DK166025B - Efomycin g, dets fremstilling og anvendelse, midler med indhold deraf, dyrefoder, drikkevand og tilsaetningsstoffer dertil med indhold af efomycin g og fremgangsmaade til fremstilling af midlerne - Google Patents

Description

i

DK 166025B

Den foreliggende opfindelse angår Efomycin G, dets fremstilling og dets anvendelse som ydelsesfremmende stof til dyr, midler med indhold af Efomycin, dyrefoder, drikkevand og tilsætningsstoffer dertil med indhold deraf, og 5 fremgangsmåde til fremstilling af midlerne.

Opfindelsen angår den hidtil ukendte kemiske forbindelse Efomycin G med formlen I

HO

10 W°\ ho-^".....η h'o .

15 H

1 O

^ ^-OH

OH

20 og de følgende kemiske og fysiske egenskaber: 1. Sumformel: ¢53^5()13 2. Massespektrum (Fast Atom Bombardment) 25 Molmasse + Na+: 1033 3. ^-H-kerneresonansspektret, angivet i ppm, ifølge fig. 1 på tegningen.

Det er optaget i et AM 300 apparat fra firmaet Bruker ved 75,48 MHz på en opløsning af Efomycin 30 Gi deutereret chloroform med tetramethylsilan som indre standard.

4. 13C-kerneresonansspektrum, angivet i ppm, ifølge fig. 2 på tegningen.

Det er optaget i et AM 300 apparat fra firmaet 35 Bruker ved 75,48 MHz på en opløsning af Efomycin

DK 166025 B

2 G i deutereret chloroform og deutereret methanol med tetramethylsilan som indre standard.

De kemiske forskydninger i 13C-NMR-signalerne fra 5 Efomycin G ifølge fig. 2 er i enkeltheder: 170.0 77,9 65,9 32,9 7,0 145,4 73,4 48,5 19,4 144,7 71,2 43,6 19,1 10 131,9 70,6 41,9 16,8 121.1 70,1 41,1 16,7 99,6 69,9 38,8 15,1 99.5 66,9 38,5 13,4 93.6 66,5 36,2 9,0 15 93,3 66,4 33,0 8,9 (ppm-værdierne er angivet relativt i forhold til tetramethylsilan ved 0 ppm).

5. UV-absorptionsmaksimum ved 251-254 nm i methanolisk opløsning.

20 Opfindelsen angår også en særlig fremgangsmåde til fremstilling af Efomycin G, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man dyrker mikroorganismen BS 1261 (DSM nr. 3200) fra Streptomycetacea-familien eller en deraf afledt mutant, der har væsentligt samme egenskaber, i et nærings-25 substrat, som indeholder assimilerbare carbon- og nitrogenkilder samt mineralsalte, under aerobiske betingelser, isolerer den dannede blanding af Efomyciner ved gængse fremgangsmåder og fraskiller Efomycin G.

Opfindelsen angår desuden 30 - anvendelsen af Efomycin G som ydelsesfremmende stof til dyr, - et middel til fremme af ydelse hos dyr, som er ejendommeligt ved et indhold af Efomycin G, - dyrefoder, drikkevand til dyr, tilsætningsstoffer 35 til dyrefoder og drikkevand til dyr, som er ejendommelige 3

DK 166025B

ved et indhold af Efomycin G, og - en fremgangsmåde til fremstilling af midler til at fremme ydelsen hos dyr, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man blander Efomycin G med strække- og/eller fortyn-5 dingsmidler.

Ved kendskab til egenskaberne af Efomycin G er det ved hjælp af gængse chromatografiske, spektroskopiske og/eller biologiske analysemetoder muligt at finde egnede mikroorganismestammer og ved dyrkning af disse at fremstille 10 Efomycin G.

Til gennemførelse af den i krav 2 omhandlede fremgangsmåde til fremstilling af Efomycin G dyrkes især mikroorganismer fra Streptomycesstammen BS 1261.

Denne stamme hører til Streptomycetaceae-familien, 15 slægten Streptomyces fra den grå serie af Streptomyceter (Cinereus-gruppen).

Stammen BS 1261 er deponeret i henhold til Budapest-traktaten den 16.01.1985 hos Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM) Grisebachstrasse 8, 3400 Gottingen, Forbunds-20 republikken Tyskland, under nummeret DSM 3200 og er blevet almindeligt tilgængelig den 02.10.86 i forbindelse med offentliggørelse af DE patentansøgning nr. 3.511.753.

Den taksonomiske beskrivelse af stammen BS 1261 (DSM

3200).

25 Den taksonomiske beskrivelse af stammen BS 1261 sker ifølge Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 8th, (1974), samt International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966) og The Prokaryotes 2., 2028-2020 (1981).

