DE2525095C2 - Polyetherantibiotika A-28086 A, B und D, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Futtermittel - Google Patents

Description

,M CH₃ CH₃ CH,

CH₃

CH₁-CH,

R¹

R¹ R²

CH,

mit folgenden Bezeichnungen und Zuordnungen von R¹. R², R' und R⁴:

Λ-28086	R1	R1	R'	O	R*
Λ	CH,	CH,	OH		f]
B	CH,	CII,
D	CH,	CH,	on	Il

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Welse Strcplomyces aureofaclens NRRL 5758 oder Sireptomyces aureofaclens NRRL 8092 In einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenhydrai, Stickstoff und anorganische Salze enthält, bei etwa 20 bis 40° C und einem pH-Wert zwischen 6,0 und 7,5 submers unter aeroben Fermentationsbedingungen züchtet, dann den Antlblollkumknmplcx A-28086 aus dem Kulturmedium gewinnt und die Polyctheramiblollku A-28086 A, B und D daraus Isoliert.

3. Geflügelfutter mit antlcoccldlalcr Wirksamkell, enthaltend eine der Verbindungen nach Anspruch I.

4. Tierfutter mit erhöhter Futtcrausnutzung bei Wiederkäuern, enthaltend eine der Verbindungen nach Anspruch 1.

Antibiotika werden nicht nur zur Behandlung von Erkrankungen des Menschen sondern auch In der Veterinärmedizin benötigt. Ein wichtiger Gesichtspunkt Ist dabei der ständige Bedarf an neuen und besseren Antibiotika zur Wachstumsförderung von Geflügel und Haustieren. Zu einer solchen Wachstumsförderung kommt es beispielsweise durch eine Verringerung der Krankheiten und durch eine Verbesserung der Futterutlllsatlon. Eine bekannte Krankheit von wirtschaftlicher Bedeutung In der Veterinärmedizin, und zwar Insbesondere In der Geflügelindustrie, Ist die durch Protozoen hervorgerufene Kokzldlose. Zu einer Kokzldlose kommt es durch Infektion mit einer oder mehreren Arten von Elmerla oder Isospora (bezüglich einer Zusammenlassung wird auf Lund und Farr In »Diseases of Poultry«, 5. Auflage, Blester und Schwarte, Eds.. Iowa State University Press, Ames, Ia., 1965, Selten 1056 bis 1096 hingewiesen). Wegen der starken wirtschaftlichen Verluste durch Kokzldlose und Infolge der Nachtelle einiger bekannter antlkokzldlaler MIttel wird Immer noch nach besseren antl-

*■» kokzldlalen Mitteln gesucht.

Eine weitere Erkrankung bei den Tieren Ist die Enteritis, durch die es bei den Tierzüchtern ebenfalls zu ernsthaften wirtschaftlichen Verlusten kommen kann. Die Enteritis tritt bei Hühnchen, Schweinen, Rindern und Schafen auf, und sie Ist vorwiegend auf anaerobe Bakterien, Insbesondere Clostridium perfrlngens, sowie Viren zurückzuführen. Die Enterotoxämle bei Wiederkäuern, beispielsweise das Überfressen bei Schafen, Ist ein

Zustand, der durch eine Infektion mit C. perfrlngens hervorgerufen wird.

Die Wachstumsförderung bei Wiederkäuern, wie Rindern, ist ein weiteres wirtschaftlich interessantes Ziel der Veterinärmedizin. Von besonderem Interesse Ist dabei eine Wachstumsförderung, die man durch Verbesserung der Futlerverwertung erreicht. Der Mechanismus für eine Verwertung des überwiegenden nuirltlven Anteils (Kohlenhydrate) des Futters von Wiederkäuern Ist bekannt. Durch Im Pansen der Tiere vorhandene Mikroorganlsmen werd"en Kohlenhydrate unter Bildung von Monosaccharlden abgebaut, und diese Monosaccharide werden dann In Pyruvalverblndungcn umgewandelt, die Pyruvate werden durch mikrobiologische Verfahren zu Acetaten, Butyraten oder Proplonatcn meiabollslerl, die zusammen als flüchtige Fettsäuren bezeichnet werden Eine ausführliche Beschreibung hierüber Ist zu finden In Leng, »Physiology öl Digestion and Metabolism In the Ruminant«, Phllllpson et al. Eds., OrIcI Press, Newcastle-upon-Tync, Großbritannien (1970), Selten 408 bis 410.

ι* Die relative Wirksamkeit der Verwertung der flüchtigen Fettsäuren wird beschrieben In Feedstuffs. 18. Juni 1971. Seite 19, J. An. ScI .13.282 (1971), und »Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants». Band 2 (1971), Selten 622 und 625. Es werden demnach /war auch Acetate und Butyratc verwertet. (Joch Ist die Verwertung von Proplonalen weit wirksamer. Ferner können die Tiere eine Kclosc entwickeln, falls /.u wenig

Proplonat verfügbar 1st. Eine entsprechend günstige Verbindung stimuliert daher die Tiere zur Bildung eines höheren Anteils an Propionaten aus Kohlenhydraten, wodurch sich die Kohlenhydratverwertung verbessert und der Befall an Ketose geringer wird.

Die bekannten Antibiotika sind bei Ii .rer Anwendung In den oben besprochenen Indikationsgebieten nicht voll befriedigend, was teils auf einer im Laufe der Zelt erfolgenden Resistenzblidung und teils auf einer noch ungenügenden Wirksamkeit beruht. Aufgabe der Erfindung 1st daher doe Schaffung neuer Antibiotika, bei denen es naturgemäß noch keine Resistenz gibt und die sich bei den verschiedenen Anwendungsgebieten durch eine den bekannten Mitteln gegenüber verbesser·? Wirksamkeit auszeichnen. Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch den aus den Ansprüchen hervorgehenden neuen Antibiotikumkomplex A-28086 mit den Faktoren A, B und D, das Verfahren zu seiner Herstellung und dessen Verwendung als Mittel gegen Kokzldlose in Geflügelfutter und als Mittel zur Erhöhung der Futterausnutzung bei Wiederkäuern in Tierfutter gelöst.

Der Antibiotikumkomplex A-28086 mit den Faktoren A, B und D gehört zu einem neuen Vertreter einer Gruppe von Polyetheranllblotlka. Beispiele für andere Polyetherantlbioilka sind Monensln (US-PS 35 01568), Dlanemycln [J. Antibiotics 22,161 (1969)], Nlgerlcln [Blochem. Blophys. Res. Comm. 33,29 (1969)] und Salinomycin [JA-PS 47 25 392, Derwent No. 7696OT, US-PS 38 57 948 und Tetrahedron Lett. 49, 4955-4958 (1973)]. is

Der erfindungsgemaße Antibiotikumkomplex A-28086 mit den Faktoren A, B und D und mit der Im Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel wird gebildet, Indem man den neuen Stamm Streplomyces aureofaclens NRRL 5758 oder den neuen Stamm Streptomyces aureofaclens NRRL 8092 In der In Anspruch 2 angegebenen Welse züchtet und den AnllbloJkumkomplex dann aus dem Kulturmedium gewinnt und gegebenenfalls die einzelnen Faktoren daraus gewinnt.

Der Antibiotikumkomplex A-28086 mit seinen Faktoren A, B und D hemmt beispielsweise das Wachstum von tierpathogenen Organismen. Diese Hemmwirkung beruht zum einen Teil darauf, daß diese Verbindungen antlkokzldial wirken. Sie sind ferner auch antibakteriell, antiviral und gegen PPLO (Pleuropneumonla ähnliche Organismen) wirksam und erhöhen auch die Futtcrutllisatlon bei Wiederkäuern.

Die A-28086-Faktoren stehen strukturell zueinander In Beziehung. Während der Fermentation werden wenig- :5 stens vier antlblotlsche Faktoren gleichzeitig gebildet, die man In Form eines Gemisches erhält. Die Faktoren werden voneinander getrennt, wodurch sich die Faktoren A, B und D als einzelne Verbindungen isolieren lassen. Das Gemisch aus den Faktoren von A-28086 Ist In den meisten organischen Lösungsmitteln löslich, jedoch In Wasser unlöslich.

In den folgenden Ausführungen werden die physikalischen und spektralen Eigenschaften vor. A-28086 Faktoren A, B und D beschrieben.

Das Antibiotikum A-28086 Faktor A kristallisiert aus Aceton-Wasser. Der Faktor A des Antibiotikums A-28086 schmilzt bei etwa 98 bis 100⁰C, worauf er sich wieder verfestigt und dann wiederum bei etwa 195 bis 200° C schmilzt. Die Elementaranalyse des Faktors A ergibt folgende mittlere prozentuale Zusammensetzung: Kohlenstoff 66,69%, Wasserstoff 9,85«, Sauerstoff 23,10%.

Der Faktor A hat daher die empirische Formel CoH₇₂On. Der Faktor A hat ein scheinbares Molekulargewicht von 764, und zwar bestimmt durch Massenspektrometrle.

Das Infrarotspektrum des Faktors A In Chloroform geht aus FI g. 1 der anliegenden Zeichnung hervor. Hierbei erhält man folgende Absorptlonsmaxlma: 2,85, 3,34, 5,83, 6,82, 7,22, 7,53 (schwach), 7,78 (schwach), 8,75 (stark), 8,95 (stark), 9,15, 9,50 (stark), 9,55 (stark), 9,60, 9,85, 10,15, 10,45 und 10,70 (schwach) Mikron.

Das Ultraviolettspektrum des Faktors A In Ethanol zeigt lediglich eine Endabsorption bei unter 220 m μ.

Das magnetische Kernresonanzspektrum von A-28086 Faktor A In Deuterochloroform zeigt folgende Charakteristiken:

δ 6,01, 4,21, 4.11, 3,99, 3,89, 3.80, 3,67. 3,65, 3,57, 3,55, 2.83, 2,76, 2,74, 2,68, 2,66, 2,58, 2,56, 2,30, 2,22, 2,17, 2,10, 2,05, 1,96, 1,90. 1.85, 1,70, 1,62, 1,60. 1,47, 1,39, 1,31, 1,25. 1,18, 0,95, 0,93, 0.90, 0,88, 0,85, 0,77, 0,75, 0,73, 0,68 und 0,66 ppm.

Das aus Aceton-Wasser umkrlstalllslerte Antibiotikum A-28086 Faktor A ergibt als Pulver folgendes charakteristisches Röntgenbeugungsspektrum (Cu** Strahlung, 1,5405 λ, Nickelfilter, d = Interplanarabstand In Angström):

d Relative Intensität

12,00 100

10,10 50

9,25 90

8,00 40

7.50 15

6,92 90 ω

6,40 40

5,98 0<

5,68 15

5.20 40

4.98 40

4.62 40

4.21 20
3.48 10

Die spezifische Drehung des Antibiotikums A-28086 Faktor Λ Ist -54" (c = 0,2. Methanol), und zwar gemessen bei einer Temperatur von 25° C. Diese spezifische Drehung Ist ein auf mehreren Bestimmungen basierender Mittelwert.

Die elektrometrlsche Titration des Faktors A In 80%lgem willJrlgen Dimethylformamid zeigt die Gegenwart einer titrierbaren Gruppe mit einem pK_u-Wcrt von 7,9.

