DE2525095A1 - Antibioticum a-28086 und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V.St.A. Antibioticum A-2 8086 und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung bezieht sich auf das Antibioticum A-28086 Faktoren A, B und D sowie ein Verfahren zur Herstellung des iVntibioticum-A-28086-Komplexes, aus dem sich die Faktoren A, B und ΰ ableiten. Die antibiotischen Verbindungen sind interessante antibakterielle, antifungale, antivirale, anticoccidiale, insekticide und acaricide Mittel sowie Mittel gegen Pleuropneumie ähnliche Organismen und Mittel zur Verbesserung der Futterutilisation bei Wiederkäuern.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung des Antibioticum A-28086-Komplexes mit den Faktoren A, B und D geschaffen, das darin besteht, daß man einen Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 oder Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 in einem assimilierbare Quellen für Kohlehydrat enthaltenden Kulturmedium submers unter aeroben Fermentationsbedingungen solange züchtet, bis die obigen Organismen im Kulturmedium eine wesentliche Menge antibiotischer Aktivität produziert haben.

Ferner wird erfindungsgemäß ein Antibioticum A-28O36-Komplex, der die Faktoren A, B und D enthält, geschaffen.

50985 1/1153

Das Antibioticum A-28086 Faktor A ist nach Umkristallisieren aus Aceton-Wasser eine weiße kristalline Verbindung, die sich in niederen Alkoholen, Dimethylformamid, DimethylsuIfoxid, Xthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol löst, in Hexan jedoch nur schwach löslich ist und sich in Wasser nicht löst, bei etwa 98 bis 100 ⁰C schmilzt, sich wieder verfestigt und dann bei etwa 195 bis 200 ⁰C wieder schmilzt und folgende weitere Eigenschaften hat:

a) ein Molekulargewicht von 764, durch Spektrometrie bestimmt.

b) eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 66,69 % Kohlenstoff, 9,85 % Wasserstoff und 23,10 % Sauerstoff,

c) eine empirische Formel ^C43^H72°ii' durch Massenspektrometrie bestimmt,

d) eine spezifische Drehung von -54 ° (c=0,2, Methanol), gemessen bei 25 C,

e) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Chloroform mit folgenden unterscheidbaren Absorptionsmaxima: 2,85, 3,34, 5,83, 6,82, 7,22, 7,53 (schwach), 7,78 (schwach), 8,75 (stark), 8,95 (stark), 9,15, 9,50 (stark), 9,55 (stark), 9,60, 9,85, 1O,15, 10,45 und 10,70 (schwach) Mikron,

f) nur eine Endabsorption bei weniger als 200 m ,u im Ultra violettspektrura in Äthanol,

g) ein magnetisches KernresonanzSpektrum in Deuterochloroform mit folgenden Eigenschaften: S 6,01,

509851/1 153

- J - ■

4,21, 4,11, 3,99, 3,89, 3,80, 3,67, 3,65, 3,57, 3,55,

2,83, 2,76, 2,74, 2,68, 2,66, 2,58, 2,56, 2,30, 2,22,

2,17, 2,10, 2,05, 1,96, 1,90, 1,85, 1,70, 1,62, 1,60,

1,47, 1,39, 1,31, 1,25, 1,18, 0,95, 0,93, 0,90, 0,88, O,85, O,77, 0,75, 0,73, 0,68 und 0,66 ppm,

h) eine titrierbare Gruppe mit einem pK -Wert von 7,9

Cl

in 80-prozentigem wässrigem Dimethylformamid,

i) ein charakteristisches Röntgenbeugungsspektrum für das Pulver (Cu⁺⁺ Strahlung, 1,5405 \, Nickelfilter) mit folgenden interplanaren Abständen in Angström (d):

d Relative Intensität

12,09 100

1O,1O 50

9,25 90

8,00 40

7,50 15

6,92 90

6,40 40

5,98 05

5,68 15

.,20 4O 4,98 40 4,62 . 40

4.21 20 3,48 10

509851/1 153

j) einen R--Wert von 0,24 in der Dünnschichtchromatographie über Silicagel unter Verwendung eines 3:2 Lösungsmittelsystems aus Benzol-Äthylacetat und Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus,

k) in den unten angegebenen papierchroinatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende Rp-Werte:

R_f-Werte

Lösungsmittelsystem

0,11

Mit Methylisobutylketon (MIBK) gesättigtes Wasser

0_r41

Mit MIBK plus 28 % p-Toluolsulfonsäure sowie 1 % Piperidin gesättigtes Wasser

0,54

Wasser:Methanol:Aceton (12:3:1) mit NH₄OH auf pH 10,5 eingestellt

und dann mit H-PO. auf pH 7,5 erniedrigt

0,48 0,15

1 % MIBK, 0,5 % NH₄OH in Wasser

17,4 g K₂HPO₄, 30 ml Äthanol pro Liter Wasser

0,24 0,24 O,75

Mit Wasser gesättigtes Benzol

Wasser

Wasser:MIBK:Äthylacetat (98:1:1)

609851/1153

1) eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion und

m) wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe,

oder das obige Antibioticum liegt in Form seiner C₂-Cg-Acylesterderivate sowie physiologisch annehmbaren Salze vor.

Das Antibioticum A-28086 Faktor B ist nach Umkristallisieren aus Aceton-Wasser eine weiße kristalline Verbindung, die sich in niederen Alkoholen, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol löst, in Hexan jedoch nur schwach löslich ist und sich in Wasser nicht löst und folgende weitere Eigenschaften hat:

a) einen Schmelzpunkt von etwa 150 - 153 ⁰C,

b) ein Molekulargewicht von 762, bestimmt durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung,

c) eine empirische Formel ^C43^H7o°ii» bestimmt durch Massenspektrometrie hoher Auflösung,

d) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Chloroform mit folgenden unterscheidbaren Absorptionsmaxima: 2,82, 3,30, 5,77, 5,85, 6,80, 7,20, 7,50 (schwach), 7,72 (schwach), 7,80 (schwach), 8,57 (stark), 8,68, 8,90 (stark), 9,10, 9,50, 9,83 (stark), 9,90, 10,10, 10,17 (stark), 10,43 (schwach), 10,80 (schwach), 11,20 (schwach), 11,35 (schwach), 11,73 (schwach) und 12,O3 (schwach) Mikron,

509851/1 153

e) ein Absorptionsmaximum in Äthanol im Ultraviolettspektrum bei 220 m.u (eJ* = 137,5, £= - 10 477),

f) ein magnetisches Kernresonanzspektrum in Deuterochloroform mit folgenden Eigenschaften: ^"7,2O, 7,09, 6,26, 6,15, 4,19, 4,12, 4,05, 3,95, 3,89, 3,78, 3,62, 3,59, 3,52, 3,48, 2,81, 2,73, 2,63, 2,54, 2,52, 1,99, 1,91, 1,84, 1,71, 1,67, 1,64, 1,55, 1,43, 1,33, 1,18, 1,11, O,96, 0,94, O,9O, 0,87, 0,84, 0,77, O,74 und 0,68 ppm,

g) einen R,.-Wert von 0,42 im Dünnschichtgromatogramm über Silicagel unter Verwendung eines 3:2-Gemisches aus Benzol und Äthylacetat sowie Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus,

h) in den im folgenden angegebenen papierchromatogra-

phischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende R_-Werte:

R_f-Werte Lösungsmittelsystem

0,16 Mit MIBK plus 2 % p-Toluolsulfon-

säure und 1 % Piperidin gesättigtes Wasser

O,46 Wasser:Methanol:Aceton (12:3:1)

mit NH₄OH auf pH 10,5 eingestellt

und dann mit H₃PO₄ auf pH 7,5 erniedrigt

0,36 1 % MIBK, 0,5 % NH₄OH in Wasser

0,51 Mit Wasser gesättigtes Benzol

O,11 Wasser

0,61 Wasser:MIBK:Äthylacetat (98:1:1)

509851/1153

i) eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion/

j) zwei Ketofunktionen und

k) wenigstens eine Hydroxylgruppe,

oder das obige Antibioticum liegt in Form seiner physiologisch unbedenklichen Salze vor.

Das Antibioticum A-28086 Faktor D ist nach Umkristallisieren aus Aceton-Wasser eine weiße kristalline Verbindung, die in Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol löslich ist, sich in Hexan jedoch nur schwach löst und in Wasser unlöslich ist, bei etwa 96 bis 98 ⁰C schmilzt und folgende weitere Eigenschaften hat:

a) ein Molekulargewicht von 778, bestimmt durch Massenspektrometrie hoher Auflösung,

b) eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 67,59 % Kohlenstoff, 9,38 % Wasserstoff und 22,Π % Sauerstoff,

c) eine empirische Formel ^C44^H74°ii» bestimmt durch Massenspektrometrie hoher Auflösung,

509851/1153

d) eine spezifische Drehung von -56° (c=O,1, Methanol), bestimmt bei 25 ⁰C,

e) ein Infrarbtabsorptionsspektrum in Chloroform mit folgenden beobachtbaren Absorptionsmaxima: 2,89, 3,39, 3,43, 3,50, 5,88, 6,90, 7,27, 7,60, 7,84, 9,OO, 9,26, 9,62, 10,31, 10,58, 11,10 und 11,49 Mikron,

f) in 95-prozentigem wässrigem Äthanol keine beobachtbare Ultraviolettabsorption,

g) in Chloroform ein magnetisches Kernresonanzspektrum mit folgenden Eigenschaften: · 6,OO, 4,20, 4,1O, 4,00, 3,98, 3,92, 3,86, 3,83, 3,79, 3,67, 3,64, 3,57, 3,54, 2,88, 2,81, 2,71, 2,62, 2,58, 2,48, 2,43, 2,37, 2,29, 2,21, 2,15, 2,10, 2,04, 1,97, 1,89, 1,83, 1,76, 1,68, 1,61, 1,58, 1,55, 1,47, 1,39, 1,30, 1,25, 1,18, O,95, O,90, 0,88, 0,84, 0,74 und 0,68 ppm, .

h) in 80-prozentigem wässrigem Dimethylformamid eine titrierbare Gruppe mit einem pK -Wert von 8,67,

i) als Pulver folgendes charakteristisches Röntgenbeugungsspektrum (Cu⁺"¹" Strahlung, 1,5405 Λ, Nickelfilter) mit folgenden interplanaren Abständen in Angström (d) :

5 0985 1/1153

Relative Intensität

12,40 100

10,20 70

8,85 90

7,80 30

6,80 10

6,30 100

5,70 20

5,35 20

5,10 2O

4,90 10

4,65 20

4,45 40

4,2O 3O

3,30 10

3,15 10

2,99 05

2,77 05

2,28 05

j) in dünnschichtchromatographischen Systemen auf Silicagel unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende R^-Werte:

R_f-Werte Lösungsmittelsystem

O,26 Benzol-Kthylacetat (3:2)

0,66 Äthylacetat-Diäthylamin

(95:5)

509851/1 153

- ίο -

k) in papierchromatographisehen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende R--Werte:

R_f-Werte Lösungsmittelsystem

O,1O Mit Methylisobutylketon (MIBK)

gesättigtes Wasser

O_f26 Mit MIBK plus 2 % p-Toluol-

sulfonsäure sowie 1 % Piperidin gesättigtes Wasser

0,36 Wasser:Methanol:Aceton (12:3:1)

mit NH₄OH auf pH 10,5 eingestellt

und dann mit H₃PO₄ auf pH 7,5 erniedrigt

0,29 1 % MIBK, O,5 % NH₄OH in Wasser

0,25 17,4 g K₃HPO₄, 30 ml Äthanol pro

Liter Wasser

0,26 Mit Wasser gesättigtes Benzol

0,09 Wasser

O,64 Wasser:MIBK:Äthylacetat

(98:1:1)

1) eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion und

m wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe,

509851/1153

oder das obige Antibioticum liegt in Form seiner C₂-C_ß-Acylesterderivate sowie physiologisch unbedenklichen Salze vor.

Es gibt zwar bereits eine Reihe antibakterieller Mittel, doch besteht immer noch ein Bedarf nach neuen und besseren Antibiotica. Ein Problem bei der derzeitigen Antibioticatherapie ist die Tatsache, daß sich Antibiotica in ihrer Wirksamkeit gegenüber pathogenen Organismen unterscheiden. Ein weiteres Problem ist die Entwicklung von Organismenstämmen, die gegenüber Standardantibiotica resistent sind. Ein anderes Problem ist schließlich die Tatsache, daß einzelne Patienten oft an ernsten Reaktionen gegenüber spezifischen Antibiotica leiden, die auf eine Hypersensitivität und/oder toxische Effekte zurückzuführen sind. Wegen dieser Probleme in der derzeitigen Therapie besteht immer noch Bedarf an neuen Antibiotica.

Außer neuen Antibiotica zur Behandlung von Erkrankungen des Menschen werden auch bessere Antibiotica in der Veterinärmedizin benötigt. Ein wichtiger Gesichtspunkt ist dabei der Bedarf an besseren Antibiotica zur Wachstumsförderung von Geflügel und Haustieren. Zu einer solchen Wachstumsförderung kommt es beispielsweise durch eine Verringerung der Krankheiten und durch eine Verbesserung der Futterutilisation.

Eine bekannte Krankheit von wirtschaftlicher Bedeutung in der Veterinärmedizin, und zwar insbesondere in der Geflügelindustrie, ist die durch Protozoen hervorgerufene Coccidiosis. Zu einer Coccidiosis kommt es durch Infektion mit einer oder mehreren Arten von Eimeria oder Isospora (bezüglich einer Zusammenfassung wird auf Lund and Farr in "Diseases of Poultry," 5.Auflage, Biester and Schwarte, Eds., Iowa State University Press, Ames, Ia., 1965,

509851/1153

Seiten 1056 - 1096 hingewiesen. Wegen der starken wirtschaftlichen Verluste durch Coccidiosis und aufgrund der Nachteile einiger bekannter anticoccidialer Mittel wird immer noch nach besseren anticoccidialen Mitteln gesucht.

Eine weitere Erkrankung bei den Tieren ist die Enteritis, durch die es bei den Tierzüchtern ebenfalls zu ernsthaften wirtschaftlichen Verlusten kommen kann. Die Enteritis tritt bei Hühnchen, Schweinen, Rindern und Schafen auf, und sie ist vorwiegend auf anaerobe Bakterien, insbesondere Clostridium perfringens, sowie Viren zurückzuführen. Die Enterotoxämie bei Wiederkäuern, von denen ein Beispiel das überfressen bei Schafen ist, ist ein Zustand, der durch eine Infektion mit C. perfringens hervorgerufen wird.

Die Wachstumsförderung bei Wiederkäuern, wie Rindern, ist ein weiteres wirtschaftlich interessantes Ziel der Veterinärmedizin. Von besonderem Interesse ist dabei eine Wachstumsförderung, die man durch Verbesserung der Futterverwertung erreicht. Der Mechanismus für eine Utilisation des überwiegenden nutritiven Anteils (Kohlehydrate) des Futters von Wiederkäuern ist bekannt. Durch im Pansen der Tiere vorhandene Mikroorganismen werden Kohlehydrate unter Bildung von Monosacchariden abgebaut, und diese Monosaccharide werden dann in Pyruvatverbindungen umgewandelt. Die Pyruvate werden durch mikrobiologische Verfahren zu Acetaten, Butyraten oder Propionaten metabolisiert, die kollektiv als flüchtige Fettsäuren (VFA) bezeichnet werden. Bezüglich einer detaillierteren Diskussion wird auf Leng "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et al. Eds., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England (1970) Seiten 408 - 410 verwiesen.

509851/1153

Die relative Effizienz der VFA-Utilisation wird von McCullough in Feedstuffs, 18. Juni 1971, Seite 19, Eskeland et al. in J. An. Sei. 33, 282 (1971) sowie Church et al. in "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants," Band 2 (1971), Seiten 622 und 625 diskutiert. Es werden zwar auch Acetate und Butyrate utilisiert, die Propionate werden jedoch weit effizienter utilisiert. Darüberhinaus können die Tiere eine Ketosis entwickeln, falls zu wenig Propionat verfügbar ist. Eine entsprechend günstige Verbindung stimuliert daher die Tiere zur Bildung eines höheren Anteils an Propionaten aus Kohlehydraten, wodurch sich die Kohlehydratutilisation verbessert und der Befall an Ketosis geringer wird.

Das Antibioticum A-28086 Faktoren A, B und D gehört zu einem neuen Vertreter einer Gruppe von Polyätherantibiotica. Beispiele von Vertretern aus dieser Gruppe sind unter anderem Monensin (US-PS 3 501 568), Dianemycin /R.L. Hamill, M.M. Hoehn, G. E. Pittenger, J. Chamberlin und M. Gorman, J. Antiniotics 22, 161 (1969/r Nigericin /L. K. Steinrauf, Mary Pinkerton und J.W. Chamberlin, Biochem.Biophys. Res. Comm. 33,29 (1968]y sowie Salinomycin /JA-PS 47-25392, Anmeldenummer 19620/1971, Derwent No. 7696OT, US-PS 3 857 948, und H. Kinashi, N. Otake, H. Yonehara, S. Sato und Y. Saito, Tetrahedron Lett. 49, 4955-4958 (1973]_/.

Die Angabe antibiotischer Komplex, wie sie in der Fermentationschemie und auch in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich nicht auf einen chemischen Komplex, sondern auf ein Gemisch gleichzeitig gebildeter indivudueller antibiotischer Faktoren. Das Verhältnis der bei einem antibiotischen Komplex gebildeten einzelnen Faktoren schwankt, wie dem mit der Bildung von Antibiotica durch Ferraantation vertrauten Fachmann bekannt ist, in Abhängigkeit von den jeweils angewandten Fermentationsbedingungen.

509851/1153

Der Antibioticum A-28086-Komplex wird gebildet, indem man den neuen Stamm Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 sumbers unter aeroben Fermentationsbedingungen solange züchtet, bis eine wesentliche Menge antibiotischer Aktivität entstanden ist. Der antibiotische Komplex A-28086 kann ferner gebildet werden, indem man einen weiteren neuen Stamm, nämlich Streptomyces aureofaciens NRRL 8092, züchtet. Der entweder durch S. aureofaciens NRRL 5758 oder durch S. aureofaciens NRRL 8092 produzierte antibiotische Komplex wird aus der Fermentationsbrühe und dem Mycel durch polare organische Lösungsmittel extrahiert. Das extrahierte antibiotische Gemisch wird durch Einengen der Lösungsmittel, Zugabe der Konzentrate zu überschüssigem Petroläther zur Ausfällung von Verunreinigungen, Abfiltrieren und Eindampfen der Filtrate gewonnen, wodurch man ein Gemisch des Antibioticums A-28086 erhält. Das antibiotische Gemisch wird dann weiter gereinigt und durch Säulenchromatographie in die einzelnen Faktoren aufgetrennt.

Die A-28086-Verbindungen hemmen das Wachstum von tier- und pflanzenphatogenen Organismen. Diese Hemmwirkung beruht zum einen Teil darauf, daß die Verbindungen A-28086 anticoccidial wirken. Die Verbindungen A-28086 sind ferner antibakteriell, antiviral, gegen PPLO (Pleuropneumonia ähnliche Organismen), insekticid und acaricid wirksam und erhöhen die Futterutilisation bei Wiederkäuern.