30 1. Moroholoai

Man kan iagttage en god sporulation på ISP-substra-terne nr. 2, 3, 4, 5, 7-9. På ISP-substrat nr. 9 med ribose som C-kilde samt ud fra ISP-substrat nr. 1 og 6 dannes der overvejende substratmycelium.

35 0

. DK 166025 B

4

Luftmycelium (ISP-substrat nr. 3, 28°C, 7 dage):

Farve: grå (Cinereus-type) 5 Sporekæder: retinaculum-aperturn-type

Sporer: kvadratiske til rektangulære, 1,4-1,8 mikrometer lange og 1,3-1,6 mikrometer brede glatte (elektromikroskop!) .

10

Substratmycelium:

Farve: brun 2. Oplysninger angående fysiologi 15 Temperaturoptimum ligger på 28°C (på ISP-sub strat nr. 2, 5 dage). Stammen vokser ikke ved 4°C og 45°C. Der dannes ikke melanin. Væksten hæmmes med de antibiotiske midler erythromycin (10 mikrogram), sulfa-furazol (100 mikrogram), streptomycin (10 mikrogram) 20 og novobiocin (5 mikrogram) (ISP-substrat nr. 2, 28°C, 2 dage).

Udnyttelsen af C-kilder efterprøves på grundagar (ISP-substrat nr. 9) ifølge Int. Syst. Bact. 16, 313-340 (1966). Til blindkontrollen sammenlignes væksten 25 på grundagar uden C-kilde. Derved fås følgende resultater : 30 35 0 5

DK 166025B

Tabel

Stammen BS 1261's udnyttelse af C-kilder.

C-kilde (10 g/1) Vækst x 5

Kontrol (ingen C-kilde) D-Glucose + L-Arabinose + L-Rhamnose + D-Fructose + 10 L-Galactose +

Raffinose + D-Mannitol + meso-inositol +

Salicin +

Saccharose +

Ribose +

Mannose +

Maltose +

Mellibiose + 20

Cellulose

Acetat )x + = vækst, - = ingen vækst 25 30 35

e DK 166025 B

o 3. Særligt egnet substrat til vækst og sporulation ISP 3 (havremel-agar) 20 g havremel suspenderes i 1000 ml deioniseret H^O og koges i 20 minutter. Derpå filtrerer man, der 5 tilsættes 1 ml sporgrundstofopløsning til ISP 3 og 18 g agar, og pH-værdien indstilles til 7,2, og der autoklaveres ved 121°C i 15-20 minutter.

Sporgrundstofopløsning til ISP 3 10 FeS04 . 7 H20 0,1 g

MnCl2 . 4 H20 0,1 g

ZnS04 . 7 H20 0,1 g deion . H20 100 ml 15 Yderligere substrater, se Int. J. Syst. Bact. 16, 313-340 (1966).

Stammen BS 1261, isoleret fra en jordprøve fra New Zealand, lader sig på baggrund af det morphologiske data indordne i den grå serie af streptomyceter (cinereus-20 -gruppen) .

Taksonomisk betegnelse: Streptomyces sp.

Efomycin G dannes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved fermentationen af streptomycetes-stammen BS 1261 eller mutanter deraf med væsentligt samme egenskaber.

25 Fermentationsfremgangsmåden ifølge opfindelsen kan gennemføres ved hjælp af faste, halvfaste eller flydende næringssubstrater. Man anvender fortrinsvis vandige, flydende næringssubstrater.

Podningen af næringssubstraterne sker ved alment 30 gængse fremgangsmåder, eksempelvis via skrårør eller kolbekulturer.

Dyrkningen sker under aerobiske betingelser og kan gennemføres ved de alment gængse fremgangsmåder, såsom under anvendelse af rystekulturer eller submers-kulturer.

35

7 DK 166025 B

o

Dyrkningen sker fortrinsvis ved aerobisk submers fremgangsmåde i beluftede fermentorer, eksempelvis i gængse submersfermentationstanke. Det er muligt at gennemføre fermentationen kontinuerligt eller diskontinuerligt. Man 5 arbejder fortrinsvis diskontinuerligt.

