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Die Erfindung betrifft ein Futtermittel, insbesondere zur Erhöhung der Futterutilisationseffizienz bei Wiederkäuern, die über eine entwickelte Pansenfunktion verfügen.
Das erfindungsgemässe Futtermittel ist dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff Antibioticum A-28086-Komplex oder Faktor A, Faktor B oder Faktor D dieses Antibioticums oder Kombinationen hieraus enthält.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Verhinderung oder Behandlung von Coccidiosis bei Ge-
EMI1.1
Antibioticums oder Kombinationen hieraus sowie einen physiologisch unbedenklichen Träger enthält. Als Träger kann in dem beim erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Futter ein Geflügelfutter dienen. Der Träger kann aber auch Trinkwasser sein.
Das Antibioticum A-28086 Faktor A ist nach Umkristallisieren ausAceton-Wasser eineweisse kristalline Verbindung, die sich in niederen Alkoholen, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol löst, in Hexan jedoch nur schwach löslich ist und sich in Wasser nicht löst, bei etwa 98 bis 1000C schmilzt, sich wieder verfestigt und dann bei etwa 195 bis 2000C wieder schmilzt und folgende weitere Eigenschaften hat :
a) ein Molekulargewicht von 764, durch Spektrometrie bestimmt, b) eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 66, 69% Kohlenstoff, 9, 85% Wasserstoff und 23, 10%
Sauerstoff,
EMI1.2
und 0, 66 ppm, h) eine titrierbare Gruppe mit einem pKa-Wert von 7, 9 in 80% igem wässerigem Dimethylformamid, i) ein charakteristisches Röntgenbeugungsspektrum für das Pulver (Cu++ Strahlung, 1, 5405 A.,
Nickelfilter) mit folgenden interplanaren Abständen in Angström (d) :
EMI1.3
<tb>
<tb> d <SEP> Relative <SEP> Intensität <SEP>
<tb> 12,00 <SEP> 100
<tb> 10,10 <SEP> 50
<tb> 9, <SEP> 25 <SEP> 90
<tb> 8,00 <SEP> 40
<tb> 7, <SEP> 50 <SEP> 15
<tb> 6, <SEP> 92 <SEP> 90
<tb> 6,40 <SEP> 40
<tb> 5,98 <SEP> 05
<tb> 5, <SEP> 68 <SEP> 15
<tb> 5, <SEP> 20 <SEP> 40
<tb> 4, <SEP> 98 <SEP> 40
<tb> 4, <SEP> 62 <SEP> 40
<tb> 4, <SEP> 21 <SEP> 20
<tb> 3,48 <SEP> 10
<tb>
j) einen Rf-Wert von 0, 24 in der Dünnschichtchromatographie über Silicagel unter Verwendung eines
3 :
2 Lösungsmittelsystems aus Benzol-Äthylacetat und Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektions- organismus, k) in den unten angegebenen papierchromatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende Rf-Werte :
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EMI2.1
<tb>
<tb> Ri-Werte <SEP> Losungsmittelsystem
<tb> 0, <SEP> 11 <SEP> Mit <SEP> Methylisobutylketon <SEP> (MIBK)
<tb> gesättigtes <SEP> Wasser
<tb> 0, <SEP> 41 <SEP> Mit <SEP> MBK <SEP> plus <SEP> 2% <SEP> p-Toluolsulfonsäure <SEP> sowie <SEP> 1% <SEP> Piperidin <SEP> gesättigtes <SEP> Wasser
<tb> 0, <SEP> 54 <SEP> Wasser <SEP> : <SEP> Methanol <SEP> : <SEP> Aceton <SEP> (12 <SEP> : <SEP> 3 <SEP> :
<SEP> 1) <SEP>
<tb> mit <SEP> NH4 <SEP> OH <SEP> auf <SEP> PH <SEP> 10,5 <SEP> eingestellt
<tb> und <SEP> dann <SEP> mit <SEP> HSP04 <SEP> aufPH <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP>
<tb> erniedrigt
<tb> 0, <SEP> 48 <SEP> 1% <SEP> MIBK, <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> NH40H <SEP> in <SEP> Wasser <SEP>
<tb> 0, <SEP> 15 <SEP> 17, <SEP> 4 <SEP> g <SEP> K2 <SEP> HPO4, <SEP> 30 <SEP> ml <SEP> Äthanol/l
<tb> Wasser
<tb> 0, <SEP> 24 <SEP> Mit <SEP> Wasser <SEP> gesättigtes <SEP> Benzol
<tb> 0, <SEP> 24 <SEP> Wasser
<tb> 0,75 <SEP> Wasser <SEP> :MIBK:Äthylacetat
<tb> (98 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1) <SEP>
<tb>
1) eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion und m) wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe, oder das obige Antibioticum liegt in Form seiner C2-C6-Acylesterderivate sowie physiologisch annehmbaren Salze vor.
Das Antibioticum A-28086 Faktor B ist nachumkristallisieren ausAceton-Wasser eine weisse kristalline Verbindung, die sich in niederen Alkoholen, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol löst, in Hexan jedoch nur schwach löslich ist und sich in Wasser nicht löst und folgende weitere Eigenschaften hat : a) einen Schmelzpunkt von etwa 150 bis 153oC, b) ein Molekulargewicht von 762, bestimmt durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung, c) eine empirische Formel C43H 0, bestimmt durch Massenspektrometrie hoher Auflösung,
EMI2.2
Chloroform3 :
2-Gemisches aus Benzol und Äthylacetat sowie Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganis- mus, h) in den im folgenden angegebenen papierchromatographischen Systemen unter Verwendung von
Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende Itf-Werte :
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EMI3.1
<tb>
<tb> Rf-Werte <SEP> Lösungsmittelsystem
<tb> 0, <SEP> 16 <SEP> Mit <SEP> MIBKplus <SEP> 2% <SEP> p-Toluolsulfon- <SEP>
<tb> säure <SEP> und <SEP> 1% <SEP> Piperidin <SEP> gesättigtes
<tb> Wasser
<tb> 0, <SEP> 46 <SEP> Wasser <SEP> : <SEP> Methanol <SEP> : <SEP> Aceton <SEP> (12 <SEP> : <SEP> 3 <SEP> :
<SEP> 1) <SEP>
<tb> mit <SEP> NH40H <SEP> aufPH <SEP> 10, <SEP> 5 <SEP> eingestellt
<tb> und <SEP> dann <SEP> mit <SEP> H <SEP> PO, <SEP> auf <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP>
<tb> erniedrigt
<tb> 0, <SEP> 36 <SEP> 1% <SEP> MIBK, <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> NH40H <SEP> in <SEP> Wasser <SEP>
<tb> 0, <SEP> 51 <SEP> Mit <SEP> Wasser <SEP> gesättigtes <SEP> Benzol
<tb> 0, <SEP> 11 <SEP> Wasser
<tb> 0,61 <SEP> Wasser <SEP> : <SEP> MIBK <SEP> : <SEP> Äthylacetat <SEP>
<tb> (98 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 1) <SEP>
<tb>
EMI3.2
<Desc/Clms Page number 4>
EMI4.1
<tb>
<tb> d <SEP> Relative <SEP> Intensität
<tb> 12, <SEP> 40 <SEP> 100
<tb> 10, <SEP> 20 <SEP> 70
<tb> 8, <SEP> 85 <SEP> 90
<tb> 7, <SEP> 80 <SEP> 30
<tb> 6, <SEP> 80 <SEP> 10
<tb> 6, <SEP> 30 <SEP> 100 <SEP>
<tb> 5, <SEP> 70 <SEP> 20
<tb> 5, <SEP> 35 <SEP> 20
<tb> 5, <SEP> 10 <SEP> 20
<tb> 4,90 <SEP> 10
<tb> 4, <SEP> 65 <SEP> 20
<tb> 4, <SEP> 45 <SEP> 40
<tb> 4, <SEP> 20 <SEP> 30
<tb> 3, <SEP> 30 <SEP> 10
<tb> 3, <SEP> 15 <SEP> 10
<tb> 2, <SEP> 99 <SEP> 05
<tb> 2, <SEP> 77 <SEP> 05
<tb> 2,28 <SEP> 05
<tb>
j) in dünnschichtchromatographischen Systemen auf Silicagel unter Verwendung von Bacillus subtilis
ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende Rf-Werte :
EMI4.2
<tb>
<tb> Rf-Werte <SEP> Lösungsmittelsystem
<tb> 0,26 <SEP> Benzol-Äthylacetat <SEP> (3:2)
<tb> 0,66 <SEP> Äthylacetat-Diäthylamin <SEP> (95:5)
<tb>
k) in papierchromatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als
Detektionsorganismus folgende Rf-Werte :
EMI4.3
<tb>
<tb> Rf-Werte <SEP> Lösungsmittelsystem
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> Mit <SEP> Methylisobutylketon <SEP> (MIBK)
<tb> gesättigtes <SEP> Wasser
<tb> 0, <SEP> 26 <SEP> Mit <SEP> MIBK <SEP> plus <SEP> 2% <SEP> p-Toluolsulfonsäure <SEP> sowie <SEP> 1% <SEP> Piperidin <SEP> gesättigtes <SEP> Wasser
<tb> 0,36 <SEP> Wasser <SEP> : <SEP> Methanol <SEP> : <SEP> Aceton <SEP> (12 <SEP> : <SEP> 3 <SEP> :
<SEP> 1) <SEP>
<tb> mit <SEP> NH40H <SEP> auf <SEP> PH <SEP> 10,5 <SEP> eingestellt
<tb> und <SEP> dann <SEP> mit <SEP> H3PO4 <SEP> auf <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 5
<tb> erniedrigt
<tb> 0,29 <SEP> 1% <SEP> MIBK, <SEP> 0,5% <SEP> NH4OH <SEP> in <SEP> Wasser
<tb> 0, <SEP> 25 <SEP> 17, <SEP> 4 <SEP> g <SEP> K2HPO, <SEP> 30 <SEP> ml <SEP> Äthanol/l
<tb> Wasser
<tb> 0, <SEP> 26 <SEP> Mit <SEP> Wasser <SEP> gesättigtes <SEP> Benzol
<tb> 0,09 <SEP> Wasser
<tb> 0,64 <SEP> Wasser <SEP> : <SEP> MIBK <SEP> : <SEP> Äthylacetat <SEP>
<tb> (98 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 1) <SEP>
<tb>
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1) eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion und m) wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe, oder das obige Antibioticum liegt in Form seiner C-C-Acylesterderivate sowie physiologisch unbedenk- lichen Salze vor.