Aus der anliegenden Zeichnung gehen folgende Infrarotabsorptionsspektren in Chloroform hervor:

Figur 1 - Antibioticum A-28086 Faktor A Figur 2 - Antibioticum A-28086 Faktor B

Figur 3 - Antibioticum A-28086 Faktor A Acetylesterderivat

509851/1153

Figur 4 - Antibioticum A-28086 Faktor A Propionylesterderivat

Figur 5 - Antibioticum A-28086 Faktor A Butyrylesterderivat

Figur 6 - Antibioticum A-28086 Faktor A Valerylesterderivat

Figur 7 - Antibioticum A-28086 Faktor A Caproylesterderivat

Figur 8 - Antibioticum A-28086 Faktor D

Die A-28086-Faktoren stehen strukturell zueinander in Beziehung. Während der Fermentation werden wenigstens vier antibiotische Faktoren gleichzeitig gebildet, die man in Form eines Gemisches erhält. Die Faktoren werden voneinander getrennt, wodurch sich die Faktoren A, B und D als einzelne Verbindungen, wie sie im folgenden beschrieben werden, isolieren lassen. Das Gemisch aus den Faktoren von A-28086 ist in den meisten organischen Lösungsmitteln löslich, jedoch in Wasser unlöslich.

In den folgenden Ausführungen werden die physikalischen und spektralen Eigenschaften von A-28086 Faktoren A, B und D beschrieben.

Das Antibioticum A-28086 Faktor A kristallisiert aus Aceton-Wasser. Der Faktor A des Antibioticums A-28086 schmilzt bei etwa 98 - 100 ⁰C , worauf er sich wieder verfestigt und dann wiederum bei etwa 195 - 200 ⁰C schmilzt. Die Elementaranalyse des Faktors A ergibt folgende mittlere prozentuale Zusammensetzung: Kohlenstoff 66,69 % , Wasserstoff 9,85 %, Sauerstoff 23,10 %.

509851/1153

^C43^H72°11 ^w*^r(* ^^^r *^^{en Fa}ktor A als empirische Formel vorgeschlagen.

Der Faktor A hat ein scheinbares Molekulargewicht von 764, und zwar bestimmt durch Massenspektrometrie.

Das Infrarotspektrum des Faktors A in Chloroform geht aus Figur 1 der anliegenden Zeichnung hervor. Hierbei erhält man folgende Absorptionsmaxima: 2,85, 3,34, 5,83, 6,82, 7,22, 7,53 (schwach), 7,78 (schwach), 8,75 (stark), 8,95 (stark), 9,15, 9,50 (stark), 9,55 (stark), 9,60, 9,85, 10,15, 1O,45 und 1O,7O (schwach) Mikron.

Das ültraviolettspektrum des Faktors A in Äthanol zeigt lediglich eine Endabsorption bei unter 220 m.u.

Das magnetische KernresonanzSpektrum von A-28086 Faktor A in Deuterochloroform zeigt folgende Charakteristiken:

(5*6,01, 4,21, 4,11, 3,99, 3,89, 3,80, 3,67, 3,65, 3,57, 3,55, 2,83, 2,76, 2,74, 2,68, 2,66, 2,58, 2,56, 2,3O, 2,22, 2,17, 2,1O, 2,05, 1,96, 1,9O, 1,85, 1,70, 1,62, 1,60, 1,47, 1,39, 1,31, 1,25, 1,18, 0,95, 0,93, 0,90, O,88, 0,85, 0,77, O,75, 0,73, 0,68 und 0,66 ppm.

Das aus Aceton-Wasser umkristallisierte Anitbioticum A-28086 Faktor A ergibt als Pulver folgendes charakteristisches Röntgenbeugungsspektrum (Cu Strahlung, 1,5405 Λ. » Nickelfilter, d = Interplanarabstand in Angstrom):

Relative d Intensität

12,00 100

10,10 50

9,25 90

8,00 40

7,50 15

509851/1153

Relative Intensität

6,92 90

6,40 40

5,98 05

5,68 15

.,20 40 4,98 40 4,62 40

4.21 20 3,48 10

Die spezifische Drehung des Antibioticums A-28086 Faktor A ist -54 (c = 0,2, Methanol), und zwar gemessen bei einer Temperatur von 25 ⁰C. Diese spezifische Drehung ist ein auf mehreren Bestimmungen basierender Mittelwert.

Die elektrometrische Titration des Faktors A in 80-prozentigem wässrigem Dimethylformamid zeigt die Gegenwart einer titrierbaren Gruppe mit einem pK -Wert von 7,9.

Das Antibioticum A-28086 Faktor A löst sich in einer Reihe organischer Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol, ist jedoch in nichtpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Hexan, nur schwach löslich und in Wasser unlöslich.

Das Antibioticum A-28086 Faktor A verfügt über eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion und wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe.

509851/1153

Auf der Basis der oben beschriebenen physikalischen Eigenschaften läßt sich für das Antibioticum A-28086 Faktor A eine Struktur vorschlagen. Nachdem die Strukturbestimmung nur postuliert wird, wird jedoch darauf hingewiesen, daß es sich bei diesem Strukturvorschlag lediglich um eine Arbeitshypothese handelt. Das Antibioticum A-28086 Faktor A dürfte demzufolge die Struktur folgender Formel I haben:

509851/1153

■ \

α)

509851/1 153

Das Antibioticum A-28086 Faktor B ist eine weiße kristalline

Verbindur

schmilzt.

Verbindung (aus Aceton-Wasser), die bei etwa 150 - 153 ⁰C

Der Faktor B verfügt aufgrund einer massenspektrometrischen Bestimmung mit hoher Auflösung über ein scheinbares Molekulargewicht von 762, und es wird hierfür die empirische Formel ^C43^H7o°ii vorgeschlagen.

Das Infrarotspektrum des Faktors B in Chloroform geht aus Figur II der anliegenden Zeichnung hervor. Hierbei lassen sich folgende Absorptionsmaxima feststellen: 2,82, 3,30, 5,77, 5,85, 6,8O, 7,20, 7,50 (schwach), 7,72 (schwach), 7,80 (schwach), 8,57 (stark), 8,68, 8,90 (stark), 9,10, 9,50, 9,83 (stark), 9,90, 10,10, 10,17 (stark), 10,43, (schwach), 1O,8O (schwach), 11,20 (schwach), 11,35 (schwach), 11,73 (schwach) und 12,03 (schwach) Mikron.

Das ültraviolettspektrüm des Faktors B in Äthanol zeigt

1 % ein Absorptionsmaximum bei 220 m₇u (E₁ =137,5,

^l ι cm = 10 477).

Das magnetische KernresonanzSpektrum von A-28086 von Faktor B in Deuterochloroform ergibt folgende Charakteristiken:

5"7,2O, 7,09, 6,26, 6,15, 4,19, 4,12, 4,05, 3,95, 3,89, 3,78, 3,62, 3,59, 3,52, 3,48, 2,81, 2,73, 2,63, 2,54, 2,52, 1,99, 1,91, 1,84, 1,71, 1,67, 1,64, 1,55, 1,43, 1,33, 1,18, 1,11, 0,96, 0,94, O,9O, 0,87, O,84, 0,77, 0,74 und 0,68 ppm.

Das Antibioticum A-28086 Faktor B ist in einer Reihe organischer Lösungsmittel löslich, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, DimethylsuIfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol, es löst sich jedoch nur schwach in nichtpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Hexan, und ist in Wasser unlöslich.

509851/1153

Die chemische Struktur des Antibioticums A-28086 Faktor B ist bis jetzt zwar noch nicht aufgeklärt, doch ergeben die verfügbaren physikalischen Daten, daß dieser Faktor B über eine einzelne Carbonsäuregruppe, zwei Ketogruppen und eine oder mehrere Hydroxylgruppen verfügt.

Bei der Herstellung über S. aureofaciens NRRL 5758 wird das Antibioticum A-28086 Faktor D als geringerer Faktor gebildet. Erfolgt die Herstellung jedoch über S. aureofaciens NRRL 8092, dann ist das Antibioticum A-28086 Faktor D in einer Menge von bis zu 10 %, bezogen auf die gewonnene antibiotische Aktivität, vorhanden.

Das Antibioticum A-28086 Faktor D ist ein weißes kristallines Material (aus Wasser-Aceton) mit einem Schmelzpunkt von etwa 96 - 98 ⁰C. A-28086 Faktor D hat ein scheinbares Molekulargewicht von 778, und zwar bestimmt durch Massenspektrometrxe hoher Auflösung.

Die elementare Zusammensetzung des Maximums im Massenspektrum des Natriumsalzes von A-28086 Faktor D ergibt einen Wert von 8OO 5050 (berechnet für C₄₄H₇₃O₁₁Na = 800 5050). Im Massenspektrum läßt sich an der freien Säure von A-28086 Faktor D ein kleines Maximum bei 778 und ein größeres Maximum bei 760 5117 (berechnet für ^C44^H72°io = 760 5125) beobachten. Der im Massenspektrum der freien Säure erhaltene Wert m/e von 76O rührt vom Wasserverlust des Molekularions her. Die Molekularionenzusammensetzung der freien Säure des Antibioticums A-28086 Faktor D ist daher C₄₄H₇₄O_n.

Für A-28086 Faktor D wird daher die empirische Formel C₄₄H₇₄O₁₁ vorgeschlagen. Die Elementaranalyse des Faktors D ergibt folgende prozentuale Zusammensetzung: Kohlenstoff 67,59 %, Wasserstoff 9,38 %, Sauerstoff 22,77 %.

50 9851/1153

Die theoretische prozentuale Zusammensetzung für C₄₄H₇₄O₁₁ ist folgende: Kohlenstoff 67,87 %, Wasserstoff 9,51 %, Sauerstoff 22,77 %.

Das Infrarotabsorptionsspektrum von A-28086 Faktor D (Figur 8) enthält folgende beobachtbare Absorptionsmaxima: 2,89, 3,39, 3,43, 3,50, 5,88, 6,90, 7,27, 7,60, 7,84, 9,00, 9,26, 9,62, 10,31, 10,58, 11,10 und 11,49 Mikron.

Das Antibioticum Ä-28086 Faktor D zeigt in 95-prozentigem wässrigem Äthanol keine Ultraviolettabsorption.

Das magnetische Kernresonanzspektrum des Antibioticums A-28086 Faktor D in Deuterochloroform ergibt folgende Charakteristiken: <^6,00, 4,20, 4,10, 4,OO, 3,98, 3,92, 3,86, 3,83, 3,79, 3,67, 3,64, 3,57, 3,54, 2,88, 2,81, 2,71, 2,62, 2,58, 2,48, 2,43, 2,37, 2,29, 2,21, 2,15, 2,1O, 2,04, 1,97, 1,89, 1,83, 1,76, 1,68, 1,61, 1,58, 1,55, 1,47, 1,39, 1,30, 1,25, 1,18, 0,95, 0,90, 0,88, 0,84, O,74 und O,68 ppm.

Das Antibioticum A-28086 Faktor D ergibt nach Umkristallisieren aus Aceton-Wasser in Pulverform folgendes charakteristisches Röntgenbeugungsspektrum (Cu Strahlung, 1,5405-Λ,/ Nickelfilter, d = Interplanerabstand in Angström):

Relative Intensität

12,4O 100

10,20 70

8,85 90

7,80 3O

6,8O 10

6,3O 100

5,70 20

5,35 2O

50985 1/1153

Relative Intensität

5,10 20

4,9O 10

4,65 2O

4,45 40

4,20 30

3,3O 10

3,15 10

2,99 05

2,77 05

2,28 05

Die spezifische Drehung des Antibioticum A-28086 Faktor D ist -56 ° (c = 0,1, Methanol), und zwar gemessen bei einer Temperatur von 25 ⁰C.

Die elektrometrische Titration von A-28086 Faktor D in 80-prozentigem wässrigem Dimethylformamid ergibt die Gegenwart einer titrierbaren Gruppe mit einem pK -Wert von 8,67.

3.

Das Antibioticum 28086 Faktor D ist in einer Reihe organischer Lösungsmittel löslich, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol, in nichtpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Hexan, jedoch nur schwach löslich und in Wasser unlöslich.

Das Antibioticum A-28086 Faktor D hat eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion und verfügt über wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe.

509851/1153

Aufgrund der oben angegebenen physikalischen Eigenschaften läßt sich für das Antibioticum A-28086 Faktor D eine Struktur vorschlagen. Nachdem dieser Strukturvorschlag jedoch nur postuliert wird, soll die angegebene Struktur lediglich als Arbeitshypothese angesehen werden. Die für A-28086 Faktor D angenommene Struktur entspricht folgender Formel II:

509851/1153

H H

Vl O

509851 /1153

Hierin steht der Substituent R₁ für CH₃ und der Substituent R₂ für C₂H₅, oder der Substituent R- bedeutet C₂H₅ und der Substituent R₃ steht für CH₃.

Die R_f-Werte des Antibioticums A-28086 Faktoren A, B und D in verschiedenen papierchromatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus gehen aus folgender Tabelle I hervor.

S09851/1153

Tabelle

	ο 30 O	Faktor A	Rf-Werte	Faktor D
	Γ co -α	0,11	Faktor B	0,10
	m α	0,41	0,09	0,26
		0,54	0,16	0,36
50985 1 /	0,48 0,15	0,46	0,29 0,25
1 153	0,24 0,24	0,36 0,33	0,26 0,09
	0,75	0,51 0,11	0,64
		0,61

Lögungsmittelsystem

Mit Methylisobutylketon (MIBK) gesättigtes Wasser

Mit MIBK plus 2 % p-Toluolsulfonsäure sowie 1 % Piperidin gesättigtes Wasser

Wasser:Methanol:Aceton (12:3:1) mit NH₄OH auf

pH 10,5 eingestellt und dann mit H-PO- auf

j 4

pH 7,5 erniedrigt

1 % MIBK, 0,5 % NH₄OH in Wasser

17,4 g K₃HPO₄, 30 ml Äthanol pro Liter Wasser

Mit Wasser gesättigtes Benzol Wasser

Wasser:MIBK:Äthylacetat (98:1:1)

In Tabelle II sind die R_f-Werte für Antibioticum A-28086 Faktoren A, B und D in zwei dünnschichtchromatographischen Systemen auf Silicagel (vorbeschichtete Platten, E. Merk, Darmstadt, F-254, Schichtstärke 0,25 mm) angegeben, wozu als Detektionsorganismus wiederum B. subtilis ATCC 6633 verwendet wird.

Tabelle II

R_f-Werte

Faktor A Faktor B Faktor D

Lösungsmittelsystem

0,24

0,42

0,26

Benzol-Äthylacetat (3:2)

0,54

0,34

0,66

Äthylacetat-Diäthylamin (95:5)

Zusammen mit dem Antibioticum A-28086-Komplex wird eine weitere Substanz gebildet, die willkürlich als A-28O86-I bezeichnet wird. A-28O86-I ist zwar mikrobiologisch nicht wirksam, es ist jedoch strukturell zu den Faktoren den Antibioticums A-28086 verwandt. Bei A-18086-1 handelt es sich um eine weiße kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser) mit einem Schmelzpunkt von etwa 160 - 162 ⁰C. Vergleichsstudien der NMR-Spektren und anderer Eigenschaften von A-28O86-I mit synthetisch hergestelltem A-28086 Faktor A Methylester liefern den Beweis, daß es sich bei A-28O86-I um den Methylester von A-28086 Faktor A oder eine nahe verwandte Verbindung, wie ein Stereoismer, handelt.

509851/1 153

A-28O86-I fällt ursprünglich zwar zusammen mit den wirksamen Faktoren des Antibioticums A-28086 aus, läßt sich von diesem jedoch ohne weiteres durch Silicagelchromatographie trennen. A-28086-I hat einen ungefähren R_f-Wert von 0,53 im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel unter Verwendung von Äthylacetat als Eluiermittel und Vanillin als Sprühmittel (3 % Vanillin in Methanol + 0,5 ml konzentrierte Schwefelsäure pro 100 ml Lösung) zur Detektion. Nach Besprühen mit Vanillin und Erhitzen ergibt A-28086-1 einen blauen Fleck, während die Faktoren von Antibioticum A-28086 helle pinkfarbene Flecken ergeben, die rasch dunkelbräunlich-blau werden.

Antibioticum 28O86 Faktoren A, B und D sowie die angegebenen Acylesterderivate der Faktoren A und D sind zur Bildung von Salzen befähigt. Unter physiologisch unbedenklichen Salzen, bei denen es sich ebenfalls um pharmakologisch unbedenkliche Salze handelt, werden Salze verstanden, bei denen sich die Toxizität der Verbindung in bezug auf die Nichtsalzform gegenüber Warmblütern insgesamt nicht erhöht. Typische und geeignete Alkali- sowie Erdalklisalze von A-28086 Faktoren A und B sind beispielsweise die Natrium-, Kalium-, Lithium-, Cäsium-, Rubidium-, Barium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Geeignete Aminsalze von A-28086 Faktoren A und B sind unter anderem die Ammoniumsalze sowie die primären, sekundären und tertiären C.-C.-Alkylammonium- und Hydroxy-C^-C.-alkylaminoniumsalze. Beispiele von Aminsalzen sind diejenigen, die durch Umsetzung von A-28086 Faktoren A und B mit Ammoniumhydroxid, Methylamin, sec.-Butylamin, Isopropylamin, Diäthylamin, Diisopropylamin, Äthanolamin, Triethylamin, 3-Amino-1-propanol und dergleichen entstehen.

50985 1/1153

Die kationischen Alkali- und Erdalkalisalze von A-28086 Faktoren A, B und D und der Acylesterderivate der Faktoren A und D werden nach Verfahren hergestellt, wie sie zur Herstellung kationischer Salze üblich sind. Hierzu wird beispielsweise die freie Säure des antibiotischen Faktors oder Esterderivats in einem geeigneten Lösungsmittel, wie warmem Methanol oder Äthanol gelöst, worauf man eine die stöchiometrische Menge der gewünschten anorganischen Base in wässrigem Methanol enthaltende Lösung zu dieser Lösung gibt. Das auf diese Weise entstandene Salz kann in üblicher Weise isoliert werden, beispielweise durch Abfiltrieren oder Verdampfen des Lösungsmittels.

In ähnlicher Weise lassen sich auch die Salze organischer Amine herstellen. Hierzu kann man beispielsweise das gasförmige oder flüssige Amin zu einer Lösung geben, die den antibiotischen,Faktor in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Aceton, enthält, worauf man das Lösungsmittel und den Überschuß an Amin durch Verdampfen entfernen kann.

Es ist in der Veterinärmedizin bekannt, daß die Form des Antibioticums nicht signifikant ist, wenn man ein Tier mit dem Antibioticum behandelt. In den meisten Fällen wird der Wirkstoff durch die im Tier herrschenden Bedingungen zu Formen verändert, die anders sind als die verabreichten Formen. Die Salzform, in der sich der Wirkstoff verabfolgen läßt, ist daher für das Behandlungsverfahren nicht signifikant. Die Salzform kann jedoch aus Gründen der Wirtschaftlichkeit, der bequemen Anwendungsart und der günstigen Toxizität gewählt werden.

