DK142061B - Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikum A-28086-kompleks, dets komponenter faktor A, faktor B og faktor D eller salte eller estere deraf. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆG6ELSISSKRIFT 1 4206 1 DANMARK (61) Int el.3 c 12 p 17/18 UMmviMnix c 07 G 11 /00 // c 07 d 493/20 §(21) Ansøgning nr. 2579/75 (22) Indleveret den 9· JUT)· 1975 (23) Løbedag 9· Jun. 1975 (44) Ansøgningen fremlagt og ο o fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 1 O· SU£· 1989

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begår«fra den

10. jun. 1974, 477954, US 21. apr. 1975a 589719a US 21. apr. 1975, 5β§74θ, US

(71) ELI LILLY AND COMPANY, 507 East McCarty Street, Indianapolis, Indiana 4620T, US.

(72) Opfinder: David Herbert Berg, 1521 Bruner Drive, Greenfield, Indiana, US: Robert L. Hamill, R.~R. 1, New Robb, Indiana, US: Marvin Martin Hoehn, 4975 East 79th Street, Indianapolis, Indiana, US: Walter Mit= suo Nakatsukasa, 2118 Crossman Drive, Indianapolis, Indiana, US.

(74) Fuldmagtig under «agens behandling:

Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co,___ (54) BY* emgangs måde til fremstilling af antibiotikum A-28086-kompleks, dets ’ komponenter faktor A, faktor B og faktor D eller salte eller estere deraf.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikum A-28086-kompleks, dets komponenter faktor A, faktor B og faktor D eller salte eller estere deraf, hvor faktor A og D har de i kravets indledning angivne, postulerede formler (I) og (II). Disse antibiotiske forbindelser er nyttige som antibakterielle, antifungale, antivirale og anti-pleuropneumoniaagtige midler, som anticoccidie-mid-ler, insecticide og acaricide midler samt til forøgelse af foderudnyttelseseffektiviteten hos drøvtyggere.

2 142061

Den her omhandlede fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man dyrker Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 eller Strepto-myces aureofaciens NRRL 8092 i et kulturmedium indeholdende assimilerbare kilder til kulhydrat, nitrogen og uorganiske salte under betingelser for submers aerob fermentering, fraskiller A-28086-antibiotikum-komplekset fra kulturmediet og, om ønsket, isolerer en eller flere af dets komponenter og, ligeledes om ønsket, omdanner disse til salte eller C2_6acylderi-vater af faktor A og D, eller flere af disse operationer udføres.

Antibiotikum A-28086-faktor A er en hvid krystallinsk forbindelse, når den krystalliseres fra en blanding af acetone og vand, som er opløselig i lavere alkoholer, såsom methanol og ethanol, dimethylformamid, dimethylsulfoxid, ethylacetat, chloroform, acetone og benzen, som kun er svagt opløselig i ikke-polære organiske opløsningsmidler, såsom hexan og uopløselig i vand, som smelter ved ca. 98-100°C, størkner på ny og smelter igen ved ca. 195-200°C, Og som har a) en molekylvægt på 764, bestemt ved spektrometri, b) en omtrentlig grundstofsammensætning på 66,69% carbon, 9,85% hydrogen og 23,10% oxygen, c) en empirisk formel r bestemt ved massespek- trometri, d) en specifik drejning på -54° (c = 0,2, methanol) bestemt ved 25°C, e) et infrarødt absorptionsspektrum i chloroform vist på fig. 1 på tegningen med nedenstående skelnelige ab-s.orptionsmaksima: 2,85, 3,34, 5,83, 6,82, 7,22, 7,53 (svagt), 7,78 (svagt), 8,75 (stærkt), 8,95 (stærkt), 9,15, 9,50 (stærkt), 9,55 (stærkt), 9,60, 9,85, 10,15, 10,45 og 10,70 (svagt) μ, f) kun slutabsorption på under 200 mp i sit ultraviolette spektrum i ethanol, g) et kememagnetisk resonansspektrum i deuterochloro- form med nedenstående karakteristika: £6,01, 4,21, 4,11, 3,99, 3,89, 3,80, 3,67, 3,65, 3,57, 3,55, 2,83, 2,76, 2,74, 2,68, 2,66, 2,58, 2,56, 2,30, 2,22, 2,17, 2,10, 2,05, 1,96, 1,90, 1,85, 1,70, 1,62, 1,60, 1,47, 1,39, 1,31, 1,25, 1,18, 0,95, 0,93, 0,90, 0,88, 0,85, 0,77, 0,75, 0,73, 0,68 og 0,66 ppm, h) en titrerbar gruppe med en pK -værdi på 7,9 i 80%'s et vandig dimethylformamid, 14206 1 3 i) krystalliseret fra en blanding af acetone og vand et karakteristisk røntgenstrålepulverdiffraktionsmønster (Cu++-bestråling, 1,5405 .A , nikkelfilter) med nedenstående interplanære mellemrum i Ångstrom-enheder (d): _d_Relativ Intensitet_ 12,00 100 10,10 50 9,25 90 8,00 40 7,50 15 6,92 90 6,40 40 5.98 05 5,68 15 5.20 40 4.98 40 4,62 40 4.21 20 3,48 10 j) en Rf-værdi på 0,24 ved tyndtlagschromatografi over silicagel i et opløsningsmiddelsystem af benzen og ethylacetat (3:2) under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganisme, mendens den tilsvarende R^-værdi ved anvendelse af ethylacetat/diethylamin (95:5) er 0,54, k) nedenstående R^-værdier i de nedenfor angivne papir-chromatografiske systemer under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganisme:

Rf-Værdi OplØsningsmiddelsystera 0,11 Vand mættet med methylisobutylketon (MIBK) 0,41 Vand mættet med MIBK plus 2% p-toluensulfonsyre og 1% piperidin 0,54 Vand:methanol:acetone (12:3:1) - indstillet på en pH-værdi på 10,5 med NH^OH og dernæst sænket til en pH-værdi på 7,5^ med H^PO^ 0,48 1% MIBK, 0,5% NH^OH 1 vand 0,15 17,4 g K2HP04, 30 ml ethanol pr. liter vand 0,24 Benzen mættet med vand 0,24 Vand 0,75 Vand:MIBK:ethylacetat (98:1:1), 4 U2061 l) en syrefunktion, der er i stand til at danne salte og esterderivater, og m) mindst én hydroxylgruppe, der er i stand til ester ificering.

Baseret på de ovenfor angivne fysiske karakteristika kan der foreslås en struktur for antibiotikum A-28086-faktor A. Eftersom strukturbestemmelsen kun er et postulat, må det imidlertid forstås, at den her angivne struktur udelukkende repræsenterer en arbejdshypotese. Arbejdsstrukturen for A-28086-faktor A er vist i formel (I): CHa /\f

Ctte '0 A 1 —*CH2-CH3

Γ /λ V

0 .0 OH Q CHs CL JO---

ho-c-ch—E —ch-o+-ch4!-gh—' o c /—°H

CHs . CHa CHa CHa . YOte V CHa CHa CHa (I)

Antibiotikum A-28086-faktor B er en hvid krystallinsk forbindelse, når den krystalliseres fra en blanding af acetone og vand, som er opløselig i lavere alkoholer såsom methanol og ethanol, dimethyIformamid, dimethylsulfoxid, ethylacetat, chloroform, acetone og benzen, men som kun er svagt opløselig i i'kke-polære organiske opløsningsmidler, såsom hexan, som er uopløselig i vand, og som har a) et smeltepunkt på ca. 150-153°C, b) en molekylvægt på 762, bestemt ved højopløsnings-massespektrometri, c) en empirisk formel C43H7o°H' bestemt ved højopløs-ningsmassespektrometri, d) et infrarødt absorptionsspektrum i chloroform vist i fig. 2 på tegningen med nedenstående skelnelige absorptionsmaksima: 2,82, 3,30, 5,77, 5,85, 6,80, 7,20, 7,50 (svagt), 7,72 (svagt), 7,80 (svagt), 8,57 (stærkt), 8,68, 8,90 (stærkt), 9,10, 9,50, 9,83 (stærkt), 9,90, 10,10, 10,17 (stærkt), 10,43 (svagt), 10,80 (svagt), 11,20 (svagt), 11,35 (svagt), 11,73 (svagt) og 12,03 (svagt) μ, 5 U2QG1 e) et iagttaget absorptionsmaksimum i ethanol i sit ultraviolette spektrum ved 220 nqa = 137,5, £=10.477), f) et kernemagnetisk resonansspektrum i deuterochloro-form med nedenstående karakteristika: <?7,20, 7,09, 6,26, 6,15, 4,19, 4,12, 4,05, 3,95, 3,89, 3,78, 3,62, 3,59, 3,52, 3,48, 2,81,' 2,73, 2,63, 2,54, 2,52, 1,99, 1,91, 1,84, 1,71, 1,67, 1,64,,1,55, 1,43, 1,33, 1,18, 1,11, 0,96, 0,94, 0,90, 0,87, 0,84, 0,77, 0,74 og 0,68 ppm, g) en R^-værdi på 0,42 ved tyndtlagschromatografi over silicagel i en blanding af benzen og ethylacetat (3:2) under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganisme, medens den tilsvarende værdi ved anvendelse af ethylacetat/di-ethylamin (95:5) er 0,34, h) nedenstående R^-værdier i de nedenfor angivne papir-chromatografiske systemer under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganisme: R^-Værdi Opløsningsmiddelsystem 0,09 Vand mættet med methylisobutylketon (MIBK) 0,16 Vand mættet med MIBK plus 2% p-toluensul-fonsyre og 1% piperidin 0,46 Vand:methanol:acetone (12:3:l)-indstillet på en pH-værdi på 10,5 med NH^OH og dernæst sænket til en pH-værdi på 7,5 med HgPO^ 0,36 1% MIBK, 0,5% NH4OH i vand 0,33 17,4 g KH2PC>4, 30 ml ethanol pr. liter vand 0,51 Benzen mættet med vand 0,11 Vand 0,61 Vand:MIBK:ethylacetat (98:1:1) 1 en syrefunktion, der er i stand til at danne salte og esterderivater, j) to ketondele, og k) mindst én hydroxydel.

6 142061

Antibiotikum A-28086-faktor D er en mindre faktor, når den er fremstillet af S. aureofaciens NRRL 5758. Når den er fremstillet af S. aureofaciens NRRL 8092, er A-28086-faktor D imidlertid til stede i mængder på op til 10% af den opnåede antibiotikum--aktivitet.

Antibiotikum A-28086-faktor D er en hvid krystallinsk forbindelse, når den krystalliseres fra en blanding af acetone og vand, som er opløselig i methanol, ethanol, dimethylformamid, di-methylsulfoxid, ethylacetat, chloroform, acetone og benzen, men som kun er svagt opløselig i ikke-polære organiske opløsningsmidler, såsom hexan, og som er uopløselig i vand, som smelter ved ca. 96-98°C, og som har a) en molekylvægt på 778, bestemt ved højopløsnings-massespektrometri, idet grundstofsammensætningen af spidsen i massespektret af natriumsaltet af A-28086-faktor D iagttages at være 800,5050 (beregnet for C^H^gO-^Na = 800,5050, medens der i massespektret af den frie syre af A-28086-faktor D iagttages en lille spids ved 778 og en større spids ved 760,5117 (beregnet for = 760,5125), dvs. m/e 760 i massespek tret af den frie syre stammer fra tabet af vand fra molekyl-ionen, b) en omtrentlig grundstofsammensætning på 67,59% carbon, 9,38% hydrogen og 22,77% oxygen, c) en empirisk formel C44H74°n/ bestemt ved højopløs-ningsmassespektrometri, d) en specifik drejning på -56° (c = 0,1, methanol), bestemt ved 25°C, e) et infrarødt absorptionsspektrum i chloroform vist i fig. 8 på tegningen med nedenstående iagttagelige absorptionsmaksimas 2,89, 3,39, 3,43, 3,50, 5,88, 6,90, 7,27, 7,60, 7,84, 9,00, 9,26, 9,62, 10,31, 10,58, 11,10 og 11,49/1.

f) ingen iagttagelig ultraviolet absorption i 95%'s vandig ethanol, q) et kernemagnetisk resonansspektrum i chloroform med nedenstående karakteristika: d'6,00, 4,20, 4,10, 4,00, 3,98, 3,92, 3,86, 3,83, 3,79, 3,67, 3,64, 3,57, 3,54, 2,88, 2,81, 2,71, 2,62, 2,58, 2,48, 2,43, 2,37, 2,29, 2,21, 2,15, 2,10, 2,04, 1,97, 1,89, 1,83, 1,76, 1,68, 1,61, 1,58, 1,55, 1,47, 1,39, 1,30, 1,25, 1,18, 0,95, 0,90, 0,88, 0,84, 0,74 og 0,68 ppm, 14206 1 7 h) en titrerbar gruppe med en pK -værdi på 8,67 i 80%'s vandigt dimethylformamid, i) omkrystalliseret fra en blanding af acetone og vand et karakteristisk røntgenstrålepulverdiffraktionsmønster (Cu++-bestråling, 1,5405 Å, nikkelfilter) med nedenstående interplanære mellemrum i Ångstrøm-enheder (d):

Relativ d intensitet 12,40 100 10,20 70 8,85 90 7.80 30 6.80 10 6.30 100 5,70 20 5,35 20 5,10 20 4,90 10 4,65 20 4,45 40 4,20 30 3.30 10 3,15 10 2,99 05 2,77 05 2,28 05 j) nedenstående R^-værdier i de nedenfor angivne tyndt-lagschromatografiske systemer under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganisme:

Rf-Værdi Opløsningsmiddelsystem 0,26 Benzen/ethylacetat (3:2) 0,66 Ethylacetat/diethylamin (95:5) k) nedenstående Rf-værdier i de nedenfor angivne papir-chromatografiske systemer under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 som påvisningsorganisme: 14206 1 δ R^-Værdi Opløsningsmiddelsystem 0,10 Vand mættet med methylisobutylketon (MIBK) 0,26 Vand mættet med MIBK plus 2% p-toluensulfon-syre og 1% piperidin 0,36 Vandrmethanol:acetone (12:3:1) - indstillet på en pH-værdi på 10,5 med NH^OH og dernæst sænket til en pH-værdi på 7,5 med H-jPO^.