Es gibt zwar bereits eine Reihe antibakterieller Mittel, doch besteht immer noch ein Bedarf nach neuen und besseren Antibiotica. Ein Problem bei der derzeitigen Antibioticatherapie ist die Tatsache, dass sich Antibiotica in ihrer Wirksamkeit gegenüber pathogenen Organismen unterscheiden. Ein weiteres Problem ist die Entwicklung von Organismenstämmen, die gegenüber Standardantibiotica resistent sind. Ein anderes Problem ist schliesslich die Tatsache, dass einzelne Patienten oft an ernsten Reaktionen gegenüber spezifi- schen Antibiotica leiden, die auf eine Hypersensitivität und/oder toxische Effekte zurückzuführen sind. Wegen dieser Probleme in der derzeitigen Therapie besteht immer noch Bedarf an neuen Antibiotica.
Ausser neuen Antibiotica zur Behandlung von Erkrankungen des Menschen werden auch bessere Antibiotica in der Veterinärmedizin benötigt. Ein wichtiger Gesichtspunkt ist dabei der Bedarf an besseren Antibiotica zur Wachstumsfòrderung von Geflügel und Haustieren. Zu einer solchen Wachstumsförderung kommt es beispielsweise durch eineverringerung der Krankheiten und durch eine Verbesserung der Futterutilisation.
Eine bekannte Krankheit von wirtschaftlicher Bedeutung in der Veterinärmedizin, u. zw. insbesondere in der Geflügelindustrie, ist die durch Protozoen hervorgerufene Coccidiosis. Zu einer Coccidiosis kommt es durch Infektion mit einer oder mehreren Arten von Eimeria oder Isospora (bezüglich einer Zusammenfassung wird auf Lund and Farr in "Disease8 of Poultry", 5.Auflage, Biester andSchwarte, Eds., Iowa State University Press, Ames, Ia., [1965], Seiten 1056 bis 1096 hingewiesen. Wegen der starken wirtschaftlichen Verluste durch Coccidiosis und auf Grund der Nachteile einiger bekannter anticoccidialer Mittel wird immer noch nach besseren anticoccidialen Mitteln gesucht.
Eine weitere Erkrankung bei den Tieren ist die Enteritis, durch die es bei den Tierzüchtern ebenfalls zu ernsthaften wirtschaftlichen Verlusten kommen kann. Die Enteritis tritt bei Hühnchen, Schweinen, Rindern und Schafen auf, und sie ist vorwiegend auf anaerobe Bakterien, Insbesondere Clostridium perfringens, sowie Viren zurückzuführen. Die Enterotoxämle bei Wiederkäuern, von denen ein Beispiel das Überfressen bei Schafen ist, ist ein Zustand, der durch eine Infektion mit C. perfringens hervorgerufen wird.
Die Wachstumsförderung bei Wiederkäuern, wie Rindern, ist ein weiteres wirtschaftlich interessante Ziel der Veterinärmedizin. Von besonderem Interesse ist dabei eine Wachstumsförderung, die man durch Verbesserung der Futterverwertung erreicht. Der Mechanismus für eine Utilisation des überwiegenden nutritiven Anteils (Kohlehydrate) des Futters von Wiederkäuern ist bekannt. Durch im Pansen der Tiere vorhandene Mikroorganismen werden Kohlehydrate unter Bildung von Monosacchariden abgebaut, und diese Monosaccharide werden dann in Pyruvatverbindungen umgewandelt. Die Pyruvate werden durch mikrobiologische Verfahren zu Acetaten, Butyraten oder Propionaten metabolisiert, die kollektiv als flüchtige Fettsäuren (VFA) bezeichnet werden.
Bezüglich einer detaillierteren Diskussion wird auf Leng "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et al. Eds., OrielPress, Newcastle-upon-Tyne, England [1970], Seiten 408 bis 410 verwiesen.
Die relative Effizienz der VFA-Utilisation wird von McCullough in Feedstuffs, 18. Juni 1971, Seite 19, Eskeland et al. in J. An. Sei. 33,282 [1971] sowie Church et al. in "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Band 2 [1971], Seiten 662 und 625 diskutiert. Es werden zwar auch Acetate und Butyrate utilisiert, die Propionate werden jedoch weit effizienter utilisiert. Darüber hinaus können die Tiere eine Ketosis entwickeln, falls zu wenig Propionat verfügbar ist. Eine entsprechend günstige Verbindung stimuliert daher die Tiere zur Bildung eines höheren Anteils an Propionaten aus Kohlehydraten, wodurch sich die Kohlehydratutilisation verbessert und der Befall an Ketosis geringer wird.
Das Antibioticum A-28086 Faktoren A, Bund D gehört zu einem neuen Vertreter einer Gruppe von Polyätherantibiotica. Beispiele von Vertretern aus dieser Gruppe sind unter anderem Monensin (US-PS
EMI5.1
3, 501, 568), Dianemycin (R. L. Hamill, M. M. Hoehn, G. E. Pittenger, J. Chamberlin und M.DerwentNo. 76960T, US-PS Nr. 3, 857, 948, und H. Kinashi, N. Otake, H. Yonehara, S. Sato und Y. Salto, Tetrahedron Lett. 49,4955-4958 [1973]).
Die Angabe antibiotische Komplex, wie sie in der Fermentationschemie und auch in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich nicht auf einen chemischen Komplex, sondern auf ein Gemisch gleichzeitig gebildeter individueller antibiotische Faktoren. Das Verhältnis der bei einem antibiotischen Komplex gebildeten einzelnen Faktoren schwankt, wie dem mit der Bildung von Antibiotica durch Fermentation vertrauten Fachmann bekannt ist, in Abhängigkeit von den jeweils angewandten Fermentationsbedingungen.
Der Antibioticum A - 28086 - Komplex wird gebildet, indem man den neuen Stamm Streptomyces
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EMI6.1
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(etwa 10 g/l) besser filtrieren, und man erhält zugleich ein besseres getrocknetes Produkt.