Das Antibioticum A-28086 Faktor A bildet Acylesterderivate. Zu einer Veresterung kommt es an den Hydroxygruppen von A-28086 Faktor A nach Behandeln mit einem C₃-C₆-Säureanhydrid

509851 /1153

oder Säurechlorid. Solche Ester werden am besten hergestellt, indem man A-28086 Faktor A bei Raumtemperatur beispielsweise mit dem entsprechenden Säureanhydrid umsetzt. Diese Esterderivate eignen sich ebenfalls als Antibiotica und Mittel zur Verbesserung der Futterutilisation.

Die Eigenschaften der Acylesterderivate von A-28086 Faktor A werden im folgenden näher beschrieben. Das A-28086 Faktor A Acetlyesterderivat ist eine weiße kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser) mit einem Schmelzpunkt von etwa 1OO - 103 ⁰C. Das Acylesterderivat von A-28086 Faktor A hat eine empirische Formel von ^C45^H74°i2 ^{und ein} Molekulargewicht von etwa 807, bezogen auf die für A-28086 Faktor A vorgeschlagene empirische Formel. Die Elementaranalyse des Acetylesterderivats von Faktor A ergibt folgende prozentuale Zusammensetzungi

^C45^H74°12^:

berechnet: C 66,97; H 9,24; O 23,79; gefunden: C 67,67; H 8,71; 0 23,13.

Das Infrarotspektrum von A-28086 Faktor A Acetylesterderivat in Chloroform geht aus Figur 3 der anliegenden Zeichnung hervor. Hierbei lassen sich folgende Absorptionsmaxima beobachten: 2,85, 3,36, 3,38 (stark), 5,80, 6,83, 7,25, 7,52 (stark), 7,6O (schwach), 7,80 (stark), 8,45 (stark), 8,80 (stark), 8,95 (stark), 9,10 (stark), 9,20, 9,63, 9,80 (stark), 10,12 (schwach), 10,25 (schwach) und 10,50 Mikron.

Das ültravxolettspektrum von A-28086 Faktor A Acetlyester in Äthanol zeigt lediglich eine Endabsorption.

Die elektrometrische Titration von A-28086 Faktor A Acetylesterderivat in 80-prozentigem wässrigem Dimethylformamid zeigt die Gegenwart einer titrierbaren Gruppe mit einem pK -Wert von 8,5.

50985 1/1153

Das A-28086 Faktor A Propionylesterderivat ist eine weiß kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser) mit einem Schmelzpunkt von etwa 96 - 98 ⁰C. Das Propionylesterderivat von A-28086

hat eine empirische Formel von ^C46^H7g°i2 ^un(* ^e*ⁿ gewicht von etwa 821, bezogen auf die für A-28086 Faktor A vorgeschlagene empirische Formel. Die Elementaranalyse von Faktor A Propionylesterderivat ergibt folgende prozentuale Zusammensetzung:

^C46^H76°12^:

berechnet: C 67,29; H 9,33;.O 23,38; gefunden: C 66,06; H 9,17; O 23,41.

Das Infratorspektrum des Propionylesterderivats von A-28086 Faktor A in Chloroform geht aus Figur 4 der anliegenden Zeichnung hervor. Hieraus lassen sich folgende Absorptionsmaxima beobachten: 2,85, 3,33, 3,38 (stark), 3,45 (stark), 5,75 (stark), 5,82, 6,81, 7,22, 7,30 (stark), 7,5O (schwach), 7,60 (schwach), 7,80, 8,43, 8,75 (stark), 8,90, 9,05,-9,15 (stark), 9,50 (stark), 9,63, 9,83 (schwach), 10,05 (stark), 10,13, 10,2O (stark), 10,45 und 1O,68 Mikron.

Das Ultraviolettspektrum des Propionylesterderivats von A-28086 Faktor A in Äthanol zeigt lediglich eine Endabsorption. ·

Das Butyrylesterderivat des Antibioticums A-28086 Faktor A ist eine weiße kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser) mit einem Schmelzpunkt von etwa 96-98 ⁰C. Der Butyrylester von A-28O86 Faktor A hat die empirische

Formel ^C47^H7q^o12' ^e*^{n M}°l-^e^^ul^ar?^ewi^cht von etwa 835 und eine ungefähre Zusammensetzung von 67,60 % Kohlenstoff, 9,41 % Wasserstoff und 22,99 % Sauerstoff, und zwar auf Basis der für A-28086 Faktor A vorgeschlagenen empirischen For mel.

50985 1/1153

Das Infrarotspektrum für den Butyrylester von A-28086 Faktor A in Chloroform geht aus Figur 5 der anliegenden Zeichnung hervor. Hierin lassen sich folgende Absorptionsmaxima beobachten: 2,89, 3,40, 3,45, 3,51, 5,85, 5,92 (stark), 5,97 (stark), 6,90, 7,30, 7,84 (schwach), 8,55, 8,85 (schwach), 9,01 (stark), 9,26, 9,76, 9,95, 10,31 und 10,64 Mikron.

Der Valerylester des Antibioticums A-28086 Faktor A ist eine weiße kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser) mit einem Schmelzpunkt von etwa 173 bis 175 C. Der Valerylester von A-28086 Faktor A hat die empirische Formel ^C48^H80°12' ^{ein Molekular}9^{ewicnt von} etwa 849 und eine ungefähre Zusammensetzung von 67,89 % Kohlenstoff, 9,50 % Wasserstoff und 22,61 % Sauerstoff, und zwar auf Basis der für A-28086 Faktor A vorgeschlagenen empirischen Formel.

Das Infrarotspektrum für den Valerylester von A-28086 Faktor A in Chloroform geht aus Figur 6 der anliegenden Zeichnung hervor. Hierin lassen sich folgende Absorptionsmaxima beobachten: 2,9OV 3,40, 3,45, 3,51, 5,87, 5,92, (stark), 5,99 (stark), 6,91, 7,30, 7,69 (schwach), 7,87, (schwach), 8,16, 8,58, 8,85 (schwach), 9,26, 9,76, 1O,OO (schwach), 1O,31 und 10,64 Mikron.

Der Caproylester des Antibioticums A-28086 Faktor A ist eine weiße kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser) mit einem Schmelzpunkt von etwa 163 - 167 ⁰C. Der Caproylester von A-28O86 Faktor A hat die empirische Formel ^C49^H82°12' ^e^^{n M}°l^ekul^ar9^{ewicnt von} etwa 863 und eine ungefähre Zusammensetzung von 68,18 % Kohlenstoff, 9,58 % Wasserstoff und 22,24 % Sauerstoff, und zwar auf Basis aus der für A-28086 Faktor A vorgeschlagenen empirischen Formel.

509851/1153

Das Infrarotspektrum für den Caproylester von A-28O86 Faktor A in Chloroform geht aus Figur 7 der anliegenden Zeichnung hervor. Hierin lassen sich folgende Absorptionsmaxima beobachten: 2,90, 3,40, 3,45, 3,51, 5,87, 5,92 (stark), 5,97 (stark), 6,90, 7,30, 7,66 (schwach), 7,84 (schwach), 8,16, 8,58, 8,85 (schwach), 9,05 (stark), 9,17, 9,72, 9,95, 10,29 und 10,62 Mikron.

Die Acylierung von A-28086 Faktor A ergibt folgende Veränderungen in dem Η-magnetischen Kernresonanzspektrum: Die bei etwa 4 ppm auftretende Carbinylresonanz wird um etwa 5,3 ppm nach unten verschoben (die genaue Position schwankt bei den verschiedenen AcyIderivaten etwas), und die Signale des Vinylprotons werden ebenfalls verschoben. Dies ist charakteristisch für die Änderung, wie sie aus folgender Partialstruktur hervorgeht:

RCOX

Der Substituent R steht für

Die obige Teilstruktur stimmt völlig mit H-homonuclearen Entkopplungsversuchen und dem

kernmagnetischen Nachweis von C für die Acetyl- und Propionylesterderivate überein.

509851/1153

Die C₂-Cg-Acylesterderivate von A-28086 Faktor A sind in einer Reihe organischer Lösungsmittel löslich, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol, lösen sich in nichtpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Hexan, jedoch nur schwach und sind in Wasser unlöslich.

Jedes der C₂-Cg-Acylesterderivate von A-28086 hat eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion.

Die neuen Antibiotica werden hergestellt, indem man einen A-28086 produzierenden Stamm von Streptomyces aureofaciens submers unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium bis zur Bildung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität züchtet. Die Antibiotica werden unter Einsatz verschiedener Isolations- und Reinigungstechniken gewonnen, wie sie auf diesem Gebiet üblich sind.

Einer der zur Herstellung der Antibiotica A-28086 geeigneten neuen Organismen wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die am Berg Ararat in der Türkei gefunden wurde. Dieser Organismus ist als Stamm von Streptomyces aureofaciens Duggar klassifiziert, wie er von E. B. Shirling und D. Gottlieb in "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces III, Additional Species Descriptions from First and Second Studies, "Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 18, 297-392 (1968) beschrieben ist. Diese Klassifikation beruht auf Methoden, wie sie für das International Streptomyces Projekt /E'.B. Shirling und D. Gottlieb "Methods for Characterization of Streptomyces species," Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 16, 313-34O (1966j_/ zusammen mit bestimmten Ergänzungsuntersuchungen empfohlen werden. Die Zuordnung' der Farbnamen erfolgt nach der ISCC-NBS-Methode (K.L. Kelly und D. B. Judd, "The ISCC-NBS Method of Designating Color and a Dictionary of Color Names," U. S. Dept. of

509 851/1153

Commerce, Circ. 553, 1955, Washington, D. C). Die in Parenthese angegebenen Zahlen beziehen sich auf die Farbtafeln von Tresner und Backus /Tresner, H. D. und S. J. Backus, "System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy," Appl. Microbiol. 11, 335 - 338 (1963]/. Die FarbstreifenbeStimmungen sind unterstrichen. Die entsprechenden Werte nach den Farbtabellen von Maerz und Paul (A- Maerz und M. R. Paul, "Dictionary of Color," McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, N.Y., 1950) sind in Klammern angegeben. Die entsprechenden Kulturen läßt man 14 Tage bei 30 ⁰C wachsen, sofern nichts anderes gesagt ist.

Charakterisierung des A-28086 produzierenden Stammes NRRL 5758 Morphologie

Die sporulierenden Lufthyphen bestehen aus Haaken, Schlaufen und offenen Spiralen. Es wurde ferner eine für rectus flexibilis atypische Morphologie beobachtet. Die Sporen sind kurz und zylindrisch und liegen in Ketten aus 10 bis 50 Sporen vor. Die Sporen messen 1,3 ,u χ 1,75 ,u mit einem Bereich von 1,3 .u bis 1,95 ,u χ 1,3 »u. Die
Sporenoberfläche ist aufgrund einer elektronenmikroskopischen Beobachtung glatt.

509851 /1153

Kulturcharakteristiken von NRRL 5758 auf verschiedenen Medien

Medium Charakteristiken

ISP ß2 (Hefeextrakt-Malzextrakt)

ISP ß3 (Hafermehl)

ISP ß4 (anorganische Salze-Stärke-Agar) Reichliches Wachstum, Unterseiten mäßig gelb /11K3/, ausreichendes bis gutes Luftmycel und ausreichende bis gute Sporulation, weiß (W) 13 ba sowie dunkelgrau (Gy) 3ih, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Unterseite gräulichgelb /11B2/, ausreichendes Luftmycel (Gy), dunkelgrau, 3 ih, leicht braunes lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite leicht gelbbraun /12E5/, Luftmycel und Sporen (W) purpurartig weiß 13 ba bis (Gy) hellgrau d, kein lösliches Pigment

ISP ß5 (Glycerin-Asparagin-Agar

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar

Gutes Wachstum, Unterseite fahlgelbgrün /1OBV, gutes Luftmycel und gute Sporen (Gy), gelblich grau 2 de bis hellgräulich rötlichbraun 5 fe, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite hell gelblichbraun /13HJ// ausreichendes bis gutes Luftmycel und entsprechende Sporen (W) weiß a bis (Gy) mittelgrau g, sehr hellbraunes lösliches Pigment

50985 1/1153

Kulturcharakteristiken von NRRL 5758 auf verschiedenen Medien

(Fortsetzung)

Medium Charakteristiken

Glycerin-Glycin-Agar Reichliches Wachstum, Unterseite dunkelgräulichgelb /12J6/, gutes Luftmycel und entsprechende Sporen (Y) fahlgelb 2 db, kein lösliches Pigment

Glycose-Asparagin-Agar Nähr-Agar

Reichliches Wachstum, Unterseite gräulich-grünlichgelb /12E2/ reichliches Luftmycel und entsprechende Sporen (Gy) gelblichgrau 2 de, sehr hellbraunes lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Unterseite gräulichgelb /12B2/, Luftmycel und Sporen, wegen schlechten Wachstums keine Farbbestimmung, kein lösliches Pigment

Bennett-Agar

Calciummaleat-Agar Reichliches Wachstum, Unterseite gräulich gelb /12KV, spärliches Luftmycel und entsprechende Sporen (Gy) gelblichgrau 2 de, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Unterseite gräulichbraun /15C8/, kein Luftmycel und keine Sporulation, braunes lösliches Pigment, die Fläche klärt sich durch Inokulum auf

509851 /1153

Kulturcharakteristiken von NRRL 5758 auf verschiedenen Medien

(Fortsetzung)

Medium Charakteristiken

Czapek-Lösung-Ägar Schlechtes Wachstum, aufgrund dieses schlechten Wachstums keine Farbbestimmung

Emerson-Agar Tyrosin-Agar Reichliches Wachstum, Unterseite gräulich gelb /11JV, kein Luftmycel und keine Sporen, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite hellolivbraun /14C4/, reichliches Luftmycel und entsprechende Sporen von (W) b (Zentrum) bis (Gy) hellbräunlichgrau 3 fe (an der Grenze), sehr hellbraunes lösliches Pigment

Trypton-Hefe-Agar Spärliches Wachstum, keine Farbbestimmung

Der Organismus NRRL 5758 wurde nach Standardverfahren hinsichtlich bestimmter physiologischer Eigenschaften untersucht. Hierbei wurden folgende Eigenschaften·untersucht und folgende Charakteristiken gefunden:

609851 /1153

Beobachtete Eigenschaften

Charakteristiken

Wirkung auf Milch

Die Milch peptonisiert, es ist ein weißer Wachstumsring zu sehen, die geklärte Fläche ist lohfarben gelb, der pH-Wert liegt bei 5,7

Nitratreduktion

Positiv

Nährgelatine

30 % Verflüssigung nach 14 Tagen

Melaninpigment-Produktion:

Tyro s in-S ehrägagar

Äußerst schwach positiv (Pigment nach 4 Tagen)

Difco-Pepton-Hefeextrakt- Negativ Eisen-Schrägagar

Trypton-Hefeextrakt-Brühe Negativ

Temperaturer fordern!sse (ISP Medium β2 Hefeextrakt-Malzextrakt-Schrägen)

Bei 26 bis 30 ⁰C gutes Wachstum, bei 30 bis 37 ⁰C hervorragendes Wachstum und Sporulation, bei 45 ⁰C leicht vegetatives Wachstum, rötliches lösliches Pigment

Unter Verwendung des Organismus NRRL 5758 wurden au<?h Untersuchungen über die KohlenstoffVerwertung durchgeführt, und diese Ergebnisse sind im folgenden angegeben. Die dabei verwendeten Symbole haben folgende Bedeutungen:

+ = gutes Wachstum, positive Verwertung

(+) = schlechtes bis ausreichendes Wachstum

(-) = schwaches Wachstum, möglicherweise keine Verwertung

- = kein Wachstum, keine Verwertung

509851/1153

Verhalten

Kohlenstoffquelle

D-Glucose L-Arabinose D-Xylose D-Fructose Saccharose D-Manriit i-Inosit Rhamnose Raffinose -C Kontrolle

(kein Kohlehydrat)

Durch eine Reihe natürlicher Selektionen, an die sich eine chemische Mutation anschließt, wird von S. aureofaciens NRRL 5758 auch ein zweiter neuer A-28086 produzierender Organismus abgeleitet. Dieser Organismus wird als NRRL 8092 bezeichnet, und er ist ebenfalls als Stamm von Streptomyces aureofaciens Duggar klassifiziert. Die Klassifikation beruht auf Studien des Organismus NRRL 8092 unter Verwendung der oben beschriebenen Klassifikationsmethoden für Streptomyces und ähnlicher Wachstumsbedingungen. Die bei diesen Untersuchungen für den Organismus NRRL 8092 beobachteten Charakteristiken gehen aus den folgenden Ausführungen hervor.

Charakterisierung des A-28086 produzierenden Stammes NRRL 8092 Morphologie

Auf Medium ISP ß7 (Tyrosin-Agar) bildet die Kultur gelegentlich Schlaufen, es entstehen vorwiegend jedoch kurze gerade Sporophoren. Die Sporenketten bestehen aus weniger als 1O Sporen pro Kette, nämlich normalerweise 4 bis 7 Sporen pro Kette.

509851 /1153

In folgenden Medien lassen sich kurze gerade Sporenketten beobachten: ISP ß3, Czapek-Lösung-Agar und ISP ß5. Auf Emerson-Agar kann eine reichliche Cpremia beobachtet werden. Auf Tyrosin-Agar (ISP ß7) und Glucose-Asparagin-Agar werden auch Untersuchungen im Elektronenmikroskop durchgeführt. Die Sporen sind glatt und 1,2 bis 2,0 ,u lang und haben einen Durchmesser von etwa 1,0 /U. Die mittlere Sporengröße beträgt 1,6 ,u χ 1,0 ,u.

50985 1/1153

Kulturcharakteristiken von NRRL 8092 auf verschiedenen Medien

Medium Charakteristiken

ISP ß2 (Hefeextrakt-Malzextrakt)

ISP ß3 (Hafermehl) Ausreichendes Wachstum, Unterseite hellgelbbraun /12H8/, ausreichendes Luftmycel, schlechte Sporulation, Luftmycel fahlgrau /11A1/, kein lösliches Pigment

Spärliches Wachstum, Unterseite hyalin, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

ISP ß4 (anorganische Salze-Stärke-Agar

ISP ß5 (Glycerin-Asparagin-Agar) Mäßiges Wachstum, Unterseite gräulichgelb /11B2/, spärliches Luftmycel und spärliche Sporulation, Luftmycel fahlgelbgrau /1OAjI/, kein lösliches Pigment

Mäßiges Wachstum, Unterseite fahlgelb /10F2/, ausreichendes Luftmycel, spärliche Sporulation, Luftmycel weiß /10A1/, kein lösliches Pigment

Tomatopaste-Hafermehl-Ager

Glycerin-Glycin-Agar Mäßiges Wachstum, Unterseite gräulich grüngelb, ausreichendes Luftmycel, mäßige Sporulation, hellfahlgrau /53A2/, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite gräulich gelb /11E4/, mäßiges Luftmycel, weiß _/iOA_1_/, keine Sporulation, kein lösliches Pigment

985 1/1153

Kultnrcäaarakteristike»!