Dyrkningen gennemføres i næringssubstrater, der som bekendt anvendes til dyrkning af mikroorganismer af Actinomycetales-ordenen. Næringssubstratet skal indeholde en eller flere assimilerbare C-kilder og N-kilder samt 10 mineralsalte, idet disse produkter kan foreligge i form af definerede enkeltbestanddele, men også i form af komplekse blandinger, idet de især er biologiske produkter af forskellig oprindelse. Som C-kilder kommer alle gængse C-kilder på tale. Eksempelvis kan nævnes carbonhydrater, 15 især polysaccharider såsom stivelse eller dextriner, di- saccharider, såsom maltose eller lactose, monosaccharider, såsom glucose eller xylose, alkoholer, såsom mannitol eller glycerol, samt naturligt forekommende blandinger, såsom maltekstrakt, melasse eller vallepulver. Som nitrogen-20 kilder kommer alle gængse organiske og uorganiske nitrogen--kilder på tale. Eksempelvis kan angives proteiner, proteinhydrolys ater, aminosyrer, nucleosidbaser, såsom cyto-sin eller uracil, samt sojabønnemel, bomuldsfrømel, linsemel, ærtemel, opløselige og uopløselige vegetabilske pro-25 teiner, majsstøbevand, gærekstrakt, peptoner og kødekstrakt, nitrogenholdige salte såsom ammoniumsalte og nitrater. Mineralsaltene, som skal være indeholdt i næringssubstratet, leverer eksempelvis følgende ioner.

30 Mg++, Na+, K+, Ca++, NH4 + , Cl“, S04~", P04 og NC^- samt ioner af de gængse sporgrundstoffer, såsom Cu, Fe,

Mn, Mo, Zn, CO, Ni. Såfremt carbon- eller nitrogen-kilderne eller det anvendte ..vand ikke indeholder disse salte eller 35 0 8

DK 166025B

sporgrundstoffer i tilstrækkelig mængde, er det hensigtsmæssigt at supplere næringssubstratet tilsvarende. Sammensætningen af næringssubstraterne kan varieres inden for vide områder. Art og sammensætning af næringssubstraterne 5 er almindeligvis afhængig af-, hvilke bestanddele, som hver gang er særligt gunstigt tilgængelige. Almindeligvis indeholder næringsopløsningerne fortrinsvis fra ca. 0,5 til ca. 8%, især fra 0,6 til 6% C-kilder, fortrinsvis fra ca.

0,5 til ca. 4%, især fra 0,5 til 2% nitrogenkilder, og 10 fortrinsvis fra ca. 0,001 til ca. 0,5%, især fra 0,003 til 0,3% mineralsalte.

Ved gennemførelse af fremgangsmåden kan det være gunstigt ved starten af dyrkningen kun at anvende relativt ringe koncentrationer af de opløselige næringsopløsnings- 1 ^ bestanddele, og derpå i løbet af de første tre dyrkningsdage ved hyppigere tilsætninger fraktioneret til dyrkningsblandingen at sætte disse bestanddele i form af sterile, relativt koncentrerede opløsninger.

pH-værdien af de voksende kulturer skal fortrinsvis 20 holdes mellem ca. 5 og ca. 10, især mellem 5,6 og 8,0.

En for kraftig pH-værdinedsættelse inden for de sure områder kan undgås ved tilsætninger af en organisk eller uorganisk base, fortrinsvis af CaCO^· Som gængs inden for fermentationsteknologien kan man også gennemføre en automatisk pH-25 -styring, ved hvilken der med mellemrum indsprøjtes sterile organiske eller uorganiske syrer, eksempelvis H2SO^, eller sterile baser, eksempelvis NaOH, i dyrkningsopløsningen.

Det er hensigtsmæssigt at sikre, at mikroorganis-30 merne bringes i tilstrækkelig kontakt med oxygen samt næringsstofferne. Dette kan ske ved de alment gængse fremgangsmåder såsom omrystning og omrøring.

Dyrkningstemperaturen kan ligge mellem ca. 24°C og ca. 34°C, fortrinsvis mellem 26°C og 32°C, især fortrins-35 0 9

DK 166025B

vis ligger den på ca. 28°C. Varigheden af dyrkningen kan varieres kraftigt, idet eksempelvis sammensætningen af næringssubstratet og dyrkningstemperaturen spiller en rol-5 le. De hver gang optimale betingelser kan let fastsættes af enhver fagmand på det mikrobiologiske område. Det har vist sig, at mængden af forbindelsen ifølge opfindelsen, som koncentreres i dyrkningsbouillonen, almindeligvis når dets maksimum efter fra ca. 1 til ca. 10, almin-10 deligvis fra ca. 4 til ca. 7 dages forløb efter dyrkningens påbegyndelse. Det ønskede slutprodukt fra fermentationen kan bestemmes ved hjælp af tyndtlagschromatografiske og højtryksvæskechromatografiske undersøgelser eller biologiske forsøgsmetoder.

15 Som alment gængs ved mikrobiologiske fremgangsmåder skal man undgå fremmedinfektioner af dyrkningssubstraterne. Hertil træffes de gængse forholdsregler, såsom sterilisation af næringssubstraterne, dyrkningsbeholdere samt den til beluftningen nødvendige luft. Til sterilisation af 20 apparaterne kan man eksempelvis anvende damp- og tørsterilisation, idet temperaturerne fortrinsvis kan ligge fra 100 til 140°C, især fra 120 til 130°C.