Die Antibiotica A-28086 Faktoren A, B und D können in bekannter Weise voneinander getrennt und als Einzelverbindungen isoliert werden, beispielsweise durch Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie u. dgl. Zur Trennung der Faktoren A, B und D bedient man sich beispielsweise einer Säulenchromatographie über Silicagel, wobei man die Säule mit variierenden Lösungsmittelgemischen, wie Gemischen aus Benzol und Äthylacetat, eluiert. Bei Verwendung von Lösungsmittelgemischen aus Benzol und Äthylacetat zum Eluieren einer Silicagelsäule wird der Faktor B als erster eluiert, und die Faktoren A und D kommen dann erst später. Das Fortschreiten der Elution lässt sich am einfachsten durch das oben beschriebene dünnschichtchromatographische Verfahren überwachen.
Die A-28086 Verbindungen inhibieren das Wachsen von Bakterien und Fungi, die Krankheitserreger für Tier und Pflanze sind. Die relativen mikrobiologischen Wirksamkeiten von A-28086 Faktoren A und B gehen aus der folgenden Tabelle 1 hervor.
Die hierin enthaltenen Werte werden nach dem üblichen Scheibendiffusionsverfahren ermittelt (hiezu werden 6 mm-Scheiben in Lösungen getaucht, die 1 mg Wirkstoff/ml Lösung enthalten, und die so erhaltenen getrennten Scheibchen werden dann auf Agarplatten gelegt, die mit den jeweiligen Testorganismen geimpft sind).
Tabelle I
EMI7.1
<tb>
<tb> Inhibierungszone <SEP> (mm)
<tb> Testorganismus <SEP> A-28086 <SEP> A-28086
<tb> Faktor <SEP> A <SEP> Faktor <SEP> B
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 19 <SEP> 21
<tb> Bacillus <SEP> subtilis
<tb> ATCC <SEP> 6633 <SEP> 28 <SEP> 31
<tb> Sarcina <SEP> lutea
<tb> ATCC <SEP> 9341 <SEP> 26 <SEP> 16
<tb> Mycobacterium <SEP> avium
<tb> ATCC <SEP> 7992 <SEP> 12 <SEP> 12
<tb> Saccharomyces <SEP> pastorianum
<tb> ATCC <SEP> 2366 <SEP> 17 <SEP> - <SEP>
<tb> Candida <SEP> tropicalis <SEP> 14 <SEP> 14
<tb> Fusarium <SEP> moniliforme <SEP> 12 <SEP> nicht
<tb> untersucht
<tb>
Ein wichtiger Gesichtspunkt ist die Tatsache, dass die A-28086-Verbindungen das Wachsen anaerober Bakterien hemmen.
Die Minimalinhibierkonzentrationen (MIC), bei denen A-28086 Faktor A verschiedene anaerobe Bakterien hemmt, werden nach dem Standard-Agarverdünnungsversuch ermittelt, und die dabei erhaltenen Werte sind in Tabelle II zusammengefasst. Die Endwerte werden nach 24-stündiger Inkubation ermittelt.
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Tabelle II
EMI8.1
EMI8.2
<tb>
<tb> Testorganismus <SEP> MIC <SEP> (g/ml)
<tb> Actinomyces <SEP> bovis <SEP> < <SEP> 0,5
<tb> Clostridium <SEP> inocuum <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Clostridium <SEP> perfringens <SEP> < <SEP> 0,5
<tb> Clostridium <SEP> ramosum <SEP> 4,0
<tb> Clostridiumsepticum <SEP> < <SEP> 0,5
<tb> Clostridium <SEP> septicum <SEP> bovine <SEP> < <SEP> 0,5
<tb> Eubacterium <SEP> aerofaciens <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Peptococcus <SEP> anaerobius <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> P <SEP> eptostreptococcus <SEP> intermedius <SEP> 16,0
<tb> Propionibacterium <SEP> acnes <SEP> 44 <SEP> 16,0
<tb> Fropionibacterlumacnes <SEP> 79 <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Bacteroides <SEP> fragillsspp.
<SEP> fragilis <SEP> 8, <SEP> 0
<tb> Bacteroides <SEP> fragilis <SEP> spp.
<tb> thetaiotacmicron <SEP> 8,0
<tb> Bacteroides <SEP> fragilis <SEP> ssp.
<tb> vulgatis <SEP> Nr. <SEP> 1563 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Bacteroides <SEP> fragilis <SEP> ssp.
<tb> vulgatis <SEP> Nr. <SEP> 1211 <SEP> 2,0
<tb> Fusobacterium <SEP> symbiosum <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Fusobacterium <SEP> necrophorum <SEP> 8,0
<tb> Veillonella <SEP> alcalescens <SEP> 16, <SEP> 0
<tb>
Auch die C-C-Acylesterderivate von A-28086 Faktor A sind antibakteriell und antifungal wirksam.
Diese Derivate zeigen eine erhöhte gram-positive Wirksamkeit. Die realtive gram-positive Wirkung bestimmter solcher Derivate wird mit der Wirksamkeit von Faktor A verglichen. Die Verbindungen werden durch einen turbidometrischen Versuch auf einem halbautomatisierten System untersucht (Autoturb Mikrobiologisches Untersuchungssystem, Elanco), wie es von N.R. Kuzel und F.W. Kavanaugh in J. Pharmaceut. Sei. 60 (5), 764 und 767 [1971] beschrieben wird. Zur Untersuchung der Antibiotica A-28086 werden folgende Versuchsparameter herangezogen : Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 in einem Nähr- brühemedium (PH 7), wobei 4 h bei 37 C inkubiert wird. Die zu untersuchenden Verbindungen und der Standard werden in Methanol-Wasser (10 : 90) gelöst.
Der Standard, nämlich A-28086 Faktor A, wird in Konzentrationen von 2,3, 4 sowie 5 mg/ml in den Drehteller des Autoturbgerates gegeben. Die zu untersuchenden Verbindungen werden soweit verdünnt, dass sie bei Eingabe in den Drehteller etwa 3 oder 4 mg Aktivität/ml enthalten.
Die untersuchten Verbindungen ergeben im Vergleich zum Standard folgende relative Aktivitäten :
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EMI9.1
<tb>
<tb> Verbindung <SEP> Relative-G-Aktivität
<tb> A <SEP> 28086 <SEP> Faktor <SEP> A <SEP> (Standard) <SEP> 1 <SEP>
<tb> A <SEP> 28086-A-Acetylesterderivat <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> A <SEP> 28086-A-Propionylesterderivat <SEP> 7
<tb> A <SEP> 28086-A-n- <SEP> Butyrylesterderivat <SEP> 8
<tb> A <SEP> 28086-A-n-Valerylesterderivat <SEP> 14
<tb> A <SEP> 28086-A-n-Caproylesterderivat <SEP> 20
<tb>
Eine weitere interessante Wirkung ist die antimikrobielle Wirksamkeit der Verbindungen A-28086, nämlich die Wirksamkeit gegenüber Mycoplasma.
Mycoplasmaarten, die auch als Pleuropneumonia-ähnliche (PPLO) Organismen bezeichnet werden, sind Krankheitserreger beim Menschen und bei verschiedenen Tie- I ren. Mittel, die gegen PPLO-Organismen wirken, werden insbesondere von der Geflügelindustrie benötigt.
Durch in-vitro-Brühenverdünnungsstudien erhält man mit dem Antibioticum A-28086 Faktor A gegenüber verschiedenen Mycoplasmaarten folgende in Tabelle m zusammengefasste Minimalinhibierkonzentrationen (MIC-Werte) :
Tabelle III
EMI9.2
EMI9.3
<tb>
<tb> Organismus <SEP> MIC <SEP> (mg/ml)
<tb> M. <SEP> gallisepticum <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP>
<tb> M. <SEP> hyorhinis <SEP> 12,5
<tb> M. <SEP> synoviae <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP>
<tb> M. <SEP> hypopneumoniae <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP>
<tb> M. <SEP> hyosynoviae <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP>
<tb>
Zum Desinfizieren von Oberflächen, um Tiere vor verschiedenen Myccplasmaarten zu schützen, reichen bereits Lösungen mit nur 10 mg Antibioticum A-28086/ml Lösung aus.