0,29 1% MIBK, 0,5% NH4OH i vand 0,25 17,4 g ^ΗΡΟ^,δΟ ml ethanol pr. liter .vand 0,26 Benzen mættet med vand 0,09 Vand 0,64 Vand:MIBK:ethylacetat (98:1:1) l) en syrefunktion, der er i stand til at danne salte og esterderivater, samt m) mindst én hydroxylgruppe, der er i stand til esteri- ficering·

Baseret på de ovenfor angivne fysiske karakteristika kan der foreslås en struktur for antibiotikum A-28086-faktor D. Eftersom strukturbestemmelsen udelukkende er et postulat, må det imidlertid forstås, at den her angivne struktur udelukkende repræsenterer en arbejdshypotese. Arbejdsstrukturen for A-28086-faktor D er angivet i formel (II): CHa /\f . . CHa 0 11—CH2—CH3 Γ ϊ/χI v 0 JO. 0H 0 CHs .0 J0~—-4

HO-O-CH-/ N-CH-CH-CH-C-Ah-/ \-0H

o CHs JI CHs CHa "* J ·=· CHa Vffla /VR2 CHa R1 (I) 14206 1 9 hvor enten R er CH^, og R er C2^5' eller R"^ er og R^ er ch3.

Selv om der i dag kendes mange antibakterielle midler, er der fortsat et behov for nye, forbedrede antibiotika. Eet problem ved den gængse antibiotikumterapi består i, at antibiotika er forskellige i deres effektivitet over for patogene organismer.

Et andet problem er udviklingen af organismestammer, der er resistente over for standardantibiotika. Endnu et problem består i, at individuelle patienter ofte lider under alvorlige reaktioner over for specifikke antibiotika på grund af overfølsomhed og/eller toksiske effekter. På grund af disse problemer ved den gængse terapi er der fortsat behov for nye antibiotika.

Foruden behovene for nye antibiotika, der er nyttige til behandling af sygdomme hos mennesker, er der også behov for forbedrede antibiotika inden for veterinærområdet. I et væsentligt aspekt er der behov for forbedrede antibiotika til fremme af væksten af fjerkræ og af husdyrbesætningen. Fremme af væksten opnås f.eks. ved reducering af sygdomme og ved forøgelse af foderudnyttelse sef f aktiviteten .

En velkendt sygdom af økonomisk betydning for veterinærvidenskaben, mere specifikt for fjerkræindustrien, er protozo--sygdommen coccidiosis. Coccidiosis kommer af en infektion af en eller flere arter af Eimeria eller Isospora (en sammenfatning er angivet af Lund og Farr i "Diseases of Poultry", 5. udg., udgivet af Biester og Schwarte, Iowa State University Press, Arnes, la,, 1965, side 1056-1096). På grund af de store økonomiske tab forårsaget af coccidiosis og ulemperne ved visse kendte anticoccidie--midler fortsætter forskningen efter bedre airticoccidie-midler.

Enteritis er en anden sygdom, der kan forårsage svære økonomiske tab for producenter af husdyr. Enteritis forekommer hos høns, svin, kvæg og får og tilskrives først og fremmest anaerobe bakterier, især Clostridium perfringens og vira. Enterotoxemia hos drøvtyggere, et eksempel herpå er "forædningssygdom" hos får, er en tilstand, der er forårsaget af en C. perfringens-infektion.

Fremme af vækst hos drøvtyggere, såsom kvæg, er et andet økonomisk ønskeligt formål med veterinærvidenskab. Af særlig interesse er den fremme af vækst, der er opnået ved forøgelse af foderudnyttelseseffektiviteten. Mekanismen til udnyttelse af den 14206 1 ίο vigtigste nærende del (kulhydrater) af drøvtyggerfoder er velkendt. Mikroorganismer i dyrets rumen nedbryder kulhydrater til frembringelse af monosaccharider og omdanner dernæst disse monosaccharider til pyrodruesyreesterforbindelser. Pyrodruesyreestere metaboliseres ved mikrobiologiske processer til dannelse af acetater, butyrater eller propionater, kollektivt kendt som flygtige fedtsyrer (FFS),

En mere detaljeret diskussion er angivet af Leng i "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et al., udgivet af Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, side 408-410).

Den relative effektivitet af FFS-udnyttelsen er behandlet' af McCullough i "Feedstuffs", 19. juni 1971, side 19, af Eskeland et al. i "J. An. Sci. 33", 282 (1971), og af Church et al. i "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", bind 2, 1971, side 622 og 625. Selv om acetater og butyrater udnyttes, udnyttes propionater med større effektivitet. Når der er for lidt propionat tilgængeligt, kan dyrene endvidere udvikle ketosis. En gunstig forbindelse stimulerer derfor dyrene til at producere en større mængde propionater ud fra kulhydrater, hvorved kulhydratudnyttelseseffektiviteten forøges, og forekomsten af ketosis også reduceres.

Antibiotikum A-28086-faktorer A, B og D er hidtil ukendte medlemmer af en gruppe af polyetherantibiotika. Eksempler på medlemmer af denne gruppe indbefatter monensin (USA-patentskrift nr. 3.501.568), dianemycin [R.L. Hamill, M.M. Hoehn, G.E. Pittenger, J. Chamberlin og M. Gorman, J. Antibiotics 22, 161 (1969(], nigericin [L.K. Steinrauf, Mary Pinkerton og J.W. Chamberlin,

Biochem. Biophys. Res. Comm. 3.3, 29 (1968)] og salinomycin [japansk patentfremlæggelsesskrift nr. 47.25392, dateret 20. okt. 1972, ansøgning nr. 19620/1971, Derwent No. 76960T, USA-patentskrift nr. 3.857.948 og H. Kinashi, N. Otake, H. Yonehara, S. Sato og Y. Saito, Tetrahedron Lett. .49, 4955-4958 (1973).

Anvendt inden for fermenteringsteknikken og i den foreliggende beskrivelse refererer udtrykket "antibiotikum-kompleks" ikke til et kemisk kompleks, men til en blanding af sam-fremstillede individuelle antibiotikum-faktorer. Som det vil erkendes af dem, der er bekendte med antibiotikum-fremstilling ved fermentering, varierer forholdet mellem individuelle faktorer, der er fremstillet i et antibiotikum-kompleks, afhængigt af de anvendte fermenteringsbetingelser .

142061 11 A-28086-Antibiotikum-komplekset fremstilles ved dyrkning af den hidtil ukendte stamme af Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 under betingelser for submers aerob fermentering, indtil en væsentlig mængde antibiotikumaktivitet er frembragt. A-28086--Antibiotikum-komplekset kan også fremstilles ved dyrkning af en anden hidtil ukendt stamme af Streptomyces aureofaciens, NRRL 8092. Når det er fremstillet af enten S. aureofaciens NRRL 5758 eller af S. aureofaciens NRRL 8092, ekstraheres A-28086-antiblotikum--komplekset fra fermenteringsvæsken og fra myceliet med polære organiske opløsningsmidler. Den ekstraherede antibiotikumblanding fraskilles ved koncentrering af opløsningsmidlerne, tilsætning af koncentraterne til overskydende mængder petroleumether til udfældning af urenheder, filtrering og inddampning af filtraterne til opnåelse af A-28086-antibiotikum-blandingen. Antibiotikum-blandingen renses yderligere og adskilles i individuelle faktorer ved søjlechromatografi.

A-28086-Forbindelserne inhiberer væksten af organismer, der patogene for dyre- og planteliv. I ét aspekt af denne inhi-beringsaktivitet er A-28086-forbindelserne anticoccidie-midler. Endvidere er A-28086-forbindelserne antlbacterielle, antivirale, anti-PPAO (pleuropneumonia-agtige organismer), insecticide og acaricide midler, og de forøger foderudnyttelseseffektiviteten hos drøvtyggere.

Nedenstående infrarøde absorptionsspektre i chloroform er angivet på tegningen:

Pig. 1 - antibiotikum A-28086-faktor A, fig. 2 - antibiotikum A-28086-faktor B, fig. 3 - antibiotikum A-28086-faktor A-acetylester- derivat, fig. 4 - antibiotikum A-28086-faktor A-propionylester- derivat, fig. 5 - antibiotikum A-28086-faktor A-butyrylester- derivat, fig. 6 - antibiotikum A-28086-faktor A-valerylester- derivat, fig. 7 - antibiotikum A-28086-faktor A-caproylester- derivat, og fig. 8 - antibiotikum A-28086-faktor D.

12 U20S1 A-28086-Faktorerne er strukturelt beslægtede med hinanden. Mindst fire antibiotikum-faktorer fremstilles samtidigt under fermenteringen og opnås som en blanding. Faktorerne adskilles fra hinanden, og faktor A, B og D isoleres som individuelle forbindelser som beskrevet nedenfor. Blandingen af A-28086-faktorer er opløselig i de fleste organiske opløsningsmidler, men uopløselig i vand.

Et andet stof, der er vilkårligt betegnet som A-28086-I, fremstilles samtidigt med antibiotikum A-28086-komplekset. Selv om A-28086-I ikke er mikrobiologisk aktivt, er det strukturelt beslægtet med A-28086-antibiotikum-faktorerne. A-28086-I er en hvid krystallinsk forbindelse (fra en blanding af acetone og vand) og har et smeltepunkt på ca. 160-162°C. Sammenlignende studier af NMR-spek-trene og andre egenskaber af Α-28Ό86-Ι og syntetisk fremstillet A-28086-faktor A-methylester giver bevis på, at A-28086-I er methyl-esteren af A-28086-faktor A eller en nært beslægtet forbindelse, såsom en stereoisomer.

Selv om A-28086-1 i begyndelsen udfældes samtidigt med de aktive A-28086-antibiotikum-faktorer, skilles det let fra dem ved silicagelchromatografi. A-28086-1 har en omtrentlig R^-værdi på 0,53 på silicageltyndtlagschromatografi med ethylacetat som elue-ringsopløsningsmidlet og under anvendelse af et vanillinsprøjte-reagens (3% vanillin i.methanol + 0,5 ml kone. pr. 100 ml op løsning) til påvisning. Efter sprøjtning med vanillin og opvarmning giver A-28086-I en blå plet, medens A-28086-antibiotikum-fak-torerne giver klare lyserøde pletter, der hurtigt bliver mørkebrun-ligblå.

Antibiotikum A-28086-faktorer A, B og D og de specificerede acylesterderivater af faktorer A og D er i stand til at danne salte. "Fysiologisk acceptable" salte er salte, der også er farmaceutisk acceptable, dvs. salte, hvor forbindelsens toksicitet som helhed mod varmblodede dyr ikke forøges i forhold til ikke-salt- 13 142061 formen. Repræsentative og egnede alkalimetal- og jordalkalimetal-salte af A-28086-faktorer A og B indbefatter natrium-, kalium-, lithium-, cæsium-, rubidium-, barium-, calcium- og magnesiumsalte. Egnede aminsalte af A-28086-faktorer A og B indbefatter ammonium- 1 saltene og de primære, sekundære og tertiære C^_4-alkylammonium-og hydroxy-G^-alkylammoniumsalte. Illustrative aminsalte indbefatter sådanne, der dannes ved omsætning af A-28086-faktorer A og B med ammoniumhydroxid, methylamin, sek.butylamin, isopropylamin, diethylamin, diisopropylamin, ethanolamin, triethylamin, 3-amino--1-propanol o.lign.

De kationiske alkalimetal- og jordalkalimetalsalte af A-28086-faktorer A, B og D og af faktor A- og D-acylesterderiva-terne fremstilles ifølge fremgangsmåder, der anvendes gængs til fremstilling af kationiske salte. Den frie syreform af antibiotikum--faktoren eller esterderivatet deraf opløses f.eks. i et egnet opløsningsmiddel, såsom varm methanol eller éthanol, og en opløsning indeholdende den støkiometriske mængde af den ønskede uorganiske base i vandig methanol sættes til denrte opløsning. Det på denne måde dannede salt kan isoleres ved rutihemetoder, f.eks. filtrering eller afdampning af opløsningsmidlet.

De salte, der dannes med organiske aminer, kan fremstilles på lignende måde. For eksempel kan den gasformige eller flydende amin sættes til en opløsning af antibiotikum-faktoren i en egnet opløsning, såsom acetone, og opløsningsmidlet og overskud af amin kan fjernes ved afdampning.

Det er velkendt inden for vetefinærfarmacien, at formen ' på et antibiotikum ikke er væsentlig, når et dyr behandles med antibiotiket. I de fleste tilfælde aeridrer betingelser inde i dyret lægemidlet til andre former end den form, i hvilket det blev indgivet. Den saltform, i hvilket det kan indgives, er derfor uden betydning for behandlingsmetoden. Saltformen kan imidlertid vælges af økonomiske grunde, bekvemmeligheds- og toksicltetsgrunde.

A-28086-Faktor A danner acylesterderivater. Estefifice-ringen sker ved en af hydroxylgrupperne i A-28086-faktor A efter behandling med et C2_g-syreanhydrid eller -syrechlorid. Sådanne estere fremstilles typisk ved omsætning af A-28086-faktor A med f.eks. det tilsvarende syreanhydrid ved stuetemperatur. Disse ester-derivater er også anvendelige som antibiotika og scan midler, der forøger foderudnyttelseseffektiviteten.

« 142061 14

Nedenstående afsnit beskriver disse A-28086-faktor A--acylesterderivaters karakteristika.

A-28086-Faktor A-acetylesterderivatet er en hvid krystallinsk forbindelse (fra en blanding af acetone og vand) med et smeltepunkt på ca. 100-103°C. A-28086-Faktor A-acetylesterderivatet har en empirisk formel C45H74°x2 °9 en molekylvægt på ca. 807, baseret på den empiriske formel, der er foreslået for A-28086-faktor A.

En grundstofanalyse af faktor A-acetylesterderivatet giver nedenstående procentsammensætning:

Beregnet for C45H74012: C = 66,97%, H = 9,24%, O = 23,79%.

Fundet; C = 67,67%, H = 8,71%, O = 23,13%.