Das Antibiotikum A-28086 Faktor A löst sich In einer Reihe organischer Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Dimethylformamid, Dlmethylsulfoxld, Ethylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol, Ist jedoch In nichtpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Hexan, nur schwach löslich und In Wasser unlöslich.

Das Antibiotikum A-28086 Faktor A verfügt über eine zur Bildung von Salzen und Eslcrderlvaten befähigte Säurefunktion und wenigstens eine vereslcrbare Hydroxylgruppe.

Auf der Basis der oben beschriebenen physikalischen Eigenschaften hat das Antibiotikum A-28086 Faktor A die folgende Struktur (Formel I):

OH

CH,

O CH

HO-C-CHY VCH-CH-CIl-C-CH

ι l^EJi ι

\₂ 1 \/| CH₃ CH.,

CHj

-CH₂-CH₅

OH

CHjCH,

CH, CH,

CH,

Das Antibiotikum A-28086 Faktor B ist cine wellk kristalline Verbindung (aus Accton-Wasser), die bei etwa M 15ObIs 153° C schmilzt.

Der Faktor B verfügt aufgrund einer massenspekirometlschen Bestimmung mit hoher Auflösung über ein scheinbares Molekulargewicht von 762 und hat die empirische Formel C41H70O11.

Das Infrarotspektrum des Faktors B In Chloroform gehl aus Flg. 2 der anliegenden Zeichnung hervor. Hierbei lassen sich folgende Absorptlonsmaxlma feststellen:

2,82, 3,30. 5,77, 5,85, 6,80, 7,20, 7,50 (schwach), 7,72 (schwach), 7,80 (schwach), 8,57 (stark), 8,68, 8,90 (stark), 9,10, 9,50, 9,83 (stark), 9,90, 10,10, 10,17 (stark), 10,43, (schwach), 10,80 (schwach), 11,20 (schwach), 11,35 (schwach), 11,73 (schwach) und 12,03 (schwach) Mikron.

·»" Das Ultravllettspektrum des Faktors B in Ethanol zeigt ein Absorptionsmaximum bei 22Om μ (E|'_cm= 137,5, e = 10 477).

Das magnetische Kernresonanzspektrum von A-28086 von Faktor B In Dcuterochloroform ergibt folgende Charakteristiken:

δ 7,20, 7,09, 6,26, 6,15, 4,19, 4,12, 4,05, 3,95, 3,89, 3.78, 3,62, 3,59, 3.52, 3,48, 2,81. 2,73, 2,63, 2,54, 2,52, 1,99, 1,91. 1,84, 1,71, 1.67, 1,64, 1.55, 1,43. 1.33, 1.18, 1,11, 0,96, 0.94, 0.90. 0.87, 0,84. 0.77, 0,74 und 0,68 ppm.

Das Antibiotikum A-28086 Faktor B ist In einer Reihe organischer Lösungsmittel löslich, wie Methanol, Etha-5" nol. Dimethylformamid, Dlmethylsulfoxtd, Ethylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol, es löst sich jedoch nur schwach In nichtpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Hexan, und Ist in Wasser unlöslich. Die chemische Struktur des Antibiotikums A-28086 Faktor B geht aus dem Anspruch 1 hervor. Bei der Herstellung über S. aureofaclens NRRL 5758 wird das Antibiotikum A-28086 Faktor D als geringerer Faktor gebildet. Erfolgt die Herstellung jedoch über S. aureofaclens NRRL 8092, dann Ist das Antibiotikum A-28086 Faktor D In einer Menge von bis zu 10%, bezogen auf die gewonnene antlbiotlsche Aktivität, vorhanden.

Das Antibiotikum A-28086 Faktor D Ist ein weißes kristallines Material (aus Wasser-Aceton) mit einem Schmelzpunkt von etwa 96 bis 98° C. A-28086 Faktor D hat ein scheinbares Molekulargewicht von 778, und zwar bestimmt durch Massenspektrometrie hoher Auflösung.

Die elementare Zusammensetzung des Maximums im Massenspektrum des Natriumsalzes von A-28086 Faktor D ergibt einen Wert von 800 5050 (berechnet für C₄₄H₇)O_nNa= 800 5050). Im Massenspektrum läßt sich an der freien Säure von A-28086 Faktor D ein kleines Maximum bei 778 und ein größeres Maximum bei 760 5117 (berechnet für C₄₄H₁₂Oi₀ = 760 5125) beobachten. Der im Massenspektrum der freien Säure erhaltene Wert m/e von 760 rührt vom Wasservcriust des Molekularions her. Die freie Säure des Antibiotikums A-28086 Faktor D hat daher die empirische Formel C₄₄H₁₄O₁₁.
f>5 Die Elementaranalyse des Faktors D ergibt folgende prozentuale Zusammensetzung:

Kohlenstoff 67,59%, Wasserstoff 9.38%, Sauerstoff 22,77v

Die theoretische prozentuale Zusammensetzung für CmH₇₄Oh Ist folgende: Kohlenstoff 67,87%, Wasserstoff 9.51%, Sauerstoff 22,77%.

Das Infrarotabsorptlonsspeklrum von A-28086 Faktor D (Flg. 3) enthüll tolgende beobachtbare Absorptionsmaxima:

2.89, 3,39, 3,43, 3,50, 5,88, 6,90, 7,27, 7,60, 7,84, 9,00, 9,26, 9,62, 10,31, 10,58, 11,10 und 11,49 Mikron.

Das Antibiotikum A-28086 Faktor D zeigt In 95%lgem wäßrigem Ethanol keine Ultravloleuabsorptlon. Das magnetische Kernresonanzspektrum des Antibiotikums A-28086 Faktor D In Deuterochloroform ergibt folgende Charakteristiken:

δ 6,00, 4,20, 4,10, 4,00, 3,98, 3,92, 3,86, 3,83, 3,79, 3,67, 3,64, 3,57, 3,54, 2,88, 2,81, 2,71, 2,62, 2,58, 2.48, 2,43, 2,37, 2,29, 2,21, 2,15, 2,10, 2,04, 1,97, 1,89, 1,83, 1,76, 1,68, 1,61, 1,58, 1,55, 1,47, 1,39, 1,30, 1,25, 1,18, 0,95, 0,90, 0,88, 0,84, 0,74 und 0,68 ppm.

Das Antibiotikum A-28086 Faktor D ergibt nach Umkristallisieren aus Aceton-Wasser In Pulverform folgendes charakteristisches Röntgenbeugungsspektrum (Cu" Strahlung, 1,5405 A, Nickelfilter, d = Interplanerabstand In Angström):

Relative Intensität

12,40 100

10,20 70

8,85 90

7,80 30

6.80 10

6.30 100

5,70 20

5,35 20

5,10 20 J"

4,90 10

4,65 20

4.45 40

4,20 30

3.30 10

3,15 10

2,99 05

2,77 05

2,28 05

Die spezifische Drehung des Antibiotikum A-28086 Faktor D ist -56" (c=0,l. Methanol), und zwar gemessen bei einer Temperatur von 25° C.

Die elektrometrlsche Titration von A-28086 Faktor D In 80%lgem wäßrigem Dimethylformamid ergibt die Gegenwart einer titrierbaren Gruppe mit einem pK₀-Wert von 8,67.

Das Antibiotikum 28086 Faktor D 1st In einer Reihe organischer Lösungsmittel löslich, wie Methanol, Ethanol. Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Ethylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol, In nichtpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Hexan, jedoch nur schwach löslich und In Wasser unlöslich.

Das Antibiotikum A-28086 Faktor D hat eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion und verfügt über wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe.

Aufgrund der oben angegebenen physikalischen Eigenschaften hat das Antibiotikum A-28086 Faktor D die

r_ni_nnn^» o*_.L·*..· /i?_a..~«a1 ii\.

IUIfUUUU Oll UfVlUI \1 Ul 1111.1 ■■/.

£ YCH₂-CH₃

Die R^-Werte des Antibiotikums A-28086 Faktoren A, B und D In verschiedenen paplerchromatographlschen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtllls ATCC 6633 als Detekllonsorganlsmus gehen aus folgender Tabelle I hervor.

Tabelle I

R_rWerte Faktor A

Faktor B

Faktor D

LosungsmUielsystcm

U)

0,11
0,41

0,54

0,09
0,16

0,46

0,10 0,26

0,36

0,48	0,36	0,29
0,15	0,33	0.25
0,24	0,51	0.26
0,24	0,11	0,09
0,75	0,61	0,64

Mit Methyllsobutylketon (MlBK) gesättigtes Wasser Mit MlBK plus 2¹V, p-Toluolsull'onsuure sowie 1% Piperidin gesättigtes Wasser Wasser : Methanol : Aceton (12:3: 1) mit NHuOH auf pH 10,5 eingestellt und dann mit H₁PO₄ auf pH 7,5 erniedrigt 1% MIBK, 0,5% NH₄OH In Wasser 17,4 g K₂HPO₄, 30 ml Äthanol pro Liter Wasser Mit Wasser gesättigtes Benzol Wasser

Wasser : MlBK : Elhylacetat (98 : 1 : 1)

In Tabelle II sind die R_rWerie für Antibiotikum A-28086 Faktoren A, B und D In zwei dünnschlchtchromatographlschen Systemen auf Slllcagel (vorbeschlchlelc Platten, Schlchlstärke 0,25 mm) angegeben, wozu als Detektlonsorganlsmus wiederum B. subtllls ATCC 6633 verwendet wird.

Tabelle U

R_rWerte
Faktor A

Faktor B

Faktor D

Lftsungsmlttclsy stern

0,24
0,54

0.42 0.34

Ben/ol-F.thylaietat (3 : 2) Elhvlacctal-Weihvlamln (95 : S)

Zusammen mit dem Antibiotikumkomplex A-28086 wird eine weitere Substanz gebildet, die willkürlich als A-28086-I bezeichnet wird. A-28086-I Ist zwar mikrobiologisch nicht wirksam, es Ist jedoch strukturell zu den Faktoren den Antibiotikums A-28086 verwandt. Bei A-28086-I handelt es sich um eine weiße kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser) mit einem Schmelzpunkt von etwa 160 bis 162" C. Verglelchsstudlen der NMR-Spek-

•jo tren und anderer Eigenschaften von A-28086-I mit synethetlsch hergestellten A-28086 Faktor A Methylesier liefern den Beweis, daß es sich bei A-28086-I um den Methylester von A-28086 Faktor A oder eine nahe verwandte Verbindung, wie ein Stereoismer, handelt.