Die A-28086 Verbindungen sind ferner antivirale Mittel. A-28086 Faktor A wirkt gegenüber Poliovirus
EMI9.4
versuche gezeigt wird, die den von Siminoff in Applied Microbiology 9 (1), 66-72 [1961] beschriebenen Versuchen ähnlich sind. A-28086 Faktor A ist ferner gegenüber dem übertragbaren Gastroenteritis-Virus, Newcastle-Disease-Virus und infektiösen Rinder-Rhinotracheitis-Virus wirksam, wie durch ähnliche Gewe- bekulturuntersuchungen gezeigt wird.
Die Verbindungen A-28086 können zur Bekämpfung von Viren Säugetieren daher oral, topisch oder parenteral verabreicht werden. GeeigneteDosierungsspiegel zur Verhinderung oder Behandlung einer viralen Erkrankung liegen zwischen etwa 1 und etwa 5 mg/kg Tierkörpergewicht, u. zw je nach dem Virus und der Frage, ob der Wirkstoff prophylaktisch oder therapeutisch verwendet werden soll.
Lösungen, die eine A-28086 Verbindung, vorzugsweise zusammen mit einem oberflächenaktiven Mittel, enthalten, können darüber hinaus zur Dekontaminierung des in-vitro-Habitats verwendet werden, auf dem Viren, wie Polio oder Herpes, vorhanden sind. Lösungen mit einem Gehalt von etwa 1 bis etwa 1500 mg/ml einer A-28086 Verbindung reichen zur Bekämpfung von Viren aus.
Die akute Toxizität LD50 des Antibiotikums A-28086 Faktor A beträgt nach intraperitonealer Verabreichung an die Maus 7, 15 mg/kg.
Die Verbindungen A-28086 sind ferner auch Insekticide sowie Acarizide. Die VerbindungenA-28086 wirken in Anwendungsmengen von nur 500 ppm gegenüber Insekten, wie dem Mexikanischen Bohnenkäfer, dem Wolfsmilchkäfer und der Hausfliege, und sie sind ferner wirksam gegenüber Milben, wie der Blattspinnmilbe. Darüber hinaus wirken die Verbindungen A-28086 in Auftragmengen von 0, 1 ppm gegenüber Moskitolarven.
Eine wichtige Eigenschaft der Verbindungen A-28086 ist ihre anticocoidiale Wirkung. Fütterungsver- suche zeigen beispielsweise, dass man günstigere Gewichtszunahmen bei jungen Hühnchen erhält, wenn man diesen ein Futter gibt, das nur 0, 003% einer A-28086-Verbindung enthält, und mit Wirkstoffkonzentrationen von nur 0,
005% lässt sich die Mortalität verhindern und die Anzahl von Verletzungen bei Hühnchen herab-
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EMI10.1
& < BTabelle IV Wirksamkeit des Antibioticums A-28086 Faktor A gegenüber Eimeria Tenella
EMI10.2
<tb>
<tb> Wirkstoff-Anzahl <SEP> der <SEP> prozentuale <SEP> prozentuale <SEP> Mittlerer <SEP> prozentuale
<tb> konzentration <SEP> im <SEP> Hühnchen <SEP> Mortalität <SEP> Gew.-Zunahme <SEP> Schädigungswert <SEP> Erniedrigung <SEP> des
<tb> Futter <SEP> in <SEP> Gew.-% <SEP> Schadigungswertes <SEP>
<tb> 0, <SEP> 04 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 50 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> 0, <SEP> 02 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 82 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 95
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 94 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 95
<tb> Infizierte
<tb> Kontrollen <SEP> 20 <SEP> 35 <SEP> 68 <SEP> 3,
<SEP> 65 <SEP>
<tb> Normale
<tb> Kontrollen <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> 0, <SEP> 02 <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 84 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 96 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> 0, <SEP> 005 <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 91 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 27
<tb> 0, <SEP> 0025 <SEP> 20 <SEP> 10 <SEP> 87 <SEP> 3, <SEP> 85 <SEP> 0
<tb> Infizierte
<tb> Kontrollen <SEP> 20 <SEP> 40 <SEP> 74 <SEP> 3,
<SEP> 85 <SEP>
<tb> Normale
<tb> Kontrollen <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
Tabelle V Wirksamkeit des Antibioticums A-28086 Faktor A gegenüber verschiedenen Spezies von Eimeria
EMI11.1
<tb>
<tb> Infizierende <SEP> Wirkstoff- <SEP> prozentuale <SEP> prozen- <SEP> Mittlerer <SEP> prozentuale <SEP> gesamte <SEP> durch- <SEP> prozenOrganismen <SEP> konzentration <SEP> Mortalität <SEP> tuale <SEP> Schädigungs- <SEP> Erniedrigung <SEP> gekommene <SEP> tuale
<tb> im <SEP> Futter <SEP> in <SEP> Gewichts-wert <SEP> des <SEP> Schädigungs-Oocyten/Tier <SEP> Reduktion
<tb> Gew.-% <SEP> zunahme <SEP> wertes <SEP> (1 <SEP> x <SEP> 106)
<tb> Eimeria
<tb> acervulina <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> 0 <SEP> 87 <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> 53 <SEP> 6, <SEP> 15 <SEP> 83
<tb> 0, <SEP> 0025 <SEP> 0 <SEP> 82 <SEP> 1, <SEP> 25-4,
<SEP> 91 <SEP> 86
<tb> infizierte
<tb> Kontrollen-0 <SEP> 63 <SEP> 1, <SEP> 60-36, <SEP> 32 <SEP>
<tb> Eimeria
<tb> maxima <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> 0 <SEP> 85 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 85 <SEP> 1, <SEP> 95 <SEP> 40
<tb> infizierte
<tb> Kontrollen-0 <SEP> 65 <SEP> 1, <SEP> 3-3, <SEP> 24 <SEP>
<tb> Eimeria
<tb> brunetti <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> 0 <SEP> 88 <SEP> 1, <SEP> 2-2, <SEP> 31 <SEP> 58
<tb> infizierte
<tb> Kontrollen-0 <SEP> 62 <SEP> 1, <SEP> 7-5, <SEP> 55 <SEP>
<tb>
vier Wiederholungen,
jeweils 5 Brathähnchen
<Desc/Clms Page number 12>
Tabelle VI Wirksamkeit des Antibioticums A-28086 Faktor A gegenüber gemischten Spezies von Eimeria
EMI12.1
<tb>
<tb> Infizierende <SEP> Wirkstoff- <SEP> prozentuale <SEP> prozentuale <SEP> Intestinalschädigungen <SEP> Caecalschädigungen
<tb> Organismen <SEP> konzentration <SEP> Mortalität <SEP> Gewichts- <SEP> Mittel <SEP> Prozentuale <SEP> Mittel <SEP> prozentuale
<tb> in <SEP> Gew. <SEP> -% <SEP> zunahme <SEP> Reduktion <SEP> Beduktion
<tb> E. <SEP> necatrix <SEP> und <SEP>
<tb> E. <SEP> tenella <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> 0 <SEP> 94 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 59 <SEP> 1, <SEP> 75 <SEP> 50
<tb> infizierte
<tb> Kontrollen <SEP> 20 <SEP> 52 <SEP> 1, <SEP> 7-3, <SEP> 5 <SEP>
<tb> E. <SEP> tenella
<tb> E. <SEP> necatrix
<tb> E. <SEP> maxima
<tb> E. <SEP> brunetti
<tb> E. <SEP> acervulina
<tb> und
<tb> E.
<SEP> mivati <SEP> 0,01 <SEP> 0 <SEP> 91 <SEP> 0,4 <SEP> 79 <SEP> 0,9 <SEP> 73
<tb> infizierte
<tb> Kontrollen-50 <SEP> 12 <SEP> 1, <SEP> 9-3, <SEP> 3 <SEP>
<tb>
vier Wiederholungen, jeweils 5 Brathähnchen
<Desc/Clms Page number 13>
Zur Verhinderung oder Behandlung von Coccidiosis bei Geflügel verabreicht man den Tieren eine nicht toxische anticoccidiale Menge einer Verbindung A-28086, u. zw. vorzugsweise oral auf täglicher Basis. Die
Verbindung A-28086 kann über eine Reihe von Wegen geliefert werden. Die einfachste Verabreichungsart besteht jedoch in Verbindung mit einem physiologisch unbedenklichen Träger, vorzugsweise dem jeweiligen Futter der Tiere.