Det infrarøde spektrum af A-28086-faktor A-acetylesterderivatet i chloroform er vist i fig. 3 på tegningen. Nedenstående absorptionsmaksima iagttages: 2,85, 3,36, 3,38 (stærkt), 5,80, 6,83, 7,25, 7,52 (stærkt), 7,60 (svagt), 7,80 (stærkt), 8,45 (stærkt), 8,80 (stærkt), 8,95 (stærkt), 9,10 (stærkt), 9,20, 9,63, 9,80 (stærkt), 10,12 (svagt), 10,25 (svagt) og 10,50 μ.

Det ultraviolette spektrum af A-28086-faktor A-acetyl-ester i ethanol viser kun slutabsorption.

Elektrometrisk titrering af A-28086-faktor A-acetylesterderivatet i 80%'s vandigt dimethylformamid indikerer tilstedeværelsen af en titrerbar gruppe med en pK -værdi på 8,5.

A-28086-Faktor A-propionylesterderivatet er en hvid krystallinsk forbindelse (fra en blanding af acetone og vand) med et smeltepunkt på ca. 96-98°C. A-28086-Faktor A-propionylesterderi-vatet har en empirisk formel C4gH76°l2 en molekylvægt på ca.

821, baseret på den empiriske formel, der er foreslået for A-28086--faktor A. Grundstofanalyse af faktor A-propionylesterderivatet giver nedenstående procentsammensætning;

Beregnet for C^gHygO·^: ^ = 67,29%, H = 9,33%, O = 23,38%.

Fundet: C = 66,06%, H = 9,17%, 0 = 23,41%.

Det infrarøde spektrum af A-28086-faktor A-propionylester-derivatet i chloroform er vist i fig. 4 på tegningen. Nedenstående absorptionsmaksima iagttages: 2,85, 3,33, 3,38 (stærkt), 3,45 (stærkt), 5,75 (stærkt), 5,82, 6,81, 7,22, 7,30 (stærkt), 7,50 (svagt), 7,60 (svagt), 7,80, 8,43, 8,75 (stærkt), 8,90, 9,05, 9,15 (stærkt), 9,50 (stærkt), 9,63, 9,83 (svagt), 10,05 (stærkt), 10,13, 10,20 (stærkt), 10,45 og 10,68 μ.

142061 15

Det ultraviolette spektrum af A-28086-faktor A-propionyl-esterderivatet i ethanol viser kun slutabsorption.

Antibiotikum A-28086-faktor A-butyrylesterderivatet er en hvid krystallinsk forbindelse (fra en blanding af acetone og vand) med et smeltepunkt på ca. 96-98°C. A-28086-Faktor A-butyrylester-derivatet har en empirisk formel c47Hyg012, en molekylvægt på ca.

835 og en omtrentlig sammensætning på C = 67,60%, H = 9,41% og O = 22,99%, hidrørende fra den empiriske formel, der er foreslået for A-28086-faktoren A.

Det infrarøde spektrum af A-28086-faktor A-butyrylesterderivatet i chloroform er vist i fig. 5 på tegningen. Nedenstående absorptionsmaksima iagttages: 2,89, 3,40, 3,45, 3,51, 5,85, 5,92 (stærkt), 5,97 (stærkt), 6,90, 7,30, 7,84 (svagt), 8,55, 8,85 (svagt), 9,01 (stærkt), 9,26, 9,76, 9,95, 10,31 og 10,64 μ.

Antibiotikum A-28086-faktor A-valerylesterderivatet er en hvid krystallinsk forbindelse (fra en blanding af acetone og vand) med et smeltepunkt på ca. 173-175°C. A-28086-Faktor A-valerylesterderivatet har en empirisk formel c48h8q°12' en på ca.

849 og en omtrentlig sammensætning på C = 67,89%, Η « 9,50% og 0 = 22,61%, hidrørende fra den empiriske formel, der er foreslået for A-28086-faktor A.

Det infrarøde spektrum af A-28086-faktor A-valerylesterderivatet i chloroform er vist i fig. 6 på tegningen. Nedenstående absorptionsmaksima iagttages: 2,90, 3,40, 3,45, 3,51, 5,87, 5,92 (stærkt), 5,99 (stærkt), 6,91, 7,30, 7,69 (svagt), 7,87 (svagt), 8.16, 8,58, 8,85 (svagt), 9,26, 9,76, 10,00 (svagt), 10,31 og 10,64"'μ.

Antibiotikum A-28086-faktor A-caproylesterderivatet er en hvid krystallinsk forbindelse (fra en blanding af acetone og vand) med et smeltepunkt på ca. 163-167°C. A-28086-faktor A-caproylester-derivatet har en empirl.k for»el på en molekylet på ca. 863 og en omtrentlig sammensætning på C 68,18%, Η * 9,58% og 0 - 22,24% hidrørende fra den empiriske formel, der er foreslået for A-28086-faktor A.

Det infrarøde spektrum af A-28086-faktor A-caproylester-derivatet i chloroform er vist i fig. 7 på tegningen. Nedenstående absorptionsmaksima iagttages: 2,90, 3,40, 3,45, 3,51, 5,87, 5,92 (stærkt), 5,97 (stærkt), 6,90, 7,30, 7,66 (svagt), 7,84 (svagt), 8.16, 8,58, 8,85 (svagt), 9,05 (stærkt), 9,17, 9,72, 9,95, 10,29 og 10,62 μ.

142061 16

Acylering af A-28086-faktor A resulterer i nedenstående ændringer i det ^H-kernemagnetiske resonansspektrum: den carbinyl-resonans, der forekommer ved ca. 4 ppm, forskydes nedad til ca.

5,3 ppm (den nøjagtige position varierer lidt i de forskellige acyl-derivater), og vinylprotonsignalerne forskydes også. Den er karakteristisk for den ændring, der i den partielle struktur er repræsenteret ved: ϊ Ύϊ

"V\ « V\- H

4 r* RC0X 4 _ “v" 'Vs hvor R betyder C.^-alkyl. Denne partielle struktur er i fuld overil3 13

ensstemmelse med H-homonukleære afkoblingseksperimenter og C

kernemagnetisk bevis fra acetyl- og propionylesterderivaterne.

C2_g-Acylesterderivaterne af A-28086-faktor A er opløselige i en mangfoldighed af organiske opløsningsmidler, såsom methanol, ethanol, dimethylformamid, dimethylsulfoxid, ethylacetat, chloroform, acetone og benzen, men er kun svagt opløselige i ikke--polære organiske opløsningsmidler, såsom hexan, og er uopløselige i vand.

Hvert af C2_g-acylesterderivaterne af A-28086 har en syrefunktion, der er i stand til at danne salte og esterderivater.

Een af de hidtil ukendte organismer, der er nyttige til fremstillingen af A-28086-antibiotika, er isoleret fra en jordprøve, der er indsamlet på Ararat-bjerget i Tyrkiet. Denne organisme klassificeres som en stamme af Streptomyces aureofaciens Duggar som beskrevet af E.B. Shirling og D. Gottlieb i "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces. III. Additional Species Descriptions from First and Second Studies," Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 18, 279-392 (1968). Denne klassificering er baseret på 142061 17 metoder, der er anbefalet til The International Streptomyces Project [E.B. Shirling og D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces species," Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 16, 313-340 (1966)] sammen med visse supplerende forsøg. Farvenavne fastsættes i overensstemmelse med ISCC-NBS-metoden (K.L. Kelly og D.B. Judd, "The ISCC-NBS Method of Designating Color and a Dictionary of Color Names," U.S. Dept, of Commerce, Circ. 553, 1955, Washington, D.C.). Tallene i parenteserne refererer til Tresner og Backus-farveserierne [H.D. Tresner og S.J. Backus, "System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy," Appl. Microbiol. 11, 335-338 (1963)], tabelbetegnelserne er understreget. Maerz og Paul--farveblokkene (A. Maerz og M.R. Paul, "Dictionary of Color," McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, N.Y., 1950) er omsluttet af kantede parenteser. Kulturerne dyrkes ved 30°C i 14 dage, medmindre andet er angivet.

KARAKTERISERING AF A-28086-PRODUCERENDE STAMME NRRL 5758

Morfologi

Sporedannende lufthyfer består af kroge, nåleøjer og åbne spiraler. Der iagttages også morfologi, der er repræsentativ for rectus flexibilis-typen. Sporerne er korte og cylindriske og i kæder på 10-50 sporer. Sporerne måler 1,3 x 1,75 μ med et udbredelsesområde på 1,3-1,95 x 1,3 μ. Iagttaget ved elektronmikroskopi er sporeoverfladen glat.

Kulturkarakteristika af NRRL 5758 på forskellige medier

Medium_ Karakteristika_ ISP 02 (gærekstrakt- Vækst - rigelig, bagsiden moderat gul [11K3], -maltekstrakt) rimeligt til godt luftmycelium og sporedan nelse, hvid (W) 13 ba og mørkegrå (Gy) 3 ih, intet opløseligt pigment.

ISP 03 (havremel) Vaskst - god, bagsiden gråliggul [11B2], rimeligt luftmycelium (Gy) mørkegrå 3 ih, svagt brunt opløseligt pigment.

ISP 04 (uorganiske Vækst - rigelig, bagsiden lysegulbrun [12E5], salte-stivelsesagar) luftmycelium og spore (W) let blfiligrød-hvld 13 ba til (Gy) lysegrå d, intet opløseligt pigment.

18 142061

Medium_'_ Karakteristika_ ISP (35 (glycerolaspara- Vækst - god, bagsiden lysegul-grøn [ΙΟΒΙ] , ginagar) godt luftmycelium og sporer (Gy) gulliggrå 2 dc til lys grålig-rødlig-brun 5 fe, intet opløseligt pigment.

Tomatpasta-havremel- Vækst - rigelig, bagsiden lys gulligbrun -agar [13H7], rimeligt til godt luftmycelium og sporer (W) hvid a til (Gy) mediumgrå g, meget svagt brunt opløseligt pigment.

Glycerol-glycinagar Vækst - rigelig, bagsiden mørk gråliggul

[1216], godt luftmycelium og sporer (Y) lysegul 2 db, intet opløseligt pigment.

Glucose-asparaginagar Vækst - rigelig, bagsiden grålig-grønliggul [12E2], rigeligt luftmycelium og sporer (Gy) gulliggrå 2 dc, meget svagt brunt opløseligt pigment.

Næringsagar Vækst - god, bagsiden gråliggul [12B2], luft mycelium og sporer, ingen farvebestemmelser på grund af ringe vækst, intet opløseligt pigment.

Bennett’s agar Vækst - rigelig, bagsiden gråliggul [12K3], sparsomt luftmycelium og sporer (Gy) gulliggrå 2 dc, intet opløseligt pigment.

Calciummalatagar Vækst - god, bagsiden gråligbrun [15C8], in tet luftmycelium eller sporedannelse, brunt opløseligt pigment. Området ved inoculet er klaret.

Czapek’s opløsnings- Vækst - ringe, ingen farvebestemmelse på agar grund af ringe vækst.

Emerson's agar Vækst - rigelig, bagsiden gråliggul [11J5], intet luftmycelium eller sporer, intet opløseligt pigment.

Tyrosinagar Vækst - rigelig, bagsiden lys olivenbrun [14C4], rigeligt luftmycelium og sporer fra (W) b (centrum) til (Gy) lysbrunlig-grå 3 fe (margin), meget svagt brunt opløseligt pigment.

Trypton-gæragar Vækst - sparsom, ingen farvebestemmelse.

NRRL 5758-Organismen studeres for udvalgte fysiologiske egen skaber i overensstemmelse med standardfremgangsmåder. De iagttagne egenskaber og de fundne karakteristika er som følger: 19 142061

Iagttaget egenskab_ Karakteristik_

Virkning på mælk Mælk peptoniseret, hvid vækst ring, klaret område gyldenbrun- ' gul - pH-reaktion 5,7.

Nitratreduktion ’ Positiv.

Næringsgelatine 30% flydendegørelse på 14 dage.

Melaminpigmentproduktion på: , ;

Tyrosin-agar-skråkulturer Meget svagt positive (pigment efter 4 dage).

Difco-pepton-gærekstrakt- Negativ, jernagar-skråkulturer

Trypton-gærekstrakt-bouillon Negativ.

Temperaturkrav (ISP medium β2- 20-30°C - god vækst/ 30-37°C - for- -gærekstrakt-maltekstrakt-skrå- trinlig vækst og sporedannelse, kulturer. 45°C - ringe vegetativ vækst, rødligt opløseligt pigment. · ,

Resultaterne af carbonudnyttelsesforsøg, der er udført med organismen NRRL 5758, er angivet nedenfor; De symboler, der anvendes til at indikere vækstreaktion, er: - + god vækst, positiv udnyttelse (+) ringe til rimelig vækst · ' I · ;.i (-) svag vækst, sandsynligvis ingen udnyttelse ingen vækst, ingen udnyttelse.

Carbonkllde Reaktion D-glucose + L-arabinose + D-xylose + D-fructose + saccharose D-mannitol i-inositol + rhamnose + raffinose -C-kontrol (intet kulhydrat) - 20 U2061

En anden hidtil ukendt A-28086-producerende organisme afledes fra S. aureofaciens NRRL· 5758 ved en række naturlige udvælgelser, efterfulgt af kemisk mutation. Denne organisme, der identificeres som NRRL· 8092, klassificeres også som en stamme af Strep-tomyces aureofaciens Duggar. Denne klassificering er baseret på studier af organisme NRRL· 8Q92 under anvendelse af de ovenfor beskrevne Streptomyces-klassificeringsmetoder og samme vækstbetingelser. De karakteristika for organisme NRRL· 8092, der iagttages ved disse studier, opsummeres i nedenstående afsnit.

KARAKTERISERING AF A-2 8 08 6-PRODUCERENDE STAMME

NRRL 8092

Morfologi På medium ISP β7 (tyrosinagar) producerer kulturen lejlighedsvise kroge, men producerer som hovedbestanddel korte, lige sporoforer. Sporekæder er mindre end 10 sporer pr, kæde, sædvanligvis 4-7 sporer pr. kæde. Kortkædede sporekæder iagttages i nedenstående medier: ISP (53, Czapek's opløsningsagar og ISP β5.