A-28086-I fällt ursprünglich zwar zusammen mit den wirksamen Faktoren des Antibiotikums A-28086 aus, läßt sich von diesem jedoch ohne weiteres durch Slllcagelchromatographle trennen. A-28086-I hat einen ungefähren Ry-Wert von 0,53 Im Dünnschlehtchromatogramm auf Slllcagel unter Verwendung von Ethylacetat als Elulermlttel und Vanillin als Sprühmlitel (3% Vanillin In Methanol +0,5 ml konzentrierte Schwefelsäure pro 100 ml Lösung) zur Detektion. Nach Besprühen mit Vanillin und Erhitzen ergibt A-28086-I einen blauen Fleck, während die anderen Faktoren des Antibiotikumkomplexes A-28086 helle plnkfarbene Flecken ergeben, die rasch dunkelhräunllch-blau werden.

so Die neuen Antibiotika werden hergestellt. Indem man einen A-28086 produzierenden Stamm von Streptomyces aureofaciens submers unicr aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium bis zur Bildung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität züchtet. Die Antibiotika werden unter Einsatz verschiedener Isolierungsund Reinigungstechniken gewonnen, wie sie auf diesem Gebiet üblich sind. Einer der zur Herstellung der Antibiotika A-28086 geeigneten neuen Organismen wurde aus einer Bodenprobe Isoliert, die am Berg Ararat In der Türkei gefunden wurde. Dieser Organismus Ist als Stamm von Sireptomyces aureofaclens Duggar klassifiziert, wie er von E. B. Shlrllng und D. Gottlieb In »Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces IH, Additional Species Descriptions from First and Second Studies«, Intern. Bull. Systematic Bacterlol. 18, 297 bis 392 (1968) beschrieben lsi. Diese Klassifikation beruht auf Methoden, wie sie für das International Streptomyces Projekt [E. B. Shlrllng und D. Gottlieb »Methods for Characterization of

ι·» Streptomyces species«. Intern. Bull. Systematic Bacterlol. 16, 313 bis 340 (1966)1 zusammen mit bestimmten ErgSnzungsuntersuchungen empfohlen werden. Die Zuordnung der Farbnamen erfolgt nach der ISCC-NBS-Methode (K. L. Kelly und D. B. Judd. »The ISCC-NBS Method of Designating Color and a Dictionary of Color Names«, U. S. Dept. of Commerce, Clrc. 553, 1955, Washington, D. C). Die in Parenthese angegebenen Zahlen beziehen sich auf die Farbtafeln von Tresner und Backus [Tresner, H. D. und S. J. Backus, »System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy«, Appl. Microbio!. 11, 335 bis 338 (1963)]. Die Farbstrelfenbestimmung sind unterstrichen. Die entsprechenden Werte nach den Farbtabellen von Maerz und Paul (A. Maerz und M. R. Paul, »Dictionary of Color«, McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, N. Y., 1950! sind In Klammern angegeben. Die entsprechenden Kulturen läßt man 14 Tage bei 30" C wachsen, sofern nichts anderes gesagt Ist.

Charakterisierung des A-28086 produzierenden Stammes NRRL 5758 Morphologie

Die sporullerenden Lufthyphcn bestehen aus Haken, Schlaufen und offenen Spiralen. Es wurde ferner eine für rectus flexlbllls typische Morphologie beobachtet. Die Sporen sind kurz und zylindrisch und liegen In Ketten aus 5 10 bis 50 Sporen vor. Die Sporen messen 1,3 μ χ 1,75 μ mit einem Bereich von 1,3 μ bis 1,95 μ χ 1,3 μ. Die Sporenoberfläche Ist aufgrund einer elektronenmikroskopischen Beobachtung glatt.

Kulturcharakterlstlken von NRRL 5758 aul verschiedenen Medien

Medium

Charakteristiken

ISP /12 (Hereextrakl-Mal/.cxlrakl)

ISP /J3 (Hafermehl) ISP /14 (anorganische Salz.c-Slärke-Agar)

ISP /!5 (Glycerin-Asparagln-Agar) Tomatenpasie-Hafcrmchl-Agar

Glycerln-Glycln-Agar Glucose-Asparagln-Agar

Nähr-Agar

Bennett-Agar Calclummaleat-Agar

Czapek-Lösu ng-Agar Emerson-Agar

Tyrosln-Agar Trypion-Hefe-Agar Reichliches Wachstum, Unterseiten mäßig gelb [11K3], ausreichendes bis gutes Luftmycel und ausreichende bis gute Sporulailon, weiß (W) 13 ba sowie dunkelgrau (Gy) 3lh, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum. Unterseite gräulich-gelb [11B2], ausreichendes Luftmycel (Gy), dunkelgrau, 3 lh, leicht braunes lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite leicht gelbbraun 11.2ES], Luftmycel und Sporen (W) purpurartig weiß 13 ba bis (Gy) hellgrau d, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Unterseite fahlgelbgrün [10Bl], gutes Luftmycel und gute Sporen (Gy), gelblich grau 2 de bis hellgräulich rölllchbraun 5 fe, kein lösliches Pigment Reichliches Wachstum, Unterselle hell gelblichbraun W [13H7], ausreichendes bis gutes Luftmycel und entsprechende Sporen (W) weiß a bis (Gy) mittelgrau g, sehr hellbraunes lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite dunkelgräullchgelb [12J6], gutes Luftmycel und entsprechende Sporen (Y) fahlgelb 2 db, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite gräulich-grünlichgelb [12E2] reichliches Luftmycel und entsprechende Sporen (Gy) gelblichgrau 2 de. sehr hellbraunes lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Unterseite gräulichgelb [12B2], Luftmycel und Sporen, wegen schlechten Wachstums as keine Farbbestimmung, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite gräulich gelb [12K3], spärliches Luftmycel und entsprechende Sporen (Gy) gelblichgrau 2 de, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Unterselle gräullchbraun [15C8], kein Luftmycel und keine Sporulation, braunes lösliches Pigment, die Fläche klart sich durch Inokulum auf

Schlechtes Wachstum, aufgrund Wachstums keine Farbbesilmmung

dieses schlechten

Reichliches Wachstum, Unterseite gräulich gelb [11J5], kein Luftmycel und keine Sporen, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite hellollvbraun [14C4], reichliches Luftmycel und entsprechende Sporen von (W) b (Zentrum) bis (Gy) hellbräunllchgrau 3 fe (an der Grenze), sehr hellbraunes lösliches Pigment

Spärliches Wachstum, keine Farbbestimmung

Der Organismus NRRL 5758 wurde nach Standardverfahren hinsichtlich bestimmter physiologischer Eigenschaften untersuch«.. Hterbel wurden folgende Eigenschaften untersucht und folgende Charakteristiken gefunden:

5 Beobachtete Eigenschaften Charakie-Istlken

Wirkung auf Milch Die Milch peptonislert, es Ist ein weißer Wachstumsring

zu sehen, die geklärte Fläche Ist lohfarben gelb, der pH-Wert liegt bei 5,7

Nitratreduktion Positiv

Nährgelatlne 30% Verflüssigung nach 14 Tagen 15 Melaninplgment-Produktlon:

Tyrosln-Schrägagar Äußerst schwach positiv (Pigment nach 4 Tagen)

Difco-Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Schrägagar Negativ

Trypton-Hefeextrakt-Brühe Negativ

Temperaturerfordernisse (ISP Medium /J2 Hefe- Bei 26 bis 30° C gutes Wachstum, bei 30 bis 37¹¹C

extrakt-Malzextrakt Schrägen) hervorragendes Wachstum und Sporulatlon, bei 45° C

25 !eicht vegetatives Wachstum, rötliches lösliches Pigment

Unter Verwendung des Organismus NRRL 5758 wurden auch Untersuchungen über die Kohlensloffverwertung durchgeführt, und diese Ergebnisse sind Im folgenden angegeben. Die dabei verwendeten Symbole haben folgende Bedeutungen:

30

+ = gutes Wachstum, positive Verwertung
(+) = schlechtes bis ausreichendes Wachstum
(-) = schwaches Wachstum, möglicherweise keine Verwertung - = kein Wachstum, keine Verwertung

35

KohlcnstolTquellc Verhalten

D-Glucosc +

L-Arablnosc +

D-Xylosc t

D-Fructosc +

Saccharose
D-Mannlt

_4S I-lnosll +

Rhamnose +

Rafflnosc
-C Kontrolle (kein Kohl?.nhydr;ii)

«ι Durch eine Reihe natürlicher Selektionen, an die sich eine chemische Mutation anschließt, wird von S. aurcofaclens NRRL 5758 auch ein zweiter neuer A-28086 produzierender Organismus abgeleitet. Dieser Organismus wird als NRRL 8092 bezeichnet, und er lsi ebenfalls als Stamm von Streptomyces aureofaclens Duggar klassifiziert. Die Klassifikation beruht auf Studien des Organismus NRRL 8092 unter Verwendung der oben beschriebenen Klasslflkatlonsmcthoden für Streptomyces und ähnlicher Wachslumsbcdlngungcn. Die bei diesen Untcr-

55 suchungen für den Organismus NRRL 8092 beobachteten Charakteristiken gehen aus den folgenden Ausführungen hervor.

Charakterisierung des A-28086 produzierenden Stammes NRRL 8092 Morphologie

Wl

Auf Medium ISP /j7 (Tyrosln-Agar) bildet die Kultur gelegentlich Schlaufen, es entstehen vorwiegend jedoch kurze gerade Sporophoren. Die Sporenketten bestehen aus weniger als 10 Sporen pro Kette, nämlich normalerweise 4 bis 7 Sporen pro Kette.

In folgenden Medien lassen sich kurze gerade Sporenketten beobachten: ISP β3. Czapek-Lösung-Agar und ISP

f'5 ß5. Auf Emerson-Agar kann eine reichliche Coremla beobachtet werden. Auf Tyrosln-Agar (ISPßl) und

Glucose-Asparagln-Agar werden auch Untersuchungen Im Elektronenmikroskop durchgeführt. Die Sporen sind glatt und 1,2 bis 2,0 μ lang und haben einen Durchmesser von etwa 1,0 μ. Die mittlere Sporengrölic betrügt 1.6 μ χ 1,0 μ.

KulturcharakierisUken von NRRL 8092 auf verschiedenen Medien

Medium

Charakteristiken

ISP /)2 (Hereextrakt-Malzcxlrakt) ISP /»3 (Hafetmehl)

ISP /?4 (anorganische Salze-Stärke-Agar ISP ßS (Glycerin-Asparagln-Agar) Tomaienpasie-Hafermehl-Agar Glycerln-Glycln-Agar Glucose-Asparagln-Agar

Nähr-Agar Bennett-Agar

Calclummalat-Agar

Czapek-Lösung-Agar

Emerson-Agar

Tyrosln-Agar Trypton-Hefe-Agar Ausreichendes Wachstum, Unterseite hellgelbbraun ^s [12H8], ausreichendes Luflmycel. schlechte Snorukatlon, Luitmycel fahlgrau [UAl]. kein lösliches Pigment

Spärliches Wachstum, Unterseite hyalln, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment >o

Mäßiges Wachstum, Unterseite gräulichgelb [11B2], spärliches Luflmycel und spärliche Sporulation, Luftmycel fahlgelbgrau [10Al]. kein lösliches Pigment

Mäßiges Wachstum. Unterseite fahlgelb [10F2], ausreichendes Luftmyccl, spärliche Sporulation, Luflmycel weiß [10Al]. kein lösliches Pigment

Mäßiges Wachstum, Unterseite gräulich grüngelb, ausreichendes Luftmycel, mäßige Sporulation, hellfahlgrau [53A2], kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite gräulichgelb [11E4], mäßiges Luftmyccl, weiß [10Al], keine Sporulation, kein lösliches Pigment

Mäßiges Wachstum, Unterseite fahlgelb [10F2], mäßiges Ljftmycel und mäßige Sporulation, weiß [10Al], kein lösliches Pigment