Zur Bestimmung der geeigneten Konzentration der Verbindung A-28086 müssen zwar ver- schiedene Faktoren berücksichtigt werden, die zu verabreichenden Mengen betragen im allgemeinen jedoch 0, 003 bis 0, 04 Gew.-%, auf das nicht mit Wirkstoff versehenes Futter bezogen, und sie machen vorzugs- weise 0, 005 bis 0, 02 Gew.-% des Futters aus.
Eine weitere wichtige Eigenschaft der Verbindungen A-28086 ist ihre Fähigkeit zur Verbesserung der Futterutilisationseffizienz bei Tieren. So wird beispielsweise die Futterutilationseffizienz bei Wiederkäuern, die über eine entwickelte Pansenfunktion verfügen, durch Einsatz von A-28086 Verbindungen verbessert.
Wie oben erwähnt, wird die Effizienz der Kohlehydratverwertung bei Wiederkäuern durch Behandlun- gen verbessert, durch die die Pansenflora des Tieres eher zur Produktion von Propionatverbindungen als zur Produktion von Acetat- oder Butyratverbindungen angeregt wird. Die Effizienz der Futterverwertung lässt sich überwachen, indem man die Produktion und Konzentration der Propionatverbindungen im Pansen unter Einsatz folgender Methoden beobachtet : Über eine in den Pansen reichende chirurgisch eingesetzte Fistel entnimmt man einem Ochsen Pansen- flüssigkeit. Der Ochse wird mit einem hochwertigen Kornfutter gefüttert. Eine Probe der Pansenflüssigkeit wird über ein aus vier Tüchern bestehendes Seihtuch abgeseiht, und das dabei erhaltene Filtrat wird ge- sammelt.
Das von dem Seihtuch zurückgehaltene stückige Material wird anschliessend in soviel physiologi- schem Puffer resuspendiert, dass man wieder das ursprüngliche Volumen der Pansenflüssigkeit erhält, und diese Suspension wird erneut filtriert. Der hiezu verwendete Puffer hat folgende Zusammensetzung :
EMI13.1
<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> g/l
<tb> Na2HPO <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 316 <SEP>
<tb> KH2PO <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 152 <SEP>
<tb> NaHCO <SEP> 2, <SEP> 260 <SEP>
<tb> KC1 <SEP> 0, <SEP> 375 <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 0,375
<tb> MgSO <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 112 <SEP>
<tb> CaCl2, <SEP> 2H20 <SEP> 0, <SEP> 050 <SEP>
<tb> FeSO <SEP> 4, <SEP> 7H2H <SEP> 0, <SEP> 008 <SEP>
<tb> MnS04, <SEP> H20 <SEP> 0, <SEP> 004 <SEP>
<tb> ZnSO. <SEP> 7H20 <SEP> 0, <SEP> 004 <SEP>
<tb> CuS04. <SEP> 5H2O <SEP> 0, <SEP> 002 <SEP>
<tb> CoCl2. <SEP> 6H2 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 001
<tb>
Dieser Puffer ist im übrigen von Cheng et al. in J. Dairy Sei. 38,1225-1230 [1955] beschrieben.
Die beiden Filtrate werden vereinigt, worauf man sie solange stehen lässt, bis sich oben festes Material abscheidet. Die klare Schicht wird abgetrennt, mit dem gleichen Puffer (1 : 1) verdünnt und dann auf einen pH-Wert von 6,8 bis 7,0 eingestellt.
Die verdünnte Pansenflüssigkeit (10 ml) wird zusammen mit 40 mg des oben beschriebenen Futters, einem weiteren Milligram Sojabohnenprotein und der zu untersuchenden Verbindung in einen 25 ml- Kolben gegeben. Jede Behandlung wird in vier Kolben durchgeführt. Es werden auch 2 Sätze aus je vier Vergleichskolben verwendet. Man arbeitet mit einem Vergleich zur Zeit Null und einem Vergleich nach 16-stündiger Inkubation. Alle Versuchskolben werden 16 h bei 38 C inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wird der pH-Wert gemessen, und man versetzt jeden Kolben mit 25%iger Metaphosphorsäure (2 ml). Hierauf lässt man den Kolbeninhalt absetzen, und die überstehenden Flüssigkeiten werden gaschromatographisch bezüglich der darin enthaltenen Propionat-, Acetat- und Butyratverbindungen analysiert.
Durch die erfindungsgemässen Wirkstoffe wird die Produktion von Propionat gegenüber den Vergleichen stark erhöht.
Die mit den erfindungsgemässenWirkstoffen erhaltenen Ergebnisse werden statistisch mit den Ergebnissen der Vergleiche verglichen. Aus Tabelle VII geht das Verhältnis der Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren in den behandelten Kolben und der Konzentrationen in den Vergleichskolben hervor.
<Desc/Clms Page number 14>
Tabelle VII VerhältnisausBehandlungzuKontrolle
EMI14.1
<tb>
<tb> Verbindung <SEP> ppm <SEP> in <SEP> der <SEP> Molprozent <SEP> Molprozent <SEP> Molprozent <SEP> gesamtes <SEP> VFA
<tb> Pansenflüssigkeit <SEP> Acetat <SEP> Butyrat <SEP> Propionat <SEP> mMol/l
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> A <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 94 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 1, <SEP> 34 <SEP> 1, <SEP> 26 <SEP>
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> B <SEP> 1 <SEP> 0,92 <SEP> 0,96 <SEP> 1, <SEP> 15 <SEP> 1, <SEP> 29 <SEP>
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> A
<tb> Acetylester <SEP> 1 <SEP> 0,79 <SEP> 0,76 <SEP> 2, <SEP> 04 <SEP> 1,04
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> A
<tb> Propionylester <SEP> 1 <SEP> 0,90 <SEP> 0, <SEP> 68 <SEP> 1, <SEP> 73 <SEP> 1,25
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> A
<tb> Butyrylester <SEP> 1 <SEP> 0,91 <SEP> 0, <SEP> 81 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 1,
<SEP> 19 <SEP>
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> A
<tb> Valerylester <SEP> 1 <SEP> 0,92 <SEP> 0,79 <SEP> 1, <SEP> 55 <SEP> 1, <SEP> 18 <SEP>
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> A
<tb> Caproylester <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 86 <SEP> 0,97 <SEP> 1, <SEP> 57 <SEP> 0,99
<tb>
<Desc/Clms Page number 15>
Die Wirksamkeit der Koblehydratutilisation wird an Hand von in-vivo-Untersuchungen weiter demonstriert, die an Tieren durchgeführt werden, in deren Pansen Fisteln angelegt sind, über die man Proben des Panseninhalts entnehmen kann.
Der in Tabelle Vm angeführte Versuch wird unter Verwendung erwachsener mit Fisteln versehener Ochsen durchgeführt, die jeweils etwa 554 kg wiegen. Zwei Ochsen werden mit einem normalen Futter gefutter, und vier Ochsen aus jeder Behandlungsgruppe füttert man mit einem identischen Futter, das mit A-28086 Faktor A versetzt ist. Jede Teilmenge (100 ml) der entnommenen Pansenflüssigkeit wird mit 10% iger Metaphosphorsaure (100 ml) versetzt. Sodann lässt man die Proben absetzen und analysiert die überstehenden Flüssigkeiten gaschromatographisch zur Bestimmung der Propionsäurekonzentration.
Die in Tabelle vm angeführten Versuchsergebnisse sind die mittleren prozentualen Zunahmen der Propionsäurekonzentration im Pansen, u. zw. Mittelwerte aus 5 Analysen während einer 14-tägigen Versuchsdauer. Die Vergleiche enthalten etwa 20 Mol-% Propionsäure.
Tabelle VIII
EMI15.1
<tb>
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> A <SEP> prozentuale <SEP> Zunahme <SEP> gegenüber
<tb> (mg/Tag) <SEP> den <SEP> Kontrollen
<tb> 25 <SEP> 17, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 100 <SEP> 54, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Durch in-vivo-Versuche wird darüber hinaus gezeigt, dass A-28086 Faktor A die Futterutilisationseffizienz bei Schafen erhöht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen, die über eine Zeitspanne von 56 Tagen durchgeführt werden, gehen aus der folgenden Tabelle IX hervor.