Såfremt der ved dyrkningen dannes skum i uønsket mængde, kan man tilsætte de gængse kemiske skumdæmpende 25 midler, såsom flydende fedtarter og olier, såsom olie--vand-emulsioner, paraffiner, højere alkoholer, såsom octadecanol, siliconeolier, polyoxyethylen- og polyoxy-propylenforbindelser (eksempelvis i mængder på højst ca. 1%). Man kan også dampe eller fjerne skum ved hjælp 30 af de gængse mekaniske anordninger (som eksempelvis anvendelse af centrifugalkræfter).

Forbindelsen ifølge opfindelsen kan isoleres fra dyrkningssubstratet ved alment gængse fysisk-kemiske fremgangsmåder. Isoleringen kan eksempelvis ske ved 35 gængse ekstraktionsfremgangsmåder, fældningsfremgangs- o 10

DK 166025 B

måder og/eller chromatografifremgangsmåder. Det isolerede stof kan også finrenses ved hjælp af de nævnte fremgangsmåder. I mange tilfælde er en finrensning imidlertid ikke nødvendig, da eventuelt tilstedeværende ubetydelige 5 forureninger ikke indvirker skadeligt på Efomycins aktivitet. Ved alle isolerings- og rensningsoperationer skal man holde øje med, at pH-værdierne ligger inden for et neutralt område. Fortrinsvis holdes pH-værdien mellem 7 og 8. Til indstilling af pH-værdien kan man anvende 10 uorganiske og organiske baser, såsom alkalimetalbaser, eksempelvis NaOH, KOH eller organiske aminer, såsom tri-ethylamin, uorganiske syrer, såsom HC1, og organiske syrer, såsom eddikesyre.

For i forbindelse med de ovennævnte isolerings- og 15 rensningsmetoder at finde frem til de fraktioner, hvori forbindelsen ifølge opfindelsen foreligger i højeste koncentration eller renhedsgrad, kan man anvende gængse fy-sisk-kemiske metoder, eksempelvis måling af et karakteristisk bånd ved spektroskop! eller R^-værdien og bestemmelse af 20 den antibakterielle aktivitet. Man kan også anvende disse metoder for ved rutinefremgangsmåder til produktion af Efomycin G at opdage egnede mikroorganismer.

Isoleringen og rensningen af forbindelsen ifølge opfindelsen kan eksempelvis i det tilfælde, at man an-25 vender et flydende vandigt næringssubstrat, foretages som følger:

Da Efomycin G er at finde både i den ovenstående dyrkningsvæske og i myceliet, kan det isoleres og eventuelt renses ved hjælp af gængse ekstraktionsfremgangsmåder, udfæld-30 ningsfremgangsmåder og/eller chromatografiske fremgangsmåder fra fermentationsudgangsblandingen. Chromatografien kan gennemføres i form af søjlechromatografi. Med godt resultat kan man også anvende højtryksvæskechromatografi (HPLC).

Som adsorptionsmidler kan man anvende gængse uorganiske 35 o

DK 166025 B

11 eller organiske absorptionsmidler, såsom silicagel, mag-nesiumsilicagel, aktivt kul, cellulose, cellulosederivater, syntetiske harpikser såsom polyamider, eksempelvis acetyleret polyamid, dextrangeler eller modificerede 5 dextrangeler. Som elueringsmidler kan man anvende de mest forskellige opløsningsmidler eller opløsningsmiddelblandinger, hvori forbindelsen ifølge opfindelsen er opløselig. Man anvender fortrinsvis ethylacetat, chloroform eller ethanol eller blandinger deraf (eksem-10 pelvis blandinger af chloroform eller methanol eller af ethylacetat og chloroform).

Man anvender fortrinsvis chromatografi-fremgangs-måder til isolering af forbindelsen ifølge opfindelsen, eksempelvis uspecificeret adsorption på sorbtionsmidler 15 såsom silicagel eller på den anden side geldiffusions- chromatografi. Dette er metoder, som er kendte fra rensningen af lidet vandopløselige naturstoffer.

Ud fra dets opløsning kan man få forbindelsen ifølge opfindelsen ved gængse fremgangsmåder, eksem-20 pelvis fordampning af opløsningsmidlet og frysetørring.

I en foretrukken udførelsesform skilles myceliet fra dyrkningsbouillonen, fortrinsvis ved centrifugering, og ekstraheres med et med vand blandbart opløsningsmiddel flere gange, fortrinsvis to gange. Som opløsningsmidler 25 kan man anvende C^-C4-alkylalkoholer, C^-C4-ketoner, især fortrinsvis acetone. Den vandigt-organiske opløsning inddampes i vakuum, eksempelvis til ca. 1/20 af dyrkningsbouillonens rumfang, og frysetørres.