Spärliches Wachstum, Unterseite fahlgelb [10B2], kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Leidliches Wachstum, Unterseite mlttelgelb-plnk ^ [I1A7], sehr spärliches Luftmycel, keine Sporulation, kein lösliches Pigment

Äußerst spärliches Wachstum, hyalln, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment «

Äußerst spärliches Wachstum, Unterseite hyalln, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Mäßiges Wachstum, Unterseite gräulichgelb [1115], flek- «5 klges Luftmycel, keine Sporulation, kein lösliches Pigment

Mäßiges Wachstum, Unterseite hellgelb-braun [12H6], mäßiges Luftmycel, leicht fahlgrauer Rand [53A2], Zentrum nahezu weiß, mäßige Sporulation, kein lösliches Pigment

Äußerst spärliches Wachstum, hyalln, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Der Organismus NRRL 8092 wird ferner nach Standardverfahren hinsichtlich bestimmter physiologischer Eigenschaften untersucht. Hierbei werden folgende Eigenschaften beobachtet und folgende Charakteristiken gefunden:

Beobachtete Eigenschaften Charakteristiken

Wirkung auf Milch

Nllratrcduktlon Nährgelatine Peptonlslert (90%), fahlgelber Wachstumsring, geklärte Rilche fahlgelb, pH-Reaktion 4,6

Positiv

50% Innerhalb von 14 Tagen hydrolislert

	Fortsetzung	25 25 095
	Beobachtete Eigenschaften
	Melanlnpigment-Produkllon auf:	Charakteristiken
5	Tyronsln-Schrägagar
	Trypton-Hefeextrakt-Brühe	Äußerst schwach positiv
	Karotten	Negativ
	Kartoffel	Reichliches Wachstum, fahlgelb, kein Luftmycel
10	Temperaturerfordernisse (ISP Medium /J 2 extrakt-Malzextrakt-Schragen)	reichliches Wachstum, graulichweiß, kein Luftmycel, keine Veränderung
15		Hefe- Bei 25° C reichliches Wachstum, ausreichendes Luft mycel, Unterseite hellbraun, kein lösliches Pigment
		Bel 3O0C reichliches Wachstum, ausreichendes Luft mycel, Unterseite hellbraun, kein lösliches Pigment
2(1	Bei 37° C reichliches Wachstum, ausreichendes Luft mycel, Unterseite braun, kein lösliches braunes Pigment

Bei 40" C reichliches Wachstum, spärliches Luftmycel, Unterseite rotbraun, tiefrotbraunes lösliches Pigment

Bei 45° C ausreichendes Wachstum, kein Luftmycel, Unterseite rotbraun, mittelmäßig rotbraunes Pigment

Der Organismus NRRL 8092 wird auch hinsichtlich seiner Kohlenstoffverwertung untersucht, und die dabei erhaltenen Ergebnisse sind Im folgenden zusammengestellt. Die hierzu verwendeten Symbole haben folgende Bedeutungen:

+ = gutes Wachstum, positive Verwertung

(+) = schlechtes bis ausreichendes Wachstum

(-) = schwaches Wachstum, möglicherweise keine Verwertung

- = kein Wachstum, keine Verwertung

Kohlcnslol'fqucllc

Verhallen

D-Glucosc +

L-Arablnose +

D-Xylose +

D-Fructosc +

Saccharose

D-Mannlt I-Inoslt +

Rhamnose +

Ra(Tl nose

-C Kontrolle (kein Kohlenhydrat)

so Bestimmte Charakteristiken der A-28086 produzierenden Stämme von S. aureofaclens unterscheiden sich von den Charakteristiken des von Shlrllng und Gottlieb beschriebenen Organismus. Diese Unterschiede gehen aus der folgenden Tabelle III hervor.

55 Tabelle 111

Kohlenstoffverwertung

NRRL 5758

NRRL 8092

veröffentliche Beschreibung

Saccharose

I-Inoslt Rhamnose

Gelatlneverflüsslgung f.¹- Wirkung auf Milch

30% In 14 Tagen

50% In 14 Tagen

begrenzt oder keine

Milch pcplonlslcrl. Milch pcptonlslcri, begrenzte oder variable

wclßc Wachstumsringc fahlgelbe Wachstums- l'cplonlslerung (oft keine).

ringe beschränktes Wachstum und

begrenzte Koagulation

Die Charakteristiken des Organismus NRRL 5758, die von den Charakteristiken des Organismus NRRL 8092 verschieden sind, sind In der folgenden Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

:haraklerlsllken NRRL 5758 NRLL 8092

Vegetative Farbe gelb auf mehreren Medien cremefarben bis fahlgelb

auf mehreren Medien

Sporulatlon einige spiralförmige Sporophoren kurze gerade Sporophoren

auf Medien aus Tomatenpaste: mit gelegentlichen Schlaufen

Hafermehl und anorganischen

Salzen-Starke'

Wachstum auf:

Calclummalat ausreichendes Wachstum, spärliches Wachstum,

braun. Klarung klar, keine Klärung

anorganische mäßige Sporulailon, mäßige Sporulatlon,

Salze-Stärke Luftmycel purpurweiß bis grau Luftmycef fahlgelbgrau ^Μ

Bennett-Agar Unterseite fahlgelb Unterseite plnkfarben

Die zur Produktion von A-28086 Antibiotika geeigneten Streptomyces aureofaclens wurden hinterlegt und In die Kultursammlung von Northern Marketing and Nutrition Research Division, U.S. Dept. of Agriculture, Agrlcultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604 aufgenommen, und sie können von dort unter den Nummern NRRL 5758 sowie NRRL 8092 frei bezogen werden.

Zum Wachsen von Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 und Streptomyces aureofaclens NRRL 8092 lälJt sich Irgendein Kulturmedium verwenden. Aus Gründen der günstigen Produktion, einer optimalen Ausbeute und einer leichten Isolierung des Produkts werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Für eine groß- M technische Fermentation werden daher als Kohlenhydratquellen beispielsweise Tapiocadextrln und Saccharose bevorzugt, man kann jedoch auch Glucose, Maisstärke, Fructose, Mannose, Maltose oder Lactose verwenden. Andere geeignete Kohlenstoffquellen sind Maisöl, Erdnußöl, Sojabohnenöl sowie Flschöl. Eine bevorzugte Stickstoffquelle Ist ein enzymhydrolyslertes Casein, es können hierfür jedoch auch Peptone, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, verwendet werden. Zu den anorganischen Nährsalzen, die man den Kulturmedien zusetzen kann, gehören die üblichen löslichen Salze, die Natrium-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat- oder Nitrationen liefern.

Die zum Wachsen und zur Entwicklung der Organismen erforderlichen essentleiien Spurenelemente können auch In dem Kulturmedium vorhanden sein. Solche Spurenelemente treten normalerweise als Verunreinigungen In anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen auf, die den zum Wachsen des Organismus erforderlichen Bedürfnissen genügen. Steht man bei der großtechnischen Fermentation vor dem Problem einer Schaumbildung, dann empfiehlt es sich, solchen Fermentationsmedien geringe Mengen (nämlich 0.2 ml/l) eines Antischaummittel zuzusetzen, wie Polypropylenglykol.

Die Produktion der Antibiotika A-28086 produzierenden Stämme von Streptomyces aureofaclens läßt sich durch Zusatz einer geringen Menge eines Öls, wie Sojabohnenöl, verbessern, obgleich dies nicht wesentlich Ist.

Zur Produktion wesentlicher Mengen der Antibiotika A-28086 wird eine submerse Fermentation unter aeroben Bedingungen In Tanks bevorzugt. Goringe Mengen der Antibiotika A-28086 lassen sich auch durch Schüttelflaschenkullur herstellen. Wegen der zeitlichen Verzögerung, zu der es bei der üblichen Produktion von Antibiotika durch Inokulation großer Tanks mit der Sporenform des Organismus kommt, geht man vorzugsweise von einem vegetativen Inokulum aus. Das vegetative Inokulum wird hergestellt. Indem man eine geringe so Menge Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstückcn des Organismus Inokuliert, wodurch man eine frische aktiv wachsende Kultur des Organismus erhält. Das vegetative Inokulum wird dann In einen größeren Tank übertragen. Zum Anwachsen des vegetativen Inokulums kann man das gleiche Medium verwenden wie auch für größere Fermentationen, man kann jedoch auch mit anderen Medien arbeiten.

Die A-28086 produzierenden Organismen läßt man bei Temperaturen zwischen etwa 20 und etwa 40° C wachsen. Zu einer optimalen Produktion an A-28086 kommt es anscheinend bei Temperaturen von etwa 27 bis 30° C.

Wie bei aeroben Submcrs-Kulturverfahren üblich, wird auch beim erfindungsgemäßen Verfahren Luft durch das Kulturmedium geblasen. Für ein ausreichendes Wachstum des Organismus sollte man bei der Tankprodukllon mit einem Luftvolumen von vorzugsweise über 0,1 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute *o arbeiten. Für eine wirksame Produktion der A-28086 Antibiotika sollte das bei der Tankproduktion angewandte Lufivolumen vorzugsweise über 0,25 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute beiragen. Durch höhere Kon/.entratloncn an gelöstem Sauerstoff wird die Bildung von Antibiotika nicht herabgesetzt.

Die Produktion an Antibiotika kann während der Fermentation überwacht werden. Indem man Proben der Brühe oder von Extrakten der Mycelfeststoffc gegenüber Organismen, von denen man weiß, daß sie gegenüber *5 den Antibiotika empfindlich sind, hinsichtlich Ihrer anilblotlschen Wirksamkeit untersucht. Ein derartiger zur Untersuchung der erllndungsgemäßen Antibiotika geeigneter Testorganismus lsi Bacillus subtilis ATCC 6633. Der Bioversuch wird am besten unter Verwendung von Papierbläuehen auf Agarplatten durchgeführt.

Der pH-Anfangswert der nlchtbelmpften Kultur schwankt In Abhängigkeit von dem verwendeten Medium. Der pH-Wert Hegt zwischen 6,0 und 7,5. De: pH-Wert am Ende der Fermentation, bei dem das Produkt geerntet wird. Ist normalerweise etwas höher, und er beträgt 6,5 bis 8,0.
Eine antlblotlsche Wirksamkeit läßt sich Im allgemeinen am zweiten Tag der Fermentation Feststellen. Zu einer maximalen Produktion an antlblotlschcr Aktivität kommt es zwischen etwa dem sechsten und dem zehnten Tag.

Nach erfolgter Produktion unter submersen aeroben Fermentallonsbedlngungen kann man die oben beschriebenen A-28086 Antibiotika aus dem Fermentationsmedium In hierzu üblicher Welse gewinnen. Die während der Fermentation eines A-28086 produzierenden Organismus gebildete antlblotlsche Aktivität tritt sowohl In der

ι» Myzelmasse als auch der filtrierten Brühe auf. Maximal lassen sich die A-28086 Antibiotika daher durch eine Kombination von Methoden gewinnen, zu denen eine Filtration, Extraktion sowie Absorptlonschromatographle gehört. Ein bevorzugtes Lösungsmittel zur Abtrennung der A-28086 Antibiotika entweder aus der ganzen oder aus der filtrierten Fermentationsbrühe Ist Ethylaceiat, es reichen für diesen Zweck jedoch auch andere hierfür normalerweise verwendete Lösungsmittel aus.

