, viser på et visst antall næringsagar vog næringsbulj onger.

som vanligvis anvendes for å undersøke utseende av Streptomyces-stammer. Hvis intet annet angis er disse karakteristika de som oppvises av kulturer på omkring 2 til 3 uker å 25°C, som har nådd et godt utviklingsstadium. Et visst antall av de anvendte dyrk-ningsmedia er blitt fremstilt i henhold til formler som angis i "The Actinomycetes" (S.A. Waksman, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A., 1950, side 193-197). I dette tilfelle

angis de med bokstaven W etterfulgt av det nummer som de har fått i "The Actinomycetes".

Referansene eller sammensetningene for de andre kul-turmedia er følgende: Ref. A - "Hickey and Tresner's Agar" - T.G. Pridham m.fl. -

Antibiotics Annual, 1956-1957, side 950.

Ref. B - K.L. Jones - Journal of Bacteriology, 57, 142, 19^9-

Ref. C - Formel W-23 tilsatt med 2% agar.

Ref. D - "Yeast Extract Agar" - T.G. Pridham m.fl. - Antibiotics

Annual, 1956-1957, side 950.

Ref. E - "Tomato Paste Oatmeal Agar" - T.G. Pridham m.fl. -

Antibiotics Annual, 1956-1957, side 950.

Ref. F - W.E. Grundy m.fl. - Antibiotics and Chem. 2, 401, 1952.

Ref. G - "Inorganic Salts - Starch Agar" - T.G. Pridham m.fl. -

Antibiotics Annual, 1956-1957, side 951-

Ref. H - tilsvarer formel W-l hvor 30 g sackarose.er erstattet

med 15 g glukose.

Ref. I - tilsvarer formel W-l, hvor 30 g sackarose er erstattet

med 15 g glyserin.

Ref. J - "Plain gelatin" - tilberedt i henhold til "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacterial Society of American

Bacteriologists, Geneva, N.Y. , H50-I8'

Ref. K - "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria"

Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y., H50-18'

Ref. L - "Manual of Methods for Pure Culture Study of ..Bacteria"

of American Bacteriologists, Geneva, N...Y,. , -'-■'•50-19'

Ref. M - tilsvarer formei W-l8, hvor 30 g sackarose er erstattet med 15 g glukose.... Ref. N - tilsvarer formel W-l8, hvor sackarose er erstattet,med små

bånd av filtrerpapir delvis nedsenket i. væsken.

Ref. 0 - Kommersiell skummet melkepulver, rekonstituert i henhold

til angivelser fra fabrikanten.

Ref. P - The Actinomycetes, vol. 2, side 333, nr. 42 - S.A. Waksman,

The Williams and Wilkings Company, Baltimore, 1961.

Ref. Q - H.D. Tresner and F. Danga - Journal of Bacteriology, 76,

239-244, 1958.

Evnen ved Streptomyces bifurcus, Stamme DS 23.219 til

å anvende forskjellige karbon- og nitrogenkilder for å sikre sin ut-, vikling er bestemt i henhold til prinsippet i Pridhams og Gottliebs metode (J. of Bact. 5_6, 107-114, 1948). Utviklingsgraden. er iakt-tatt på det av forfatterne angitte basismediet under utbytting av enten glukose med forskjellige karbonkilder eller (NH^)2S0^ med "forskjellige undersøkte nitrogenkilder. Resultatene angis i nedenstående tabell II.

Summen av de karakteristika som Streptomyces bifurcus, stamme DS 23.219 utviser, har ikke muliggjort å identifisere den som noen av de tidligere omtalte arter, og det er derfor man bør anse den som representant for en ny art.

Gjennom å følge den klassifisering av Streptomyces som angis i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7. utgave - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957) gjør dets egenskaper å ikke danne melanotisk pigment på organiske medier, at på potet å danne et oppløselig rødaktig brunt pigment og likeledes på potet å utvikle et lyst rødaktig brunt vegetativt mycelium, at den

■ må sammenstilles med Streptomyces noursei. Det finnes imidlertid ingen likhet med sistnevnte som danner spiralformede sporoforer og hvis sporedannende luftmycelium antar en rosa fargetone, idet den bare gir ikke spiralformede sporebærende filamenter, og har et lyst blågrått sporedannende luftmycelium.