Dette råpræparat suspenderes i vand, og Efomycin G

30 ekstraheres med et med vand ikke-blandbart opløsningsmiddel, såsom chlorcarbonhydrider, såsom chloroform, estere af eddikesyre eller ketoner. Ud fra dette ekstrakt kan man isolere Efomycin G ved gængse chromatografiske metoder, fortrinsvis chromatografi på silicagel.

35 12 o

DK 166025 B

Efomycin G kan ligeledes ekstraheres fra dyrkningsfiltratet ved ekstrahering med et med vand ikke-blandbart opløsningsmiddel, såsom ethylacetat, methylenchlorid eller chloroform.

5 Det kan ligeledes bindes på uspecifikke adsorptions- -harpikser på polystyrenbasis (eksempelvis "Amberlite XAD" fra firmaet Roehm und Haas eller "Lewatit OC 1031" fra firmaet Bayer). Desorption foretages fraktioneret med blandinger af vand og organiske opløsningsmidler, især vand/-10 methanol. De mod staphylococcus aureus 1756 ved forsøg fundne aktive fraktioner inddampes under formindsket tryk til fuldstændig fjernelse af det organiske opløsningsmiddel ved fra 30 til 35°C, og remanensen suspenderes i ca.

1/100 af;dyrkningsfiltratets rumfang og frysetørres.

15 Lyophilisatet suspenderes atter i vand og ekstra heres fortrinsvis med ethylacetat eller andre med vand ikke-blandbare opløsningsmidler. Ud fra ekstraktet fås Efomycin G ved gængse chromatografiske fremgangsmåder, fortrinsvis chromatografi på silicagel.

20 Forbindelsen ifølge opfindelsen viser en god anti- bakteriel virkning fremfor alt over for grampositive kim.

Især skal nævnes dets egnethed til hindring og helbredelse af svinedysenteri og ketase.

Forbindelsen ifølge opfindelsen kan anvendes som 25 aktivt ydelsesfremmende stof til dyr til at fremme og fremskynde væksten, mælke- og uldproduktionen samt til forbedring af foderudnyttelsen, kødkvaliteten og til forskydning af kød/fedt-forholdet til gunst for kød. Det aktive stof anvendes til nyttedyr, fortrinsvis til drøvtyggere, 30 såsom kreaturer, får og geder.

Det aktive stof anvendes uafhængigt af dyrenes køn under alle dyrets ydelsesfaser. Især anvendes det aktive stof under den intensive ydelsesfase. Den intensive vækst- og ydelsesfase varer alt efter dyrearten fra 35

13 DK 166025 B

o 1 måned op til 10 år.

Mængden af aktivt stof, som indgives til dyrene til opnåelse af den ønskede virkning, kan varieres i vid udstrækning på grund af de gunstige egenskaber af det aktive 5 stof. Den ligger fortrinsvis fra ca. 0,001 til ca.

500 mg/kg, især fra 0,01 til 5 mg/kg legemsvægt pr. dag.

En passende mængde af det aktive stof samt den passende varighed af indgiften afhænger især af arten, alderen, kønnet, ydelsesfasen, sundhedstilstanden og den måde, man 10 holder dyrene på, og fodring af dyrene, og er let at finde for enhver fagmand.

Man indgiver det aktive stof til dyrene ved gængse fremgangsmåder. Arten af indgiften afhænger især af arten, adfæren og sundhedstilstanden hos dyrene.

15 Det aktive stof kan indgives en gang. Det aktive stof kan imidlertid ligeledes indgives under hele eller under en del af ydelsesfasen temporært eller kontinuerligt.

Ved kontinuerlig indgift kan anvendelsen ske en eller flere gange dagligt ved regelmæssige eller uregelmæssige 20 mellemrum.

Indgiften sker oralt eller parenteralt i dertil egnede præparater eller i ren form.

Det aktive stof kan foreligge i præparater alene eller i blanding med andre ydelsesfremmende aktive stof-25 fer, mineralske foderstoffer, sporgrundstof-forbindelser, vitaminer, ikke-protein-forbindelser, farvestoffer, anti-oxidanter, a’romastoff er, emulgatorer, f lydehjælpestof fer, konserverings- og pressehjælpestoffer.

Andre ydelsesfremmende aktive stoffer er: 30 Eksempelvis antibiotika såsom tylosin, virginia- mycin og monensin. Mineralske foderstoffer er eksempelvis dicalciumphosphat, magnesiumoxid og natriumchlorid.

Sporgrundstof-forbindelser er eksempelvis jernfuma- rat, natriumiodid, cobaltchlbrid, kobbersulfat, zinkoxid.