IS Ein besonders zweckmäßiges Verfahren zur Abtrennung der A-28086 Faktoren A, B und D besieht in der Erniedrigung des pH-Wertes der gesamten Fcrmentatlonsbrühc auf etwa pH 3.0. Bei diesem pH-Wert von 3,0 lassen sich A-28086 Faktoren A, B und D von der Myzelmassc mühelos durch Filtrieren trennen. Ein anderes günstiges Verfahren zur Abtrennung der A-28086 Faktoren besteht In einem Zusatz eines Blcarbonats, wie Natrlumbicarbonat, zu der Gesamtbrühe, und zwar In Mengen von etwa 1 g pro Liter. Die A-28086 Faktoren

2·) können hierzu auch In Salzform von der Myzelmasse abgetrennt werden. Zur Abtrennung der Antibiotika aus der Myzelmasse wird Methanol als Lösungsmittel bevorzugt, es können hierzu jedoch auch andere niedere Alkohole und Ketone verwendet werden.

Die Gewinnung der A-28086 Antibiotika kann zweckmäßigerweise auch durch azeotrope Destillation vorgenommen werden. Hierzu versetzt man die wäßrige Fermentationsbrühe mit einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser ein geeignetes Azeotrop bildet. Dieses Gemisch aus Lösungsmittel und Fermentationsbrühe wird dann zur Entfernung wenigstens der Hälfte des Wassers aus der Brühe azeotrop destilliert, wodurch ein Gemisch aus Wasser und Lösungsmittel zurückbleibt, bei dem die A-28086 Antibiotika in dem organischen Lösungsmittel gelöst sind. Unlösliche Nebenprodukte lassen sich In geeigneter Welse abtrennen, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugleren. Die Λ-28086 Antibiotika können anschließend aus der organischen Lösung

3() In bekannter Welse gewonnen werden, beispielsweise durch Verdampfen des Lösungsmittels, Ausfällen unter Zugabe eines Nichtlösungsmlttels oder Extraktion.

Organische Lösungsmittel, die mit Wasser ein zur Durchführung eines derartigen Gewinnungsverfahrens geeignetes Azeotrop bilden, sind Butylalkohol, Amylalkohol, Hexylalkohol, Benzylalkohol, Butylacelat, Amylacetat, 1,2-Dlchlorethan, 3-Pentanon, 2-Hexanon, Benzol, Cyclohexanon, Toluol oder die Xylole.

Die Gewinnung durch azeotrope Destillation bietet einen besonderen Vorteil bei großtechnischen Fermentatlonsverfahren. Sowohl Wasser als auch Lösungsmittel, die beide über Kopf Im Azeotrop abgezogen werden, können durch bekannte Verfahren voneinander getrennt und dann zur weiteren Verwendung wieder rückgeleitet werden. Das auf diese Welse entfernte Wasser Ist frei von Verunreinigungen und muß daher von seiner Wellerleitung als Abwasser nicht zusätzlich behandelt werden. Das dabei entfernte Lösungsmittel kann In das Verfahren rilckgeleltet werden.

Die weitere Reinigung der A-28086 Antibiotika besieht In einem zusätzlichen Extraktions- und Adsorptionsverfahren. Hierzu werden zweckmäßigerweise adsorptionsfähige Materlallen eingesetzt, wie Slllcagel, Aktivkohle oder Magneslumslllcat.
Wahlwelse kann man die Feststoffe der Kulturbrühe unter Einschluß der Bestandteile des Mediums sowie des Myzels auch ohne Extraktion oder Abtrennung als Quelle für die A-28086 Antibiotika verwenden, wobei vorzugsweise jedoch zuerst das Wasser abgetrennt wird. So kann man das Kulturmedium nach Produktion der A-28086-antlbioilachen Aktivität, beispielsweise durch Lyophlllsleren trocknen und direkt mit einer Futtervormischung vermischen.
Das Myzel kann jedoch nach Produktion der A-28086 Aktivität In dem Kulturmedium abgetrennt und

5« geiruckiiet werden, wodurch man ein Produkt erhält, das sich direkt als Futtervormischung verwenden läßt, Wird das Myzel zu diesem Zweck abgetrennt, dann läßt sich das Ganze durch Zugabe von Calclumcarbonal (etwa 10 Gramm pro Liter) besser filtrieren, und man erhält zugleich ein besseres getrocknetes Produkt.

Unter den bis jetzt angewandten Bedingungen produzieren die oben beschriebenen Stämme von Strepiomyce: aureofaciens, die mit den Nummern NRRL 5758 sowie NRRL 8092 bezeichnet werden, das Antibiotikum A-28086 Faktor A als Überwiegenden Faktor. Das Verhältnis der Faktoren schwankt zwar In Abhängigkeit von der angewandten Fermentationsbedingungen, doch macht der Faktor A Im allgemeinen mehr als 99* der gesamter aus NRRL 5758 gewonnenen antlblotlschen Aktivität und etwa 90% der gesamten aus NRRL 8092 gewonnener antlbiotlschen Aktivität aus. A-28086 Faktor B macht den Großteil der restlichen antiblotlschen Aktivität au: NRRL 5758 aus, und der Faktor D liegt lediglich In geringerer Menge vor. A-28086 Faktor D macht andererselt

w) jedoch etwa 8 bis 10% der gesamten gewonnenen antlblotlschen Aktivität aus NRRL 8092 aus, und der Faktor I Hegt hier lediglich In gereingerer Menge vor.

Die Antibiotika A-28086 Faktoren A, B und D können In an sich bekannter Welse voneinander getrennt un als Einzelverbindungen Isoliert werden, beispielsweise durch Säulenchromatographie oder Dünnschlchtchroms tographle. Zur Trennung der Faktoren A, B und D bedient man sich beispielsweise einer Säulenchromatographi

^h<; über Slllcagel, wobei man die Säule mit variierenden Lösungsmlttelgemlschen, wie Gemischer, aus Benzol un Ethylacetat, elulPrt. Bei Verwendung von Lösungsmiltelgemlschen aus Benzol und Ethylacetat zum Elulere einer Sillcagelsäule wird der Faktor B als erster elulert, und die Faktoren A und D kommen dann erst späte Das Fortschreiten der Elutlon läßt sich am einfachsten durch das oben beschriebene dünnschlchtchromatogn

phische Verfahren überwachen.

Die A-28086 Verbindungen Inhibieren das Wachsen von Bakterien und Fungi, die Krankheitserreger für Tier und Pflanze sind. Die relativen mikrobiologischen Wirksamkelten von A-28086 Faktoren A und B gehen aus der folgenden Tabelle V hervor.

Die hierin enthaltenen Werte werden nach dem üblichen Schelbendlffuslonsverl'ahren ermittelt (hierzu werden 6-mm-Schelben In Lösungen getaucht, die 1 mg Wirkstoff pro ml Lösung enthalten, und die so erhaltenen getrennten Scheibchen werden dann auf Agarplatten gelegt, die mit den jeweiligen Testorganismen geimpft sind).

Tabelle V

to

Tcslorganlsnius	Hemmzone (mm)	Λ-28086
	Λ-28086	l"aktor B
	Faktor A	21
Staphylococcus aurcus	19	31
Bacillus subtllls ATCC 6633	28	16
Sarclna lutca ATCC 9341	26	12
Mycobaelerlum avlum ATCC 7992	12
Saccharomyces paslorlunum ATCC 2366	17	14
Candida troplcalls	14	nicht untersucht
Fusarlum monlllforme	12

Ein wichtiger Gesichtspunkt Ist die Tatsache, daß die A-28086 Verbindungen das Wachsen anaerober Bakterlen hemmen. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK), bei denen A-28086 Faktor A verschiedene anaerobe Bakterien hemmt, werden nach dem Standard-Agarverdünnungsversuch ermittelt, und die dabei erhaltenen Werte sind In Tabelle VI zusammengefaßt. Die Endwerte werden nach 24slündlger Inkubation ermittelt.

Tabelle Vl

Tesiorganismus	MHK (μΒ/ΓΠΐ)
Acilnomyces bovls	<0,5
Clostridium inocuum	< 0,5
Clostridium perfrlngens	<(),5
Clostridium ramosum	4,0
Clostridium septlcum	-0,5
Clostridium septlcum bovine	<0,5
Eubacterlum aerofaciens	1,0
Peptococcus anaerobius	<0,5
Peptostreptococcus Intermedlus	16.0
Proplonlbacierlum acnes 44	16,0
Proplonibacterlum acnes 79	2,0
Bacteroldes fragilIs ssp. fragllis	8,0
Bacteroides fragllis ssp.	8,0
thethalotacmlcron
Bacteroldes fragllis ssp.	8,0
vulgatls Nr. 1563
Bacteroides fragllis ssp.	2,0
vulgatls Nr. 1211
Fusobacterlum symblosum	<0,5
Fusobacterlum necrophorum	8,0
Vellloneila alcalescens	16,0

JO .15 40 45

50

55

Eine weitere Interessante Wirkung 1st die antlmlkroblelle Wirksamkell der Verbindungen A-28086, nämlich die Wirksamkeit gegenüber Mycoplasma. Mycoplasmaarten, die auch als Pleuropneumonia-ähnllche (PPLO) Organismen bezeichnet werden, sind Krankheitserreger, beim Menschen und bei verschiedenen Tieren. Mittel, die gegen PPLO-Organlsmen wirken, werden Insbesondere von der Geflügellndustrle benötigt. Durch In-vltro-Brühenverdünnungsstudlen erhalt man mit dem Antibiotikum A-28086 Faktor A gegenüber verschiedenen Mycoplasmaarten folgende In Tabelle VII zusammengefaßte minimale Hcmmkonzenlratlonen (MHK-Werte):

65

10

25	Tabelle VII	25 095
Organismus
M. galllsepilcum	MIlK (mg/ml)
M. hyorhlnls	12,5
M. synovlac	12,5
M. hypopneumonlae	6,25
M. hyosvnovlac	6,25
6,25

20

Zum Desinfizieren von Oberflachen, um Tiere vor verschiedenen Mycoplasmaarten zu schützen, reichen bereits Lösungen mit nur 10 Milligramm Antibiotikum A-28086 pro Milliliter Lösung aus.

Die akute Toxlzltät LDso des Antibiotikums A-28086 Faktor A betrügt nach Intrapcrltonealer Verabreichung an die Maus 7,15 mg/kg.

Eine wichtige Eigenschaft der Verbindungen A-28086 !st ihre antlkokzidlaic Wirkung. Fütterungsversuche zeigen beispielsweise, daß man günstigere Gewichtszunahmen bei jungen Hühnchen erhält, wenn man diesen ein Futter gibt, das nur 0,003% einer A-28086 Verbindung enthält, und mit Wlrkstoffkonzentratlonen von nur 0,005% läßt sich die Mortalität verhindern und die Anzahl von Verletzungen bei Hühnchen herabsetzen, die von Kokzldiose befallen sind. Die bei Versuchen unter Verwendung von Faktor A an Hühnchen, die von verschiedenen Elmerla-Specles befallen sind, erhaltenen Ergebnisse gehen aus den folgenden Tabellen VIII bis X hervor.