I The Actinomycetes (vol. 2, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, side 158) finner man omtalen av tre andre typer som sammen med Streptomyces noursei har egen-skapene å ikke danne melanotisk pigment på organiske medier og danne et rødaktig oppløselig pigment på potet og på potet å danne et rødt til rødaktig vegetativt mycelium: Streptomyces albogriseolus, Streptomyces spiralis og Streptomyces fragilis. Men disse tre arter har slike vesentlige forskjeller overfor stammen Streptomyces bifurcus, stamme DS 23.219 at de ubestridelig er arter som ikke kan tilsvare den. Streptomyces albogriseolus og Streptomyces spiralis danner spiralformede sporoforer, som klassifiserer dem innen seksjonen Spira i henhold til Pridhams klassifisering, mens Streptomyces bifurcus, stamme DS 23-219, som bare gir rette eller svakt bøyede sporebærende filamenter, befinner seg innen seksjonen Rectus-Flexibilis i samme klassifisering. Når det gjelder Streptomyces fragilis viser den rosa farge som dets luftmycelium antar, når det befinner seg i sporedannelsen, at den er uten likhet med Streptomyces bifurcus, stamme DS 23.219, hvis luftmycelium som nevnt ovenfor, farges i lyst blågrått når sporer dannes.

Streptomyces bifurcus, stamme DS 23.219, kan altså ikke

identifiseres som noen av de stammer som den ligner mest.

Dyrking ved gjæring av Streptomyces bifurcus, stamme DS 23.219 gir hovedsakelig daunorubicin men likeledes de øvrige bestanddeler av antibiotikumet 9865 R.P., som fraskilles daunorubicin under ekstraksjon- og rensingsoperasjoner og som eventuelt isoleres, men det hovedsakelig formål med oppfinnelsen består i fremstilling av daunorubicin.

Dyrkingen av Streptomyces bifurcus, stamme DS 23.219, kan utføres ved hjelp av en hvilken som helst metode for aerob dyrking på overflaten eller på dypet, men sistnevnte er å foretrekke av bekvemmelighetsgrunner. Man anvender for dette formål forskjellige apparaturtyper, som nå er i ålment bruk,innen gjæringsindustrien. Man kan spesielt anvende følgende forløp for oppdeling av arbeids-trinnene:

Gjæringsmediet bør vesentlig inneholde en assimilerbar karbonkilde og en assimilerbar nitrogenkilde, mineralstoffer og eventuelt vekstfremmende stoffer, idet alle disse stoffer kan anvendes i form av veldefinerte forbindelser eller komplekse bland-inger, slike man støter på i forskjellige naturlige biologiske pro-dukter.

Som assimilerbar karbonkilde kan man anvende kullhy-drater, som glukose, maltose, dekstriner, stivelse eller andre karbon- og hydrogenholdige stoffer som sukkeralkoholer: mannitol eller som visse organiske syrer som melkesyre og sitronsyre. Visse animalske eller vegetabilske oljer som spekk- eller soyaolje kan med fordel erstatte disse forskjellige karbon-hydrogenkilder eller være tilsetninger til dem.

De egnede assimilerbare nitrogenkilder er meget forskjellige. De kan være meget enkle kjemiske stoffer som nitrater, uorganiske eller organiske ammoniumsalter, karbamid, aminosyrer.

De kan også utgjøres av komplekse stoffer, som hovedsakelig inneholder nitrogen i proteinform som kasein, laktalbumin, gluten og dets hydrolysater, soyamel, jordnøttsmel, fiskemel, kjøttekstrakt, gjærekstrakt, drank, maisstøpevann.

Blant de tilsatte mineralstoffer kan visse ha en puffrende eller nøytraliserende effekt som alkalimetall- eller jord-alkalimetallfosfater eller kalsium- og magnesiumkarbonater.

Nødvendig ionisk likevekt ved utvikling av Streptomyces bifurcus, stamme DS 23-219 og ved fremstillingen av antibiotikumet gis av andre av de tilsatte mineralstoffer, som klorider og sulfater av alkalimetaller og jordalkalimetaller. Endelig virker visse stoffer mer spesielt som aktivatorer for de metaboliske reaksjonene for Streptomyces DS 23-219 bg disse stoffer er salter av sink, ko-bolt, jern, kobber og mangan.

pH i gjæringsmediet ved dyrkingens begynnelse bør ligge mellom 6,0 og 7,8, fortrinnsvis 6,5 - 7,5. Den optimale temperatur for gjæringen er 25_30°C, men en tilfredsstillende produksjon opp-nås ved temperaturer mellom 23 og 33°C. Lufttilførselen til gjæringen kan variere mellom ganske store verdier. Man har imidlertid funnet at lufttilførsel på 0,3 - 3 liter luft pr. liter buljong og pr. min. passer spesielt godt. Det maksimale utbytte av antibiotikum fåes etter 2-8 døgns dyrking, idet denne tid hovedsakelig er avhengig av det anvendte mediet.