<Desc/Clms Page number 16>
Tabelle, IX
EMI16.1
<tb>
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> A <SEP> Anzahl <SEP> der <SEP> Mittlere <SEP> tägliche <SEP> Futteraufnahme <SEP> Verhältnis <SEP> aus <SEP> prozentuale
<tb> in <SEP> g/Tonne <SEP> Tiere <SEP> Gewichtszu- <SEP> in <SEP> kg/Tag <SEP> Futteraufnahme <SEP> Verbesserung
<tb> Futter <SEP> nahme <SEP> zu
<tb> in <SEP> kg/Tag <SEP> Gewichtszunahme
<tb> 9 <SEP> 13 <SEP> 0,20 <SEP> 1,50 <SEP> 7,40 <SEP> 12
<tb> 18 <SEP> 13 <SEP> 0, <SEP> 17 <SEP> 1, <SEP> 43 <SEP> 8, <SEP> 31 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Kontrolle <SEP> 17 <SEP> 0, <SEP> 19 <SEP> 1,61 <SEP> 8, <SEP> 38 <SEP> - <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 17>
Die Verbindungen A-28086 Faktor D sind antivirale Mittel.
A-28086 Faktor D wirkt gegenüber MarylandB-Virus, Poliovirus Typ m, COE-Virus, Herpes-Virus und Semliki-Forest-Virus, wie durch den in-vitroPlattensupressionsversuch. gezeigt wird, der vom von Siminoff in Applied Microbiology 9 (1), 66-72 [1961] beschriebenen Versuch ähnlich ist. A-28086 Faktor D ist ferner wirksam gegenüber dem übertragbaren Gastroenteritis-Virus, Newcastle-Dlsease-Virus und infektiösem Rinder- Rhinotracheitis- Virus, wie sich durch ähnliche Gewebekulturuntersuchungen ergibt.
Die Tatsache, dass die Verbindungen A-28086 Faktor D sowohl gegenüber Viren als auch gegenüber anaeroben Bakterien wirksam sind, macht diese Verbindungen besonders geeignet zur Behandlung oder Verhinderung von Enteritis bei Hühnchen, Schweinen, Rindern und Schafen. Die Verbindung A-28086 Faktor D eignet sich ferner zur Behandlung einer Enterotoxämie bei Wiederkäuern.
Die anticoccidiale Wirkung der erfindungsgemässen Verbindungen A-28086 Faktor D ist eine wichtige Eigenschaft. Die anticoccidiale Wirkung von A-28086 Faktor D gegenüber Eimeria tenella wird durch
EMI17.1
Unter Einsatz üblicher Techniken stellt man unter Verwendung von Leighton-Röhrchen, Plastikschäl- chen oder Platten oder sonstiger geeigneter Kulturbehältnisse Wirtszellkulturen her. Nach 2 bis 3 Tage langem Wachsen in einem geeigneten Kulturmedium (Eagle Minimalessentialmedium, Lactalbuminhydrolysat in Earle- oder Hank-Salzlösung, Medium 199 u. dgl.) bildet sich gewöhnlich eine geeignete Monoschicht, die infiziert und mit Wirkstoff behandelt werden kann. Für diese Untersuchungen werden Primärkulturen von Hühnchennierenzellen verwendet.
Aus den Fäkalien infizierter Hühnchen gewinnt man lebende Oocysten von Eimeria tenella, und diese werden vor ihrer Verwendung gereinigt und sterilisiert. Die Oocysten sporuliert man dann durch Inkubation bei Raumtemperatur, indem man durch die Suspension Luft leitet oder diese Suspension auf einem Rotationsschüttler oder einem sonstigen geeigneten Gerät leicht schüttelt. Zur Verhinderung von Bakterien oder Schimmelwachstum während der Sporulation kann man Kaliumdichromat oder Schwefelsäure (oder andere Chemikalien) verwenden.
Die infektiven Sporozoiten lassen sich aus den Oocysten durch eine Kombination aus einer mechanischen Zerstörung der Wand des Oocysten, anschliessende Behandlung mit Trypsin und Behandlung mit Gallensalzen excystieren, wodurch die Selbstbefreiung der Sporozoiten aus den Sporocysten eingeleitet wird.
Zellkulturen werden infiziert, indem man in das Kulturgefäss lebende Sporozoiten einbringt. Die zu untersuchenden Chemikalien kann man gleichzeitig damit oder auch später einführen. Der zu untersuchende Wirkstoff wird in der gewünschten Konzentration in 10% Dimethylformamid in physiologischer Salzlösung eingebracht. Der Endpunkt des Versuchs besteht in einer Hemmung nichtgeschlechtlicher Entwicklungsstufen, und er wird durch mikroskopische Untersuchung von Kulturen bestimmt, die man 96 h nach Infektion fixiert und anfärbt. Die Ergebnisse werden angegeben in wirksam (A), unwirksam (N) oder cycotoxisch (C), u. zw. je nach der Gegenwart oder Fehlen von Schlzonten der zweiten Generation und irgendeiner offensichtlichen Toxizität gegenüber der Zellmonoschicht.
Die bei dieser Untersuchung für A-28086 Faktor D erhaltene anticoccidiale Wirksamkeit ist in der folgenden Tabelle X zusammengefasst.
Tabelle X
Anticoccidiale Wirksamkeit
Antibioticum A-28086 Faktor D
EMI17.2
<tb>
<tb> Konzentration <SEP> von
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> D <SEP> Bewertung
<tb> (mg/ml)
<tb> 5 <SEP> C
<tb> 1 <SEP> C <SEP>
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> C <SEP>
<tb> 0, <SEP> 4 <SEP> A, <SEP> C+ <SEP>
<tb> 0,03 <SEP> A
<tb> 0, <SEP> 02 <SEP> A
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> : <SEP> f <SEP> : <SEP> A <SEP>
<tb> 0,008 <SEP> N
<tb>
Ergebnis aus zwei Versuchen
<Desc/Clms Page number 18>
Ein weiteres interessante Merkmal der Verbindungen A-28086 Faktor D ist ihre Fähigkeit zur Verbesserung der FutterutillsationsefSzienz bei Wiederkäuern, die über eine entwickelte Pansenfunktion verfügen. Der Mechanismus zur Utilisation bzw. Verwertung des überwiegenden nutritiven Anteils (Kohlehydrate) von Wiederkäuer futter ist genau bekannt.
Durch Im Pansen des Tieres vorhandene Mikroorganismen werden Kohlehydrate unter Bildung von Monosacchariden abgebaut, und diese Monosaccharide werden dann In Pyruvatverbindungen umgewandelt. Die Pyruvate werden durch mikrobiologische Verfahren unter Bildung von Acetaten, Butyraten oder Propionaten metabolisiert, die man kollektiv als flüchtige Fettsäuren (VFA)
EMI18.1
"Physiology'England [1970], Seiten 408-410 verwiesen.
Die relative Effizienz der VFA-Utilisation wird von McCullough In Feedstuffs, 19. Juni 1971, Seite 19, Eskeland et al. in "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Band 2, [1971], Seiten 622 und 625 erörtert. Es werden zwar auch die Acetate und Butyrate utilisiert, die Utilisation der Propionate ist jedoch
EMI18.2
aus Kohlehydraten angeregt, wodurch sich die Utilisationseffizlenz für Kohlehydrate erhöht und gleichzeitig die Gefahr einer Ketosis verringert.
Die Wirksamkeit eines derartigen Wirkstoffes lässt sich bestimmen, indem man seinen Einfluss auf die Produktion und Konzentration der Propionatverbindungen im Pansen nach dem gleichen Verfahren ermittelt, wie es auch oben im Zusammenhang mit Faktor A verwendet wird.
Die dabei erhaltenen Versuchsergebnisse sind verglichen mit Vergleichsergebnissen statistische Werte.