Tabelle VIII
Wirksamkeit des Antibiotikums A-28086 Faktor A gegenüber Elmerla Tcnella

■JO

55

Wl

Wirkstoffkonzen	Anzahl der	prozentuale	prozentuale	Mittler	pro/cnluale
tration Im Futter	Hühnchen	Mortalität	Gew.-Zunahme	Schaülgungs-	Erniedrigung
In Gew.-%				werl	des Schädigungs
					wertes

0,04 10 0 50 0 100

0,02 10 0 82 0,2 95

0,01 10 0 94 0.2 95

Infizierte 20 35 68 3.65 —

Kontrollen

Normale 20 0 100 — —

Kontrollen

0,02 20 0 84 0 100

0,01 20 0 96 0 100

0,005 20 0 91 2,8 27

0,0025 20 10 87 3,85 0

Infizierte 20 40 74 3,85 — Kontrollen

Normale 20 0 100 — — Kontrollen

Tabeiic IX

Wirksamkeit des Antibiotikums A-28086 Faktor A gegenüber verschiedenen Spezies von Elmerla')

Infizierende	Wlrkstoff-	prozentuale	prozentuale	mittlerer	prozentuale	gesamte	prozentuale
Organismen	konzcntrallon	Mortalität	Gewichts	Schadigungs-	Erniedrigung	durchge	Reduktion
	Im Futter		zunahme	wert	des Schadl-	kommene
	In Gew-%				gungswcrles	Oocyien/Tler
						(IxIO')

Eimerla 0,005

acervulina 0,0025

infizierte — Kontrollen

Elmerla maxima

0,005

87 82

63

85

') vier Wiederholungen, jeweils 5 Brathähnchen

53

85

6,15 4,91

36.32 1,95

83 86

40

	Wirkslull- konzenl nil lon Im Fuller In Gew ·>'	prozentuale Mortalität	25	25 095	prozentuale Erniedrigung des Schüdl- gungswertes	gesamte durchge kommene Ooeylen/Tler (1 χ K)*)	prozentuale Reduktion
!■orisL-t/.ung	—	0			—	3,24	—
Inh/ierendc Organismen	0,005	0	prn/cnlUiilc Gewichts zunahme	minierer Schadlgungs- wert	—	2,31	58
Infizierte Kontrollen	—	0	65	1.3	—	5,55	—
KI me rl a brunettl		88	1,2
infizierte Konirollen		62	1.7

Tabelle X Wirksamkeit des Antibiotikums A-28086 Faktor A gegenüber gemischten Spezies von Elmerla ')

Infizierende Wirkstoff- prozentuale prozentuale Imeslinalschädlgungen Caecalschädlgungen

Organismen konzentration Mortalität Gewichts- Mittel prozentuale Mittel prozentuale

In Gew.-¹V zunähme Reduktion Reduktion

50

73

E. necatrlx 0,005 und E. tenella	0	94	0,7	59	1,75
Infizierte Kontrollen	20	52	1,7	—	3.5
E. tenella, 0,01 E. nccatrix, E. maxima, E. brunetti, E. acervullna und E. mlvatl	0	91	0,4	79	0,9
Infizierte — Kontrollen	50	12	1,9	—	3,3

') vier Wiederholungen, jeweils 5 Brathähnchen

Zur Verhinderung ode: Behandlung von Kokzldlose bei Geflügel verabreicht man den Tieren eine nlchttoxlsche antlkokzldlale Menge einer Verbindung A-28086, und zwar vorzugsweise oral auf täglicher Basis. Die Verbindung A-28086 kann über eine Reihe von Wegen geliefert werden. Die einfachste Verabreichungsart besteht jedoch In Verbindung mit einem physiologisch unbedenklichen Träger, vorzugsweise dem jeweiligen Futter der Tiere. Zur Bestimmung der geeigneten Konzentration der Verbindung A-28086 müssen zwar verschiedene Faktoren berücksichtigt werden, die zu verabreichenden Mengen betragen Im allgemeinen jedoch 0,003 bis 0,04 Gcw.-%, auf das nicht mit Wirkstoff versehene Futter bezogen, und sie machen vorzugsweise 0,005 bis 0,02 Gew.-% des Futters aus.

Eine weitere wichtige Eigenschaft der Verbindungen A-28086 ist Ihre Fähigkeit zur Verbesserung der Futterausnutzung bei Tieren. So wird beispielsweise das Futterausnutzungsvermögen bei Wiederkäuern, die über eine entwickelte Pansenfunktion verfügen, durch Einsatz von A-28086 Verbindungen verbessert.

Wie oben erwähnt, wird die Effizienz der Kohlenhydratverwertung bei Wiederkäuern durch Behandlungen verbessert, durch die die Pansenflora des Tieres eher zur Produktion von Proplonatverblndungen als zur Produktion von Acetat- oder Butyratverblndungen angeregt wird. Die Effizienz der Futterausnutzung läßt sich überwachen, Indem man die Produktion und Konzentration der Proplonatverblndungen im Pansen unter Einsatz folgender Methoden beobachtete:

Über eine in den Pansen reichende chirurgisch eingesetzte Fistel entnimmt man einem Ochsen PansenflOssigkelt. Der Ochse wird mit einem hochwertigen Kornfutter gefüttert. Eine Probe der Pansenflüssigkeit wird über ein aus vier Tüchern bestehendes Seihtuch abgeseiht, und das dabei erhaltene Flltrat wird gesammelt. Das von dem Seihtuch zurückgehaltene stückige Material wird anschließend in soviel physiologischem Puffer lesuspendiert, daß man wieder das ursprüngliche Volumen der PansenflOssigkelt erhält, und diese Suspension wird erneut filtriert. Der hierzu verwendete Puffer hat folgende Zusammensetzung:

Bestandteile g/l. Her

Na3HPO4	0,316
KH2PO4	0,152
NaHCCi,	2,260
KCI	0,375
NaCl	0,375
MgSO4	0,112
CaCI2 2H2O	0,050
FeSO4 · 7H;0	0,008
MnSO4 · H2O	0,004
ZnSO4 · 7H2O	0,004
CuSO4 · 5H2O	0,002
CoCl2 6H2O	0,001

Dieser Puffer 1st In J. Dairy Sei. 38, 1225 bis 1230 (1955) beschrieben.

Die beiden Filtrate werden vereinigt, worauf man sie solange stehen läßt, bis sich oben festes Material abscheidet. Die klare Schicht wird abgetrennt, mit dem gleichen Puffer (1:1) verdünnt und dann auf einen 2" pH-Wert von 6,8 bis 7,0 eingestellt.

Die verdünnte Pansenflüsslgkelt (10 ml) wird zusammen mit 40 mg des oben beschriebenen Futters, einem weiteren Milligramm Sojabohnenprotein und der zu untersuchenden Verbindung in einen 25-ml-Kolben gegeben. Jede Behandlung wird In vier Kolben durchgeführt. Es werden auch 2 Satze aus je vier Vergleichskolben verwendet. Man arbeitet mit einem Vergleich zur Zelt Null und einem Vergleich nach 16stündlger Inkubation. Alle Versuchskolben werden 16 Stunden bei 38° C Inkublcrt. Nach erfolgter Inkubation wird der pH-Wert gemessen, und man versetzt jeden Kolben mit 25%lger Metaphosphorsäure (2 ml). Hierauf läßt man den Kolbeninhalt absetzen, und die überstehenden Flüssigkellen werden gaschromatographlsch bezüglich der darin enthaltenen Proplonat-, Acetat- und Butyratverblndungen analysiert. Durch die crflndungsgemäßen Wirkstoffe wird die Produktion von Proplonat gegenüber den Vergleichen stark erhöht.

Ji) Die mit den erfindungsgemäßen Wirkstoffen erhaltenen Ergebnisse werden statistisch mit den Ergebnissen der Vergleiche verglichen. Aus Tabelle XI geht das Verhältnis der Konzentralionen an flüchtigen Fettsäuren (FFS) In den behandelten Kolben und der Konzentrationen In den Vergleichskolben hervor.

35	Tabelle Xl Verhältnis aus Behandlung	zu Kontrolle	Mol-'*, Acetat	Mol-% Butyral	Mol-% Proplonat	gesamtes FFS mMol/Lller
40	Verbindung	ppm In Jcr Panscn- flüsslgkclt	0,94 0,92	0,87 0,96	1,34 1.15	1,26 1,29
	A-28086 Faktor A A-28086 Faktor B	1 1

Die Wirksamkeit der Kohlenhydratvcrwcrtung wird anhund von In-vlvo-Untersuchungen weitet demonstriert, die an Tieren durchgeführt werden. In deren Pansen Fisteln angelegt sind, über die man Proben des Panseninhalts entnehmen kann.

Der In Tabelle XU angeführte Versuch wird i'nter Verwendung erwachsener mit Fisteln versehener Ochsen durchgeführt, die jeweils etwa 554 kg wiegen. Zwei Ochsen werden mit einem normalen Futter gefüttert, und

5ti vier Ochsen aus jeder Behandlungsgruppe füttert man mit einem Identischen Futter, das mit A-28086 Faktor A versetzt Ist. Jede Teilmenge (100 ml) der entnommenen Pansenflüsslgkelt wird mit iO%igcr Metaphosphorsäure (100 ml) versetzt. Sodann läßt man die Proben absetzen und analysiert die überstehenden Flüssigkelten gaschromatographlsch zur Bestimmung der Proplonsäurekonzentratlon. Die In Tabelle XIl angeführten Versuchsergebnisse sind die mittleren prozentualen Zunahmen der Proplon säurekonzentratlon Im Pansen, und zwar Mittelwerte aus 5 Analysen während einer I4taglgen Versuchsdauer. Die Vergleiche enthalten etwa 20 Mol-% Propionsäure.

Tabelle XII

Λ-28Π86 Faktor Λ prozentuale Zunahme

(mg/Tag) gegenüber den Kontrollen

25 17,4

100 54,0

f. 5

Durch In-vlvo-Versuche wird darüber hinaus gezeigt, daß A-28086 Faktor A das Futterausnutzungsvermögen bei Schafen erhöht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen, die über eine Zeitspanne von 56 Tagen durchgerührt werden, gehen aus der folgenden Tabelle X!!! hervor.

Tabelle XUI

A-28086	Anzahl	Mllllcre tägliche	FuUcraul nähme	Verhältnis aus	prozentuale
Faktor A	der Tiere	Gewichtszunahme	in kg pro Tug	Fuueraufnahme	Verbesserung
in g pro Tonne		In kg pro Tag		zu
Futter				Gewichtszunahme

9 18 Kontrolle

13 13

1.50	7,40	12	_
1,43	8,31	1
1,61	8,38

Die Verbindung A-28086 Faktor D 1st ein antlvirales Mittel. A-28086 Faktor D wirkt gegenüber Maryland-B-Vlrus, Poliovirus Typ III, COE-Vlnis, Herpes-Vlrus und Semllki-Forest-Vlrus, wir durch den In-vitro-Plattensuppresslonsversuch gezeigt wird, der dem von Slmlnoff In Applied Microbiology 9 (1), 66 bis 72 (1961) beschriebenen Versuch ähnlich 1st. A-28086 Faktor D 1st ferner wirksam gegenüber dem übertragbaren Gastroenteritls-Vlrus, Newcastle-Dlsese-Virus und Infektiösem Rlnder-Rhlnotracheltls-Vlrus, wie sich durch ähnliche Gewebekulturuntersuchungen ergibt.