Der iagttages rigelige coremia på Emerson's agar. Der foretages elektronmikroskopiagttagelser på tyrosinagar (ISP β7) og glucose--asparaginagar. Sporerne er glatte og ligger i størrelsesområdet fra 1,2 til 2,0 μ i længde og ca. 1,0 μ i diameter. Gennemsnitssporestørrelsen er 1,6 μ x 1,0 μ.

Kulturkarakteristika af NRRL· 8092 på forskellige medier

Medium_i__ Karakteristika _ ISP β2 (gærekstrakt- Vækst - rimelig, bagsiden lys gulbrun [12H8], -maltekstrakt) rimeligt luftmycelium, ringe sporedannelse, luftdel bleggrå [11A1], intet opløseligt pigment .

ISP β3 (havremel) Vækst - spredt, bagsiden glasklar, intet luftmycelium, intet opløseligt pigment.

ISP β4 (uorganiske Vækst - moderat, bagsiden gråliggul [11B2], salte-stivelsesagar) sparsomt luftmycelium og sporedannelse, luftdel bleggulgrå [10A1], intet opløseligt pigment.

ISP β5 (glycerolaspara- Vækst - moderat, bagsiden bleggul [10F2], ginagar) rimeligt luftmycelium, sparsom sporedannelse, luftdel hvid [10A1], intet opløseligt pigment.

21 142061

Medium_ Karakteristika__

Tomatpasta-havremel- Vaskst - moderat, bagsiden grålig-grøngul, agar luftmycelium - rimeligt, moderat spore dannelse, lysbleggrå [53A2], intet opløseligt pigment.

Glycerol-glycinagar Vaskst - rigelig, bagsiden gråliggul [11E4] , moderat luftmycelium, hvidt [10A1], ingen sporedannelse, intet opløseligt pigment.

Glucose-asparaginagar Vækst - moderat, bagsiden bleggul [10F2], moderat luftmycelium og sporedannelse, hvid [lOAl], intet opløseligt pigment.

Næringsagar Vækst - spredt, bagsiden bleggul [10B2], intet luftmycelium, intet opløseligt pigment.

Bennett's agar Vækst - rimelig, bagsiden mediumgul-pink [11A7], meget sparsomt luftmycelium, ingen sporedannelse, intet opløseligt pigment.

Calciummalatagar Vækst - meget sparsom, glasklar, intet luft mycelium, intet opløseligt pigment.

Czapek's opløsnings- Vækst - meget sparsom, bagsiden glasklar, agar intet luftmycelium, intet opløseligt pig ment.

Emerson's agar Vækst - moderat, bagsidan gråliggul {1115], pletvis luftmycelium, ingen sporedannelse, intet opløseligt pigment.

Tyrosinagar Vækst - moderat, bagsiden lys gulbrun [12H6], moderat luftmycelium, lys bleggrå margin I53A2], center næsten hvidt, og moderat sporedannelse, intet opløseligt pigment.

Trypton-gæragar Vækst - meget sparse®, glasklar, intet luftmycelium, intet opløseligt pigment. '"

Organisme NRRL 8092 studeres også for udvalgte fysiologiske egenskaber i overensstemmelse med standardmetoder. De iagttagne egenskaber og de fundne karakteristika er sena følger;

Iagttaget egenskab Karakteristik _' _

Virkning på mælk Peptonieeret (90%), bleggul vækstring, klaret område bleggult - pH-reaktion 4,6.

Nitratreduktion Positiv.

Næringsgelatine 50% hydrolyseret på 14 dage.

_·.'· ,.;4t · !· 22 142061

Iagttaget egenskab Karakteristik_______

Melaninpigmentproduktion på:

Tyrosin-agar-skråkulturer Meget svagt positiv.

Trypton-gærekstrakt-bouillon Negativ

Gulerodsprop Rigelig vækst, bleggul, intet luftmycelium, ingen ændring i pladen.

Kartoffelprop Rigelig vækst, grålighvid, intet luftmycelium, ingen ændring i pladen.

Temperaturkrav (ISP medium 02- 25°C - rigelig vækst, rimeligt -gærekstrakt-maltekstrakt-skrå- luftmycelium, bagsiden lysebrun, kulturer intet opløseligt pigment.

30°C - rigelig vækst, rimeligt luftmycelium, bagsiden lysebrun, intet opløseligt pigment.

37°C - rigelig vækst, rimeligt luftmycelium, bagsiden brun, opløseligt pigment brunt.

40°C - rigelig vækst, spredt luftmycelium, bagsiden rødbrun, opløseligt pigment dybrødbrunt.

45°C - rimelig vækst, intet luftmycelium, bagsiden rødbrun, moderat rødbrunt pigment.

Resultaterne af carbonudnyttelsesforsøg, der er udført med organisme NRRL 8092, er angivet nedenfor. De symboler, der anvendes til indikering af vækstreaktion, er: + god vækst, positiv udnyttelse (+) ringe til rimelig vækst (-) svag vækst, sandsynligvis ingen udnyttelse ingen vækst, ingen udnyttelse.

- 23 142061

Carbonkilde Reaktion D-glucose + L-arabinose + D-xylose + D-fructose + saccharose - D-mannitol i-inositol + rhamnose + raffinose - -C-kontrol (intet kulhydrat) -

Visse karakteristika yed de A-28086-producerende S. aureofaciens-stammer er forskellige fra den af Shirling og Gottlieb beskrevne organismes karakteristika. bisse forskelle er opsummeret i tabel III:

Tabel III

Carbonudnyttelse NRRL 5758 NRRIi 8092 Offentliggjort beskrivelse saccharose - - + i-inositol + + - rhamnose + + - gelatine-flyden- 30% p& 50% på begrænset eller ingen degørélse 14 dage 14 dage virkning på mælk mælk pep- mælk pep- begrænset og variabel toniseret, toniseret, peptonisering (ofte ingen), hvid vækst- bleggul begrænset vækst og koagu- ring vækstring lering

De karakteristika af organisme NRRL 5758, der er forskellige fra organisme NRRL 8092's karakteristika, er opsummeret i tabel IV.

1 £20 G 1 24 01

Tf i I 0) tn h xl tn Q)

•β tn β rH

X -ri -H X! ω ι-i β -r—i tti tn

Id Φ rH -H

ή λ: -β old Ή

Pi Ti β β φ 0) Η Η g tn β β tn Μ ·β φ tn (U μ φ β « η η ο β Φ X! 44 β β ο .η β τι

ιβ β X β «L

•Η Ο Ti β +) α· - φ φ 03 +J β 03 4-> β Τί Ο >1 <υ α> ω ο) φ α. >-ι in > ·β tn tn β 03 ο\ β 'd -η Ο ø( _ c Ο Id φ Η β 03 £ Φ ο ¢3 g X Ο'Λ Ά Q) φ +> 03 β ·β β| £ φ 44 φ 01 βίι 01 ρίΦίη βοι 44 id η tn Ρί β -β ο -β RJ α: β <ΰ

_3 υ Η. « > >totncQ

i tn β β Φ ·β £ β tn Ο Φ id -Η β χ γΗ -β 03 χ 44 £> old -Η β Η β Pi β Ti Η φ id φ β ·β β tn £ •‘•id ft)' Tf φ β β φβ ο φ β ο Φ > οι tn id 6 Ο β ·Η β Η ρη 44 tJ β Φ η Φ ο tn Φ β β -η tn βΟΕ X! β-βΗ -Η Ο 03 Ιΰ β β 0|β φ - Ti Τ3 tn Η 01 φ 03 ίβ Φ -Η tn Η Η Ε β "β β t5* Φ X id φ φ β οί Η - οι β β > Φ Øj I X! 00 Ti ·Η > ·β £ 01 Τ3 in id tu id -β ·β ©. β Γ~ 03 XI 03 β-ββΦ in oid ·· ι ιΰ tn Ti 04 Φ id Φ 4-1 β ·β ·β J Η 4-1 4-1 03 Φ β 01 g β tn οι β 44 τ) «ο tn

Pi β Oidid ta ο >—ι id - at U 20iO3 > £ X! ffl Φ 44 - β β id id -β 03 tn id id φ Η Φ > id 44 Φ 03 χί, Φ I 03 01 - β Id 03 g ·β β 44 44 44 i—t β β Φ -β οι Φ -β id > Φ •β > β -ο tn-β β β -β β Old r-l β 44 β Φ -β id 04(ΰθοΐΦ +1 id τ! UDI ffl 4*144 φ 44

Id Φ β 03 β tn Ο -¾ id Φ øj « χ > ω > 25 U206 1

De Streptomyces aureofaciens-kulturer, der er nyttige til fremstilling af A-28086-antibiotika, er blevet deponeret og gjort til en del af den kulturkollektion, der er på lager i The Northern Marketing and Nutrition Research Division, U.S. Dept. qf Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604, hvorfra de er tilgængelige for offentligheden under numrene NRRL 5758 og NRRL 8092.

Det kulturmedium, der anvendes til dyrkning af Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 eller Streptomyces aureofaciens NRRL 8092, kan være et hvilket som helst af en række medier. Til opnåelse af økonomisk produktion, optimalt udbytte og let produktisolering foretrækkes imidlertid visse kulturmedier. Således er foretrukne kulhydratkilder ved fermentering i stor målestok f.eks. tapioka-dextrin og saccharose, selv om glucose, majsstivelse, fructose, mannose, maltose, lactose o.lign. også kan anvendes. Majsolie, jordnødolie, sojabønneolie og fiskeolie er andre anvendelige carbon- ,.jd kilder. En foretrukket nitrogenkilde er enzymhydrqlyseret casein, selv om peptoner, sojabønnemel, bomuldsfrørael, aminosyrer, såsom glutaminsyre, o.lign. også er anvendelige. Blandt de nærende uorgar. niske salte, der kan inkorporeres i kulturmedierne, er de gængse opløselige salte, der er i stand til at give natrium-, magnesium-, calcium-, ammonium-, chlorid-, carbonat-, sulfat-, nitrat- og x lignende ioner.

Essentielle sporelementer, der er nødvendige for organismens vækst og udvikling, bør også indbefattes i kulturmediet. Sådanne sporelementer forekommer almindeligvis som urenheder i andre bestanddele af mediet i mængder, der er tilstrækkeligt til at opfylde organismens vækstkrav.

Det kan være nødvendigt at sætte små mængder (dvs. 0,2 ml pr. liter) af et antiskummiddel, såsom polypropylenglycol, til medier til fermentering i stor målestok, hvis opskumning bliver et problem.

Selv om det ikke er essentielt, forbedres antibiotikumproduktionen af de A-23086-producerende Streptomyces aureofaciens- ·. -stammer ved tilsætningen af en ringe mængde olie, såsom sojabønneolie.

Til fremstilling af væsentlige mængder af de ønskede A-28086-antibiotika foretrækkes submers aerob dyrkning i tanke.

Små mængder af disse A-28086-antibiotika kan opnås ved hjælp af 26 142061 en rystekolbekultur. På grund af den tidsforsinkelse i antibiotikumproduktionen, der almindeligvis er forbundet med inoculering af store beholdere med sporeformen af organismen, foretrækkes anvendelse af et vegetativt inoculum. Det vegetative inoculum er fremstillet ved inoculering af en ringe mængde kulturmedium med sporeformen eller myceliefragmenter af organismen til opnåelse af en frisk, aktivt voksende kultur af organismen. Det vegetative inoculum overføres derpå til en større tank. Det medium/ der anvendes til dyrkningen af den vegetative inoculum, kan være det samme, som anvendes til større fermenteringer, men andre medier kan også anvendes .

De A-28086-producerende organismer kan dyrkes ved temperaturer på mellem ca. 20 og 40°C, En optimal A-28086-produktion synes at forekomme ved temperaturer på ca. 27-30°C.

Som det er gængs ved aerobe submerse kulturprocesser, blæses steril luft gennem kulturmediet. Til effektiv vækst af organismen ligger det luftvolumen, der anvendes ved tankproduktionen, fortrinsvis på over 0,1 volumen luft pr. volumen kulturmedium pr. minut. Til opnåelse af effektiv produktion af de ønskede A-28086--antibiotika er det luftvolumen, der anvendes ved tankproduktionen, fortrinsvis på over 0,25 volumen luft pr. volumen kulturmedium pr. minut. Højere mængder opløst oxygen sænker ikke antibiotikumproduktionen.

Produktionen af antibiotika kan følges under fermenteringen ved afprøvning af prøver af fermenteringsvæsken eller af ekstrakter af myceliefaststofferne for antibiotikumaktivitet mod organismer, der .er kendte for at være følsomme over for disse antibiotika. En prøveorganisme, der er anvendelig til afprøvning af de her omhandlede antibiotika, er Bacillus subtilis ATCC 6633. Bio-prøven udføres bekvemt ved papirskive-prøve på agarplader.

Det uinoculerede kulturmediums begyndelses-pH-værdi varierer med det anvendte medium. Almindeligvis bør pH-værdien ligge i området fra 6,0 til 7,5. Den fremkomne pH-værdi ved fermenteringens afslutning er sædvanligvis lidt højere, i området fra 6,5 til 8,0.

Almindeligvis kan antibiotikumaktiviteten påvises på fermenteringens anden dag. Maksimal produktion af antibiotikumaktivitet forekommer sædvanligvis mellem ca, sjettedagen og tiendedagen.

Efter deres produktion under betingelser for submers aerob fermentering kan de ovenfor beskrevne A-28086-antibiotika 27 142061 udvindes fra fermenteringsmediet ved metoder, der anvendes gængs inden for fermenteringsteknikken. Den antibiotikum^ktivltet, der produceres under fermentering af en A-28086-produoerende organisme, forekommer i både myceliemassen og i den filtrerede fermenteringsvæske . Maksimal udvinding af disse A-28086-antlbiotika opnås derfor ved en kombination af metoder, herunder filtrering, ekstraktion og adsorptionschromatografi. Et foretrukket opløsningsmiddel til fra-skillelse af disse A-28086-antibiotika fra enten hel eller filtreret fermenteringsvæske er ethylacetat, selv om andre gængs anvendte opløsningsmidler er tilfredsstillende.