35 0 14

DK 166025B

Vitaminer er eksempelvis vitamin A, vitamin , vitamin E, B-vitaminer og vitamin C.

Ikke-protein-forbindelser er eksempelvis biuret og urinstof. Farvestoffer er eksempelvis carotinoider, 5 såsom citranaxanthin, zeaxanthin og capsanthin.

Antioxidanter er eksempelvis aethoxyquin og butylhydroxy-toluen.

Aromastoffer er eksempelvis vanillin.

Emulgatorer er eksempelvis estere af mælkesyre 10 og lecithin.

Flydende hjælpestoffer er eksempelvis natrium-stearat og calciumstearat.

Konserveringsmidler er eksempelvis citronsyre og propionsyre. Pressehjælpestoffer er eksempelvis lignin- 15 sulfonater og celluloseethere.

Indgiften af det aktive stof kan ligeledes ske sammen med foder og/eller drikkevand.

Til foder henregnes enkeltfoderstoffer af vegetabilsk oprindelse, såsom hø, roer, kornbiprodukter, enkelt-20 foderstoffer af animalsk oprindelse såsom kød, fedtarter, mælkeprodukter, knoglemel, fiskeprodukter, samt enkeltfoderstoffer såsom vitaminer, proteiner, aminosyre, eksempelvis DL-methionin, salte, såsom kalk og natriumchlorid. Til foderet henregnes ligeledes tilskuds-, færdig- og blan-25 dingsfoderstoffer. Disse indeholder enkeltfoderstoffer i en sammensætning, som sikrer en afbalanceret ernæring i henseende til energi- og proteinforsyningen samt forsyningen med vitaminer, mineralsalte og sporgrundstoffer.

Koncentrationen af det aktive stof i foderet udgør 30 normalt fra ca. 0,01 til ca. 500 ppm, fortrinsvis fra 0,1 til 50 ppm.

Det aktive stof kan sættes til foderet som sådant eller i form af forblandinger eller foderkoncentrater.

35 0 15

DK 166025 B

Eksempel på sammensætningen af et foder til kreaturer, som indeholder det aktive stof ifølge opfindelsen: 69,95% foderkornsskrå, 10% formalede majskolber, 8% sojabønnemel, 5% lucernemel, 5% melasse, 0,6% urinstof, 5 0,5% calciumphosphat, 0,5% calciumcarbonat, 0,3% natrium- chlorid og 0,15% forblanding. Forblandingen indeholder 70.000 i.e. vitamin A, 7000 i.e. vitamin D3, 100 mg vitamin E, 50 mg mangan, 30 mg zink og 0,06 mg cobalt. Det aktive stof blandes i forblandingen i fornøden mængde.

10 Det er ikke ubetinget nødvendigt at anvende det rensede og isolerede Efomycin G. Det er ligeledes muligt at anvende den ved dets fremstilling dannede blanding og endog den dannede dyrkningsbouillon eller myceliet uden rensning, eventuelt efter tørring. Til mange formål er 15 det ligeledes tilstrækkeligt at anvende rå former af det aktive stof ifølge opfindelsen og blandinger deraf uden forudgående finrensning.

Fremstillingen og den biologiske virkning af den hidtil ukendte forbindelse ifølge opfindelsen belyses 20 ved de følgende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af podekultur.

Celler af Streptomyces sp. BS 1261 (DSM 3200) føres 25 fra et skrårør til 1000 ml Erlenmeyer-kolber, som hver indeholder 150 ml af følgende sterile næringsopløsning: CASci^ fra firmaet Merck, Darmstadt, med sammensætningen:

Pepton fra casein 15 g 30 Pepton fra sojamel 5 g

Glucose 2,5 g

NaCl 5 g

Vand ad 1000 ml 35

1K DK 166025 B

16 0

Kolberne inkuberes i 3 dage ved 28°C med 250 opm på en roterende rystemaskine. To kolber fra den resulterende kultur forenes og tjener som inoculum til en 30 liters fermenter, som indeholder 20 liter af den 5 ovennævnte, sterile næringsopløsning, hvortil der er sat 20 ml "SAG 5693" (Union Carbide).

Fermentationen gennemføres ved 28°C med en beluft-ningshastighed på 10 1/min. (0,5 wm) luft og et overtryk på 0,5 bar. Bladrørerens omdrejningstal er 300 opm.

10 Efter 48 timers forløber tjener den således tilvejebragte kultur som podekultur til tankfermentation.

Eksempel 2 Tankfermentation.