■BBI. 8Ο92 auf verschiedenen Medien

fFartsetzang)

-Asparagin-Agar

Bähr-Agax

Bennett—Agar Calcium! iliit- Czapek—Losung BBerson—Agar Tyrosin—Agar Trypton—Befe-Agar Charakteristiken

Mäßiges Warhstna, Unterseite fahlgelb /1OFS-/» mäßiges Iael and Mäeige Sporalation, veiB JTiOAt/', kein löslidies Piijiiil

Spärl äcnes VaclistiHi, Unterseite fanlgell» /1OB2/, kein Loftaiycel, kein lösüdies

Leidlicfaes Wacnstnai, Unterseite nittelgelb-pink /11*7/, sehr sparlicnes laft-■■ycel, keine S^oanilati cn, kein lösücbes Pigment

HnBerst spärliches Nachstxan, hyalin, kein lcel, kein lösliches Piganexit

SnBerst spärliches Kacfastxaa, Onterseite hyalin, kein Loftnycel, kein losliches

Mäßiges MacfastOB, Unterseite granlich— gelb /1115/, fleckiges iaftaeycel, keine S^porolation, kein lösliches Pigeent

MäBiges Itachstxoi, Unterseite hellgelbbEraam /12B6/, aäBiges Dnftatycel, leicht fahlgraner Band /53A2/, SentroB nahezu WEiIB, fällige Spaxnlation, kein lösliches Pigment

füoflerst spärliches HachstisB, hyalin, kein iaitmycel, kein lösliches Pigment

509851/1153

ORIGINAL INSPECTED

Der Organismus NRRL 8092 wird ferner nach Standardverfahren hinsichtlich bestimmter physiologischer Eigenschaften untersucht. Hierbei werden folgende Eigenschaften beobachtet und folgende Charakteristiken gefunden:

509851/1153

Beobachtete Eigenschaften Charakteristiken

Wirkung auf Milch

Nitratreduktion Nährgelatine

Melaninpigment-Produktion auf:

Tyronsin-Schrägager

Trypton-He f eextr akt-Brühe

Karotten

Kartoffel

Temperaturerfordernisse (ISP Medium ß2 Hefeextrakt-Malz extrakt-Schrägen)

Peptonisiert (90 %), fahlgelber Wachstumsring, geklärte Fläche fahlgelb, pH-Reaktion 4,6

Positiv

5O % innerhalb von 14 Tagen hydrolysiert

Äußerst schwach positiv

Negativ

Reichliches Wachstum, fahlgelb, kein Luftmycel

reichliches Wachstum, gräulichweiß, kein Luftmcel, keine Veränderung

Bei 25 ⁰C reichliches Wachstum, ausreichendes Luftmycel, Unterseite hellbraun, kein lösliches Pigment

Bei 30 ⁰C reichliches Wachstum, ausreichendes Luftmycel, Unterseite hellbraun, kein lösliches Pigment

Bei 37 ⁰C reichliches Wachstum, ausreichendes Luftmycel, Unterseite braun, kein lösliches braunes Pigment

Bei 40 ⁰C reichliches Wachstum, spärliches Luftmycel, Unterseite rotbraun, tiefrotbraunes lösliches Pigment

Bei 45 ⁰C ausreichendes Wachstum, kein Luftmycel, Unterseite rotbraun, mittelmäßig rotbraunes Pigment

509851/1153

Der Organismus NRRL 8O92 wird auch hinsichtlich seiner Kohlenstoff verwertung untersucht, und die dabei erhaltenen Ergebnisse sind im folgenden zusammengestellt. Die hierzu verwendeten Symbole haben folgende Bedeutungen:

+ = gutes Wachstum, positive verwertung

(+) = schlechtes bis ausreichendes Wachstum

(-) = schwaches Wachstum, möglicherweise kein Verwertung

— = kein Wachstum, keine Verwertung

Kohlenstoffquelle Verhalten

D-Glucose +

L-Arabinose +

D-Xylose +

D-Fructose +

Saccharose · —

D-Mannit —

i-Isosit +

Rhamnose +

Raffinose -

-C Kontrolle

(kein Kohlehydrat}

Bestimmte Charakteristiken der A-28O86 produzierenden Stämme von S. aureofaciens unterscheiden sich von den Charakteristiken des von Shirling und Gottlieb beschriebenen Organismus. Diese Unterschiede gehen aus der folgenden Tabelle III hervor.

509851/1153

T a b e 1 1 e III

Kohlenstoffverwertung

NRRL 5758

NRRL 8092 veröffentlichte Beschreibung

Saccharose

i-Inosit cn

oo Rhamnose cn

Gelatineverflüssigung 30 % in 14 Tagen 50 % in 14 Tagen begrenzt oder keine

Wirkung auf Milch

Milch peptonisiert, weiße Wachsturnsringe

Milch peptonisiert, fahlgelbe Wachstumsringe begrenzte oder variable
Peptonisierung (oft keine),
beschränktes Wachstum und
begrenzte Koagulation

- 48 -

ro

cn ro cn O CD

cn

Die Charakteristiken des Organismus NRRL 5758, die von den Charakteristiken des Organismus NRRL 8092 verschieden sind, sind in der folgenden Tabelle IV zusammengefaßt.

509851 /1153

Tabelle IV

Charakteristiken

NRRL 5758

NRLL 8092

Vegetative Farbe

Spekulation

gelb auf mehreren Medien

einige spiralenförmige Sporophoren auf Medien

5098	Wachstum auf:	aus Tomatenpaste: Hafer mehl und anorganischen Salzen-Stärke
cn	Calciummalat
cn	anorganische Salze-Stärke	ausreichendes Wachstum, braun, Klärung
co	Bennett-Agar	mäßige Sporulation, Luftmycel purpurweiß bis grau
	Unterseite fahlgelb

cremefarben bis fahlgelb
auf mehreren Medien

kurze gerade Sporophoren
mit gelegentlichen Schlaufen

spärliches Wachstum,
klar, keine Klärung

mäßige Sporulation,
Luftmycel fahlgelbgrau

Unterseite pinkfarben

- 50 -

cn ro cn ο

Die zur Produktion von A-28086 Antibiotica geeigneten Streptomyces aureofaciens wurden hinterlegt und in die Kultursammlung von Northern Marketing and Nutrition Research Division, U.S. Dept. of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604 aufgenommen, und sie können von dort unter den Nummern NRRL 5758 sowie NRRL 8092 frei bezogen werden.

Zum Wachsen von Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 und Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 läßt sich irgendein Kulturmedium verwenden. Aus Gründen der günstigen Produktion, einer optimalen Ausbeute und einer leichten Isolierung des Produkts werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Für eine großtechnische Fermentation werden daher als Kohlehydratquellen beispielsweise Tapiocadextrin und Saccharose bevorzugt, man kann jedoch auch Glucose, Maisstärke, Fructose, Mannose, Maltose, Lactose und dergleichen verwenden. Andere geeignete Kohlenstoffquellen sind Maisöl, Erdnußöl, Sojabohnenöl sowie Fischöl. Eine bevorzugte Stickstoffquelle ist ein enzymhydrolysiertes Casein, es können hierfür jedoch auch Peptone, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, und dergleichen verwendet werden. Zu den anorganischen Nährsalzen, die man den Kulturmedien zusetzen kann, gehören die üblichen löslichen Salze, die Natrium-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat-, Nitrat- und ähnliche Ionen liefern.

Die zum Wachsen und zur Entwicklung der Organismen erforderlichen essentiellen Spurenelemente können auch in dem Kulturmedium vorhanden sein. Solche Spurenelemente treten normalerweise als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen auf, die den zum Wachsen des Organismus erforderlichen Bedürfnissen genügen. Steht man bei der großtechnischen Fermentation vor dem Problem einer Schaumbildung, dann empfiehlt es sich, solchen Fermentationsmedien geringe Mengen (nämlich 0,2 ml/1) eines Antischaummittels zuzusetzen, wie Polypropylenglycol.

5098 51/1153

Die Produktion der Antibioticum A-28086 produzierenden Stämme von Streptomyces aureofaciens läßt sich durch Zusatz einer geringen Menge eines Öls, wie Sojabohnenöl, verbessern, obgleich dies nicht wesentlich ist.

Zur Produktion wesentlicher Mengen der Antibiotica A-28086 wird eine submerse Fermentation unter aeroben Bedingungen in Tanks bevorzugt. Geringe Mengen der Antibiotica A-28086 lassen sich auch durch Schüttelflaschenkultur herstellen. Wegen der zeitlichen Verzögerung, zu der es bei der üblichen Produktion von Antibiotica durch Inokulation großer Tanks mit der Sporenform des Organismus kommt, geht man' vorzugsweise von einem vegetativen Inokulum aus. Das vegetative Inokulum wird hergestellt, indem man eine geringe Menge Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstticken des Organismus inokuliert, wodurch man eine frische aktiv wachsende Kultur des Organismus erhält. Das vegetative Inokulum wird dann in einen größeren Tank übertragen. Zum Anwachsen des vegetativen Inokulums kann man das gleiche Medium verwenden wie auch für größere Fermentationen, man kann jedoch auch mit anderen Medien arbeiten.

Die A-28086 produzierenden Organismen kann man bei Temperaturen zwischen etwa 20 und etwa 40 ⁰C wachsen lassen. Zu einer optimalen Produktion an A-28086 kommt es anscheinend bei Temperaturen von etwa 27 bis 30 °C.

Wie bei aeroben Submers-Kulturverfahren üblich, wird auch beim erfindungsgemäßen Verfahren Luft durch das Kulturmedium geblasen. Für ein ausreichendes Wachstum des Organismus sollte man bei der Tankproduktion mit einem Luftvolumen von vorzugsweise über 0,1 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute arbeiten. Für eine wirksame Produktion der A-28086 Antibiotica sollte das bei der Tankproduktion angewandte Luftvolumen vorzugsweise über 0,25 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute betragen. Durch höhere Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff wird die Bildung von Antibioticum nicht herabgesetzt.

50985 1/1153

Die Produktion an Antibiotica kann während der Fermentation überwacht werden, indem man Proben der Brühe oder von Extrakten der Mycelfeststoffe gegenüber Organismen, von denen man weiß, daß sie gegenüber den Antibiotica empfindlich sind, hinsichtlich ihrer antibiotischen Wirksamkeit untersucht. Ein derartiger zur Untersuchung der erfindungsgemäßen Antibiotica geeigneter Testorganismus ist Bacillus subtilis ATCC 6633. Der Bioversuch wird am besten unter Verwendung von Papierblättchen auf Agarplatten durchgeführt.

Der pH-Anfangswert der nichtbeimpften Kultur schwankt in Abhängigkeit von dem verwendeten Medium. Der pH-Wert sollte im allgemeinen zwischen 6,0 und 7,5 liegen. Der pH-Wert am Ende der Fermentation, bei dem das Produkt geerntet wird, ist normalerweise, etwa höher, und er beträgt 6,5 bis 8,0.

Eine antibiotische Wirksamkeit läßt sich im allgemeinen am zweiten Tag der Fermentation feststellen. Zu einer maximalen Produktion an antibiotischer Aktivität kommt es zwischen etwa dem sechsten und dem zehnten Tag.

Nach erfolgter Produktion unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen kann man die oben beschriebenen A-28086 Antibiotica aus dem Fermentationsmedium in hierzu üblicher Weise gewinnen. Die während der Fermentation eines A-28086 produzierenden Organismus gebildete antibiotische Aktivität tritt sowohl in der Mycelmasse als auch der filtrierten Brühe auf. Maximal lassen sich die A-28086 Antibiotica daher durch eine Kombination von Methoden gewinnen, zu denen eine FitIration, Extraktion sowie Absorptionschromatographie gehört. Ein bevorzugtes Lösungsmittel zur Abtrennung der A-28086 Antibiotica entweder aus der ganzen oder aus der filtrierten Fermentationsbrühe ist Äthylacetat, es reichen für diesen Zweck jedoch auch andere hierfür normalerweise verwendete Lösungsmittel aus.

509851 /1153

Ein besonders zweckmäßiges Verfahren zur Abtrennung der A-28086 Faktoren A, B und D besteht in der Erniedrigung des pH-Wertes der gesamten Fermentationsbrühe auf etwa pH 3,0. Bei diesem pH-Wert von 3,0 lassen sich A-28086 Faktoren A, B und D von der Mycelmasse mühelos durch Filtrieren trennen. Ein anderes günstiges Verfahren zur Abtrennung der A-28086 Faktoren besteht in einem Zusatz eines Bicarbonats, wie Natriumbicarbonat, zu der Gesamtbrühe, und zwar in Mengen von etwa 1 g pro Liter. Die A-28086 Faktoren können hierzu auch in Salzform von der Mycelmasse abgetrennt werden. Zur Abtrennung der Antibiotica aus der Mycelmasse wird Methanol als Lösungsmittel bevorzugt, es können hierzu jedoch auch andere niedere Alkohole und Ketone verwendet werden.

Die Gewinnung der A-28086 Antibiotica kann zweckmäßigerweise auch durch azeotrope Destillation vorgenommen werden. Hierzu versetzt man die wässrige Fermentationsbrühe mit einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser ein geeignetes Azeotrop bildet. Dieses Gemisch aus Lösungsmittel und Fermentationsbrühe wird dann zur Entfernung wenigstens der Hälfte des Wassers aus der Brühe azeotrop destilliert, wodurch ein Gemisch aus Wasser und Lösungsmittel zurückbleibt, bei dem die A-28086 Antibiotica in dem organischen Lösungsmittel gelöst sind. Unlösliche Nebenprodukte lassen sich in geeigneter Weise abtrennen, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Die A-28086 Antibiotica können anschließend aus der organischen Lösung in bekannter Weise gewonnen werden, beispielsweise durch Verdampfen des Lösungsmittels, Ausfällen unter Zugabe eines Nichtlösungsmittels oder Extraktion.

Organische Lösungsmittel, die mit Wasser ein zur Durchführung eines derartigen Gewinnungsverfahrens geeignetes Azeotrop bilden, sind Butylalkohol, Amylalkohol, Hexylalkohol, Benzylalkohol, Butylacetat, Ämylacetat, 1,2-Dichloräthan, 3-Pentanon, 2-Hexanon, Benzol, Cyclohexanon, Toluol, die Xylole und dergleichen.

509851 /1153

Die Gewinnung durch azeotrope Destillation bietet einen besonderen Vorteil bei großtechnischen Fermentationsverfahren. Sowohl Wasser als auch Lösungsmittel, die beide über Kopf im Azeotrop abgezogen werden, können durch bekannte Verfahren voneinander getrennt und dann zur weiteren Verwendung wieder rückgeleitet werden. Das auf diese Weise entfernte Wasser ist frei von Verunreinigungen und muß daher vor seiner Weiterleitung als Abwasser nicht zusätzlich behandelt werden. Das dabei entfernte Lösungsmittel kann in das Verfahren rückgeleitet werden.

Die weitere Reinigung der A-28086 Antibiotica besteht in einem zusätzlichen Extraktions- und Adsorptionsverfahren. Hierzu werden zweckmäßigerweise adsorptionsfähige Materialien eingesetzt, wie Silicagel, Aktivkohle, Florisil (Magnesiumsilicat, Floridin Co., P.O. Box 989, Tallahassee, Fla.) und dergleichen.

Wahlweise kann man die Feststoffe der Kulturbrühe unter Einschluß der Bestandteile des Mediums sowie des Mycels auch ohne Extraktion oder Abtrennung als Quelle für die A-28086 Antibiotica verwenden, wobei vorzugsweise jedoch zuerst das Wasser abgetrennt wird. So kann man das Kulturmedium nach Produktion der A-28086-antibiotischen Aktivität, beispielsweise durch Lyophilisieren trocknen und direkt mit einem Futtervorgemisch vermischen.

Das Mycelium kann jedoch nach Produktion der A-28086 Aktivität in dem Kulturmedium abgetrennt und getrocknet werden, wodurch man ein Produkt erhält, das sich direkt als Futtervorgemisch verwenden läßt. Wird das Mycel zu diesem Zweck abgetrennt, dann läßt sich das Ganze durch Zugabe von Calciumcarbonat (etwa 1O Gramm pro Liter) besser filtrieren, und man erhält zugleich ein besseres getrocknetes Produkt.

Unter den bis jetzt angewandten Bedingungen produzieren die oben beschriebenen Stämme von Streptomyces aureofaciens, die

50985 1/1153

mit den Nummern NRRL 5758 sowie NRRL 8092 bezeichnet werden, das Antibioticum A-28086 Faktor A als überwiegenden Faktor. Das Verhältnis der Faktoren schwankt zwar in Abhängigkeit von den angewandten Fermentationsbedingungen, doch macht der Faktor A im allgemeinen mehr als 99 % der gesamten aus NRRL 5758 gewönne-, nen antibiotischen Aktivität und etwa 90 % der gesamten aus NRRL 8092 gewonnenen antibiotischen Aktivität aus. A-28086 Faktor B macht den Großteil der restlichen antibiotischen Aktivität aus NRRL 5758 aus, und der Faktor D liegt lediglich in geringerer Menge vor. A-28086 Faktor D macht andererseits jedoch etwa 8 bis 1O % der gesamten gewonnenen antibiotischen Aktivität aus NRRL 8092 aus, und der Faktor B liegt hier lediglich in geringerer Menge vor.

Die Antibiotica A-28086 Faktoren A, B und D können in bekannter Weise von einander getrennt und als Einzelverbindungen isoliert werden, beispielsweise durch Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie und dergleichen. Zur Trennung der Faktoren A, B und D bedient man sich beispielweise einer einer Säulenchromatographie über Silicagel, wobei man die Säule mit variierenden Lösungsmxttelgemischen, wie Gemischen aus Benzol und Äthylacetat, eluiert. Bei Verwendung von Lösungsmxttelgemischen aus Benzol und Äthylacetat zum Eluieren einer Silicagelsäule wird der Faktor B als erster eluiert, und die Faktoren A und D kommen dann erst später. Das Fortschreiten der Elution läßt sich am einfachsten durch das oben beschriebene dünnschichtchromatographische Verfahren überwachen.

Die A-28086 Verbindungen inhibieren das Wachsen von Bakterien und Fungi, die Krankheitserreger für Tier und Pflanze sind. Die relativen mikrobiologischen Wirksamkeiten von A-28086 Faktoren A und B gehen aus der folgenden Tabelle V hervor.

Die hierin enthaltenen Werte werden nach dem üblichen Scheibendiffusionsverfahren ermittelt (hierzu werden 6 mm-Scheiben in Lösungen getaucht, die 1 mg Wirkstoff pro ml Lösung enthalten, und die so erhaltenen getrennten Scheibchen werden dann auf Agarplatten gelegt, die mit den jeweiligen Testorganismen geimpft sind).