En særlig fordelagtig metode til fraskillelse af A-2SQ86--faktoreme A, B og D består i sænkning af pS-værdien af hele fermenteringsvæsken til en pH-værdi på ca. 3,6. Ved denne pB-værdi på 3,0 fraskilles A-28086-faktorerne A, B og D hensigtsmasssigt med myceliemassen ved filtrering. En anden fordelagtig metode til fraskillelse af A-28086-faktorerne involverer tilsætning af et biearbg-nat, såsom natriumbioarbonat, til hele væsken i mængder nå ca. 1 g/liter. Derved fraskilles A-28086-faktorerne bekvemt sammen med myceliemassen i saltform. Methanol er et foretrukket opløsningsmiddel til fraskillelse af de opnåede antibiotika fra myceliemassen, men andre lavere alkoholer og ketoner er også egnede.

Azeotrop destillering kan også anvendes med fordel vød udvindingen af de ønskede A-28086-antibiotika. Ved denne måde sættes et organisk opløsningsmiddel, der danner en hensigtsmæssig azeotrop med vand, til den vandige fermenteringsvasfce. Denne opløsninge-middel-væske-blaading underkastes azeotrop destillering til fjer-, nelse af mindst halvdelen af vandet fra væskén, hvorved der efterlades en vand-opløsningsmiddel-blanding, 1 hvilken de fremkomne A-28086-antibiotika foreligger i opløsning 1 det organiske opløsningsmiddel . Oopløselige biprodukter kan fraskilles ved hensigtsmæssige metoder, såsom filtrering eller centrifugering. De fremkomne A-28086-antlbiotlka kan dernæst udvindes fra den organiske opløsning ved velkendte metoder, såsom afdampning af opløsningsmiddel, udfældning ved tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel eller ekstraktion.

Organiske opløsningsmidler, der danner hensigtsmæssige azeotroper med vand til gennemførelse af en sådan udvindingsmetode, indbefatter illustrativt butylalkohol, amylalkohol, hexylalkohol, benzylalkohol, butylacetat, amylacetat, 1,2-dichlorethan, 3-pentanon, 28 142061 2-hexanon, benzen, cyclohexanon, toluen og xylenerne.

Der er en særlig fordel ved udvinding ved azeotrop destillering ved fermenteringsprocesser i stor målestok. Både vand og opløsningsmiddel, der tages ud via toppen i azeotropen, kan adskilles ved kendt teknik og derefter recirkuleres til yderligere anvendelse. Det vand, der fjernes på denne måde, er fri for forurenende bestanddele og kræver ikke en spildevandsbortfjernelsesproces. Det på denne måde fjernede opløsningsmiddel kan recirkuleres til processen.

yderligere rensning af de fremkomne A-28086-antibiotika indbefatter yderligere ekstraktions- og adsorptionsmetoder. Adsorptive materialer, såsom silicagel, carbon, "Florisil'® (magnesium-silicat, Floridin Co., P.O. Box 989, Tallahassee, Fla.) o.lign. kan anvendes med fordel.

Alternativt kan kulturfaststofferne, herunder mediumbe-standdele og mycelium, anvendes uden ekstraktion eller fraskillelse, men fortrinsvis efter fjernelse af vand, som en kilde til de fremkomne A-28086-antibiotika. Efter production af A-28086-antibiotikum-aktiviteten kan kulturmediet f.eks. tørres ved lyofilisering og blandes direkte i en føde-præblanding.

Ved en anden udførelsesform kan myceliet efter produktion af A-28086-aktivitet i kulturmediet fraskilles og tørres til frembringelse af et produkt, der kan anvendes direkte i en føde-præblanding. Når myceliet fraskilles til sådan anvendelse, medvirker tilsætningen af calciumcarbonat (ca. 10 g/liter) til filtrering og giver et forbedret tørret produkt.

Under de betingelser, der hidtil er blevet anvendt, producerer de ovenfor beskrevne Streptomyces aureofaciens-stammer, der betegnes NRRL 5758 og NRRL 8092, antibiotikum A-28086-faktor A som den overvejende faktor. Selv om mængden af faktorer varierer afhængigt af de anvendte fermenteringsbetingelser, tegner faktor A sig sædvanligvis for mere end 99% af den totale udvundne antibiotikumaktivitet fra NRRL 5758 og for ca. 90% af den totale udvundne antibiotikumaktivitet fra NRRL 8092, A-28086-Faktor B tegner sig for det meste af den resterende antibiotikumaktivitet fra NRRL 5758, og faktor D er en mindre væsentlig faktor. På den anden side tegner A-28086-faktor D sig for ca. 8-10% af den totale udvundne antibiotikumaktivitet fra NRRL 8092, og faktor B er en mindre væsentlig faktor.

29 142061

Antibiotikum A-28086-faktorer A, B og D adskilles fra hinanden og isoleres som individuelle forbindelser ved anvendelse af velkendte metoder, såsom søjlechromatografi, tyndtlagschromato-grafi o.lign. For eksempel anvendes søjlechromatografi over silica-gel til fraskillelse af faktorer A, B og D ved eluering af søjlen med varierende opløsningsmiddelblandinger, såsom benzen-ethylacetat. Ved anvendelse af benzen-ethylacetatopløsnlngsmiddelblandinger over en silicagelsøjle elueres faktor B først, og faktorerne A og D elueres senere. Som beskrevet ovenfor er tyndtlagschromatografi en bekvem metode til overvågning af elueringens fremskriden.

A-28086-forbindelserne inhiberer væksten af bakterier og svampe, der er patogene over for dyr og planteliv. De relative mikrobiologiske aktiviteter af A-28086-faktorer A og B er beskrevet 1 nedenstående tabel V.

Forsøgsmetoden er den konventionelle pladediffusionsmetode (6 mm skiver dyppes i opløsninger indeholdende 1 mg forbin-delse/ml opløsning, skiverne anbringes på agarplader, der er podet med forsøgsorganismen).

Tabel V

Inhlberlngszone (mm) A-28086- A-28086-

Forsøgsorganlsme -Faktor A -Faktor B

Staphylococcus aureus 19 21

Bacillus subtilis ATCC 6633 28 31

Sarcina lutea ATCC 9341 26 16

Mycobacterium avium ATCC 7992 12 12

Saccharomyces pastorianum ATCC 2366 17

Candida tropicalis 14 14

Fusarium moniliforme 12 Ikke afprøvet A-28086-forbindelserne inhiberer væksten af anaerobe bakterier. De minimuminhiberingskoncentrationer (MIK), ved hvilke A-28086-faktor A inhiberer forskellige anaerobe bakterier, bestemt ved standard-agarfortyndingsforsøg, er opsummeret i tabel VI. Slutpunkterne aflæses efter 24 timers inkubering.

30 142061

Tabel VI

Forsøgsorganisme MIK (γ/ml)

Actinomyces bovis <0,5

Clostridium inocuum <0,5

Clostridium perfringens <0,5

Clostridium ramosum 4,0

Clostridium septicum <0,5

Clostridium septicum bovine <0,5

Eubacterium aerofaciens 1,0

Peptococcus anaerobius <0,5

Peptostreptococcus intermedius 16,0

Propionibacterium aenes 44 16,0

Propionibacterium aenes 79 2,0

Bacteroides fragilis ssp. fragilis 8,0

Bacteroides fragilis ssp.

thetaiotaemieron 8,0

Bacteroides fragilis ssp. vulgatis nr. 1563 8,0

Bacteroides fragilis ssp. vulgatis 1211 2,0

Fusobacterium symbiosum <0,5

Fusobacterium necrophorum 8,0

Veillonella alcalescens 16,0 C2_g-Acylesterderivaterne af A-28086-faktor A har også bactericid og fungicid virkning. Ved én udførelsesform har disse derivater forøget grampositiv virkning. De relative grampositive virkninger af visse af disse derivater sammenlignes med aktiviteten af faktor A. Forbindelserne afprøves ved turbidometrisk prøve på et halvautomatiseret system ("Autoturb ®microbiological assay system, Elanco"), der er beskrevet af N.R. Kuzel og F.W, Kavanaugh i J. Pharmaceut. Sci. jSO (5), 764 og 767 (1971). Ved afprøvning af de fremkomne A-28086-antibiotika anvendes nedenstående forsøgsparametre: Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 i et næringsbouillonmedium (pH-værdi 7), der er inkuberet i 4 timer ved 37°C. Forsøgsprøver og standardprøverne opløses i en blanding af methanol og vand (10:90). Standarden, A-28086-faktor A, tilføres "Autoturb" ®-karrusellen i koncentrationer på 2, 3, 4 og 5 γ/liter. Forsøgsforbindelserne fortyndes, således at de indholder ca.

31 14206 1 3 eller 4 γ aktivitet pr. ml, når de tilføres karrusellen. De relative aktiviteter af forsøgsforbindelser sammenlignet med den relative aktivitet af standardprøven, er angivet nedenfor:

Relativ G+-

Forblndelse_ -aktivitet A-28086-Faktor A (standard) 1 A-28086-A-Acetylesterderivat 2,5 A-28086-A-Propionylesterderivat 7 A-28086-A-n-Bytyrylesterderivat 8 A- 28086-A-n-Valerylesterderivat 14 A-2 8 0 8 6-A-n-Caproyles te rderivat 2 0

Aktivitet mod Myooplasma er en anden nyttig aspekt af den antimikrobielle aktivitet af A-28086-forbindelserne. Mycoplasma--arter, der også er kendte som pleuropneumonia-agtige (ppao) organismer, er patogene over for mennesker og forskellige dyr. Der er et særligt behov for midler, der er aktive mod PPAO-organismer, inden for fjerkræindustrien. Minimuminhiberingskoncentrationerne (MIK) af antibiotikum A-28086-faktor A mod forskellige Mycaplasma--arter, bestemt ved in vitro-bouillon-fortyndingsstudier, er opsummeret 1 nedenstående tabel VII:

Tabel vil

Organisme MIK (γ/ml) M. galllsepticum 12,5 M. hyorhinis 12,5 M. synoviae 6,25 M. hypopneumoniae 6,25 M. hyosynoviae 6,25

Opløsninger indeholdende så lidt som 10 γ antibiotikum A-28086 pr. ml opløsning er nyttige til desinficering af overflader til beskyttelse af dyr mod forskellige Mycoplasma-arter.

A-28086-Forbindelserne er også antivirale midler. A-28086--Faktor A er aktiv mod type III poliovirus, vaccinia-virus, herpes--virus og Semliki Forest-virus, hvilket er påvist ved in vitro-plague-fortrængningsforsøg, der er de samme som det forsøg, der er be- 32 U2061 skrevet af Siminoff, Applied Microbiology [1], 66-72 (1961). A-28086-Faktor A er også aktiv mod Transmissible Gastro-enteritis--virus, Newcastle Disease-virus og Infectious Bovine Rhinotracheitis--virus, hvilket er påvist ved lignende vævskulturforsøg.

A-28086-forbindelserne kan derfor indgives oralt, topisk eller parenteralt til pattedyr til bekæmpelse af vira. Anvendelige doseringsmængder til forebyggelse eller behandling af virale sygdomme varierer fra ca. 1 til ca. 5 mg/kg af pattedyrets legemsvægt, afhængigt af viruset og af, hvorvidt lægemidlet skal anvendes profylaktisk eller terapeutisk.

Endvidere kan opløsninger indeholdende en A-28086-for-bindelse, fortrinsvis sammen med et overfladeaktivt middel, anvendes til dekontaminering af det in vitro-voksested, hvor sådanne vira som polio.eller herpes er til stede. Opløsninger indeholdende fra ca. 1 til ca. 1500 γ/ml af en A-28086-forbindelse er effektive til bekæmpelse af vira.

Den akutte toksicitet af antibiotikum A-28086-faktor A indgivet intraperitonæalt til mus og udtrykt som LD^q er 7,15 mg/kg.

A-28086-Forbindelserne er også insecticider og acaricider. A-28086-Forbindelserne er aktive mod insekter, såsom den mexikanske bønnefrøbille, mælkeukrudtsinsektet og stuefluen, og mod mider, såsom den toplettede edderkopmide, når de påføres i så små mængder som 500 ppm. Desuden er A-28086-forbindelserne aktive mod myggelarver, når de påføres i så små mængder som 1 ppm.

Anticoccidie-aktivitet er en vigtig egenskab hos A-28086--forbindelserne. Fodringsforsøg viser f.eks., at en A-28086-forbindelse, der er til stede i foderet til små kyllinger i så små mængder som 0,003%, forbedrer vægtforøgelser, og at den, når den er til stede i så små mængder som 0,005%, forebygger dødelighed og formindsker antallet af læsioner hos kyllinger, der er blevet angrebet af cocci-dia. Resultaterne af forsøg med faktor A med kyllinger, der er angrebet af forskellige Eimeria-arter er vist i tabel VIII - X.

33 142061 •Η +j c α O Η •Η Ο

jj li ο ιλ in ιι ο ο r«. ο II

Αίωοσισι ιι ο ο <ν β β Η r-Ι Η T3 Ο φ Η β ω «

<3Ρ 1—I

(0 Η Η -Ρ α) Di β Η +3 φ Η β .ρ -Ρ Ή m m ιη •Η ο cncnvo oo oo co nidft * * .*·*··*

Η 03 03 o ο ο ro ι ο o rs ro ro I

M es

Φ O) O

6 fi Ή •Η β 03 Η II Kl

OH

t) i < 03 Η β 03

Η 0 I H

Η -Ρ -P 0)

> ^JiJlijOCN'iOOO -"O' VO H -O

id ss in co m io o to οι σι æ n- o

H H > β H rH

Q) I O

Λ 14) dP m (ti 00

EH O

00 CN I

ri! i 03 X) £ Ό 03 3 101 ,β O O O 1/10 o o o o o o X Ό O ro Η ίΡ

•HH +3 dP H

0 •H Λ H +j β β id 03 Ο Η g

Id HH O O O O O O O O O O O

IdHHHHNM NMMN MOI

4-> -Ρ H

03 β !>i +> <i λ:1

*H

> •H .

+3 β β Μ 03 «

ri! 03 Η H

Ό IH I H

tn β 0 β O

β -Ρ 0 β 0 β 2 s * +j „ * -y a 03 β m β Η ϋ φ β 0 m Μ 03 β ο OJ+JO ηι Η flJI Λ ν Η ο © « « .