Herav kan man fastslå at de generelle betingelser for dyrking av Streptomyces bifurcus, DS 23-219, for dannelse av daunorubicin kan variere innen et ganske stort område og kan tilpasses til hvert spesielt behov.

Daunorubicin kan isoleres fra gjæringsmediet ved hjelp av forskjellige metoder. Man kan filtrere dyrkingsvæsken ved en pH mellom 1,5 og 9 og ved disse betingelser overgår størstedelen av aktiviteten i filtratet. Etter vasking med vann har filterkaken praktisk talt ingen aktivitet. Det er fordelaktig å utføre denne operasjon i surt miljø og spesielt under surgjøring ved en pH mellom 1,5 og 2 ved hjelp av oksalsyre. Det er likeledes mulig å utføre filtrering ved en pH mellom 2 og 7, fortrinnsvis i nærheten av 2,

i nærvær av en alifatisk alkohol inneholdende 1-3 karbonatomer.

Ved de ovennevnte isoleringsfremgangsmåter fåes daunorubicin i vannoppløsning eller vannholdig alkoholoppløsning, og man kan deretter overføre den i organisk oppløsning ved ekstrahering med et organisk oppløsningsmiddel som ikke er blandbart^med vann, såsom butanol, metylisobutylketon, etylacetat eller kloroform, ved en pH mellom 5,5 og 9, fortrinnsvis i nærheten av 7,5- Før denne ekstrahering foregår eventuelt en behandling med ionebytterharpiks. I dette tilfelle reguleres vannoppløsningen til en pH nær 4 og fikseres.-deretter ved en kationbytterharpiks. Daunorubicin éluéres, fortrinnsvis, ved hjelp av metanol ,inneholdende 105? vann og 1% natrium-klorid. Eluatet konsentreres så for å eliminere alkoholen og ekstraheres som angitt nedenfor.- -

Man kan likeledes utsette gjæringsvæskén for en ekstrahering med et organisk oppløsningsmiddel, som er ikke blandbart med vann, som butanol,' etylacetat eller kloroform ved en pH mellom 5,5

og 9, fortrinnsvis i nærheten av 7,5- I dette tilfelle overgår hele aktiviteten i den organiske fase, som adskilles fra vannfasen i henhold til kjente fremgangsmåter.

Hvilken ekstraheringsmåte som enn velges, fåes daunorubicin endelig i organisk oppløsning. Det kan være fordelaktig at i dette stadium å utføre en rensing gjennom -suksessivt å overføre antibiotikumet i vannoppløsning og deretter i organisk oppløsning ved endring av pH. Det urene antibiotikum kan deretter isoleres fra den endelige dannede organiske oppløsning ved konsentrering eller ved utfelling ved hjelp av et dårlig oppløsningsmiddel som heksan.

Por å oppnå daunorubicin renere kan man anvende vanlige brukbare metoder som kromatografi på forskjellige adsorberende mid-ler, motstrømsfordeling eller oppdeling mellom forskjellige oppløs-ningsmidler. Daunorubicin kan likeledes omdannes til addisjonssalt med syrer som klorhydrogensyre. Disse salter kan renses ved til-passing av vanlige metoder.

Daunorubicin oppnådd i henhold til den nye fremgangsmåte og dens salter har karakteristika, som er identiske med de som i det norske patent nr. 125.396 er omtalt for antibiotikumet 13.057 R.P. og for dets salter.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av' følg-ende eksempel.

Eksempel.

I en gjæringsapparatur på 170 liter ifylles:

Springvann resterende til 110 liter.

pH justeres til 7,20 med 120 ml 10-n natronlut. Man steriliserer mediet ved 122°C ved gjennombobling av vanndamp i 40 min.

Etter avkjøling er buljongens volum 120 liter-og pH 6,65. Man poder da med 200 ml av en kultur av Streptomyces bifurcus, stamme DS 23.219 omrørt i en Erlenmeyer-kolbe. Kulturen utvikles ved 27°C i 30 timer under omrøring og under lufting med steril luft. Den er da egnet for poding av produksjonsdyrkingen.

Produksjonsdyrkingen utføres i gjæringsapparatur på 800 liter, som er fylt med følgende stoffer:

Springvann resterende til 330 liter.