509851 /1153

Tabelle V

Inhibierungszone (mm)

Testorganismus

Staphylococcus aureus Bacillus subtilis ATCC 6633 Sarcina lutea ATCC 9341 Mycobacterium avium ATCC 7992

Saccharomyces pastorianum ATCC 2366

Candida tropicalis Fusarium moniliforme

A-28086 Faktor A	A-28086 Faktor B
19	21
28	31
26	16
12	12
17	—
14	14
12	nicht un tersucht

509851 /1153

Ein wichtiger Gesichtspunkt ist die Tatsache, daß die A-28086-Verbindungen das Wachsen anaerober Bakterien hemmen. Die Minimalinhibierkonzentrationen (MIC), bei denen A-28086 Faktor A verschiedene anaerobe Bakterien hemmt, werden nach dem Standard-Agarverdünnungsversuch ermittelt, und die dabei erhaltenen Werte sind in Tabelle VI zusammengefaßt. Die Endwerte werden nach 24-stündiger Inkubation ermittelt.

Tabelle VI

.Testorganismus

Actinomyces bovis Clostridium inocuum Clostridium perfringens Clostridium ramosum Clostridium septicum Clostridium septicum bovine Eubacterium aerofaciens Peptococcus anaerobius Peptostreptococcus intermedius Propionibacterium acnes Propionibacterium acnes Bacteroides fragilis ssp. fragilis

Bacteroides fragilis ssp. thetaiotacmicron

Bacteroides fragilis ssp. vulgatis Nr. 1563

Bacteroides fragilis ssp. vulgatis Nr. 1211

Fusobacterium symbiosum Fusobacterium necrophorum Veillonella alcalescens

MIC (	,ug/ml)
<	0,5
<	0,5
<	0,5
	4,0
<	0,5
	0,5
<	0,5
1	6,0
1	6,0
	2,O
	8,0
	8,0
	8,0
	2,0
<	0,5
	8,0
1	6,0

509851/1153

Auch die C₃-Cg-ACylesterderivate von A-28086 Faktor A sind antibakteriell und antifungal wirksam. Diese Derivate zeigen eine erhöhte gram-positive Wirksamkeit. Die relative gram-positive Wirkung bestimmter solcher Derivate wird mit der Wirksamkeit von Faktor A verglichen. Die Verbindungen werden durch einen turbidometrisehen Versuch auf einem halbautomatisierten

(R)

System untersucht (Autoturb -Mikrobilogisches Untersuchungssystem, Elanco), wie es von N. R. Kuzel und F. W. Kavanaugh in J. Pharmaceut. Sei. 60 (5), 764 und 767 (1971) beschrieben Wird. Zur Untersuchung der Antibiotica A-28086 werden folgende Versuchsparameter herangezogen: Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 in einem Nährbrühemedium (pH 7), wobei vier Stunden bei 37 C inkubiert wird. Die zu untersuchenden Verbindungen und der Standard werden in Methanol-Wasser (10:90) gelöst. Der Standard, nämlich A-28086 Faktor A, wird in Konzentrationen von 2, 3, 4 sowie 5 mg/ml in den Drehteller des Autoturbgerätes gegeben. Die zu untersuchenden Verbindungen werden soweit verdünnt, daß sie bei Eingabe in den Drehteller etwa 3 oder 4 mg Aktivität pro ml enthalten. Die untersuchten Verbindungen ergeben im Vergleich zum Standard folgende relative Aktivitäten:

Verbindung Relative-G"'"-Aktivität

A28O86 Faktor A (Standard) 1

A28O86-A-Acetylesterderivat 2,5

A28086-A-Propionylesterderivat 7

A28O86-A-n-Butyrylesterderivat 8

A28O86-A-n-Valerylesterderivat 14

A28086-A-n-Caproylesterderivat 2O

509851/1153

Eine weitere interessante Wirkung ist die antimikrobielle Wirksamkeit der Verbindungen A-28086, nämlich die Wirksamkeit gegenüber Mycoplasma. Mycoplasmaarten, die auch als Pleuropneumonia-ähnliche (PPLO) Organismen bezeichnet werden, sind Krankheitserreger beim Menschen und bei verschiedenen Tieren. Mittel, die gegen PPLO-Organismen wirken, werden insbesondere von der Geflügelindustrie benötigt. Durch in-vitro-Brühenverdünnungsstudien erhält man mit dem Antibioticum A-28086 Faktor A gegenüber verschiedenen Mycoplasmaarten folgende in Tabelle VII zusammengefaßte Minimalinhibierkonzentrationen (MIC-Werte):

Tabelle VII

MIC	1	(mg/ml)
1	2,5
	2,5
	6,25
	6,25
6.25

Organ i smu s

M. gallisepticum

M. hyorhinis

M. synoviae

M. hypopneumoniae

M. hyosynoviae

Zum Desinfizieren von Oberflächen, um Tiere vor verschiedenen Mycoplasmaarten zu schützen, reichen bereits Lösungen mit nur 10 Milligramm Antibioticum A-28086 pro Milliliter Lösung aus.

Die A-28086 Verbindungen sind ferner antivirale Mittel. A-28086 Faktor A wirkt gegenüber Poliovirus Typ III, Vaccinia-Virus, Herpes-Virus und Semliki-Forest-Virus, wie durch invitro-Plattensuppressionsversuche gezeigt wird, die den von Siminoff in Applied Microbiology 9 (1), 66-72 (1961) beschriebenen Versuchen ähnlich sind. A-28086 Faktor A ist ferner gegenüber dem übertragbaren Gastroenteritis-Virus, Newcastle-Disease-Virus und infektiösen Rinder-Rhinotracheitis-Virus wirksam, wie durch ähnliche Gewebekulturuntersuchungen gezeigt wird.

509851/1153

Die Verbindungen A-28086 können zur Bekämpfung von Viren Säugetieren daher oral, topisch oder parenteral verabreicht werden. Geeignete Dosierungsspiegel zur Verhinderung oder Behandlung einer viralen Erkrankung liegen zwischen etwa 1 und etwa 5 mg/kg Tierkörpergewicht, und zwar je nach dem Virus und der Frage, ob der Wirkstoff prophylaktisch oder therapeutisch verwendet werden soll.

Lösungen, die eine A-28086 Verbindung, vorzugsweise zusammen mit einem oberflächenaktiven Mittel, enthalten, können darüberhinaus zur Dekontaminierung des in-vitro-Habitats verwendet werden, auf dem Viren, wie Polio oder Herpes, vorhanden sind. Lösungen mit einem Gehalt von etwa 1 bis etwa 1500 mg/ml einer A-28086 Verbindung reichen zur Bekämpfung von Viren aus.

Die akute Toxizität LD₅ des Antibiotikums A-28086 Faktor A beträgt nach intraperitonealer Verabreichung an die Maus 7,15 mg/kg.

Die Verbindungen A-28086 sind ferner auch Insekticide sowie Acaricide. Die Verbindungen A-28086 wirken in Anwendungsmengen von nur 500 ppm gegenüber Insekten, wie dem Mexikanischen Bohnenkäfer, dem Wolfsmilchkäfer und der Hausfliege, und sie sind ferner wirksam gegenüber Milben, wie der Blattspinnmilbe. Darüber hinaus wirken die Verbindungen A-28O86 in Auftragmengen von 0,1 ppm gegenüber Moskitolarven.

Eine wichtige Eigenschaft der Verbindungen A-28086 ist ihre anticoccidiale Wirkung. Fütterungsversuche zeigen beispielsweise, daß man günstigere Gewichtszunahmen bei jungen Hühnchen erhält, wenn man diesen ein Futter gibt, das nur 0,003 % einer A 28086-Verbindung enthält, und mit Wirkstoffkonzentrationen von nur O,OO5 % läßt sich die Mortalität verhindern und die Anzahl von Verletzungen bei Hühnchen herabsetzen, die von Coccidiosis befallen sind. Die bei Versuchen unter Verwendung von Faktor A

509851/1153

an Hühnchen, die von verschiedenen Eimeria-Species befallen sind, erhaltenen Ergebnisse gehen aus den folgenden Tabellen VIII bis X hervor.

509851/1153

Tabelle VIII

Wirksamkeit des Antibioticums A-28086 Faktor A gegenüber Eimerla Tenella

cn
ο
co

Wirkstoffkonzentration im Futter in Gew.-%

0,04
0,02
0,01

Infizierte
Kontrollen

Normale
Kontrollen

Anzahl der Hühnchen

10 10 10

20 20 prozentuale prozentuale Mittlerer Mortalität Gew.-Zunahme Schädigungswert

50 82 94

68 100

0,2 0,2

3,65

prozentuale Erniedrigung des Schädigungswertes

100 95 95

0,02
0,01
0,005
0,0025

Infizierte
Kontrollen

Normale
Kontrollen

20 20 20 20

20 20

84 96 91 87

74 100

0 0

2,8

3,85

3,85

100

100

27

Tabelle IX

	Wirksamkeit	des Antibioticums	A-28086 Faktor A gegenüber verschiedenen Spezies	prozen tuale Gewichts	5 Brathähnchen	Mittlerer Schädigungs wert	prozen tuale Er niedrigung des Schädi	von Eimeria	prozen tuale Reduktion	ΓΟ cn CO an
	infizie rende Or	Wirkstoff konzentration im Futter in	prozen tuale Mortali	zunahme		gungswertes	gesamte durchge kommene Oocyten/ Tier6
	ganismen	Gew.-%	tät	87 82 63	0,75 1,25 1,60	53	(1x10b)	83 86
50985	Eimeria acervulina infizierte Kontrollen	0,005 0,0025	0 0 0	85 65	0,2 1,3	85	6,15 4,91 36,32	# 40 · « 0
1/1153	Eimeria maxima infizierte Kontrollen	0,005	0 0	cn co to co	1,2 1,7	—	1,95 3,24	58
	Eimeria brunetti infizierte Kontrollen	0,005	0 0			2,31 5,55
	vier Wiederholungen, jeweils

Tabelle X Wirksamkeit des Antiblotieums A-28086 Faktor Λ gegenüber gemischten Spezies von Eimeria

Infizierende
Organismen

Wirkstoffkonzentration in Gew.-%

prozentuale

prozentuale Gev/ichts-Mortalität zunähme Intestinalschädigungen Caecalschädigungen prozentuale prozentuale Mittel Reduktion Mittel Reduktion

E. necatrix und E. tenella

cn infizierte ο Kontrollen co

OO

0,005

20

94

52

59

1,75

3,5

50

E. tenella,

E. necatrix,

E. maxima,

E. brunetti,

E. acervulina

und

E. mivati

infizierte Kontrollen

0,01

0 50

91 12

vi.er Wiederholungen, jeweils 5 Brathähnchen

79

0,9 3,3

73

cn "Mg

Zur Verhinderung oder Behandlung von Coccidiosis bei Geflügel verabreicht man den Tieren eine nichttoxische anticoccidiale Menge einer Verbindung A-28086, und zwar vorzugsweise oral auf täglicher Basis. Die Verbindung A-28086 kann über eine Reihe von Wegen geliefert werden. Die einfachste Verabreichungsart besteht jedoch in Verbindung mit einem physiologisch unbedenklichen Träger, vorzugsweise dem jeweiligen Futter der Tiere. Zur Bestimmung der geeigneten Konzentration der Verbindung A-28086 müssen zwar verschiedene Faktoren berücksichtigt werden, die zu verabreichenden Mengen betragen im allgemeinen jedoch 0,003 bis 0,04 Gewichtsprozent, auf das nicht mit Wirkstoff versehenes Futter bezogen, und sie machen vorzugsweise 0,005 bis 0,02 Gewichtsprozent des Futters aus.

Eine weitere wichtige Eigenschaft der Verbindungen A-28086 ist ihre Fähigkeit zur Verbesserung der Futterutilisationseffizienz bei Tieren. So wird beispielsweise die Futterutilationseffizienz bei Wiederkäuern, die über eine entwickelte Pansenfunktion verfugen, durch Einsatz von A-28086 Verbindungen verbessert.

\'ie oben erwähnt, wird die Effizienz der Kohlehydratverwertung bei Wiederkäuern durch Behandlungen verbessert, durch die die Pasenflora des Tieres eher zur Produktion von Propionatverbindungen als zur Produktion von Acetat- oder Butyratverbindungen angeregt wird. Die Effizienz der Futterverwertung läßt sich überwachen, indem man die Produktion und Konzentration der Propionatverbindungen im Pansen unter Einsatz folgender Methoden beobachtet:

Über eine in den Pasen reichende chirurgisch eingesetzte Fistel entnimmt man einem Ochsen Pansenflüssigkeit. Der Ochse wird mit einem hochwertigen Kornfutter gefüttert. Eine Probe der Pansenflüssigkeit wird über ein aus vier Tüchern bestehendes Seihtuch

509851/1153

abgeseiht, und das dabei erhaltene Filtrat wird gesammelt. Das von dem Seihtuch zurückgehaltene stückige Material wird anschließend in soviel physiologischem Puffer resuspensdiert, daß man wieder das ursprüngliche Volumen der Pasenflüssigkeit erhält, und diese Suspension wird erneut filtriert. Der hierzu verwendete Puffer hat folgende Zusammensetzung:

Bestandteile g/Liter

Na₂HPO₄ 0,316

KH₂PO₄ 0,152

NaHCO₃ 2,260

KCl 0,375

NaCl 0,375

MgSO₄ 0,112

CaCl₂-2H₂O 0,050

FeSO₄.7H₂H 0,008

MnSO₄-H₃O 0,004

ZnSO₄.7H₂O 0,004

CuSO₄-5H₂O 0,002

CoCl₂-6H₂O 0,001

Dieser Puffer ist im übrigen von Cheng et al. in J. Dairy Sei. 38, 1225-1230 (1955) beschrieben.

509851/1 153

Die beiden Filtrate werden vereinigt, worauf man sie solange stehen läßt, bis sich oben festes Material abscheidet. Die klare Schicht wird abgetrennt, mit dem gleichen Puffer (1:1) verdünnt und dann auf einen pH-Wert von 6,8 bis 7,0 eingestellt.

Die verdünnte Pansenflüssigkeit (10 ml) wird zusammen mit 40 mg des oben beschriebenen Futters, einem weiteren Milligramm Sojabohnenprotein und der zu untersuchenden Verbindung in einen 25 ml-Kolben gegeben. Jede Behandlung wird in vier Kolben durchgeführt. Es werden auch 2 Sätze aus je vier Vergleichskolben verwendet. Man arbeitet mit einem Vergleich zur Zeit Null und einem Vergleich nach 16-stündiger Inkubation. Alle Versuchskolben werden 16 Stunden bei 38 ⁰C inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wird der pH-Wert gemessen, und man versetzt jeden Kolben mit 25-prozentiger Methaphosphorsäure (2 ml). Hierauf läßt man den Kolbeninhalt absetzen, und die überstehenden Flüssigkeiten werden gaschromatographisch bezüglich der darin enthaltenen Propionat-, Acetat- und Butyratverbindungen analysiert. Durch die erfindungsgemäßen Wirkstoffe wird die Produktion von Propionat gegenüber den Vergleichen stark erhöht.

Die mit den erfindungsgemäßen Wirkstoffen erhaltenen Ergebnisse werden statistisch mit den Ergebnissen der Vergleiche verglichen. Aus Tabelle XI geht das Verhältnis der Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren in den behandelten Kolben und der Konzentrationen in den Vergleichskolben hervor.

509851/1153

Tabelle XI Verhältnis aus Behandlung zu Kontrolle Verbindung

ppm in der Pansen- Molprozent Molprozent flüssigkeit Acetat , Butyrat

A-28086 Faktor A

ο A-28086 Faktor B

oo A-28086 Faktor A

^1X1 Acetylester

^ A-28086 Faktor A __» Propionylester
01

co A-28086 Faktor A Butyrylester

A-28086 Faktor A Valerylester

A-28086 Faktor A Caproylester Molprozent gesamtes VFA Propionat mMol/Liter

0,94	0,87	1,34	1,26
0,92	0,96	1,15	1 ,29
0,79	0,76	2,04	1,04
0,90	0,68	1,73	1,25
0,91	0,81	1,56	1,19
0,92	0,79	1,55	1,18
0,86	0,97	1,57	0,99

O - 69 - CO

Die Wirksamkeit der Kohlehydratutilisation wird anhand von in-vivo-Untersuchungen weiter demonstriert, die an Tiren durchgeführt werden, in deren Pansen Fisteln angelegt sind, über die man Proben des Panseninhalts entnehmen kann.

Der in Tabelle XII angeführte Versuch wird unter Verwendung erwachsener mit Filsteln versehener Ochsen durchgeführt, die jeweils etwa 554 kg wiegen. Zwei Ochsen werden mit einem normalen Futter gefüttert, und vier Ochsen aus jeder Behandlungsgruppe füttert man mit einem identischen Futter, das mit A-28086 Faktor A versetzt ist. Jede Teilmenge (100 ml) der entnommenden Pansenflüssigkeit wird mit 10-prozentiger Metaphosphorsäure (100 ml) versetzt. Sodann läßt man die Proben absetzen und analysiert die überstehenden Flüssigkeiten gaschromatographisch zur Bestimmung der Propionsaurekonzentration .

Die in Tabelle XII angeführten Versuchsergebnisse sind die mittleren prozentualen Zunahmen der Propionsaurekonzentration im Pansen, und zwar Mittelwerte aus 5 Analysen während einer 14 tägigen Versuchsdauer. Die Vergleiche enthalten etwa 20 Molprozent Propionsäure.

Tabelle XII

A-28086 Faktor A prozentuale Zunahme gegenüber

(mg/Tag) den Kontrollen

25 17,4

1OO 54,0

Durch in-vivo-Versuche wird darüber hinaus gezeigt, daß A-28086 Faktor A die Futterutilisationseffizienz bei Schafen erhöht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen, die über eine Zeitspanne von 56 Tagen durchgeführt werden, gehen aus der folgenden Tabelle XIII hervor.

509851/1153

Tabelle XIII

	A-28086	Anzahl der	Mittlere täg	Futterauf	Verhältnis aus	prozentuale
	Faktor A in	Tiere	liche Gewichts	nahme in	Futteraufnahme	Verbesserung
	g pro Tonne	13	zunahme in	kg pro Tag	zu	12
	Futter		kg pro Tag	1,50	Gewichtszunahme
on ο	9		0,20		7,40
co		13				1
00		17		1,43		•MN
cn —A	18	0,17	1,61	8,31
__»	Kontrolle	0,19	8,38

Die Verbindungen A-28086 Faktor D sind antivirale Mittel. A-28086 Faktor D wirkt gegenüber Maryland-B-Virus, Poliovirus Typ III, COE-Virus, Herpes-Virus und Semliki-Forest-Virus, wie durch den in-vitro-Plattensuppressionsversuch gezeigt wird, der dem von Siminoff in Applied Microbiology 9 (1), 66-72 (1961) beschriebenen Versuch ähnlich ist. A-28086 Faktor D ist ferner wirksam gegenüber dem übertragbaren Gastroenteritis-Virus, Newcastle-Disease-Virus und infektiösem Rinder-Rhinotracheitis-Virus, wie sich durch ähnliche Gewebekulturuntersuchungen ergibt.

Die Tatsache, daß die Verbindungen A-28086-Faktor D sowohl gegenüber Viren als auch gegenüber anaeroben Bakterien wirksam sind, macht diese Verbindungen besonders geeignet zur Behandlung oder Verhinderung von Enteritis bei Hühnchen, Schweinen, Rindern und Schafen. Die Verbindung A-28086 Faktor D eignet sich ferner zur Behandlung einer Enterotoxämie bei Wiederkäuern.