Ό Φ β Ο Ο Ο ΦΗ Ο Ο Ο Ο © Η Γ0β&**·*·βΗΦ « *> » η Η Η Φ ΗΦ-ΡΟΟΟΦΟΗ Ο ο ο ο ® ο η m -sa i 5ΰ i r> s 3 .

ιβ Η Η Η !Ζ Η a 34 142061 -Μ Φ β +ι Ο Μ I -Η >) tu +J ro νο ο oo ι ϋ ρ 44 oo oo 1 ^ I ml Ο 3 Ο ύΡ 13 r-i pa)'-φ τι <ό +J ω ° n ρ \ η m η <ν m ί* η m rCOl-P Η ο ro on rom I IlIrlH X - - - -- * ' n5 m P to νο'φνο ηγο oim -Η P P H ro μ P( H W ' Φ

g -H

•Η -P

H c fi

O H

a) h o to -P O.

η 44 m , . , i—ι ρ β ro i i mi il η Ό o mi i oo i ii

Q) d) H

x n ra to (8

Ρ o\° H

O

14 -P

tu 13 H 4-1 O Η β

g -Ρ H

-H o m m o rtj β d r- n to n ro nr- tom - -

p g β O Η H OH HH

o (U o

-P C H

X C w ρ o) « X m Oh

Η I

tO φ i—I CO 10

Q) O IH

X! oo -P Q) H5 n OG5 Η i g -& r~ n ro mm co n ,<j > ρ co co m corn oo to

O

g dp m

P

X i ri (1) Ό -P 13 0) Λ _ ,· o -SlÆJOOO o o O O S-j -ri 13 to 0 42 ·Η £

-r| CIP Η H

•P , CO) P t3

to P

ms £ id S £ g H -P β

-Ρ Η β m -H

a) 0) -P d) m n m m H

+) tJ <D o o o o o H

•rll3P0OO o o >- > -Η β) p - » I "I “I 44 -ri g 13 α o O 1 o I O I Φ

p o o -p S

44 to l-i to <ο sd g fB £

Pl-H > ®

(!) P P P G

g <u cu <u cd

(0 Η Η Η H

Η p Η Η H (0

β β 0 O O

pH Ρ P "P P m

to H -P -P -p -P

Ρ Ρ β Ρ β -PC Ό 0 > 0 go 0)0 0) M 44 Η 44 ^Χ g (Ud) !4 Ρ ho a) pa) pa) to β p i3 gtJ 43 13 ©.

0) a) a) a) to

p p p PP PPIP

a) η ο η a) h a) o ΟΡΟ PO PO ή η a) *h a) η a) -h 14 g 1-1 gH g H ^ β -rl β Η β Η β

HW Η Η Η Η Η H

35 U2G61 d

M O

<1) I H

d © -P o i ni 0 P λ: n i f" i •h d tn op Ό

fB

Η -P

1 -H

g α ih ø w n p O g r« tn σ> n CL) Q) 0) - - +j O C f-t η O n PUS ' ? $ d

•H

P d

O) O

g I -H

Η P © +> σι I σι I

w tu p x in i r- i d d

Hl O #t)

-H

© tn -P

d $ Ή d h d d S m η P g r- t~~ Ί1 cn ,Q d © ·> *» s *

E-ι d OH OH

d d O ©

g U

< tu p tn

o i H

X +» -P © M tji (Ji 'S1 tN H o) h td !& σι in σι h

© lp > P

Λ I O

ttJ ID OP IM

Eh oo 0

00 I

O) (Ufl 1 Ό © C s. jd o o o o >d tr es in .

g ή p 3 dP H © X > •Η Λ 4J © O Ό t) •h tn Λ d -P p h g d © -p s © &i d Η o in d

d © o o H H

d P o o h

h d ft - * H

d η -P o i o i > g tr x -P © fB © © tn > d -P « d H PI -H .£} > © •P © P P & x g © _ © d

< tn H U> H H

•Η H OH® CO o d P P in

tji -p d -P

P tn d - - d d d 000 XHHO © d X -H «.+) H ,* i © HH »pd-ps-rl i« -HH© d -P S © > -P © tn d p © d h d ·η 5 p d d §

© +Jfi© rlUHSJO II B

p d©p ©©dPo-Hp p © o-p© d d g λ d S © 0

0 © 0 © 0 LP

H d'H +) ····« H

lp W <P HWWHMtp ^ d · d * d

Η Μ Η Η Η H

36 142061

Til forebyggelse eller behandling af coccidiosis hos fjerkræ indgives en ikke-toksisk anticoccidie-mængde af en A-28086--forbindelse til fugle, fortrinsvis oralt på dagsbasis. A-28086-Forbindelsen kan tilføres på mange måder, men den tilføres mest hensigtsmæssigt med en fysiologisk acceptabel bærer, fortrinsvis det foder, der indtages af fuglene. Selv om en mangfoldighed af faktorer skal tages i betragtning ved bestemmelsen af en hensigtsmæssig koncentration af A-28086-forbindelsen, ligger indgiftsmængderne almindeligvis i området fra 0,003 til 0,04 vægtprocent af det ikke-præparerede foder, og fortrinsvis i området fra 0,005 til 0,02%.

Evnen til at forbedre foderudnyttelseseffektiviteten hos dyr er en anden vigtig egenskab ved A-28086-forbindelserne. A-28086--Forbindelser forbedrer f.eks. foderudnyttelseseffektiviteten hos drøvtyggere, der har en udviklet rumenfunktion.

Som diskuteret ovenfor forøges effektiviteten af kulhydratudnyttelsen hos drøvtyggere ved behandlinger, der stimulerer dyrets rumenflora til at producere propionatforbindelser fremfor acetateller butyratforbindelser. Effektiviteten af foderudnyttelsen kan overvåges ved iagttagelse af produktionen og koncentrationen af propionatforbindelser i ruminen under anvendelse af nedenstående metoder:

Rumenvæske opnås fra en stud med en kirurgisk anbragt røråbning i ruminen. Studen holdes på en ration med stort kerneindhold. En prøve af rumenvæske presses igennem 4 lag osteklæde, og filtratet opsamles. Det partikelformede materiale, der tilbageholdes af osteklædet, resuspenderes i tilstrækkelig fysiologisk puffer til at bringe det tilbage til dets oprindelige volumen af rumenvæsken, og denne suspension presses igennem igen. Den anvendte puffer har nedenstående sammensætning: 37 142061

Bestanddel g/llter

Na2HP04 0,316 KH2P04 0,152

NaHC03 2,260 KC1 0,375

NaCl 0,375

MgS04 0,112

CaCl2.2H20 0,050

FeS04.7H20 0,008

MnS04.H20 0,004

ZnS04.7H20 0,004

CuS04.5H20 0,002

CoC12.6H20 0,001 som beskrevet af Cheng et al. i J. Dairy Sci., 28, 1225-1230 (1955).

De to filtrater kombineres og får lov at henstå, indtil partikelformet materiale udskilles mod toppen. Det klare lag fraskilles, fortyndes med den samme puffer (1:1) og indstilles derpå til en pH-værdi på fra 6,8 til 7,0.

Den fortyndede rumenvæske (10 ml) anbringes i en 25 ml kolbe med 40 mg af ovenstående foder, yderligere 1 mg sojabønneprotein og den forbindelse, der skal afprøves. Der anvendes 4 kolber pr. behandling. Der anvendes ligeledes to sæt med fire kontrolkolber i hver. Der anvendes en nul-tidskontrol og en inkuberet 16 timers kontrol. Alle forsøgskolberne inkuberes i 16 timer ved 38°C. Efter inkubering måles pH-værdien, og 2 ml 25%'s metaphos-phorsyre sættes til hver kolbe. Prøverne får lov at henstå til afsætning, og de væsker, der flyder ovenpå, analyseres ved gaschro-matografi for propionat-, acetat- og butyratforblndelser. Aktive forbindelser forøger propionatproduktionen væsentligt i forhold til kontrollernes propionatproduktion.

Forsøgsforbindelsesresultaterne sammenlignes statistisk med kontrolresultater. Tabel XI viser forholdet mellem koncentrationerne af flygtige fedtsyrer i de behandlede kolber og koncentrationerne i kontrolkolberne.

38 142061 w fe fe ft 1) φ p "j lo o\co σ (U+lfvjOl O OM Η Η σι rp -ft ·. ·. » - ^ v -

- id rp r—! rP rp (-1 rp rp O

-P \ H Og o Heft x c o

tn -P

0 rd s +) O'ri'in'a'oncDinr·· tu o\° ·ρ m rP o r- in tn in H I ft - » ·· * - * - *0 rp O rp rP OM rp (-4 rp rp

ft OP

Id S ft

A 0) rQ

rP +) ΗΐΰΓ^νονοοαΗσΓ^ ti) <λ° ft oo o n~ to co t~~ σ S I > - - ' - - - * H-Pooooooo Ό O d

rP S A

o £ ft

O

H fe

X

-P

h dp (β ίϊ1 r- σ o η om to tu ί·Ρ σσθ"σσσοο Λ ρ 0) - ‘ - - - *- *· id ooooooooo H g Id

ID

X

tn æ κ*

•ft ft rp t—I Η Η rp Η H

0) e ε ft 3 ft ft

I ft 1 I I

ril CQ ril ril 0) ril ril ril .p ft ft ft ft ft ftft fttn ft o ft o ft tu OOOOOOO-PO-PO-P •P +J -P-P -p h +> tn +>tn +> tn <ΰ X Λ! X tn ,W Sft Ai 0) Αία) A! tu

tn id id id Φ id. ft td h idn tdH

pp fe fe ferP fe O fe >| fe >s fe >i O i I 1 >i I -H Ift Ift 10 Ό to to to+J tofttofetotu toft fi co co eotl) «0 co -P copP ooft η o o oo oft oft oid oid A <» oo »id oo ft oo A co > oou

ft OM CM CM I CM I CM I OM I CM I

o i i i i i L L

fe ril ri! ril <£j «1 ril 39 142061

Effektiviteten af kulhydratudnyttelsen påvises yderligere ved in vivo-forsøg, der er udført med dyr, der har fået rør anbragt i deres rumina, hvilket gør det muligt at udtrække prøver af rumen-indholdene .

Det forsøg, der er anført i tabel XXI, gennemføres med udvoksede stude, der vejer ca. 450 kg hver, og som har fået rør indopereret. To stude fodres med en normal diæt, og fire stude i hver behandlingsgruppe fodres med en identisk diæt, hvortil der er sat A-28086-faktor A. Til hver aliquot (100 ml) udtaget rumenvæske sættes 100 ml 10%'s metaphosphorsyre. Prøverne får lov at sætte 'sig og de væsker, der flyder ovenpå, analyseres ved gaschromatografiske metoder til bestemmelse af propionsyrekoncentrationerne. >

Resultaterne i tabel XII er gennemsnitsprocentstigningerne i rumen-propionsyrekoncentrationen, beregnet over fem analyser i en 14 dages behandlingsperiode. Kontrollerne har ca. 20 molprocent propionsyre.

Tabel XII

A-28086-Faktor A % stigning i for- (mg/dag) hold til kontrollerne 25 17,4 i 100 54,0

In vivo-afprøvning påviser endvidere, at A-28086-faktor A forøger foderudnyttelseseffektiviteten hos får. Resultaterne af disse forsøg, der er gennemført over et tidsrum på 56 dage, er opsummeret i tabel XIII.

* 40 U2061 in

G

•Η Μ tf

(D cm cm· I C H

U O iw d» 0 0)

I i—I

\ ø trr H oo U tn «a* co 'tf ø tf: - - tf G r-~ oo co O O &) Ή 0 m r—i ø tn i tnifl en m i-t G id tf 'ί* *5P 'Λ ø -P \ - - - tf tf tn i—f t—{ i—i

O CM

H É "H '—

H

H

X

i—I 0

øm Λ H

ta tn ø E-t -ri tn .-t o.

+J m •ri O O f- 0\

Gm^-N CN H H

tn ti »·*·»· g tn ta o o o ø -H tf G H\ G tn tn

ø G M

O tf —

i—I

ta - +> H m en r~

G >i Η Η H

< tf

M

< 0 tf

U O

0 m

-P

G H

GO O

Pm 4-J <n co M

1 Η -P

VD· * - G

00 M 0 oa. « 00 CM *“» 1 tn -«! — 41 14206 1 A-28086-Faktor D-forbindelserne er antivirale midler. A-28086-Faktor D er aktiv mod Maryland B-vlrus, type III-polio-virus, COE-virus, herpes-virus og Semliki Forest-virus, hvilket påvises ved in vitro-plaque-undertrykkelsesforsøg, der svarer til det forsøg, der er beskrevet af Siminoff, i Applied Microbiology_2 [1] , 66-72 (1961) . A-28086-Faktor D er også aktiv mod Transmissible Gastro-enteritis-virus, Newcastle Disease-virus, hvilket er påvist ved lignende vævskulturforsøg.

Den kendsgerning, at A-28086-faktor D-forbindelserne har aktivitet både mod vira og mod anaerobe bakterier, gør disse ! forbindelser særlig gunstige til behandling eller forebyggelse af enteritis hos høns, svin, kvæg og får. A-28086-Faktor D-forbindel- ’ serne er også anvendelige til behandling af entero-toxemia hos drøvtyggere .

Anticoccidie-aktivitet er en vigtig egenskab hos de her omhandlede A-28086-faktor D-forbindelser. In vitro-forsøg påviser anticoccidie-aktiviteten af A-28086-faktor D mod Eimeria tenella. Nedenstående metode anvendes [yderligere detaljer er angivet af L.R. McDougald og R.B. Galloway i Exper. Parasitology .34, 189-196 (19739]: Værtcellekulturer fremstilles ved konventionel teknik under anvendelse af Leighton-rør, plastskåle eller -plader eller andre egnede dyrkningsbeholdere. Efter 2-3 dages vækst i et hvilket som helst egnet kulturmedium (Eagle's minimale essentielle medium, Laotalbumin-hydrolysat i Earle's eller Hank's balancerede saltvand, Medium 199 osv) dannes almindeligvis et egnet monolag, og det er parat til inficering og lægemiddelbehandling. Der anvendes primære kulturer af kyllingenyreceller til disse studier.