15 En 300 liters kedel podes med 20 liter af det ved eksempel 1 franstillede podekultur, og denne kedel indeholder 200 liter sterilt næringssunstrat med følgende sammensætning:

Skummetmælkspulver 10 g 20 Gærautolysat 1,5 g

Dextrin -40 g D-glucose 5 g "SAG 5693" (Union Carbide) 1 ml

Vand ad 1000 ml 25 pH-værdien af substratet ligger efter sterilisation på 6,6. Fermentationen gennemføres ved 28°C og et bladrøreromdrejningstal på 100 opm, en beluftningshastig-hed på 100 liter luft pr. minut (0,5 wm) og et overtryk 30 på 1,0 bar, indtil man efter 3-5 dages forløb kan påvise Efomycin G.

35 o 17

DK 166025B

Eksempel 3

Den ifølge eksempel 2 tilvejebragte dyrkningsbouillon fra en 200 liters fermentation separeres ved en pH-værdi på 7-7,5 og 200-250 liter pr. time i en 5 Westfalia-separator. Myceliet omrøres med det dobbelte rumfang acetone i 30 minutter ved stuetemperatur og centrifugeres. Remanensen omrøres på ny med det dobbelte rumfang acetone og centrifugeres. De forenede centrifu-gater inddampes med reduceret tryk ved en bad temperatur 10 på 40°C. Til· koncentratet sættes der 10 liter vand, og man ekstraherer tre gange med hver gang 10 liter dichlor-methan. Man tørrer de forenede organiske faser over natriumsulfat, filtrerer dem og inddamper dem under formindsket tryk ved en badtemperatur på højst 40°C til et 15 rumfang på 3 liter. Man lader koncentratet lukke ud i ca. 30 liter ekstraktionsbenzin under omrøring. Udfældningen skilles fra ved filtrering og tørres i vakuum ved 40°C. Udbytte: 61 g gulligt pulver.

20 Eksempel 4

Man isolerer Efomycin G fra det ved eksempel 3 udvundne rå produkt ved præpareret væskechromatografi.

Parameter:

Elueringsmiddel A: 5 mM citronsyre/acetonitril =6:4 25 B: 5 mM citronsyre/acetonitril =4:6

Gradient: efter 3 minutters isokratisk vandring med elueringsmiddel A/B = 4:1 lineær gradient i 1 fra A/B = 4:1 til A/B =1:9 30 Elueringshastighed: 20 ml/min.

Detektion: UV 254 nm Søjle: 21,6 x 250 mm

Stationær fase: Zorbax®C8 8^um (DuPont) 35 0 18

DK 166025 B

For hver separation anvendes ca. 30 mg af det ifølge eksempel 3 tilvejebragte rå produkt, opløst i hver gang 2 ml tetrahydrofuran/vand =2:1. Søjleelu-atet opfanges fraktioneret og underkastes en analytisk 5 højtryksvæskechromatografi med følgende parametre. Elueringsmiddel A: 5 ioM citronsyre 0,1 M NaC104

Elueringsmiddel B: acetonitril

Gradient: lineær 52-75% B i løbet af 10 18 minutter

Elueringshastighed: 1,5 ml/min.

Detektion: UV 254 nm

Stationær fase: Nucleosil® 10C18 Søjle: 4,6 x 250 ml 15

Fraktioner, som indeholder rert Efomycin G, forenes og inddampes under formindsket tryk ved en badtemperatur på 40°C til 1/3 af udgangs rumfanget. Det som farveløs udfældning dannede Efomycin G skilles fra ved filtrering 20 og tørres i højvakuum ved 40°C. Udbytte: 5 mg Efomycin G? renhedsgrad ifølge HPLC højere end 85%.

Eksempel A

Fra en kastreret vædder, som pr. dag får 650 g grov-25 malet færdigfoder til får og 250 g "Trockengriin Cobs", tages der mavevæske ud via en fistel i vommen. Færdigfoderet indgives via en foderautomat i 12 ens portioner med et mellemrum på 2 timer, og cobsene indgives i to ens portioner kl. 8.30 og 16.15. Mavevæsken underkastes umiddelbart efter 30 udvindingen følgende behandling: Man går ud fra 2,5 ml af vom-inoculet i et reagensrør med et volumen på 13 ml, begasset med carbondioxid, som desuden indeholder følgende tilsætninger: 35 19

DK 166025B

100 mg fint formalet færdigfoder til får 7,5 ml pufferopløsning 0,5 ml 5%'s vandig ethanol med eller uden Efomycin G.