Die anticoccidiale Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen A-28086 Faktor D ist eine wichtige Eigenschaft. Die anticoccidiale Wirkung von A-28086 Faktor D gegenüber Eimeria tenella wird durch in-vitro-Versuche gezeigt. Hierzu bedient man sich des folgenden Verfahrens /bezüglich Einzelheiten wird auf L. R. McDougald und R. B. Galloway in Exper. Parasitology 34, 189-196 (1973) verwiesen/:

Unter Einsatz üblicher Techniken stellt man unter Verwendung von Leighton-Röhrchen, Plastikschälchen oder Platten oder sonstiger geeigneter Kulturbehältnisse Wirtszellkulturen her. Nach 2 bis 3 Tage langem Wachsen in einem geeigneten Kulturmedium (Eagle Minimalessentialmedium, Lactalbuminhydrolysat in Earle- oder Hank-Salzlösung, Medium 199 und dergleichen) bildet sich gewöhnlich eine geeignete Monoschicht, die infiziert und mit Wirkstoff behandelt werden kann. Für diese Untersuchungen werden Primärkulturen von Hühnchennierenzellen verwendet.

509851/1153

Aus den Fäkalien infizierter Hühnchen gewinnt man lebende Oocysten von Eimeria tenella, und diese werden vor ihrer Verwendung gereinigt und sterilisiert. Die Oocysten sporuliert man dann durch Inkubation bei Raumtemperatur, indem man durch die Suspension Luft leitet oder diese Suspension auf einem Rotationsschüttler oder einem sonstigen geeigneten Gerät leicht schüttelt. Zur Verhinderung von Bakterien oder Schimmelwachstum während der Sporulation kann man Kaliumdichromat oder Schwefelsäure (oder andere Chemikalien) verwenden .

Die infektiven Sporozoiten lassen sich aus den Oocysten
durch eine Kombination aus einer mechanischen Zerstörung der Wand des Oocysten, anschließende Behandlung mit Trypsin und Behandlung mit Gallensalzen excystieren, wodurch die Selbstbefreiung der Sporozoiten aus den Sporocysten eingeleitet wird.

Zellkulturen werden infiziert, indem man in das Kulturgefäß lebende Sporozoiten einbringt. Die zu untersuchenden Chemikalien kann man gleichzeitig damit oder auch
später einführen. Der zu untersuchende Wirkstoff wird in der gewünschten Konzentration in 10 % Dimethylformamid
in physiologischer Salzlösung eingebracht. Der Endpunkt
des Versuchs besteht in einer Hemmung nichtgeschlechtlicher Entwicklungsstufen, und er wird durch mikroskopische Untersuchung von Kulturen bestimmt, die man 96 Stunden nach Infektion fixiert und anfärbt. Die Ergebnisse
werden angegeben in wirksam (A), unwirksam (N) oder
cycotoxisch (C), und zwar je nach der Gegenwart oder
Fehlen von Schizonten der zweiten Generation und irgendeiner offensichtlichen Toxizität gegenüber der Zeilmonoschicht.

509851/1153

Die bei dieser Untersuchung für A-28086 Faktor D erhaltene anticoccidiale Wirksamkeit ist in der folgenden Tabelle XIV zusammengefaßt.

Tabelle XIV

Anticoccidiale	Wirksamkeit	Bewertung
Antibioticum A-28086 Faktor D	C
Konzentration von A-28086 Faktor D (mg/ml)	C
5	C
1	A1C+
0,2	A
0,4	A ± A
0,03	N
O,O2 0,01
O.OO8

Ergebnis aus zwei Versuchen

Ein weiteres interessantes Merkmal der Verbindungen A-28O86 Faktor D ist ihre Fähigkeit zur Verbesserung der Futterutilisationseffizienz bei Wiederkäuern, die über eine entwickelte Pansenfunktion verfügen. Der Mechanismus zur Utilisation bzw. Verwertung des überwiegenden nutritiven Anteils (Kohlehydrate) von Wiederkäuerfutter ist genau bekannt. Durch im Pansen des Tieres vorhandene Mikroorganismen werden Kohlehydrate unter Bildung von Honosacchariden abgebaut, und diese Monosaccharide werden dann in Pyruvatverbindungen umgewandelt. Die Pyruvate

509851 /1 Ϊ53

werden durch mikrobiologische Verfahren unter Bildung von Acetaten, Butyraten oder Propionaten metabolisiert, die man kollektiv als flüchtige Fettsäuren (VFA) bezeichnet. Bezüglich einer detallierteren Erörterung dieser Zusammenhänge wird auf Leng in "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant,"Phillipson et al. Eds., Oriel Press, Newcastle upon Tyne, England (1970), Seiten 408 - 410 verwiesen.

Die relative Effizienz der VFA-UtiIisation wird von McCullough in Feedstuffs, 19. Juni 1971, Seite 19, Eskeland et al.in "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants," Band 2, (1971), Seiten 622 und 625 erörtert. Es werden zwar auch die Acetate und Butyrate utilisiert, die Utilisation der Propionate ist jedoch höher. Ist zu wenig Propionat vorhanden, dann entwickelt sich bei den Tieren ferner eine sogenannte Ketosis. Durch eine geeignete Verbindung werden die Tiere daher zur Bildung eines höheren Anteils an Propionaten aus Kohlenhydraten angeregt, wodurch sich die Utilisationseffizienz für Kohlenhydrate erhöht und gleichzeitig die Gefahr einer Ketosis verringert.

Die Wirksamkeit eines derartigen Wirkstoffes läßt sich bestimmen, indem man seinen Einfluß auf die Produktion und Konzentration der Propionatverbindungen im Pansen nach dem gleichen Verfahren ermittelt, wie es auch oben im Zusammenhang mit Faktor A verwendet wird.

Die dabei erhaltenen Versuchsergebnisse sind verglichen mit.Vergleichsergebnissen statistische Werte. Aus Tabelle XV geht das Verhältnis der Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren in mit A-28086 Faktor D behandelten Kolben und den Konzentrationen in den Vergleichskolben hervor.

50 985 1/1153

Tabelle

XV

A-28086 D mg/ml

1/0 0,3

Molprozent Acetat

0,8715 0,8976

Molprozent
Butyrat

0,7973
0,8726

Molprozent Propionat 1,7981 1,5871

gesamtes VFA mMol/Llter

1,1979 1,0630

- 76 -

"""' 25250':'

Die erfindungsgemaßen Verbindungen erhöhen den Anteil an Propionaten und somit die Effizienz der Futterutilisation, wenn sie Wiederkäuern oral in Mengen von etwa 0,05 bis etwa 5,0 ng pro kg und Tag verabfolgt werden. Die günstigster: Ergebnisse erhält man bei einer Verabreichung von eiva C,I bis etwa 2,5 mg Wirkstoff pro kg und Tag. Ein bevorzugtes Verfahren zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe besteht in einem Vermischen mit den Tierfutter, die Wirkstoffe lassen sich jedoch auch in anderer Weise verabreichen, beispielsweise in Form von Tabletten, Tränken, BoIi oder Kapseln. Diese verschiedenen Dosier mgsformen lassen sich in in der Veterinärmedizin bekannter Weise formulieren. Jede einzelne Dosierungseinheit sollte eine Wirkstoffmenge enthalten, die der jeweiligen Tagesdosis direkt entspricht, mit der das Tier behandelt werden soll.

Das A-28086 kann zusammen mit Rindermastfuttern verwendet werden, die ein Rinderfutter und 1 bis 30 g Wirkstoff pro Tonne enthalten. Rindert ..^r unterscheidet sich bekanntlich von anderen Futtermitte t.. i ü beispielsweise Ceflügelfutter. Rinderfutter enth;! i t Rohfutter, wie Baumwollsaathülsen oder Maissilage. Darfiber hinaus enthält Rinderfutter noch einen hohen Prozentsatz, oft 15 bis 25 %, nichtproteinartiger StickstofEqueJlen. Eine häufig verwendete nichtproteinartige Stickstoffquelle ist Harnstoff.

Wie oben erwähnt, sind die erfindungsgemaßen A-28086-Verbindungen antivirale Mittel, und sie wirken ferner gegenüber anaeroben Bakterien, insbesondere Clostridium perfringens. Die A-28086-Verbindungen eignen sich daher zur Behandlung oder Verhinderung einer Enteritis bei Hühnern, Schweinen, Rindern und Schafen. Die erfindungsgemaßen Verbindungen A-28086 können ferner zur Behandlung von Enterotoxämie bei Wiederkäuern verwendet werden.

509851/1153

uia Ertindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

A. Schüttelflaschenfermentation von A-28086 unter Verwendung

von S. aureofaciens NRRL 5758

Es wird eine Kultur von Streptomyces aureofaciem; NRRL 5758 hergestellt und auf Schrägagar folgender Zusammensetzung gehalten:

Bestandteile Menge

Agar	auf	20	g
Dextrin	10	g
mit Enzym hydrolysiertes Casein	2	g
Rinderextrakt	2	g
Hefeextrakt	2	g
Destilliertes Wasser q.s.	1	Liter

Die Schräge wird mit Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 inokuliert, worauf man die beimpfte Schräge 6 bis TO Tage bei 30 ⁰C inkubiert. Die reife Schrägkultur wird mit Rinderserum überdeckt und zum Abläsen der Sporen mit einer sterilen Schlaufe abgekratzt. Die dabei erhaltene Rinderserumsuspension der Sporen und der Mycelfragmente wird zu 6 Pellets lyophili s iert.

Ein auf diese Weise hergestelltes lyophilisiertes Pellet verwendet man zum Inokulieren von 5O ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung:

509851/1153

20	g
15	g
1O	g
2	g-
1	Liter

Bestandteile Menge

Glucose

Soj abohnenschrot Maisquellwasser CaCO₃

Leitungswasser q.s. auf

Das inokulierte vegetative Medium wird in einen 25O ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und bei einer Temperatur von 30 ⁰C über eine Zeitspanne von 72 Stunden auf einem Schüttler, der in einem Bogen mit etwa 5 cm Durchmesser bei 250 Umdrehungen pro Minute rotiert, inkubiert.

B. Tankfermentation von A-28086 unter Verwendung von

S. aureofaciens NRRL 5758

Zur Bildung eines größeren Volumens Inokulum verwendet man 10 ml des oben beschriebenen inkubierten vegetativen Mediums zum Inokulieren von 400 ml eines zweiten vegetativen Wachstumsmediums, das die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium hat. Dieses in einem 2-Liter Kolben befindliche zweite Medium wird bei einer Temperatur von 30 ⁰C über eine Zeitspanne von 24 Stunden auf einem Schüttler, der in einem Bogen von etwa 5 cm Durchmesser, bei einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute rotiert, inkubiert.

Das in dieser zweiten Stufe erhaltene vegetative Medium (1 Liter) verwendet man zum Inokulieren von 100 Liter sterilen Produktionsmedium folgender Zusammensetzung:

50985 1/1153

Bestandteile

Menge

Tapiocadextrin

mit Enzym hydrolysiertes Casein

Melasse
MgSO₄.7H₂O CaCO₃

raffiniertes Sojabohnenöl

60,0 g/Liter

8,0 g/Liter 15,0 g/Liter 0,5 g /Liter

2,0 g/Liter 5,0 g/Liter

Deionisiertes Wasser q. s. auf 1 Liter

Nach 30 Minuten langem Sterilisieren in einem Autoklaven bei einer Temperatur von 120 ⁰C und einem Druck von 1,05

bis 1,41 kg/cm hat das Medium einen pH-Wert von 6,7. Das inokulierte Produktionsmedium läßt man dann in einem 165 Liter fassenden Fermentationstank 10 Tage bei einer Temperatur von 29 ⁰C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft belüftet, und zwar mit einer Geschwindigkeit von 0,4 Volumina Luft pro Volumen Kulturmedium und pro Minute. Das Medium wird mit üblichen Rührern bei einer Rührgeschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute gerührt.

Beispiel 2

Die Herstellung der Antibiotica A-28086 erfolgt nach dem gleichen Verfahren wie bei Beispiel 1, wobei man jedoch ein Kolbenproduktionsmedium folgender Zusammensetzung verwendet:

5 0 9 8 5 1/115 3

Bestandteile Menge

Glucose 10 g/Liter

eßbare Melasse 20 g/Liter

Pepton 5 g/Liter

CaCO₃ 2 g/Liter

Leitungswasser q.s. auf 1 Liter

Beispiel 3

Abtrennung des durch S. aureofaciens NRRL 5758 produzierten Antibioticum A-28086-Komplexes

Die nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhaltene gesamte Fermentationsbrühe (132 Liter) wird unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Supercel, nämlich einer Diatomeenerde, Johns-Manville Products Corp.) filtriert, wodurch man 97 Liter filtrierte Brühe erhält. Die filtrierte Brühe wird mit einem etwa gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird von der wässrigen Phase abgetrennt und auf etwa 500 ml Volumen eingeengt. Der so erhaltene konzentrierte Äthylacetatextrakt wird zu einem großen Überschuß Petroläther (Skelly Solve F; etwa 1O Liter) gegeben, um auf diese Weise unerwünschtes Material auszufällen und abzutrennen. Das abgetrennte Filtrat wird unter Vakuum eingedampft, wodurch man den Brühenanteil des Antibioticum A-28086-Komplexes erhält (6,9 g).

Den im Mycel vorhandenen Anteil des Antibioticum A-28O86-Komplexes erhält man durch zweimaliges Extrahieren des abfiltrierten Mycels mit jeweils etwa dem halben Volumen Methanol (62 Liter und 59 Liter). Die zwei Methanolextrakte

509851/1153

werden vereinigt und zur Entfernung des Methanols unter Vakuum konzentriert. Nach diesem Einengen bleiben etwa 10 Liter einer wässrigen Phase zurück. Die wässrige Phase stellt man mit verdünntem Natriumhydroxid auf etwa pH 7,5 ein. Die dabei erhaltene Lösung wird zweimal mit etwa gleichen Volumina Äthylacetat (9 Liter und 10 Liter) extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und dann auf etwa 400 ml Volumen eingeengt. Der so erhaltene konzentrierte Äthylacetatextrakt wird zur Entfernung unerwünschter Materialien zu einem großen Überschuß Petroläther gegeben, wozu man genauso vorgeht wie oben bei dem konzentrierten filtrierten Brühenextrakt. Der auf diese Weise aus dem Filtrat erhaltene im Mycel vorhandene Anteil des A-28086-Antibioticumkomplexes wiegt 20,6 g.

Beispiel 4

Isolierung der einzelnen Faktoren A und B aus A-28086

Der Mycelantell des A-28086-Antibioticumkomplexes (235 g, hergestellt gemäß Beispiel 3) wird in etwa 80 ml Benzol gelöst. Die Benzollösung wird auf eine Silicagelsäule (9 χ 130 cm, 8 Liter, Matheson Silicagel Sorte 62) aufgegeben. Die Säule eluiert man mit variierenden Gemischen aus Benzol und Äthylacetat. Der Fortgang der Elution wird dünnschichtchromatographisch* verfolgt. Unter Verwendung eines LösungsmitteISy¹Stems aus Benzol und Äthylacetat (90:10) wird zuerst der Faktor B eluiert und als Einzelfaktor isoliert. Der aus Aceton-Wasser umkristallisierte Faktor B (43 g) schmilzt bei 15O bis 153 ⁰C.

5 0985 1/1153

Es wird weiter mit Gemischen aus Benzol und Äthylacetat eluiert, wobei man die Menge an Äthylacetat jedoch graduell steigert. Hierbei wird der Faktor A eluiert. Die verschiedenen Fraktionen, die den Faktor A enthalten, werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Rückstand eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wird in Aceton (etwa 150 ml) gelöst, worauf man die Acetonlösung mit Wasser (etwa 150 ml) versetzt. Sodann stellt man den pH-Wert der erhaltenen Lösung durch Zugabe von 1 η Chlorwasserstoffsäure auf pH 3 ein. Das angesäuerte Gemisch wird etwa 1 Stunde gerührt, und während dieser Zeit entsteht ein Niederschlag. Der Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt und aus Aceton (etwa 150 ml) unter anschließender Zugabe von Wasser (etwa 60 ml) umkristallisiert. Das dabei angefallene Produkt wird über Nacht unter Vakuum getrocknet,, wodurch man den Faktor A (etwa 6,6 g) erhält. Nach teilweiser Verdampfung des Acetons aus dem Filtrat erhält man eine zweite Ernte des Faktors A (etwa 1,2 g).

Beispiel 5 A-28086 Faktor A Acetylesterderivat

Antibioticum A-28086 Faktor A (7,4 g) wird in Pyridin (150 ml) gelöst. Die Lösung versetzt man mit Essigsäureanhydrid (50 ml). Die erhaltene Lösung wird gründlich durchmischt, worauf man sie über Nacht bei Raumtemperatur stehen läßt. Unter gründlichem Durchmischen gibt man dann Wasser (200 ml) zu. Das so erhaltene Gemisch läßt man 4 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Der dabei ausfallende* weiße Feststoff wird durch Filtrieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Der erhaltene Feststoff wird in Aceton (100 ml) gelöst, worauf man die

509851/1153

Acetonlösung unter Vakuum zur Trockne eindampft (der obige Vorgang wird dreimal wiederholt). Nach Umkristallisieren dieses Feststoffes aus Aceton (100 ml) und Wasser (50 ml) erhält man A-28086 Faktor A Acetylesterderivat (6,14 g) , das bei 100 - 103 ⁰C schmilzt.

Beispiele 6- 9

a) Nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren stellt man durch Umsetzen von Faktor A mit Propionsäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin Antibioticum A-28086 Faktor A Propionylesterderivat her, das bei 96 - 98 ⁰C schmilzt.

b) Nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren stellt man durch Umsetzen des Faktors A mit n-Buttersäureanhydrid in Gegenwart von, Pyridin Antibioticum A-28086 Faktor A n-Butyrylesterderivat her, das bei 79 - 81 ⁰C schmilzt.

c) Nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren stellt man durch Umsetzen des Faktors A mit Capronsäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin Antibioticum A-28086 Faktor A n-Caproylesterderivat her, das bei 163-167 C schmilzt.

d) Nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren stellt man durch Umsetzen von Faktor A mit Valeriansäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin Antibioticum A-28086 Faktor A n-Valerylesterderivat her, das bei 173 - 175 ⁰C schmilzt.

SO 9851/1153

Beispiel 10 Herstellung von A-28086 Faktor A Natriumsalz

Antibioticum A-28086 Faktor A (500 mg) wird in Aceton (50 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit Wasser (50 ml) versetzt, worauf man den pH-Wert mit 5 η Natriumhydroxid auf 10,5 bis 11 einstellt. Die Lösung wird 1 Stunde gerührt und dann mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Aceton-Wasser-Lösung ausgefällt, wodurch man 378 mg A-28086 Faktor A Natriumsalz erhält, das bei 120 - 123 ⁰C schmilzt.