Aus Tabelle XI geht das Verhältnis der Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren in mit A-28086 Faktor D
EMI18.3
EMI18.4
<tb>
<tb> A-28086 <SEP> D <SEP> Molprozent <SEP> Molprozent <SEP> Molprozent <SEP> gesamtes <SEP> VFA
<tb> mg/ml <SEP> Acetat <SEP> Butyrat <SEP> Propionat <SEP> mMol/1
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 8715 <SEP> 0, <SEP> 7973 <SEP> 1, <SEP> 7981 <SEP> 1, <SEP> 1979 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 8976 <SEP> 0, <SEP> 8726 <SEP> 1, <SEP> 5871 <SEP> 1, <SEP> 0630 <SEP>
<tb>
Die erfindungsgemäss eingesetzten Verbindungen erhöhen den Anteil an Propionaten und somit die Effizienz der Futterutilisation, wenn sie Wiederkäuern oral In Mengen von etwa 0, 05 bis etwa 5, 0 mg/kg und Tag verabfolgt werden. Die günstigsten Ergebnisse erhält man bei einer Verabreichung von etwa 0, 1 bis etwa 2, 5 mg Wirkstoff/kg und Tag.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Verabreichung der erfindungsgemässen Wirkstoffe besteht in einem Vermischen mit dem Tierfutter, die Wirkstoffe lassen sich jedoch auch in anderer Weise verabreichen, beispielsweise In Form von Tabletten, Tränken, Boll oder Kapseln. Diese verschiedenen Dosierungsformen lassen sich In In der Veterinärmedizin bekannter Weise formulieren. Jede einzelne Dosierungseinheit sollte eine Wirkstoffmenge enthalten, die der jeweiligen Tagesdosis direkt entspricht, mit der das Tier behandelt werden soll.
Das A-28086 kann zusammen mit Rindermastfuttern verwendet werden, die ein Rinderfutter und 1 bis 30 g Wirkstoff/t enthalten. Rinderfutter unterscheidet sich bekanntlich von andern Futtermitteln, wie bei-
EMI18.5
quellen. Eine häufig verwendete nichtproteinartige Stickstoffquelle ist Harnstoff.
Wie oben erwähnt, sind die erfindungsgemäss eingesetzten A-28086-Verbindungen antivirale Mittel, und sie wirken ferner gegenüber anaeroben Bakterien, insbesondere Clostridium perfringens. Die A-28086-Verbindungen eignen sich daher zur Behandlung oder Verhinderung einer Enteritis bei Hühnern, Schweinen, Rindern und Schafen. Die erfindungsgemäss eingesetzten Verbindungen A-28086 können ferner zur Behandlung von Enterotoxämie bei Wiederkäuern verwendet werden.
Vorschrift 1 :
EMI18.6
wendung einer Filterhilfe (Hyflo Supercel, nämlich einer Diatomeenerde, Johns-Manville Products Corp. ) filtriert, wodurch man 97 1 filtrierte Brühe erhält. Die filtrierte Brühe wird mit einem etwa gleichen Volu-
<Desc/Clms Page number 19>
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<Desc/Clms Page number 20>
EMI20.1
<tb>
<tb> ;1) <SEP> Benzol
<tb> 2) <SEP> Benzol <SEP> : <SEP> Äthylacetat <SEP> (9 <SEP> : <SEP> 1) <SEP>
<tb> 3) <SEP> Benzol <SEP> : <SEP> Äthylacetat <SEP> (4 <SEP> : <SEP> 1) <SEP>
<tb> 4) <SEP> Benzol <SEP> : <SEP> Äthylacetat <SEP> (7 <SEP> : <SEP> 3) <SEP>
<tb> 5) <SEP> Benzol <SEP> : <SEP> Äthylacetat <SEP> (1 <SEP> : <SEP> 1) <SEP>
<tb> 6) <SEP> Äthylacetat
<tb> 7) <SEP> Methanol
<tb>
Es werden Fraktionen von jeweils 11 gesammelt.
Jede Fraktion wird durch einen entsprechenden Versuch gegenüber Bacillus subtilis untersucht und zur Identifizierung der eluierten Verbindungen dünnschicht- chromatographisch ausgewertet. Das A-28086-I wird mit einem Gemisch aus Benzol und Äthylacetat (4 : 1) eluiert. Die Eluierung von A-28086 Faktor B erfolgt mit einem Gemisch aus Benzol und Äthylacetat (7 : 3). A-28086 Faktoren A und D werden in den Fraktionen eluiert, die man mit den Gemischen aus Benzol und Äthylacetat (7 : 3 und 1 : 1), nämlich den Fraktionen 119 bis 156, erhält. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wird in Aceton (500 ml) gelöst.
Die Acetonlösung versetzt man mit Wasser (500 ml), worauf man den pH-Wert der erhaltenen wässerigen Lösung mit verdünnter Salzsäure auf pH 3 einstellt und die Lösung 1 h rührt. Der dabei entstandene Niederschlag wird abfiltriert und aus Aceton (500 ml) sowie Wasser (180 ml) umkristallisiert. Die dabei entstandenen Kristalle werden abfiltriert und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 20, 1 g eines Gemisches aus A-28086 Faktoren A sowie D erhält.
Vorschrift 4 :
Trennen und Reinigung der Einzelfaktoren A und D
Das nach Vorschrift 3 erhaltene kristalline Gemisch der Faktoren A und D von A-28086 (18,8 g) wird in Benzol (50 mI) gelöst. Die Benzollösung wird auf eine Silicagelsäule (7 x 100 cm Säule, E. Merk Silicagel, Sorte 60, feiner als 0,062 mm) aufgegeben.
Die Eluierung der Säule erfolgt bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 90 ml/h der Reihe nach mit folgenden Eluiermitteln :
EMI20.2
<tb>
<tb> 1) <SEP> 121 <SEP> Benzol
<tb> 2) <SEP> 12 <SEP> 1 <SEP> Benzol <SEP> : <SEP> Äthylacetat <SEP> (9 <SEP> : <SEP> 1) <SEP>
<tb> 3) <SEP> 121 <SEP> Benzol <SEP> : <SEP> Äthylacetat <SEP> (4 <SEP> : <SEP> 1) <SEP>
<tb> 4) <SEP> 321 <SEP> Benzol <SEP> : <SEP> Äthylacetat <SEP> (7 <SEP> : <SEP> 3) <SEP>
<tb> 5) <SEP> 101 <SEP> Methanol
<tb>
Das Eluierverfahren wird durch Dünnschichtchromatographie mit Cellulose (Merk Darmstadt, Cellulose auf Aluminiumträger) sowie bioautographisch unter Verwendung von B. subtilis verfolgt.
Man arbeitet mit folgenden Lösungsmittelsystemen : Wasser : Methanol : Aceton (12 : 3 : 1), wobei der pH-Wert der Lösung mit Ammoniumhydroxyd zuerst auf pH 10,5 und dann mit Salzsäure auf pH 7,5 eingestellt wird.
Bis zum Auffinden einer Aktivität werden Fraktionen von 1 bis 2 l aufgefangen, und dann sammelt man Fraktionen von 200 ml. Die Fraktionen, die lediglich A-28086 Faktor D enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zu einem Rückstand eingedampft. Der Rückstand wird aus Aceton-Wasser (1 : 1) umkristallisiert. Die Kristalle werden abgetrennt und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 140 mg kristallines A-28086 Faktor D erhält. Diejenigen Fraktionen, die A-28086 Faktor D mit einer Spur A-28086 Faktor A enthalten, werden genauso behandelt, wodurch man weitere 150 mg kristallines A-28086 Faktor D erhält, das eine geringe Menge A-28086 Faktor A enthält.
Die Fraktionen, die lediglich A-28086 Faktor A enthalten, werden ebenfalls in der gleichen Weise behandelt, wodurch man 4, 7 g kristallines A-28086 Faktor A erhält.