Die Tatsache, daß die Verbindung A-28086 Faktor D sowohl gegenüber Viren als auch gegenüber anaeroben Bakterien wirksam Ist, macht diese Verbindung besonders geeignet zur Behandlung oder Verhinderung von Enteritis bei Hühnchen, Schweinen, Rindern und Schafen. Die Verbindung A-28086 Faktor D eignet sich ferner zur Behandlung einer F.nierotoxämic bei Wiederkauern.

Die antlkokzldlale Wirkung der erflndungsgemäücn Verbindung A-28086 Faktor D Ist eine wichtige Eigenschaft. Die antlkokzldlale Wirkung von A-28086 Faktor D gegenüber Elmerla tenella wird durch In-vltro-Versuche gezeigt. Hierzu bedient man sich des folgenden Verfahrens [bezüglich Einzelhellen wird auf Exper. Parasltology 34, 189 bis 196 (1973) verwiesen]:

Unter Einsatz üblicher Techniken stellt man unter Verwendung von Lelghton-Röhrchen, Plastlkschälchen oder Platten oder sonstiger geeigneter Kulturbehältnisse Wirtszellkulturen her. Nach 2 bis 3 Tage langem Wachsen In einem geeigneten Kulturmedium (Eagle Mlnlmaiessenllalmedlum, Lactalbumlnhydrolysat In Earle- oder Hank-Salzlösung, Medium 199 und dergleichen) bildet sich gewöhnlich eine geeignete Monoschlcht, die Infiziert und mit Wirkstoff behandelt werden kann. Für diese Untersuchungen werden Prlmarkulturen von Hühnchennierenzellen verwendet.

Aus den Fäkalien Infizierter Hühnchen gewinnt man lebende Oocysten von Elmerla tenella, und diese werden vor ihrer Verwendung gereinigt und sterilisiert. Die Oocysten sporullen man dann durch Ikubatlon bei Raumtemperaturen, Indem man durch die Suspension Luft leitet oder diese Suspension auf einem Rotationsschüttler oder einem sonstigen geeigneten Gerät leicht scnüttelt. Zur Verhinderung von Bakterien oder Schimmelwachstum während der Sporulatlon kann man Kallumdlchromat oder Schwefelsäure (oder andere Chemikalien) verwenden.

Die Infekten Sporozolten lassen sich aus den Oocysten durch eine Kombination aus einer mechanischen Zerstörung der Wand des Oocysten, anschließende Behandlung mil Trypsin und Behandlung mit Gallensalzen excystleren, wodurch die Selbstheilung der Sporo/.olten aus den Sporocysten eingeleitet wird.

Zellkulturen werden infiziert. Indem man In das Kulturgefflß lebende Sporozolten einbringt. Die zu untersuchenden Chemikalien kann man gleichzeitig damit oder auch spüler einführen. Der zu untersuchende Wirkstoff wird In der gewünschten Konzentration In 10% Dimethylformamid In physiologischer Salzlösung eingebracht. Der Endpunkt des Versuchs besteht In einer Hemmung nichtgeschlechtlicher Entwicklungsstufen, und er wlra durch mikroskopische Untersuchung von Kulturen bestimmt, die man 96 Stunden nach Infektion fixiert und anfärbt. Die Ergebnisse werden angegeben In wirksam (A), unwirksam (N) oder cycotoxisch (C), und zwar je nach der Gegenwart oder Fehlen von Schlzonten der zweiten Generation und Irgendeiner offensichtlichen Toxlzltät gegenüber der Zellmonoschlchi.

Die bei dieser Untersuchung für A-28086 Faktor D erhaltene antlkokzldlale Wirksamkeit Ist In der folgenden Tabelle XIV zusammengefaßt.

Tabelle XIV

Antlkokzldlale Wirksamkeit Antibiotikum A-28086 Faktor D

Konzentration von	Bewcrtun
A-28086 Faktor D
(mg/ml)
5	C
1	C
0,2	C
0,4	A.C·)
0,03	Λ
0,02	A
0.01	±A
0.008	N

*) Ergebnis aus zwei Versuchen 20

Ein weiteres Interessantes Merkmal der Verbindung A-28086 Faktor D Ist seine Fähigkeit zur Verbesserung des Futterausnutzungsvermögens bei Wiederkauern, die über eine entwickelte Pansenfunktion verfügen. Der Mechanismus zur Utilisation bzw. Verwertung des überwiegenden nutrltlven Anteils (Kohlenhydrate) von Wlederkauerfutter Ist genau bekannt. Durch Im Pansen des Tieres vorhandene Mikroorganismen werden Kohlenhydrate unter Bildung von Monosaccharlden abgebaut, und diese Monosaccharide werden dann In Pyruvatverblndungen umgewandelt. Die Pyruvate werden durch mikrobiologische Verfahren unter Bildung von Acetaten, Butyraten oder Proplonaten metabollslert, die man kollektiv als fluchtige Fettsauren (FFS) bezeichnet. Bezüglich einer detaillierten Erörterung dieser Zusammenhänge wird auf Leng In »Physiology of Digestion and Metabolism In the Ruminant«. Phllllpson et al. Eds., Oriel Press, Newcastle upon Tyne, England (1970). Selten

M 408 bis 410 verwiesen.

Die relative Effizienz der FFS-Utlllsation wird In Feedstuffs, 19. Juni 1971, Seite 19, und In »Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants«, Band 2, (1971), Selten 622 und 625 erörtert. Es werden zwar auch die Acetate und Bulyrale verwertet, die Verwertung der Propionate Ist jedoch höher. Ist zu wenig Proplonat vorhanden, dann entwickelt sich bei den Tieren ferner eine sogenannte Kctose. Durch eine geeignete Verbindung werden die Tiere daher zur Bildung eines höheren Anteils an Proplonaten aus Kohlenhydraten angeregt, wodurch sich das Ausnutzungsvermögen für Kohlenhydrate erhöht und gleichzeitig die Gefahr einer Kelose verringert.

Die Wirksamkeit eines derartigen Wirkstoffes laßt sich bestlnmen. Indem man seinen Einfluß auf die Produktion und Konzentration der Propionatverblndungen im Pansen nach dem gleichen Verfahren ermittelt, wie es auch oben Im Zusammenhang mit Faktor A verwendet wird.

Die dabei erhaltenen Versuchsergebnisse sind verglichen mit Vergleichsergebnissen statistische Werte. Aus Tabelle XV geht des Verhältnis der Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren In mit Λ-28086 Faktor D behandelten Kolben und den Konzentrationen in den Verglelehskolben hervor.

Tabelle XV	Mol-",, Acetal	Mnl-\ Butyral	ΜοΙ-Λ. l'roplonat	KCSiimlc ITS mMnl/llter
A-28086 I) mg/ml	0.8715 0,8976	0,7973 0,8726	1,7981 1.5871	1,1979 1,0630
1.0 0.3

Die erflndungsgemäßen Verbindungen erhöhen den Anteil an Proplonaten und somit die Effizienz der Futter- ausnutzung, wenn sie Wiederkäuern oral In Mengen von etwa 0.05 bis etwa 5,0 mg pro kg und Tag verabfolgt

ss werden. Die günstigsten Ergebnisse erhält man bei einer Verabreichung von etwa 0,1 bis etwa 2,5 rng Wirkstoff pro kg und Tag. Ein bevorzugtes Verfahren zur Verabreichung der erflndungsgemäßen Wirkstoffe besteht in einem Vermischen mit dem Tierfutter, die Wirkstoffe lassen sich jedoch auch In anderer Welse verabreichen, beispielsweise In Form von Tabletten, Tränken, BoII oder Kapseln. Diese verschiedenen Dosierungsformen lassen sich In der Veterinärmedizin bekannter Welse formulieren. Jede einzelne Dosierungseinheit sollte eine

«> Wirkstoffmenge enthalten, die der jeweiligen Tagesdosis direkt entspricht, mit der das Tier behandelt werden soll.

Das A-28086 kann zusammen mit Rindermastfuttermitteln verwendet werden, die ein Rlnderfutter und 1 bis 30 g Wirkstoff pro Tonne enthalten. Rlnderfutter unterscheidet sich bekanntlich von anderen Futtcrmlilcln, wie beispielsweise Geflügelfutler. Rlnderfutter enthält Rohfutter, wie Baumwollsaalhulsen oder Malssllage. Darüber

<'^s hinaus enthält Rlnderfutter noch einen hohen Prozentsatz, oft 15 bis 25%. nlchtprotclnartlger Sllckstoffquellen. Eine häufig verwendete nlchlproielnartlge Stickstoffquelle Ist Harnstoff.

Wie oben erwähnt, sind die erflndungsgemäßen A-28086 Verbindungen antlvlralc MIttel, und sie wirken ferner gegenüber anaeroben Bakterien, Insbesondere Clostridium pcrfrlngens. Die A-28086 Verbindungen eignen

sich daher zur Behandlung oder Verhinderung einer Enteritis bei Hühnern, Schweinen, Rindern und Schafen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen A-28086 können ferner zur Behandlung von Enterotoxämle bei Wiederkäuern verwendet werden.
Die Erfindung wird anhand der folgendci Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

A. Schüttelkolbenfermentatlon von A-28086 unter Verwendung von

S. aureofaclens NRRL 5758

Es wird eine Kultur von Streptomyces aureofaclens NRRL 5758 hergestellt und auf Schrägagar folgender Zusammensetzung gehalten:

Bestund teile	Menge
Agar	20 g
Dextrin	10 g
Enzymhydrolysal von Casein	2g
Rinderextrakt	2g
Hefeextrakt	2g
Destilliertes Wasser q. s. auf	1 Liier

20 25

Die Schräge wird mit Slreptomyces aureofaclens NRRL 5758 Inokuliert, worauf man die beimpfte Schräge 6 bis 10 Tage bei 30° C Inkublen. Die reife Schrägkultur wird mit Rlnderscrum überdeckt und zum Ablösen der Sporen mit einer sterilen Schlaufe abgekratzt. Die dabei erhaltene Rinderserumsuspension der Sporen und der Myzelfragmente wird zu 6 Pellets lyophlllslert.

Ein auf diese Welse hergestelltes lyophlllslertes Pellet verwendet man zum Inokulieren von 50 ml eines vegetatlven Mediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge

Glucose 20 g

Sojabohcnschrot 15 g

Malsquellwasscr 10 g

CuCO, 2 g

Leitungswasser q. s. auf 1 Liter

Das Inokulierte vegetative Medium wird In einen 250 ml Erlenmcyer-Kolben gegeben und bei einer Temperatur von 30° C über eine Zeltspanne von 72 Stunden auf einem Schüttler, der In einem Bogen mit etwa 5 cm Durchmesser bei 250 Umdrehungen pro Minute rotiert, Inkublen.