Beispiele 11 - 15

a) Durch Umsetzen von Antibioticum A-28086 Faktor A

(500 mg) mit gesättigtem Bariumhydroxid unter Verwendung des in Beispiel 10 beschriebenen Verfahrens erhält man 369 mg A-28086 Faktor A Bariumsalz, das bei 188 - 190 ⁰C schmilzt.

b) Durch Umsetzen von Antibioticum A-28086 Faktor A (500 mg) mit 5 η Kaliumhydroxid nach dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren erhält man 363 mg A-28086 Faktor A Kaliumsalz,

das bei 165 - 167 ⁰C schmilzt.

c) Durch Umsetzen von Antibioticum A-28086 Faktor A (500 mg) mit 1 η Cäsiumhydroxid nach dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren erhält man 540 mg A-28086 Faktor A Cäsiumsalz, das bei 190 - 210 ⁰C schmilzt.

d) Durch Umsetzen von Antibioticum A-28086 Faktor B mit 5 η Natriumhydroxi nach dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren erhält man Antibioticum A-28086 Faktor B Natriumsalz.

50985 1/1153

Beispiel 16

Schüttelflaschenfermentation von A-28086 unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 8092

Man stellt eine Kultur von Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 her und hält diese auf Schrägagar folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge

K2HPO4	7H2O	2 g
MgSO4 .		0,25 g
NH4NO3	- S	2 g
CaCO3	7H2O	2,5 g
FeSO4 .	7H2O	O,OO1 g
MnCl2 .	7H2O	O,OO1 g
ZnSO4 .		0,001 g
Glucose		10 g
Agar	Deionisiertes Wasser	20 g
	pH (nicht eingestellt)	q.s.auf 1 Liter
7,7

Der Schrägagar wird mit Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 inokuliert, worauf man die inokulierte Schräge bei 30 ⁰C etwa 7 Tage inkubiert. Die reife Schrägkultur wird mit sterilem Rinderserum überdeckt und mit einer sterilen Schlaufe abgekratzt, wodurch man aus der Schrägkultur eine Sporen- und Mycelsuspension erhält. Die erhaltene Suspension wird zu maximal 6 Pellets lyophilisiert.

5 0 9 8 5 1/115 3

20	g
15	g
10	g
2	g
1	Liter

Ein auf diese Weise hergestelltes lyophilisiertes Pellet verwendet man zum Inokulieren von 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge

Glucose

Soj abohnennmehl

Maisquellwasser

CaCO₃

Leitungswasser q.s. auf

Der pH-Wert wird mit verdünntem NaOH auf pH 6,5 eingestellt.

Das in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben befindliche inokulierte vegetative Medium wird bei einer Temperatur von 30 ⁰C über einen Zeitraum von 48 Stunden, auf einem Rotationsschüttler, der unter einem Bogen von 5 cm bei einer Geschwindigkeit von Umdrehungen pro Minute rotiert, inkubiert.

Das oben beschriebene inkubierte vegetative Medium (0,5 ml, %) verwendet man zum Inokulieren von 50 ml eines Fermentationsmediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteil Menge

Tapiocadextrln 60,0 g

Mit Enzym hydrolysiertes

Casein 6,Og

Enzymatisches Hydrolysat

3)
von Casein 2,0 g

CaCO₃ 2,0 g

MgSO₄.7H₂O O,5 g

509851/1153

Bestandteile Menge

Ruminelasse (Blackstrap-

Melasse) 15,Og

Raffiniertes Sojabohnenöl 5,0 ml

Leitungswasser q.s. auf 1 Liter pH (nicht eingestellt) 6,6

Staley Dextrin No. 11, A.E. Staley Co, Decatur 111,

Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

NZ Amin A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N. Y.

Beispiel 17

Tankfermentation von A-28086 unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 8092

Das in Beispiel 16 für die Schüttelkolbenfermentation von A-28086 verwendete Verfahren wird auch für eine Tankfermentation herangezogen. Zur Bildung eines größeren Volumens an Inokulum werden 10 ml des inkubierten vegetativen Mediums zum Inokulieren von 400 ml eines zweiten vegetativen Mediums verwendet, das die gleiche Zusammensetzung wie das erste vegetative Medium hat. Dieses zweite Medium wird in einem 2 Liter Erlenmeyer-Kolben bei 30 ⁰C über eine Zeitspanne von 24 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute und unter einem Bogen von etwa 5 cm inkubiert.

50 9 8 51/1153

Das dabei erhaltene inkubierte vegetative Medium der zweiten Stufe (800 ml) verwendet man zum Inokulieren von 100 Liter sterilem Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge

Tapiocadextrin 6O,O g/Liter

Mit Enzym hydrolysiertes

Casein²* 6,0 g/Liter

Enzymatisches Hydrolysat

von Casein 2,0 g/Liter

CaCO₃ 2,0 g/Liter

MgSO₄ . 7H₂O 0,5 g/Liter

Rummelasse (Blackstrap-Melasse) 15,O g/Liter Raffiniertes Sojabohnenöl 5,0 mg/Liter

Leitungswasser g.s. auf 1 Liter

'Staley Dextrin No. 11, A. E. Staley Co., Decatur, 111.

'Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

³'NZ Amin A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

Nach Sterilisation in einem Autoklaven bei einer Temperatur von 121 ⁰C über eine Zeitspanne von 30 Minuten bei

2 einem Druck von 1,05 bis 1,41 kg/cm hat das Medium einen pH-Wert von 6,8 - O,1. Das inokulierte Produktionsmedium läßt man in einem 165 Liter fassenden Fermentationstank 10 bis 12 Tage bei einer Temperatur von 28 - 1 ⁰C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft in einer Geschwindigkeit von 0,4 Volumina Luft pro

509851/1153

Volumen Kulturmedium pro Minute belüftet. Das Medium wird mit üblichen Rührern bei einer Geschwindigkeit von 300 Umdrehungen pro Minute grührt.

Beispiel 18

Die Herstellung der Antlbiotica A-28086 erfolgt nach dem im Beispiel 17 beschriebenen Verfahren, wobei man jedoch ein Schüttelflaschen-Tank-Produktionsmedium folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteile Menge

Tapiocadextrin ' 30,0 g/Liter

Glucose . 15,0 g/Liter

Mit Enzym hydrolysiertes

Casein³* 3,0 g/Liter

Enzymatisches Hydrolysat

von Casein 1,0 g/Liter

Hefeextrakt 2,5 g/Liter

CaCO₃ 2,0 g/Liter

MgSO₄ . 7H₂O · 1,0 g/Liter

Rummelasse (Blackstrap-Melasse) 15,O g/Liter Raffiniertes Sojabohnenöl 5,0 ml/Liter

Leitungswasser q.s. auf 1 Liter

'staley Dextrin No. 11, A.E. Staley Co., Decatur, 111.

Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

³*NZ Amin A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

09851/1153

Der pH-Wert des Mediums wird nach Sterilisieren in einem Autoklaven in der in Beispiel 17 beschriebenen Weise auf 6,4 eingestellt.

Beispiel 19 Abtrennung des durch S. aureofaciens NRRL 8092 produzierten A-28086 Antibioticumkomplexes

Die nach dem Verfahren von Beispiel 17 erhaltene gesamte Fermentationsbrühe (60 Liter) wird durch Zugabe verdünnter Salzsäure auf pH 3 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Supercel, nämlich einer Diatomeenerde, Johns-Manville Products Corp.) filtriert. Der abgetrennte Mycelkuchen wird mit 30 Liter Methanol extrahiert, worauf man den Extrakt unter Rühren mit 1,56 kg Natriumbicarbonat versetzt. Nach Abtrennen dieses Extrakts wird der Mycelkuchen wiederum mit weiteren 30 Liter Methanol extrahiert. Die beiden Methanolextrakte werden vereinigt und zur Entfernung des Methanols unter Vakuum konzentriert. Die erhaltene wässrige Lösung (etwa 7 Liter) wird mit verdünnter Salzsäure auf pH 7,5 eingestellt. Diese Lösung extrahiert man dann zweimal mit Xthylacetat (jeweils 7 Liter). Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und unter Vakuum zu einem öligen Rückstand konzentriert. Der ölige Rückstand wird in 1500 ml Aceton gelöst. Die Acetonlösung versetzt man mit Wasser (1500 ml). Die erhaltene Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf pH 3 eingestellt und 1 Stunde gerührt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und dann in Aceton (1500 ml) gelöst, worauf man die Lösung mit Wasser (400 ml) versetzt. Die erhaltene Lösung läßt man anschließend bis zum Kristallisieren 16 Stunden stehen. Die entstandenen Kristalle werden abfiltriert und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 74 g rohes kristallines Produkt erhält, das A-28086 Faktoren A und B sowie andere kristalline Verunreinigungen enthält.

50985 1/1153

Das obige kristalline Produkt (40 g) wird in etwa 250 ml Benzol gelöst. Die Benzollösung wird dann auf eine Silicagelsäule (9 χ 120 mm, Silicagel von Grace-Davidson, Sorte 62) gegeben. Die Säule wird der Reihe nach mit jeweils 40 1 folgender Lösungsmittel eluiert:

1) Benzol

2) Benzol:Äthylacetat (9:1)

3) Benzol:Äthylacetat (4:1)

4) Benzol:Äthylacetat (7:3)

5) Benzol:Äthylacetat (1:1)

6) Äthylacetat

7) Methanol

Es werden Fraktionen von jeweils 1 Liter gesammelt. Jede Fraktion wird durch einen entsprechenden Versuch gegenüber Bacillus subtilis untersucht und zur Identifizierung der eluierten Verbindungen dünnschichtchromatographisch ausgewertet. Das A-28O86-I wird mit einem Gemisch aus Benzol und Äthylacetat (4:1) eluiert. Die Eluierung von A-28086 Faktor B erfolgt mit einem Gemisch aus Benzol und Äthylacetat (7:3) . A-28086 Faktoren A und D werden in den Fraktionen eluiert, die man mit den Gemischen aus Benzol und Äthylacetat (7:3 und 1:1), nämlich den Fraktionen 119 bis 156, erhält. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wird in Aceton (500 ml) gelöst. Die Acetonlösung versetzt man mit Wasser (500 ml), worauf man den pH-Wert der erhaltenen wässrigen Lösung mit verdünnter Salzsäure auf pH 3 einstellt und die Lösung 1 Stunde rührt. Der dabei entstandene Niederschlag wird abfiltriert und aus Aceton (500 ml) sowie Wasser (180 ml) umkristallisiert. Die dabei entstandenen Kristalle werden abfiltriert und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 20,1 g eines Gemisches aus A-28086 Faktoren A sowie D erhält.

509851 /1153

Beispiel 20 Trennen und Reinigung der Einzelfaktoren A und D

Das nach Beispiel 18 erhaltene kristalline Gemisch der Faktoren A und D von A-28086 (18,8 g) wird in Benzol (50 ml) gelöst. Die Benzollösung wird auf eine Silicagelsäule (7 x 100 cm Säule, E. Merk Silicagel, Sorte 60, feiner als 0,062 mm) aufgegeben. Die Eluierung der Säule erfolgt bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 90 ml pro Stunde der Reihe nach mit folgenden Eluiermitteln:

1) 12 Liter Benzol

2) 12 Liter Benzol:Äthylacetat (9:1)

3) 12 Liter Benzol:Äthylacetat (4:1)

4) 32 Liter Benzol:Äthylacetat (7:3)

5) 10 Liter Methanol

Das Eluierverfahren wird durch Dünnschichtchromatographie mit Cellulose (Merk Darmstadt, Cellulose auf Aluminiumträger) sowie bioautographisch unter Verwendung von B. subtilis verfolgt. Man arbeitet mit folgenden Lösungsmittelsystemen: Wasser:Methanol:Aceton (12:3:1) , wobei der pH-Wert der Lösung mit Ammoniumhydroxid zuerst auf pH 10,5 und dann mit Salzsäure auf pH 7,5 eingestellt wird.

Bis zum Auffinden einer Aktivität werden Fraktionen von 1 bis 2 Liter aufgefangen, und dann sammelt man Fraktionen von 2OO ml. Die Fraktionen, die lediglich A-28086 Faktor D enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zu einem Rückstand eingedampft. Der Rückstand wird aus Aceton-Wasser (1:1) umkristallisiert. Die Kristalle werden abgetrennt und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 140 mg kristallines A-28086 Faktor D erhält. Diejenigen Fraktionen, die

50985 1/1153

A-28086 Faktor D mit einer Spur A-28086 Faktor A enthalten, werden genauso behandelt, wodurch man weitere 150 mg kristallines A-28086 Faktor D erhält, das eine geringe Menge A-28086 Faktor A enthält.

Die Fraktionen, die lediglich A-28086 Faktor A enthalten, werden ebenfalls in der gleichen Weise behandelt, wodurch man 4,7 g kristallines A-28086 Faktor A erhält.

Beispiel 21

Nach dem in Beispiel 16 beschriebenen Verfahren werden A-28086 Antibiotica hergestellt, wobei man jedoch ein Schrägenmedium folgender Zusammensetzung verwendet:

Zusammensetzung Menge

Rinderextrakt 2,OO g

Dextrin 20,00 g

Hefeextrakt 2,00 g

Enzymatisches Hydrolysat

von Casein 4,0O g

CoCl₂.6H₂O 0,02 g

Agar 20,00 g

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter Der pH-Wert ist mit KOH auf 7,0 eingestellt.

Die inokulierte Schräge wird bei einer Temperatur von ⁰C etwa 7 Tage inkubiert.

509851/1153

Beispiel

22

Nach dem in Beispiel 17 beschriebenen Verfahren werden die Antibiotica A-28086 hergestellt, wobei man jedoch ein Kolben-Produktions-Medium folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteile

1)

Tapiocadextrin

Mit Enzym hydrolysiertes

Casein '

Rummelasse (Blackstrap-Melasse) Calciumcarbonat

Ammoniumsulfat

Magnes iumsulfat
Raffiniertes Sojabohnenöl

Menge

g/Liter

15,O g/Liter 15,0 g/Liter

2,0 g/Liter

1,0 g/Liter

0,5 g/Liter 4,6 g/Liter

Staley Dextrin No. 11, A.E. Staley Co., Decatur, 111,

Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

Beispiel

23

Nach dem in Beispiel 21 beschriebenen Verfahren werden A-28086 Antibiotica hergestellt, wobei man als dazwischen befindliche dritte Stufe jedoch ein vegetatives Medium folgender Zusammensetzung verwendet:

509851/1153

Bestandteile Menge

Cerelose 20,0 g/Liter

Maisquellwasser (Naßgewicht) 10,0 g/Liter

Sojabohnenschrot 15,0 g/Liter

CaCO₃ 2,0 g/Liter

Hefe 2,0 g/Liter

Zuckerrübenmelasse 5,0 g/Liter

Beispiel 24 Mit A-28086 modifiziertes Hühnerfutter zur Bekämpfung von Coccidiosis

Nach folgender Rezeptur stellt man ein für eine rasche Gewichtszunahme geeignetes ausgewogenes Hühnerkraftfutter her:

Bestandteile % kg

gemahlener gelber Mais 50 454

Sojabohnenmehl, mit Lösungsmittel
extrahiert und enthülst, fein gemahlen, 50 % Protein 31,09 282,3

Tierfutter (Rindertalg) 6,5 59

getrocknetes Fischmehl, mit Solubles (60 % Protein)

Distillers' Solubles aus Mais

Dicalciumphosphat, als Futterzusatzqualität

Calciumcarbonat

5,0	45,4
4,0	36,3
1,8	16,34
0,8	7,26

509851/1153

Bestandteile % kg

Vitaminvorgemisch

(Vitamin A, D, E, K und B₁₂, Cholin, Niacin, Pantothensäure, Riboflavin,

Biotin, mit Glucose gefüllt) 0,5 4,54

Spurenmineralvorgemisch

(MnSO., ZnO, KJ, FeSO., CaCO,) O,2 1,81

2-Amino-4-hydroxybuttersäure

(Hydroxyanalog von Methionin) 0,1 0,90

A-28086 Faktor A 0,01 0,09

Die obigen Substanzen werden in üblicher Weise miteinander vermischt. Die mit einem solchen Futter gefütterten Hühnchen, wobei Wasser ad libitum gegeben wird, sind gegen Coccidiosis geschützt. Die Gewichtszunahme der Tiere ist vergleichbar zu derjenigen coccidiosisfreier Hühnchen, die mit einem ähnlichen, jedoch nicht wirkstoffhaltigen Futter gefüttert werden.

509851/1153

Beispiel 25 A-28086 enthaltendes Rinderfutter

Aus folgenden Bestandteilen wird ein ausgewogenes Rinderfutter mit hohem Korngehalt hergestellt:

Bestandteile % kg

Fein gemahlener Mais 67,8 615,6

Gemahlene Maiskolben 1O 90,7

Entwässertes Alfalfamehl

17 % Protein 5 45,4

Mehl aus enthülsten Sojabohnen, mit Lösungsmittel extrahiert, 50 % Protein

Rohzuckermelasse Harnstoff
A-28086 Faktor A

Dicalciumphosphat, Futterqualität

Calciumcarbonat Natriumchlorid Spurenmineralvorgemisch Vorgemisch aus Vitamin A und D₂

2)

Vorgemisch aus Vitamin E Calciumpropionat

'Enthält pro kg: 4 405 300 I.E. Vitamin A, 5 OO4 400 I.E. Vitamin D₂ und 849,5 g Sojabohnenfutter mit 1 % ölzusatz.

Getrocknete Destillationsrückstände aus Mais mit Solubles, die 440 53O I.E. d-alpha-Tocopherylacetat pro kg enthalten.

9,9956	90,76
5	45,4
0,6	5,44
O,OO44	0,04
0,5	4,54
0,5	4,54
0,3	2,72
O,O3	0,27
O,O7	0,63
0,05	0,45
0,15	1,36

509851/1

Das Futtergemisch wird zu Pellets verpreßt. Bei einer mittleren täglichen Freßmenge von 6,8 kg Futter pro Tier erhält man mit diesem Futter etwa 3OO mg A-28086 Faktor A pro Tier und Tag.

Beispiel 26 A-28086 Faktor D Acety!esterderivat

Antibioticum A-28086 Faktor D wird in Pyridin gelöst. Die Lösung versetzt man mit einer stöchiometrisehen Menge Essigsäureanhydrid. Die erhaltene Lösung wird gründlich durchmischt, worauf man sie über Nacht bei Raumtemperatur stehen läßt. Die erhaltene Lösung wird dann mit einem Überschuß Wasser versetzt, worauf man alles gründlich durchmischt und das Gemisch mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehen läßt. Der dabei entstehende Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der erhaltene Feststoff wird in Aceton gelöst und unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man A-28086 Faktor D Acetylesterderivat erhält.

Beispiele 27 - 30

a) Nach dem in Beispiel 26 beschriebenen Verfahren setzt man A-28086 Faktor D mit Propionsäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin zu Antibioticum A-28086 Faktor D Propionylesterderivat um.

b) Nach dem in Beispiel 26 beschriebenen Verfahren setzt man A-28086 Faktor D mit η-ButterSäureanhydrid in Gegenwart von Pridin zu Antibioticum A-28086 Faktor D n-Butyrylesterderivat um.