5 Sammensætningen af pufferopløsningen, som før be gyndelsen af forsøget mættet med carbondioxid, er som følger:

Na2HP0^ 4,61 g pr. 1 vand

NaHCC>3 12,25 g pr. 1 vand 10 NaCl 0,59 g pr. 1 vand KCl 0,71 g pr. 1 vand

MgCl2 0,32 g pr. 1 vand

CaCl2 0,13 g pr. 1 vand 15 Hvert reagensrør lukkes med en Bunsen-prop og inku beres ved 39°C. Efter 2, 4, 6 og 8 timers forløb rystes udgangsblandingerne for hånd. Efter 24 timers inkuberina udtages 1 ml af fermentationsvæsken fra udgangsblandingerne og pipetteres til en Eppendorf-beholder, som indeholder 20 0,2 ml 10%'s phosphorsyre (der indeholder 5,7 mikromol 2-methylvalerianesyre) . Erobeme centrifugeres ved 11.000 g, og ud fra den ovenstående væske bestemmes de flygtige fedtsyrekoncentrationer gaschromatografisk.

Ved hvert forsøg bestemmes forholdet mellem eddike-25 syre og propionsyre. Den værdi, der fås ved blindkontrollerne, fastsættes til 100, og afvigelserne angives i forhold hertil. Jo mere propionsyre, der dannes, jo lavere er forholdet mellem eddikesyre og propionsyre, og jo lavere er forholdstallet i sammenligning med kontrollen. Lave forholdstal 30 svarer til formindskede eddikesyre/propionsyre-forhold og forbedret foderudnyttelse. Dette beror på, at lave forholdstal viser, at propionsyredannende bakterier begunstiges i deres vækst på bekostning af eddikesyredannende bakterier, hvilket medfører en ringere methandannelse og en formindskel-35 se af de tab, der skyldes methandannelsen.

DK 166025 B

•20

Yderligere angives ved hvert forsøg koncentrationerne af totalfedtsyrerne i sammenligning med kontrollen (= 100).

Tabel Mængde Eddikesyre- y propionsyre-

Qug/udgangsblånding) forhold_ Total fedtsyrer

Kontrol 100 100 250 64,3 101,5 10 500 58,8 103,8 15

Claims (7)

1. Sumformel: C53H86O28

1. Efomycin G med formlen I

2. Fremgangsmåde til fremstilling af Efomycin G, kendetegnet ved, at man dyrker mikroorganismen BS 1261 (DSM nr. 3200) fra Streptomycetaceae-familien eller en deraf afledt mutant, der har væsentligt samme egenskaber, i et næringsubstrat, som indeholder assimilerbare carbon-20 og nitrogen-kilder samt mineralsalte, under aerobiske betingelser, isolerer den dannede blanding af Efomyciner ved gængse fremgangsmåder og fraskiller Efomycin G.

2. Massespektrum (Fast Atom Bombardment)

20 Molmasse + Na+: 1033 3. -^H-Kerneresonansspektrum, angivet i ppm, ifølge fig. 1 på tegningen. Det er optaget i et AM 300 apparat fra firmaet Bruker ved 75,48 MHz på en opløsning af Efomycin 25 Gi deutereret chloroform med tetramethylsilan som indre standard. 4. 13c-kerneresonansspektrum, angivet i ppm, ifølge fig. 2 på tegningen. Det er optaget i et AM 300 apparat fra firmaet 30 Bruker ved 75,48 MHz på en opløsning af Efomycin G i deutereret chloroform og deutereret methanol med tetramethylsilan som indre standard. De kemiske forskydninger i 13C-NMR-signalerne fra Efomycin G ifølge fig. 2 er i enkeltheder: 35 DK 166025B 170/0 77,9 65,9 32,9 7,0 145,4 73,4 48,5 19,4 144,7 71,2 43,6 19,1 131,9 70,6 41,9 16,8 5 121,1 70,1 41,1 16,7 99,6 69,9 38,8 15,1 99.5 66,9 38,5 13,4 93.6 66,5 36,2 9,0 93,3 66,4 33,0 8,9 10 (ppm-værdierne er angivet relativt i forhold til tetra-methylsilan ved 0 ppm)

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den gennemføres med stammen BS 1261 25 (svarende til DSM nr. 3200).

4. Anvendelse af Efomycin G som ydelsesfremmende stof til dyr.

5. Middel til fremme af ydelse hos dyr, kendetegnet ved et indhold af Efomycin G. O Λ

5. UV-absorptionsmaksimum ved 251-254 nm i methanolisk opløsning.

5 H0 HO-^'.....η O hn hK 10 ooo 9 9 i __ ΝΠ H 0‘^^/yS/V^CH3 O L oh u) v^A

15 OH og de følgende kemiske og fysiske egenskaber:

6. Dyrefoder, drikkevand til dyr, tiléætningsstoffer til dyrefoder og drikkevand til dyr, kendetegnet ved et indhold af Efomycin G.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af midler til at fremme ydelsen hos dyr, kendetegnet ved, at 35 man blander Efomycin G med strække- og/eller fortyndingsmidler.