Levedygtige oocyster af Eimeria tenella opnås ud fra fæces fra inficerede kyllinger, og de renses og steriliseres forud for anvendelsen. Oocysterne danner sporer ved inkubering ved stuetemperatur, medens luft bobles gennem suspensionen, eller ved forsigtig omrystning på et gyrorysteværk eller ved hjælp af et andet hensigtsmæssigt organ. Kaliumdichromat eller svovlsyre (eller andre kemikalier) kan anvendes til forebyggelse af bakterie- eller skimmel-vækst under sporedannelsen.

Ekscystering af inficerende sporozoitter fra oocysterne gennemføres ved en kombination af mekanisk sprængning af oocyst-væggen efterfulgt af behandling med trypsin og galdesuresalte for 142061 42 at formå sporozoitterne til at frigøre sig fra sporocysterne.

Cellekulturer inficeres ved indføring af levedygtige sporozoitter i dyrkningsbeholderen. Forsøgskemikalier kan indføres på dette tidspunkt eller senere. Forsøgskemikaliet indføres i den ønskede koncentration i 10%*s dimethylformamid i fysiologisk saltvand. Forsøgets slutpunkt er inhibering af kønsløse udviklingstrin, og det bestemmes ved mikroskopisk undersøgelse af kulturer, der er faste og farvede 96 timer efter inficeringen. Resultaterne er optegnet som aktiv (A), inaktiv (N) eller cytotoksisk (C) afhængigt af tilstedeværelsen eller fraværelsen af anden generations-schizon-ter og eventuel synlig toksicitet over for cellemonolaget.

Den anticoccidie-aktivitet af A-28086-faktor D, der er påvist ved dette forsøg, er opsummeret i tabel XIV.

Tabel XIV

Anticoccidie-aktivitet af antibiotikum A-28086-faktor D

Koncentration af A-28086-faktor D, γ/ml Bedømmelse

5 C

1 C

0,2 C

0,4 A,CX

0,03 A

0,02 A

0,01 - A

0,008 N

x Resultater af to forsøg.

Et andet nyttigt træk ved A-28086-faktor D-forbindelserne er deres evne til at forbedre foderudnyttelseseffektiviteten hos drøvtyggere, der har en udviklet rumenfunktion.

Aktiviteten af en sådan gunstig forbindelse kan bestemmes ved iagttagelse af dens virkning på produktionen og koncentrationen af propionatforbindelser i ruminen ved samme metode, som anvendes ovenfor ved faktor A.

Resultater for forsøgsforbindelsen sammenlignes statistisk med resultater for kontrolforbindelser. Tabel XV viser forholdet mellem koncentrationerne af flygtige fedtsyrer i kolber, der er A-28086-faktor D-behandlede, og koncentrationerne i kontrolkolberne.

14206 1 43

Tabel XV

A-28086-D Mol-% Mol-% Mol-% Totale FFS

γ/ml_acetat_butyrat_propionat_mM/liter 1,0 0,8715 0,7973 1,7981 1,1979 0,3 0,8976 0,8726 1,5871 1,0630

Forbindelserne er typisk effektive til forøgelse af prop-ionater og derved effektiviteten af foderudnyttelsen, når de indgives oralt til drøvtyggere i mængder på fra ca. 0,05 mg/kg/dag til ca. 5,0 mg/kg/dag. De mest gunstige resultater opnås med mængder på fra ca. 0,1 mg/kg/dag til ca. 2,5 mg/kg/dag. En fore-trukken metode til indgift af en forbindelse er ved blanding af forbindelsen med dyrenes foder, den kan imidlertid indgives på andre måder, f.eks. som tabletter, store doser, store piller eller kapsler. Formuleringen af disse forskellige doseringsformer kan gennemføres ved metoder, der er velkendte inden for veterinærfarmacien. Hver enkelt doseringsenhed bør indeholde en mængde af en forbindelse, der står i direkte relation til den egnede daglige dosis for det dyr, der skal behandles.

A-28086-Antibiotiket kan anvendes i fodersammensætninger, der er tilpasset til at opfede kvæg, "og som omfatter kvægfoder og fra 1 til 30 g/ton af forbindelsen.

Som det erkendes af en fagmand, er kvægfoder forskelligt fra andet foder, såsom fjerkræfoder. Kvægrationer indeholder grovfoder, såsom bomuldsfrøskaller og majsensilage. Kvægfoder indeholder endvidere en høj procentdel, ofte fra 15 til 25%, af ikke-protein--nitrogenkilder. En gængs ikke-protein-nitrogenkilde er urinstof.

Som beskrevet ovenfor er A-28086-forbindelserne antivirale midler, og de er også aktive mod anaerobe bakterier, især Clostridium perfringens. A-28086-Forbindelserne er derfor gunstige til behandling eller forebyggelse af enteritis hos høns, svin, kvæg og får. A-28086-Forbindelserne er også nyttige til behandling af enterotoxemia hos drøvtyggere.

Nedenstående eksempler illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen yderligere.

Eksempel 1 A. Rystekolbefermentering af A-28086 under anvendelse af S. aureo-faciens NRRL 5758____

En kultur af Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 fremstilles og holdes på en agarskråkultur med nedenstående sammensætning: 44 142061

Bestanddel Mængde

Agar 20 g

Dextrin 10 g

Enzymhydrolyseret casein 2 g Kødekstrakt 2 g Gærekstrakt 2 g

Destilleret vand indtil 1 liter

Skråkulturen inoculeres med Streptomyces aureofaciens NRRL 5758, og den inoculerede skråkultur inkuberes ved 30°C i 6-10 dage. Den udviklede skråkultur dakkes med okseserum og skrabes med et sterilt nåleøje for at løsne sporerne. Den fremkomne okse-serumsuspension af sporer og myceliefragmenter lyofiliseres i 6 pellets.

En på denne måde fremstillet lyofiliseret pellet anvendes til inoculering af 50 ml af et vegetativt medium med nedenstående sammensætning:

Bestanddel Mængde

Glucose 20 g

Soj abønnegrut 15 g

Majsstøbevæske 10 g

CaCOg 2 g

Ledningsvand indtil 1 liter

Det inoculerede vegetative medium, der er i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe, inkuberes ved 30°C i 72 timer på et rysteværk, der roterer gennem en bue med en diameter på 5 cm ved 250 omdrejninger pr. minut, B. Tankfermentering af A-28086 under anvendelse af S. aureofaciens HRRL 5758_

Til tilvejebringelse af et større volumen af inoculet anvendes 10 ml af det ovenfor beskrevne inkuberede vegetative medium til inoculering af 400 ml af et vegetativt vækstmedium på andet trin med samme sammensætning som det vegetative mediums. Dette andettrinsmedium inkuberes i en 2 liter kolbe ved 30°C i 24 timer på et rysteværk, der roterer gennem en bue med en diameter på 5 cm ved 250 omdrejninger pr. minut.

Dette vegetative medium på andet trin (1 liter) anvendes til inoculering af 100 liter sterilt produktionsmedium med nedenstående sammensætning: 45 142061

Bestanddel Mængde

Tapioka-dextrin 60,0 g/liter

Enzymhydrolyseret casein 8,0 g/liter

Melasse 15,0 g/liter

MgS04.7H20 0,5 g/liter

CaC03 2,0 g/liter

Raffineret sojabønneolie 5,0 g/liter

Afioniseret vand indtil 1 liter

Mediets pH-værdi er 6,7 efter sterilisering ved autoklavering ved 120°C i 30 minutter ved et tryk på 1,05-1,41 kg/cmz. Det ino-culerede produktionsmedium får lov at fermentere i 10 dage ved en temperatur på 29°C i en 165 liters fermenteringstank. Permen-teringsmediet gennemluftes med steril luft i en mængde på 0,4 volumen luft pr. volumen kulturmedium pr. minut. Mediet omrøres med konventionelle omrørere ved 250 omdrejninger pr. minut.

Eksempel 2

De ønskede A-28086-antibiotika fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge eksempel 1, men under anvendelse af et kolbeproduktionsmedium med nedenstående sammensætning:

Bestanddel Mængde

Glucose 10 g/liter

Spiselig melasse 20 g/liter

Pepton 5 g/liter

CaC03 2 g/liter

Ledningsvand indtil 1 liter

Eksempel 3

Fraskillelse af det A-28086-antibiotikum-kompleks, der er produce-ret af S. aureofaciens NRRL 5758_

Hele den fermenteringsvæske (132 liter)/ der er opnået ved den i eksempel 1 beskrevne metode, filtreres med et filterhjælpemiddel ("Hyflo Super-cel", en diatomé-jord, Johns-Manville Products Corp.) til frembringelse af 97 liter filtreret væske.

Den filtrerede væske ekstraheres med et omtrentligt lige så stort volumen ethylacetat. Ethylacetatekstrakten skilles fra den vandige fase og koncentreres til et volumen på ca. 500 ml. Denne koncentrerede ethylacetatekstrakt sættes til et stort overskud af petroleumsether ("Skelly Solve F", ca. 10 liter) til udfældning og derved fraskillelse af uønsket materiale. Det fraskilte filtrat afdampes under vakuum til frembringelse af væskedelen af A-28086-antibiotikum-komplekset (6,9 g).

46 UZ061

Myceliedelen af A-28 08 6-antibiotikum-komplekset opnås ved ekstrahering af det filtrerede medium to gange med ca. det halve volumen methanol (62 liter og 59 liter). De to methanoleks-trakter kombineres og koncentreres under vakuum til fjernelse af methanolen. Efter denne koncentrering er der ca. 10 liter af en vandig fase tilbage. Denne vandige fase indstilles på en pH-værdi på 7,5 med fortyndet natriumhydroxid. Den fremkomne opløsning ekstraheres to gange med ca. lige så store voluminer ethylacetat (9 liter og 10 liter). Ethylacetatekstrakterne kombineres og koncentreres dernæst til et volumen på ca. 400 ml. Denne koncentrerede ethylacetatekstrakt sættes til et stort overskud af petroleums-ether til fjernelse af uønskede materialer under anvendelse af den metode, der er beskrevet ovenfor for den koncentrerede filtrerede væskeekstrakt. Den myceliedel af A-28&86-antibiotikum-komplek-set, der er opnået ud fra filtratet, vejer 20,6 g.

Isolering af A-28086*s individuélle faktorer A og B

Myceliedelen af A-28086-antibiotikum-komplekset (235 g, fremstillet som beskrevet) opløses i ca. 80 ml benzen.

Denne benzenopløsning påføres en silicagelsøjle (9 x 130 cm, 8 liter, "Matheson grade 62l,-silicagel). Søjlen elueres med forskellige benzen-ethylacetat-blandinger. Elueringens fremadskriden følges ved tyndtlagschromatografi. Under anvendelse af et opløsningsmiddelsystem af benzen og ethylacetat (90il0) elueres faktor B først, og den isoleres som en individuel faktor. Faktor B (43 g) krystalliseres fra en blanding af acetone og vand, smp.: 150-153°C.

Ved fortsættelse af elueringen med blandinger af benzen og ethylacetat, men ved gradvis forøgelse af mængden af det tilstedeværende ethylacetat elueres faktor A. De forskellige fraktioner indeholdende faktor A kombineres og koncentreres under vakuum til en remanens. Denne remanens opløses i ca. 150 ml acetone, og ca. 150 ml vand sættes til acetoneopløsningen. Den fremkomne opløsnings pH-værdi indstilles til en pH-værdi på 3 ved tilsætning af 1 N saltsyre. Den syrnede blanding omrøres i ca. 1 time, i løbet af hvilket tidsrum der dannes et præcipitat. Dette præcipitat fraskilles ved filtrering og omkrystalliseres fra acetone (ca. 150 ml) efter tilsætning af vand (ca. 60 ml). Produktet tørres natten over under vakuum til frembringelse af faktor A (ca. 6,6 g). Efter delvis afdampning af acetonen fra filtratet opnås et yderligere udbytte af faktor A (ca. 1,2 g).

47 142061 A-28086-Faktor A-;esterderivater 7,4 g antibiotikum-A 28086-faktor A opløses i 150 ml pyridin. 50 ml eddikesyreanhydrid sættes til denne opløsning. Den fremkomne opløsning blandes omhyggeligt og får dernæst lov at henstå natten over ved stuetemperatur.

200 ml vand tilsættes under omhyggelig blanding. Denne blanding får lov at henstå i 4 timer ved stuetemperatur. Et hvidt faststof udfældes. Dette faststof fraskilles ved filtrering, vaskes med vand og lufttørres. Det fremkomne faststof opløses i 100 ml acetone, og acetoneopløsningen inddampes til tørhed under vakuum, dette gentages tre gange. Den på denne måde opnåede remanens krystalliseres fra en blanding af 100 ml acetone og 50 ml vand til frembringelse af A-28086-faktor A-acetylesterderivatet (6,14 g) med smp. 100-103°C.

Antibiotikum A-28086-faktor A-prøpionylesterderivatet, fremstillet ved omsætning af faktor A med propionsyreanhydrid i nærværelse af pyridin ved den beskrevne fremgangsmåde, smp. 96-98°C.

Antibiotikum A-28086-faktor A-n-butyrylesterderivatet, fremstillet ved omsætning af faktpr A med n-smørsyreanhydrid i nærværelse af pyridin ved den beskrevne fremgangsmåde, smp. 79-81°C.

Antibiotikum A-28086-faktor A-n-caproylesterderivatet, fremstillet ved omsætning af faktor A med capronsyreanhydrid i nærværelse af pyridin ved den beskrevne fremgangsmåde, smp. 163-167°C.

Antibiotikum A-28086-faktor A-n-valerylesterderivatet, fremstillet ved omsætning af faktor A med valerianesyreanhydrid i nærværelse af pyridin ved den beskrevne fremgangsmåde, smp. 173-175°C.