509851/1153

- 1OO -

c) Nach dem in Beispiel 26 beschriebenen Verfahren setat man A-28086 Faktor D mit Capronsäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin zu Antibioticum A-28086 Faktor D n-Caproylesterderivat um.

d) Nach dem in Beispiel 26 beschriebenen Verfahren setzt man A-28086 Faktor D mit Valeriansäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin zu Antibioticum A-28086 Faktor D n-Valerylesterderivat um.

Beispiel 31 Herstellung von A-28086 Faktor D Natriumsalz

Antibioticum A-28086 Faktor D wird in Aceton gelöst. Die Lösung wird mit einer äquivalenten Menge Wasser versetzt, worauf man soviel 5 η Natriumhydroxid zugibt, daß sich der pH-Wert auf etwa 11 einstellt. Die erhaltene Lösung wird etwa 1 Stunde gerührt und dann mit Xthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird unter Vakuum eingedampft, wodurch man A-28086 Faktor D Natriumsalz erhält.

Beispiele 32-34

a) Nach dem in Beispiel 31 beschriebenen Verfahren setzt man A-28086 Faktor D mit 5 η Kaliumhydroxid zu Antibioticum A-28086 Faktor D Kaliumsalz um.

b) Nach dem in Beispiel 31 beschriebenen Verfahren setzt man A-28086 Faktor D mit gesättigtem Bariumhydroxid zu Antibioticum A-28086 Faktor D Bariumsalz um.

509851/1153

c) Nach dem in Beispiel 31 beschriebenen Verfahren setzt man A-28086 Faktor D mit 1 η Cäsiumhydroxid zu Antibioticum A-28086 Faktor D Cäsiumsalz um.

Beispiel 35 A-28O86 Faktor D enthaltendes Hühnerfutter zur Bekämpfung von Coccidiosis

Unter Verwendung folgender Bestandteile wird ein für eine rasche Gewichtszunahme geeignetes ausgewogenes Hühnerkraftfutter hergestellt:

Bestandteile % kg

Gemahlener gelber Mais 50 454

Sojabohnenmehl, mit Lösungsmittel extrahiert und enthülst, fein gemahlen, 50 % Protein

Tierfutter (Rindertalg)

Getrocknetes Fischmehl mit Solubles (60 % Protein)

Distillers' Solubles aus Mais

Dicalciumphosphat, als Futterzusatzqualität

Calciumcarbonat

31,09	282,3
6,5	59
5,0	45,4
4,0	36,3
i,a	16,34
0,8	7,26

609851/1

Bestandteile % kg

Vitaminvorgemisch
(Vitamin A, D, E, K und B^r Cholin,

Niacin, Pantothensäure, Riboflavin,

Biotin, mit Glucose gefüllt) 0,5 4,54

Spurenmineralgemisch

(MnSO₄, ZnO, KJ, FeSO₄, CaCO₃) 0,2 1,81

2-Amino-4-hydroxybuttersäure

(Hydroxyanalog von Methionin) 0,1 0,90

A-28086 Faktor A 0,01 0,09

Die obigen Substanzen werden in bekannter Weise miteinander vermischt. Mit einem derartigen Futter gefütterte Hühner,
denen man Wasser ad libitum gibt, sind gegen Coccidiosis
geschützt. Die Gewichtszunahme der Tiere ist vergleichbar
mit derjenigen coccidiosisfreier Hühnchen, die man mit
einem ähnlichen jedoch nicht wirkstoffhaltigen Futter füttert.

Beispiel A-28O86 Faktor D enthaltendes Rinderfutter

Aus folgenden Bestandteilen wird ein ausgewogenes Rinderfutter mit hohem Korngehalt hergestellt:

509851/1153

Bestandteile

Fein gemahlener Mais Gemahlener Maiskolben

Entwässertes Alfalfamehl 17 % Protein

Mehl aus enthülsten Sojabohnen, mit Lösungsmittel extrahiert, 50 % Protein Rohzuckermelasse Harnstoff A-28086 Faktor A

Dicalciumphosphat, Futterqualität

Calciumcarbonat Natriumchlorid Spurenmineralvorgemi s ch Vorgeraisch aus Vitamin A und

2) Vorgeraisch aus Vitamin E Calciümpropionat

1) 67,8
10

Jc₂

615,6 90,76

45,4

9,9956	90,7
5	45,4
0,6	5,44
0,0044	0,040
O,5	4,54
0,5	4,54
0,3	2,72
0,03	0,27
0,07	0,63
O,O5	0,45
0,25	1,36

Enthält pro kg: 4 405 300 I.E. Vitamin A, 5 004 400 I.E. Vitamin D₂ und 849,5 g Sojabohnenfutter mit 1 % ölzusatz.

Getrocknete Destillationsrückstände aus Mais mit Solubles, die 440 530 I.E. d-alpha-Tocopherylacetat pro kg enthalten.

509851/1153

Das vermischte Futter wird zu Pellets verpreßt. Bei einer im Mittel täglich gefressenen Futtermenge von 6,8 kg Futter pro Tier liefert dieses Futtermittel etwa 300 mg A-28086 Faktor D pro Tier und Tag.

50985 1/1153

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1.J Verfahren zur Herstellung des Antibioticum A-28086-—/
   Komplexes mit den Faktoren A, B und D, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 oder Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrat, Stickstoff sowie anorganische Salze enthält, submers unter aeroben Fermentationsbedingungen solange züchtet, bis diese Organismen im Kulturmedium eine wesentliche Menge antibiotischer Aktivität produziert haben.

   2. Antibioticum A-28086-Komplex mit den Faktoren A, B und D nach Anspruch 1.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Antibioticum A-28086-Komplex aus dem Kulturmedium abtrennt.

   4. Verfahren nach Anspruch Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man A-28086 Faktor A aus dem abgetrennten Antibioticum A-2 8086-Komplex isoliert.

   5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man A-28O86 Faktor D aus dem abgetrennten Antibioticum-A-28086-Komplex isoliert.

   509851/1153

   BRD - 106 -

   6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man A-28086 Faktor B aus dem abgetrennten Antibioticum A-28086-Kömplex isoliert.

   7. Antibioticum A-28086 Faktor A, dadurch gekennzeichnet/ daß es sich dabei um eine nach Umkristallisieren aus Aceton-Wasser weiße kristalline Verbindung handelt, die in niederen Alkoholen, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol löslich ist, sich in Hexan jedoch nur schlecht löst und in Wasser unlöslich ist, bei etwa 98 bis 100 ⁰C schmilzt, sich wieder verfestigt und dann bei etwa 195 bis 200 ⁰C wieder schmilzt und folgende weitere Eigenschaften hat:

   a) ein Molekulargewicht von 764, bestimmt durch Massenspektroaetrie,

   b) eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 66,69 % Kohlenstoff, 9,85 % Wasserstoff und 23,10 % Sauerstoff,

   c) eine empirische Formel ^C43^H72°ii' durch Massenspektrometrie bestimmt,

   d) eine spezifische Drehung von -54 (c =0,2, Methanol) , gemessen bei 25 ⁰C,

   e) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Chloroform mit folgenden unterscheidbaren Absorptionsmaxima: 2,85, 3,34, 5,83, 6,82, 7,22, 7,53 (schwach), 7,78 (schwach), 8,75 (stark), 8,95 (stark), 9,15, 9,50 (stark), 9,55 (stark), 9,60, 9,85, 10,15, 10,45 und 10,70 (schwach)

   Mikron,

   f) nur eine Endabsorption bei weniger als 2OO m,u im Ultraviolettspektrum in Äthanol,

   $09851/1153

   BRD - 1O7 -

   g) · ein magnetisches Kernresonanzspektrum in Deuterochloroform mit folgenden Eigenschaften: <T 6,01 4,21, 4,11, 3,99, 3,89, 3,80, 3,67, 3,65, 3,57, 3,55, 2,83, 2,76, 2,74, 2,68, 2,66, 2,58, 2,56, 2,30 2,22 2,17, 2,10, 2,05, 1,96, 1,90, 1,85, 1,7O, 1,62, 1,60, 1,47, 1,39, 1,31, 1,25, 1,18, 0,95, 0,93, O,90, 0,88, O,85, 0,77, 0,75, 0,73, 0,68 und O,66 ppm,

   h) eine titrierbare Gruppe mit einem pK -Wert von 7,9

   el

   in 80-prozentigem wässrigem Dimethylformamid,

   i) ein charakteristisches RöntgenbeugungsSpektrum für das Pulver (Cu⁺⁺ Strahlung, 1,5405 ^. , Nickelfilter) mit folgenden interplanaren Abständen in Angström (d):

   d Relative Intensität

   12,00 1OO

   1O,1O 50

   9,25 90

   8,00 40

   7,50 15

   6,92 90

   6,40 40

   5,98 05

   5,68 15

   .,20 40 4,98 4O 4,62 40

   4.21 2O 3,48 10

   509851/1153

   j) einen R_f-Wert von 0,24 in der Dünnschichtchromatographie über Silicagel unter Verwendung eines 3:2 Lösungsmittelsysterns aus Benzol-Äthylacetat und Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus,

   k) in den unten angegebenen papierchromatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende R_f-Werte:

   R_f-Werte

   Lösungsmi ttelsystem

   0,11

   Mit Methylisobutylketon (MIBK) gesättigtes Wasser

   0,41

   Mit MIBK plus 2 % p-Toluolsulfonsäure sowie 1 % Piperidin gesättigtes Wasser

   0,54

   Wasser:Methanol:Aceton (12:3:1) mit NH₄OH auf pH 10,5 eingestellt und dann mit H₃PO₄ auf pH 7,5 erniedrigt

   0,48 0,15

   1 % MIBK, 0,5 % NH₄OH in Wasser

   17,4 g K₂HPO₄, 30 ml Äthanol pro Liter Wasser

   0,24 0,24 0,75

   Mit Wasser gesättigtes Benzol

   Wasser

   Wasser:MIBK:Äthylacetat (98:1:1)

   509851/1153

   BRD - 109· -

   1) eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion und

   m) wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe,

   oder das obige Antibioticum in Form seiner C₂~C_ß-Acylesterderivate sowie physiologisch annehmbaren Salze.

   8. Antibioticum A-28086 Faktor B, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um eine nach Umkristallisieren aus Aceton-Wasser weiße kristalle Verbindung handelt, die in niederen Alkoholen, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol löslich ist, sich in Hexan nur schlecht löst und in Wasser unlöslich ist, und folgende weitere Eigenschaften hat:

   a) einen Schmelzpunkt von etwa 150 - 153 ⁰C,

   b) ein Molekulargewicht von 762, bestimmt durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung,

   c) eine empirische Formel C₄₃H₇₀O₁₁, bestimmt durch Massenspektrometrie hoher Auflösung,

   d) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Chloroform mit folgenden unterscheidbaren Absorptionsmaxima: 2,82, 3,30, 5,77, 5,85, 6,80, 7,20, 7,50 (schwach), 7,72 (schwach), 7,80 (schwach), 8,57 (stark), 8,68, 8,90 (stark), 9,10, 9,50, 9,83 (stark), 9,90, 10,10, 10,17 (stark), 10,43 (schwach), 10,80 (schwach), 11,20 (schwach), 11,35 (schwach), 11,73 (schwach) und 12,03 (schwach) Mikron,

   509851/1153

   BRD - 110 -

   e) ein Absorptionsmaximum in Äthanol im Ultraviolettspektrum bei 22O m,u (eJ*_ - 137,5, £ = - 1O 477),

   f) ein magnetisches Kernresonanzspektrum in Deuterochloroform mit folgenden Eigenschaften: ζ 7,20, 7,09, 6,26, 6,15, 4,19, 4,12, 4,05, 3,95, 3,89, 3,78, 3,62, 3,59, 3,52, 3,48, 2,81, 2,73, 2,63, 2,54, 2,52, 1,99, 1,91, 1,84, 1,71, 1,67, 1,64, 1,55, 1,43, 1,33, 1,18, 1,11, O,96, 0,94, O,9O, O,87, O,84, 0,77, 0,74 und 0,68 ppm,

   g) einen Rp-Wert von 0,42 im Dünnschichtgromatogramm über Silicagel unter Verwendung eines 3:2-Gemisches aus Benzol und Äthylacetat sowie Bacillus subtilis

   ATCC 6633 als Detektionsorganismus,

   h) in den im folgenden angegebenen papierchromatogra-

   phischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende R_f-Werte:

   R_-Werte Lösungsmittelsystem

   0,16 Mit MIBK plus 2 % p-Toluolsulfon-

   säure und 1 % Piperidin gesättigtes Wasser

   0,46 Wasser:Methanol:Aceton M2:3:1)

   mit NH₄OH auf pH 10,5 eingestellt

   und dann mit H^PO. auf pH 7,5 erniedrigt

   0,36 1 % MIBK, 0,5 % NH₄OH in Wasser

   0,51 Mit Wasser gesättigtes Benzol

   O,11 Wasser

   0,61 Wasser:MIBK:Äthylacetat (98:1:1)

   50985 1/1153

   BRD - 111 -

   i) eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion,

   j) zwei Ketofunktionen und

   k) wenigstens eine Hydroxylgruppe,

   oder das obige Antibioticum in Form seiner physiologisch unbedenklichen Salze.

   9. Antibioticum A-28086 Faktor D, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um eine nach Umkristallisieren aus Aceton-Wasser kristalline Verbindung handelt, die in Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol löslich ist, sich in Hexan jedoch nur schlecht löst und in Wasser unlöslich ist, über einen Schmelzpunkt von etwa 96 - 98 ⁰C verfügt und folgende weitere physikalische Daten hat:

   a) ein Molekulargewicht von 778, bestimmt durch Massenspektrometrie hoher Auflösung,

   b) eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 67,59 % Kohlenstoff, 9,38 % Wasserstoff und 22,77 % Sauerstoff,

   c) eine empirische Formel C₄₄H₇₄O..., bestimmt durch Massenspektrometrie hoher Auflösung,

   50985 1/1153

   BRD - 112 -

   d) eine spezifische Drehung von -56° (c=O,1, Methanol), bestimmt bei 25 ⁰C,

   e) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Chloroform mit folgenden beobachtbaren Absorptionsmaxima: 2,89/ 3,39, 3,43, 3,50, 5,88, 6,90, 7,27, 7,60, 7,84, 9,00, 9,26, 9,62, 10,31, 10,58, 11,10 und 11,49 Mikron,

   f) in 95-prozentigem wässrigem Äthanol keine beobachtbare ültraviolettabsorption,

   g) in Chloroform ein magnetisches Kernresonanzspektrum mit folgenden Eigenschaften: 6 6,00, 4,20, 4,10, 4,00, 3,98, 3,92, 3,86, 3,83, 3,79, 3,67, 3,64, 3,57, 3,54, 2,88, 2,81, 2,71, 2,62, 2,58, 2,48, 2,43, 2,37, 2,29, 2,21, 2,15, 2,10, 2,04, 1,97, 1,89, 1,83, 1,76, 1,68, 1,61, 1,58, 1,55, 1,47, 1,39, 1,30, 1,25, 1,18, 0,95, 0,90, 0,88, 0,84, 0,74 und 0,68 ppm,

   h) in 80-prozentigem wässrigem Dimethylformamid eine titrierbare Gruppe mit einem pK_a~Wert von 8,67,

   i) als Pulver folgendes charakteristisches Röntgenbeugungsspektrum (Cu⁺⁺ Strahlung, 1,5405 Λ , Nickelfilter) mit folgenden interplanaren Abständen in Angström (d):

   509851/1153

   BRD - 113 -

   Relative d Intensität

   12,40 100

   10,20 70

   8,85 90

   7,80 30

   6,80 10

   6,30 1OO

   5,70 20

   5,35 20

   5,10 20

   4,90 10

   4,65 20

   4,45 40

   4,20 30

   3,30 10

   3,15 10

   2,99 05

   2,77 05

   2,28 05

   j) in dünnschichtchromatographischen Systemen auf Silicagel unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende R_f-Werte:

   R_f-Werte Lösungsmittelsystem

   0,26 Benzol-Äthylacetat (3:2)

   0,66 Äthylacetat-Diäthylamin

   (95:5)

   509851/1 153

   BRD - 114-

   k) in papierchromatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende R_f-Werte:

   R^-Werte Lösungsmittelsystem

   O_f1O Mit Methylisobutylketon (MIBK)

   gesättigtes Wasser

   0,26 Mit MIBK plus 2 % p-Toluol-

   sulfonsäure sowie 1 % Piperidin gesättigtes Wasser

   0,36 Wasser:Methanol:Aceton (12:3:1)

   mit NH₄OH auf pH 10,5 eingestellt

   und dann mit H₃PO₄ auf pH 7,5 erniedrigt

   - •

   0,29 1 % MIBK, 0,5 % NH₄OH in Wasser

   0,25 17,4 g K₂HPO₄, 30 ml Äthanol pro

   Liter Wasser

   0,26 Mit Wasser gesättigtes Benzol

   0,09 Wasser

   0,64 Wasser:MIBK:Äthylacetat

   (98:1:1)

   1) eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion und

   m wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe,

   oder das obige Antibioticum in Form seiner C₂-Cg-Acylesterderivate sowie physiologisch unbedenklichen Salze.

   509651/11S3

   BRD

   10. Veterinär zvibereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Antibioticum A-28086-Komplex oder an Faktor A, Faktor B oder Faktor D dieses Antibioticums oder Kombinationen hieraus als Wirkstoff.

   -44-,

   Coccidiosis bei Geflügel, dadurch gekennzeichne^^daß man Geflügel eine wirksame Menge einer Zubereitung verabreicht, die eine Verbindung nach Anspruch ^JP^sowie einen physiologisch unbedenklichen

   12.

   Trä

   nachträglich geändert

   nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, L-

   /\ H^. Anticoccidiales Futtermittel, gekennzeichnet durch ein Geflügelfutter sowie 0,003 bis 0,04 % einer Verbindung nach Anspruch 3.

   Al

   Anticoccidiales Futtermittel, gekennzeichnet durch ein Geflügelfutter sowie 0,003 bis 0,04 % einer Verbindung nach Anspruch 4.

   Verfahren zur Erhöhung der Futterutilisationseffizienz bei Wiederkäuern, die über eine entwickelte Pansenfunktion verfügen, dadurch gekennzeichnet, daß man solchen Tieren oral eine propionaterhöhende Menge einer Verbindung nach Anspruch 3, einer Verbindung nach Anspruch 4 oder der ^C2~^Cfi"" Acylderivate hiervon oder der physilogisch unbedenklichen Salze der Verbindungen nach Anspruch 3 oder 4 oder der Esterderivate hiervon verabreicht.

   509851/1153

   BRD - 116 -

   y>. Rindermastfutter, gekennzeichnet durch ein Rinderfutter sowie 1 bis 30 g pro Tonne einer Verbindung nach
   Anspruch 3, einer Verbindung nach Anspruch 4, eines ^cj~^C6~ Acylesterderivats solcher Verbindungen sowie der physiologisch unbedenklichen Salze solcher Verbindungen und der
   Esterderivate hiervon.

   509851/1153

   Leerseite