<Desc/Clms Page number 21>
Beispiel1 :MitA-28086modifiziertesHühnerfutterzurBekämpfungvonCoccidiosis
Nach folgender Rezeptur stellt man ein für eine rasche Gewichtszunahme geeignetes ausgewogenes Hühnerkraftfutter her :
EMI21.1
<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> kg <SEP>
<tb> gemahlener <SEP> gelber <SEP> Mais <SEP> 50 <SEP> 454
<tb> Sojabohnenmehl, <SEP> mit <SEP> Lösungsmittel
<tb> extrahiert <SEP> und <SEP> enthülst, <SEP> fein <SEP> gemahlen, <SEP> 50% <SEP> Protein <SEP> 31, <SEP> 09 <SEP> 282, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Tierfutter <SEP> (Rindertalg) <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> 59
<tb> getrocknetes <SEP> Fischmehl, <SEP> mit
<tb> Solubles <SEP> (60% <SEP> Protein) <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 45, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Distillers'Solubles <SEP> aus <SEP> Mais <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 36, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Dicalciumphosphat, <SEP> als <SEP> Futterzusatzqualität <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> 16,
<SEP> 34 <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 7, <SEP> 26 <SEP>
<tb> Vitaminvorgemisch
<tb> (Vitamin <SEP> A, <SEP> D, <SEP> E, <SEP> Kund <SEP> B <SEP> ,
<tb> Cholin, <SEP> Niacin, <SEP> Pantothensäure,
<tb> Riboflavin, <SEP> Biotin, <SEP> mit <SEP> Glucose
<tb> gefüllt) <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 54 <SEP>
<tb> Spurenmineralvorgemisch
<tb> (MnSO4, <SEP> ZnO, <SEP> KJ, <SEP> FeSO4, <SEP> CaCO3) <SEP> 0,2 <SEP> 1,81
<tb> 2-Amino-4-hydroxybuttersäure
<tb> (Hydroanalog <SEP> von <SEP> Methionin) <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 90 <SEP>
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 09 <SEP>
<tb>
EMI21.2
EMI21.3
<tb>
<tb> :
Bestandteile <SEP> % <SEP> kg <SEP>
<tb> Fein <SEP> gemahlener <SEP> Mais <SEP> 67, <SEP> 8 <SEP> 615,6
<tb> Gemahlene <SEP> Maiskolben <SEP> 10 <SEP> 90, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Entwässertes <SEP> Alfalfamehl
<tb> 17% <SEP> Protein <SEP> 5 <SEP> 45, <SEP> 4 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 22>
EMI22.1
<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> kg
<tb> Mehl <SEP> aus <SEP> enthülsten <SEP> Sojabohnen,
<tb> mit <SEP> Lösungsmittel <SEP> extrahiert,
<tb> 50% <SEP> Protein <SEP> 9, <SEP> 9956 <SEP> 90, <SEP> 76 <SEP>
<tb> Rohzuckermelasse <SEP> 5 <SEP> 45, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Harnstoff <SEP> 0,6 <SEP> 5,44 <SEP>
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 0044 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP>
<tb> Dicalciumphosphat,
<tb> Futterqualität <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 54 <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 54 <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0,
<SEP> 3 <SEP> 2, <SEP> 72 <SEP>
<tb> Spurenmineralvorgemisch <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP>
<tb> Vorgemisch <SEP> aus <SEP> Vitamin <SEP> A <SEP> und <SEP> D <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP> 0, <SEP> 63 <SEP>
<tb> Vorgemisch <SEP> aus <SEP> Vitamin <SEP> E <SEP> 0,05 <SEP> 0,45
<tb> Calciumpropionat
<tb>
Enthält pro kg : 4405300 I. E. Vitamin A, 5004400 I. E. Vitamin D2 und
849,5 g Sojabohnenfutter mit 1% Ölzusatz.
Getrocknete Destillationsrückstände aus Mais mit Solubles, die 440 530 I. E. d-o'-Tocopherylacetat/kg enthalten.
Das Futtergemisch wird zu Pellets verpresst. Bei einer mittleren täglichen Fressmenge von 6, 8 kg Futter/Tier erhält man mit diesem Futter etwa 300 mg A-28086 Faktor A/Tier und Tag.
Beispiel3 :A-28086FaktorDenthaltendesHühnerfutterzurBekämpfungvonCoccidiosis
Unter Verwendung folgender Bestandteile wird ein für eine rasche Gewichtszunahme geeignetes ausgewogenes HUhnerkraftfutter hergestellt :
EMI22.2
<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> kg <SEP>
<tb> Gemahlener <SEP> gelber <SEP> Mais <SEP> 50 <SEP> 454
<tb> Sojabohnenmehl, <SEP> mit <SEP> Lösungsmittel
<tb> extrahiert <SEP> und <SEP> enthülst, <SEP> fein <SEP> gemahlen, <SEP> 50% <SEP> Protein <SEP> 31,09 <SEP> 282,3
<tb> Tierfutter <SEP> (Rindertalg) <SEP> 6,5 <SEP> 59
<tb> Getrocknetes <SEP> Fischmehl <SEP> mit
<tb> Solubles <SEP> (60% <SEP> Protein) <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 45, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Distillers'Solubles <SEP> aus <SEP> Mais <SEP> 4,0 <SEP> 36,
3
<tb>
<Desc/Clms Page number 23>
EMI23.1
<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> kg <SEP>
<tb> Dicalciumphosphat, <SEP> als <SEP> Futterzusatzqualität <SEP> 1,8 <SEP> 16,34
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0,8 <SEP> 7, <SEP> 26
<tb> Vitaminvorgemisch
<tb> (Vitamin <SEP> A, <SEP> D, <SEP> E, <SEP> KundB,
<tb> Cholin, <SEP> Niacin, <SEP> Pantothensäure,
<tb> Riboflavin, <SEP> Biotin, <SEP> mit <SEP> Glucose
<tb> gefüllt) <SEP> 0,5 <SEP> 4,54
<tb> Spurenmineralgemisch
<tb> (MnSO, <SEP> ZnO, <SEP> KJ, <SEP> FeSO, <SEP> CaCOs) <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 81 <SEP>
<tb> 2-Amino-4-hydroxybutters <SEP> aure <SEP>
<tb> (Hydroxyanalog <SEP> von <SEP> Methionin) <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0,90
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 09 <SEP>
<tb>
Die obigen Substanzen werden in bekannter Weise miteinander vermischt.
Mit einem derartigen Futter gefüttert Hühner, denen man Wasser ad libitum gibt, sind gegen Coccidiosis geschützt. Die Gewichtszunahme der Tiere ist vergleichbar mit derjenigen coccidiosisfreier Hühnchen, die man mit einem ähnlichen jedoch nicht wirkstoffhaltigen Futter füttert.
Beispiel 4 : A-28086 Faktor D enthaltendes Rinderfutter
Aus folgenden Bestandteilen wird ein ausgewogenes Rinderfutter mit hohem Korngehalt hergestellt :
EMI23.2
<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> kg
<tb> Fein <SEP> gemahlener <SEP> Mais <SEP> 67, <SEP> 8 <SEP> 615, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Gemahlener <SEP> Maiskolben <SEP> 10 <SEP> 90, <SEP> 76 <SEP>
<tb> Entwässertes <SEP> Alfalfamehl
<tb> 17% <SEP> Protein <SEP> 5 <SEP> 45, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Mehl <SEP> aus <SEP> enthülsten <SEP> Sojabohnen,
<tb> mit <SEP> Lösungsmittel <SEP> extrahiert,
<tb> 50% <SEP> Protein <SEP> 9, <SEP> 9956 <SEP> 90, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Rohzuckermelasse <SEP> 5 <SEP> 45, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Harnstoff <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 5, <SEP> 44 <SEP>
<tb> A-28086 <SEP> Faktor <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 0044 <SEP> 0, <SEP> 040 <SEP>
<tb> Dicalciumphospbat, <SEP> Futterqualität <SEP> 0,
<SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 54 <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 54 <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 2, <SEP> 72 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 24>
EMI24.1
<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> kg
<tb> Spurenmineralvorgemisch <SEP> 0,03 <SEP> 0,27
<tb> Vorgemisch <SEP> aus <SEP> Vitamin <SEP> A <SEP> und <SEP> D2 <SEP> 1) <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP> 0,63
<tb> Vorgemisch <SEP> aus <SEP> Vitamin <SEP> E <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP>
<tb> Calciumpropionat <SEP> 0,25 <SEP> 1, <SEP> 36
<tb>
1) Enthält pro kg : 4 405 300 I. E. Vitamin A, 5 004400 I. E. Vitamin D2 und
849,5 g Sojabohnenfutter mit 1% Ölzusatz.
2) Getrocknete Destillationsrückstände aus Mais mit Solubles, die 440 530 I. E. d-o'-Tocopherylacetat/kg enthalten.
Das vermischte Futter wird zu Pellets verpresst. Bei einer im Mittel täglich gefressenen Futtermenge von 6,8 kg Futter/Tier liefert dieses Futtermittel etwa 300 mg A-28086 Faktor D/Tier und Tag.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Futtermittel, insbesondere zur Erhöhung der Futterutilisationseffizienz bei Wiederkäuern, die über eine entwickelte Pansenfunktion verfügen, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff Anti- bioticumA-28086-Komplex oder Faktor A, Faktor B oder Faktor D dieses Antibioticums oder Kombinationen hieraus enthält.