Etter å ha justert pH til 7,70 med 400 ml 10-n natronlut steriliserer man mediet ved 122°C i 40 min. Etter adskillelse er buljongens volum 360 liter. Den kompletteres til 400 liter ved tilsetning av 40 liter av en steril vannoppløsning inneholdende 6 kg cerelose. pH er da 6,80. Man poder med 40 liter podningskultur fra den ovenfor omtalte gjæringsapparatur på 170 liter. Dyrkningen utføres ved 27°C i 170 timer under omrøring ved hjelp av en omrører som gjør 260 omdr./min. og under lufting med 30 m steril luft pr. time. Kulturens pH er da 7,30 og dets volum 305 liter. Den tilstede-værende mengde daunorubicin (13.057 R.P.) er 22,5/Ug/ml.

200 liter av den dyrkingsvæske som er oppnådd i den omtalte gjæring fylles i et kar utstyrt med en omrører og en rørspiral for oppvarming med damp.. Man tilsetter 6 kg oksalsyre og oppvarmer massen til 50°C. Omrøring, og temperaturen holdes i 1 time og 30 min. Etter denne til filtreres suspensjonen på filterpresse etter tilsetning av 30 kg filtreringsadjuvant. Filterkaken vaskes på filteret med 100 liter vann. Filtratet, hvis volum er 260 liter, avkjøles til +15°C og pH justeres til 4,5 ved hjelp av 10#-ig natronlut.

Filtratet has gjennom en" kolonne inneholdende 6 liter "Amberlite IRC-50" i surcykel, således at det renner gjennom harpiks-laget ovenifra og ned i en strøm på 15 liter/time. Kolonnen vaskes deretter med 30 liter vann som sirkulerer i samme retning som filtratet og med samme strømming, deretter med 30 liter metanol med 50% vann ved en nedenifra og oppad sirkulerende strøm på 15 l/time og deretter etterhvert med samme strøm og nedenifra pg opp med 50 liter metanol med 10% vann...

De utstrømmende væsker og vaskevæskene fjernes og kolonnen elueres med en oppløsning som sirkulerer ovenifra dg ned gjennom harpiksen og har, følgende sammensetning:.

Eluatet samles opp, alt fra det finnes en rødorange farge og til denne farge forsvinner. Man får således et volum på 50 liter som inneholder størstedelen av antibiotikumet. Eluatet konsentreres under redusert trykk (2 mm Hg) ved 35°C til.et volum på 10 liter. Konsentratet ekstraheres ved pH 8,5, suksessivt med tre ganger 5 liter kloroform. Kloroformekstraktet konsentreres ved 30°C under nedsatt trykk (5 mm Hg) til et volum på 50 ml. Antibiotikumet utfelles i form av baser med 500 ml heksan, sugefil-treres, vaskes og tørkes. Man får til slutt 4,9 g uren base inneholdende 63% daunorubicin.

6,8 g av det dannede produkt med et innhold av 64% daunorubicin suspenderes i 70 ml vann og oppløses ved suksessiv tilsetning av 7 ml l-n klorhydrogensyre. Oppløsningen klares ved filtrering og hydrokloridet av daunorubicin krystalliserer ved langsom tilsetning av 1 liter aceton. De således dannede krystaller filtreres, vaskes med 50 ml aceton og tørkes ved 50°C under redusert trykk (5 mm Hg) i 15 timer. Man får 3,3 g krystallisert hydroklorid med et innhold av 90% daunorubicin i et utbytte på 68%.

3 g av det dannede produkt oppløses i 10 ml metanol, hvoretter 100 ml kloroform tilsettes suksessivt, hvilket fremkaller omkrystallisering av hydrokloridet av daunorubicin. De således dannede krystaller filtreres, vaskes med 20 ml kloroform og tørkes

ved 50°C under redusert trykk (50 mm Hg) i 15 timer. Man får 1,8 g omkrystallisert hydroklorid med et innhold av 90% daunorubicin. Ut-fellingen av moderluten fra krystallisering med 200 ml heksan mulig-gjør å oppnå en annen fraksjon daunorubicin. Etter filtrering, vasking med 50 ml heksan og tørking ved 50°C under redusert trykk (50 mm Hg) får man 1 g daunorubicin, som er recyklerbar ved be-tingelsene angitt ovenfor.

2,4 g hydroklorid av daunorubicin dannet som beskrevet ovenfor suspenderes i 40 ml butanol. Etter en halv times omrøring filtreres krystallene, vaskes med 10 ml butanol og tørkes ved 60°C under redusert trykk (0,5 mm Hg) i 8 timer. Man får 2,1 g rent

hydroklorid av daunorubicin i et utbytte på 88%.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for- fremstilling av antibiotikumet 13.057 R.P., kalt daunorubicin, ved dyrking av en mikroorganisme åv slekten Streptomyces, karakterisert ved at man som mikroorganisme anvender Streptomyces bifurcus, stamme DS 23.219 (NRRL 3539).