Fremstilling af A-28086-faktor A- og B-salte 500 mg af antibiotikum A-28086-faktor A opløses 1 50 ml acetone. 50 ml vand sættes til denne opløsning, og 5 N natriumhydroxid tilsættes til indstilling af opløsningens pH-værdi på 10,5-11. Den resulterende opløsning omrøres i 1 time og ekstraheres med ethylacetat. Ethylacetatekstrakten inddampes til tørhed under vakuum. Remanensen udfældes fra en opløsning af acetone og vand til frembringelse af 378 mg A-28086-faktor A-natriumsalt, smp. 120-123°C.

142061 48

Antibiotikum A-28086-faktor A-bariumsaltet fremstilles ud fra 500 mg af antibiotikum A-28086-faktor A og mættet bariumhydroxid under anvendelse af den beskrevne fremgangsmåde til frembringelse af 369 mg A-28086-faktor A-bariumsalt, smp. 188-190°C.

Antibiotikum A-28086-faktor A-kaliumsaltet fremstilles ud fra 500 mg antibiotikum A-28086-faktor A og 5 N kaliumhydroxid under anvendelse af den angivne fremgangsmåde til frembringelse af 363 mg A-28086-faktor A-kaliumsalt, samp. 165-167°C.

Antibiotikum A-28086-faktor A-cæsiumsaltet fremstilles ud fra 500 mg af antibiotikum A-28086-faktor A og 1 N cæsium-hydroxid under anvendelse af den beskrevne fremgangsmåde til frembringelse af 540 mg A-28086-faktor A-cæsiumsalt, smp.

190-210°C.

Antibiotikum A-28086-faktor B-natriumsaltet, fremstillet ud fra antibiotikum A-28086-faktor B og 5 N natriumhydroxid ifølge den beskrevne fremgangsmåde.

Eksempel 4

Rystekolbefermentering af A-28086 under anvendelse af S. aureo-faciens NRRL 8092__

Der fremstilles en kultur af Streptomyces aureofaciens NRRL 8092, og den holdes på en agarskråkultur med nedenstående sammensætning:

Bestanddel Mængde K2HF04 2 g

MgS04.7H20 0,25 g NH4N03 2 g

CaC03 2,5 g

FeS04.7H20 0,001 g

MnCl2.7H20 0,001 g

ZnS04.7H20 0,001 g

Glucose 10 g

Agar 20 g

Afioniseret vand indtil 1 liter (pH-værdi, ikke--indstillet) 7,7 .^V "/ .

49 142061

Skråkulturen inoculeres med Streptomyces aureofaciens NRRL 8092, og den inoculerede skråkultur inkuberes ved 30°C i ca.

7 dage. Den modne skråkultur dækkes med sterilt okseserum og skrabes med et sterilt nåleøje til fremstilling af en spore- og myce-liesuspension ud fra skråkulturen. Den fremkomne suspension lyofi-liseres til et maksimum på 6 pellets.

En af de på denne måde fremstillede lyofiliserede pellets anvendes til inoculering af 50 ml af et vegetativt medium med nedenstående sammensætning:

Bestanddel Mængde

Glucose 20 g

Sojabønnemel 15 g

Majsstøbevæske 10 g

CaC03 2 g

Ledningsvand indtil 1 liter pH-Værdien indstillet på 6,5 med fortyndet NaOH.

Det inoculerede vegetative medium inkuberes i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe ved 30°C i 48 timer på et roterende rysteværk ved 250 omdrejninger pr. minut med en 5 cm's bue.

Det inkuberede vegetative medium, der er beskrevet ovenfor (0,5 ml, 1%) anvendes til inoculering af 50 ml af et fermenteringsmedium med nedenstående sammensætning:

Bestanddel Mængde

Tapioka-dextrin* 60,0 g

Enzymhydrolyseret casein5*5* 6,0 g

Enzymatisk hydrolysat af casein5*5** 2,0 g

CaC03 2,0 g

MgS04.7H20 0,5 g "Blackstrap"-melasse 15,0 g

Raffineret sojabønneolie 5,0 ml

Ledningsvand indtil 1 liter pH-Værdi (ikke-indstillet) 6,6 * Staley-dextrin nr. 11, A.E. Staley Co, Decatur, 111.

vu

Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

*** NZ-Amin A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

50 142061

Eksempel 5

Tankfermentering af A-28086 under anvendelse af S.aureofaciens NRRL 8092_

Den i eksempel 4 beskrevne indledende fremgangsmåde til rystekolbefermentering af A-28086 anvendes også til tankfermentering; Til frembringelse af et større volumen inoculum anvendes 10 ml af det inkuberede vegetative medium til inoculering af 400 ml af et vegetativt medium på andet trin med samme sammensætning som sammensætningen af det første vegetative medium. Dette andettrinsmedium inkuberes i en 2 liters Erlenmeyer-kolbe ved 30°C i 24 timer på et roterende rysteværk ved 250 omdrejninger pr. minut med en 5 cm's bue.

Dette inkuberede vegetative medium på andet trin (800 ml) anvendes til inoculering af 100 liter sterilt fermenteringsmedium med nedenstående sammensætning:

Bestanddel Mængde

Tapioka-dextrin* 60,0 g/liter

Enzymhydrolyseret casein** 6,0 g/liter

Enzymatisk hydrolysat af casein*** 2,0 g/liter

CaCO^ 2,0 g/liter

MgSO^,7H20 0,5 g/liter "Blackstrap"-melasse 15,0 g/liter

Raffineret sojabønneolie 5,0 mg/liter

Ledningsvand indtil 1 liter u

Staley Dextrin nr. 11, A.E. Staley Co., Decatur, 111.

'2£9!

Ambet EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

νν» NZ-Amin A, Sheffield Chemical CO., Norwich, N.Y.

Mediets pH-værdi er 6,8 - 0,1 efter sterilisering ved autoklavering ved 121°C i 30 minutter ved et tryk på 1,05-1,41 kg/cm2. I en 165.liters fermenteringstank får det inoculerede produktionsmedium lov at fermentere i 10-12 dage ved 28 ί 1°C. Fermenteringsmediet gennemluftes med steril luft i en mængde på 0,4 volumen luft pr. volumen kulturmedium pr. minut. Mediet omrøres med konventionelle omrørere ved 300 omdrejninger pr. minut.

Eksempel 6

De ønskede A-28086-antibiotika fremstilles ved den i eksem- 51 142061 pel 5 beskrevne fremgangsmåde; men under anvendelse af et ryste-kolbe/tankproduktionsmedium med nedenstående sammensætning:

Bestanddel Mængde

Tapioka-dextrin* 30,0 g/liter

Glucose 15,0 g/liter

Enzymhydrolyseret caseinXK 3,0 g/liter

UHIU

Enzymatisk hydrolysat af casein 1,0 g/liter Gærekstrakt 2,5 g/liter

CaCO^ 2,0 g/liter

MgS04,7H20 1,0 g/liter "Blackstrap"-melasse 15,0 g/liter

Raffineret sojabønneolie 5,0 ml/liter

Ledningsvand indtil 1 liter H Staley Dextrin nr. 11, A.E. Staley Co., Decatur, 111. xx Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wise. xxx NZ-Amin A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

Mediets pH-værdi er 6,4 efter sterilisering ved autoklavering som beskrevet i eksempel 17.

Eksempel 7

Fraskillelse af A-28086-antibiotikum-komplekset fremstillet ved hjælp af S. aureofaciens NRRL 8092 __

Hele den fermenteringsvæské (60 liter), der opnås ved den i eksempel 5 beskrevne metode, indstilles på en pH-værdi på 3 ved tilsætning af fortyndet saltsyre. Den fremkomne opløsning filtreres under anvendelse af et filterhjælpemiddel pHyflo Super-cel", en diatoméjord, Johns-Manville Products Corp.). Den fraskilte myce-liekage ekstraheres med 30 liter methanol, idet 1,56 kg NaHCOg sættes til ekstrakten under omrøring. Efter fraskillelse af denne ekstrakt ekstraheres myceliekaijen igen med yderligere 30 liter methanol. De to methanolekstrakter kombineres og koncentreres under vakuum til fjernelse af methancrlen. Den tilbageværende vandige opløsning (ca. 7 liter) indstilles på en pH-værdi på 7,5 med fortyndet saltsyre. Den fremkomne opløsning ekstraheres to gange med ethyl- v acetat i portioner på 7 liter. Ethylacetatekstrakterne kombineres og koncentreres under vakuum til frembringelse af en olieagtig remanens. Denne olieagtige remanens opløses i 1500 ml acetone.' 52 142061 1500 ml vand sættes til acetoneopløsningen. Den fremkomne opløsning indstilles på en pH-værdi på 3 med fortyndet saltsyre og omrøres i 1 time. Det præcipitat, der er dannet, fraskilles ved filtrering og opløses dernæst i 1500 ml acetone. 400 ml vand sættes til denne opløsning. Den fremkomne opløsning får lov at henstå i 16 timer, for at krystallisationen kan forekomme. De dannede krystaller fraskilles ved filtrering og tørres under vakuum til frembringelse af 74 g råt krystallinsk produkt indeholdende A-28086-faktorer A og D og andre krystallinske urenheder.

Dette rå krystallinske produkt (40 g) opløses i ca. 250 ml benzen. Bénzenopløsningen påføres dernæst en silicagelsøjle 9- x 120-cm søjle, "Grace-Davidson grade 62,,-silicagel). Søjlen elueres successivt med 40 liter af hver af nedenstående: 1) benzen 2) benzen:ethylacetat (9:1) 3) " " (4:1) 4) ,r " (7:3) 5) " " (1:1) 6) ethylacetat 7) . methanol.

1 liters fraktioner opsamles. Hver fraktion undersøges ved afprøvning mod Bacillus subtilis og ved tyndtlagschromatografi til identificering af de eluerede forbindelser. A-28086I elueres med benzen:ethylacetat (4:1). A-28086-Faktor B elueres med benzen:ethyl-acetat (7:3). A-28086-Faktorer A og D elueres i de fraktioner, der opnås-med benzen:ethylacetat (7:3 og 1:1), fraktioner 119-156.

Disse fraktioner kombineres og inddampes til tørhed under vakuum.

Den på denne måde opnåede remanens opløses i 500 ml acetone. 500 ml vand sættes til acetoneopløsningen, og den fremkomne opløsning indstilles på en pH-værdi på 3 med fortyndet saltsyre og omrøres i 1 time. Det præcipitat, der dannes, fraskilles ved filtrering og krystalliseres fra 500 ml acetone og 180 ml vand. De på denne måde dannede krystaller fraskilles ved filtrering og tørres under vakuum til frembringelse af 20,1 g af en blanding af A-28086-faktorer A og D.

Fraskillelse og rensning af individuelle faktorer A og D

Den krystallinske blanding af A-28086-faktorer A og D, 53 142061 der er fremkommet (18,8 g), opløses i 50 ml benzen.

Benzenopløsningen påføres en silicagelsøjle (7- x IQO-cm søjle, "Merck grade 60"-silicagel, finere end 230 mesh A$TM). Søjlen elueres i en strømningsmængde på 90 ml pr. time successivt med 1) 12 liter benzen 2) 12 liter benzen:ethylacetat (9si) 3) 12 liter benzen:ethylacetat (4:1) 4) 32 liter benzen:ethylacetat (7:3) 5) 10 liter methanol.

Tyndtlagscellulosechramatograff (Merck Darmstadt cellulose på en aluminiumbærer) følges ved $· subtilis-bioautografi til overvågning af elueringsprccessen. Der anvendes følgende ppløsnfngsmiddelsystem: vand:methanol:acetone (12:3:1), idet opløsningen føf.st indstilles på en pH-værdi på .10,5 med NH^OH og dernæst på 7,5 med saltsyre.

Der opsamles 1 til 2 liters fraktioner, indtil aktiviteten er påvist. Dernæst opsamles 200 ml fraktiqner. De fraktioner, der kun indeholder A-28Q86-faktpr kombineres og inddampes upder vakuum til en remanens. Denne remanens krystalliseres fra en blanding af acetone og vand i forholdet 1:1. Krystallerne fraskllles og tørres under vakuum til frembringelse af 140 mg krystallinsk A-28086-faktor D.

De fraktioner, der indeholder A-28086-faktor p med spor af A-28086-faktor A, behandles på samme måde til frembringelse af yderligere 150 mg krystallinsk A-28086-faktor D indeholdende en ringe.mængde A-28086-faktor A.

De fraktioner, der kun indeholder A-28086-faktor A, behandles også på samme måde til frembringelse af 4,7 g krystallinsk A-28086-faktor A.

Eksempel 8

De ønskede A-28086-antibiotika fremstilles ved fremgangsmåden ifølge eksempel 4, men under anvendelse af et skråkulturmedium med nedenstående sammensætning: 54 142061

Bestanddel Mængde Kødekstrakt 2,00 g

Dextrin 20,00 g Gærekstrakt 2,00 g

Enzymatisk hydrolysat af casein 4,00 g . CoClr6H20 0, Q2 g

Agar 20,00 g

Afioniseret vand indtil 1 liter pH-værdien indstillet på 7,0 med KOH og den inoculerede skråkultur inkuberes ved 28°C i ca. 7 dage.

Eksempel -9 „De ønskede A-28086-aktibiotika fremstilles ved fremgangsmåden. ifølge eksempel 5, men under anvendelse af et kolbe/produk-tionsmedium med nedenstående sammensætning;

Bestanddel Mængde

Tapioka-dextrin1 80 g/liter

Enzymhydrolyseret casein2 15,0 g/liter "Blackstrap"-melasse 15,0 g/liter

Calciumcarbonat 2,0 g/liter

Ammoniumsulfat 1,0 g/liter

Magnesiumsulfat 0,5 g/liter

Raffineret sojabønneolie 4,6 g/liter

Staley Dextrin nr. 11, A.E. Staley Co., Decatur, 111.

2 vv

Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

Eksempel 10

De ønskede A-28086-antibiotika fremstilles ved fremgangsmåden ifølge eksempel 8, men under anvendelse af et vegetativt mellemproduktsmedium på tredje trin med nedenstående sammensætning; 55 14206 1

Bestanddel Mængde

Cerelose 20,0 g/liter

Majsstøbevæske (vådvægt) 10,0 g/liter

Sojabønnegrut 15,0 g/liter

CaCOg 2,0 g/liter Gær 2,0 g/liter

Foderbede-melasse 5,0 g/liter