B. Tankfermentation von A-28086 unter Verwendung von S. aureofaclens NRRL 5758

Zur Bildung eines größeren Volumens Inokulum verwendet man 10 ml des oben beschriebenen inkubierten vegetativen Mediums zum Inokulieren von 400 ml eines zweiten vegetativen Wachstumsmediums, das die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium hat. Dieses In einem 2-Llter-Kolben befindliche zweite Medium wird bei einer Temperatur von 30⁰C über eine Zeitspanne von 24 Stunden auf einem Schüttler, der In einem Bogen von etwa 5 cm Durchmesser bei einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute rotiert, Inkubiert.

Das In dieser zweiten Stufe erhaltene vegetative Medium (1 Liter) verwendet man zum Inokulieren voa 100 Liter sterilem Produktionsmedium folgender Zusammensetzung:

Beslundlcllc Menge

Tuplcadcxirln 60,0 g/Llter

Ln/ymhytlrolysal von Casein 8,0 g/Llter

Melasse 15,0 g/Llter

MySO, 7II,() 0,5 g/Llter (>S

CaCO, 2,0 g/Lltcr

RalTlnerlertcs Sojubohnenol 5,0 g/Llter

Dclonlslcrtes Wasser μ s. auf I Liter

Nach 30 Minuten langem Sterilisieren In einem Autoklav bei einer Temperatur von 120° C und einem Druck von 1,03 bis 1.38 bar hat das Medium einen pH-Wert von 6,7. Das Inokulierte Produkllonsmedlum läßt man dann In einem 165 Liter fassenden Fermentationstank 10 Tage bei einer Temperatur von 29° C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft belüftet, und zwar mit einer Geschwindigkeit von 0,4 Volumina Luft pro Volumen Kulturmedium und pro Minute. Das Medium wird mit üblichen Rührern bei einer Rührgeschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute gerührt.

Beispiel 2

Die Herstellung der Antibiotika A-28086 erfolgt nach dem gleichen Verfahren wie bei Beispiel 1, wobei man jedoch ein Kolbenproduktionsmedium folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteile	auf	Menge
Glucose	Beispiel 3	10 g/Llier
Eßbare Melasse	20 g/Lltcr
Pepton	5 g/Liter
CaCO,	2 g/Llier
Leitungswasser q. s.	1 Liter

Abtrennung des durch S. aurcofaclcns NRRL 5758 produzierten Antibioticum A-28086-Komplexes

Die nach dem In Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhaltene gesamte Fermentationsbrühe (132 Liter) wird

unter Verwendung einer Filterhilfe auf Basis von Dlatomecnerde filtriert, wodurch man 97 Liter filtrierte Brühe erhält. Die filtrierte Brühe wird mit einem etwa gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wird von der wäßrigen Phase abgetrennt und auf etwa 500 ml Volumen eingeengt. Der so erhaltene konzentrierte Ethylacetatextrakt wird zu einem großen Überschuß Petrolether (etwa 10 Liter) gegeben, um auf diese Welse unerwünschtes Material auszufällen und abzutrennen. Das abgetrennte Flltrat wird unter Vakuum elngedampft, wodurch man den Brühenanteil des Antibiotikum A-28086-Komplexes erhält (6,9 g).

Den Im Myzel vorhandenen Anteil des Antibiotikum A-28086-Komplexes erhält man durch zweimaliges Extrahieren des abfiltrierten Myzels mit jeweils etwa dem halben Volumen Methanol (62 Liter und 59 Liter). Die zwei Methanolextrakte werden vereinigt und zur Entfernung des Methanols unter Vakuum konzentriert. Nach diesem Einengen bleiben etwa 10 Liter einer wäßrigen Phase zurück. Die wäßrige Phase stellt man mit

4(i verdünntem Natriumhydroxid auf etwa pH 7,5 ein. Die dabei erhaltene Lösung wird zweimal mit etwa gleichen . Volumina Ethylacetat (9 Liter und 10 Liter) extrahiert. Die Ethylacetatextrakte werden vereinigt und dann auf etwa 400 ml Volumen eingeengt. Der so erhaltene konzentrierte Ethylacetatextrakt wird zur Entfernung unerwünschter Materlallen zu einem großen Überschuß Petrolether gegeben, wozu man genauso vorgeht wie oben bei dem konzentrierten filtrierten Brühenextrakt. Der auf diese Welse aus dem Filtrat erhaltene im Myzel vorhandene Anteil des A-28086-Antlblotlkumkomplexes wiegt 20,6 g.

Beispiel 4

5ü Isolierung der einzelnen Faktoren A und B

aus A-28086

Der Myzelanteil des A-28086-Antiblotlkumkomplexes (235 g, hergestellt gemäß Beispiel 3) wird in etwa 80 m Benzol gelöst. Die Benzollösung wird auf eine Slllcagelsäule (9 χ 130 cm, 8 Liter, Slllcagel Sorte 62) aufgegeben

Die Säule eluiert man mit variierenden Gemischen aus Benzol und Ethylacetal. Der Fortgang der Elution wire dünnschlchtchromatographlsch verfolgt. Unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Benzol und Ethyl

acetat (90 :10) wird zuerst der Faktor B eluiert und als Einzelfaktor Isoliert. Der aus Aceton-Wasser umkrlstalll slerte Faktor B (43 g) schmilzt bei 150 bis 153° C.

Es wird weiter mit Gemischen aus Benzol und Ethylacetal eluiert, wobei man die Menge an Ethylaceta

to jedoch graduell steigert. Hierbei wird der Faktor A eluiert. Die verschiedenen Fraktionen, die den Faktor / enthalten, werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Rückstand eingedampft. Der dabei erhaltene Rück stand wird in Aceton (etwa 150 ml) gelöst, worauf man die Acetonlösung mit Wasser (etwa 150 ml) versetz! Sodann stellt man den pH-Wert der erhaltenen Lösung durch Zugabe von 1 η Chlorwasserstoffsäure auf pH ein. Das angesäuerte Gemisch wird etwa 1 Stunde gerührt, und während dieser Zelt entsteht ein Niederschlag

e-5 Der Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt und aus Aceton (etwa 150 ml) unter anschließender Zugab von Wasser (etwa 60 ml) umkristallisiert. Das dabei angefallene Produkt wird Ober Nacht unter Vakuur getrocknet, wodurch man den Faktor A (etwa 6,6 g) erhält. Nach tellweiser Verdampfung des Acetons aus der Flltrat erhält man eine zweite Ernte des Faktors A (etwa 1,2 g).

Beispiel 5

Schütiülkolbcnlcrmentatlon von A-28086 unter Verwendung von S. aureoraclens NRRL 8092

Man stellt eine Kultur von Strcptomyces aureofaclens NRRL 8092 her und hält diese auf Schrägagar folgender Zusammensetzung:

liest ;i [UlIClIc	Menge
K-IIPO4	2 g
MgSO4 711)0	0,25 g
NH4NO,	2g
CaCO,	2,5 g
IcSO4 711,0	0,001 g
MnG; · 7M;()	0,001 g
ZnSO4 · 71I2O	0.001 g
Ciluco.sc	ίο g
Agar	20 g
Dclonlslertcs Wasser q. s. auf	1 Liter
pll (nicht eingestellt	7,7 g

Der Schrägagar wird mit Streptomyccs aureofaclens NRRL 8092 Inokuliert, worauf man die Inokulierte Schräge bei 30° C etwa 7 Tage Inkubleri. Die reife Schrägkultur wird mit sterilem Rinderserum überdeckt und mit einer sterilen Schlaufe abgekratzt, wodurch man aus der Schrägkullur eine Sporen- und Myzelsuspension 25 erhält. Die erhaltene Suspension wird zu maximal 6 Pellets lyophlllsleri.

Ein auf diese Welse hergestelltes lyophlllslertes Pellet verwendet man zum Inokulieren von 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge 5°

Glucose 20 g

Sojabohnenmehl 15 g Malsquellwasser 10 g

CaCOj 2 g 35

Leitungswasser q. s. auf 1 Liter

Der pH-Wert wird mit verdünntem NaOH auf pH 6.5 eingestellt.

Das In einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben befindliche Inokulierte vegetative Medium wird bei einer Tempera- ⁴⁰ tür von 30° C über einen Zeltraum von 48 Stunden auf einem Rotationsschüttler, der unter einem Bogen von cm bei einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute rotiert, inkubiert.

Das oben beschriebene Inkubierte vegetative Medium (0,5 ml, 1%) verwendet man zum Inokulieren von 50 ml eines Fermentationsmediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge

Taplocadextrin 60,0 g Enzymdydrolysat von Casein (Amber HIlC) 6,0 g Enzymhydrolysat von Casein (NZ AmIn A) 2,0 g 50

CaCO₁ 2,0 g

MgSO₄-7H₂O 0,5 g

Bestandteile Menge ₅₅

Rohrzuckermelasse 15,0 g Raffiniertes Sojabohnenöl 5,0 ml Leitungswasser q. s. auf 1 Liter

pH (nicht eingestellt) 6,6 _M

Befsplel 6

Tankfermentatlcn von A-28086 unter Verwendung von S. aureofaclens NRRL 8092 65

Das In Beispiel 5 für die Schüttelkolbenfermentatlon von A-28086 verwendete Verfahren wird auch für eine Tankfermentation herangezogen. Zur Bildung eines größeren Volumens an Inokulum werden 10 ml des inku-

21

blerten vegetativen Mediums zum Inokulieren von 400 ml eines zweiten vegetativen Mediums verwendet, das ^vj die gleiche Zusammensetzung wie das erste vegetative Medium hat. Dieses zweite Medium wird In einem

:'..;' Liter Erlenmeyer-Kolben bei 30° C über eine Zeitspanne von 24 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei einer

ϊΐ Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute und unter einem Bogen von etwa 5 cm Inkubiert.

5 Das dabei erhaltene Inkubierte vegetutlve Medium der zweiten Stufe (800 ml) verwendet man zum Inokulieren von 100 Liter sterilem Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge

Taplocadextrln 60,0 g/Liter Enzymhydrolysat von Casein

(Amber EHC) 6,0 g/Lltcr Enzymhydrolysat von Casein

(NZ AmIn A) 2,0 g/Llter

CaCOi 2,0 g/Llier MgSO₄ · 7H₂O 0,5 g/Llter Rohrzuckermelasse 15.0 g/Lltcr Raffiniertcs Sojabohncnöl 5,0 mg/Lller Leitungswasser q. s. auf 1 Liter

Nach Sterilisation in einem Autoklav bei einer Temperatur von 121°C über eine Zeltspanne von 30 Minuten bei einem Druck von 1,03 bis 1,38 bar hat das Medium einen pH-Wert von 6,8 ± 0,1. Das Inokulierte Produktionsmedlum läßt man In einem 165 Liter fassenden Fermentationstank 10 bis 12 Tage bei einer Temperatur von 28 ± 1° C fermentleren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft In einer Geschwindigkeit von 0,4 Volumina Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute belüftet. Das Medium wird mit üblichen Rührern bei einer Geschwindigkeit von 300 Umdrehungen pro Minute gerührt.

Beispiel 7

Die Herstellung der Antibiotika A-28086 erfolgt nach dem Im Beispiel 6 beschriebenen Verfahren, wobei man jedoch ein Schüttelkolben-Tank-Produktionsmedium folgender Zusammensetzung verwendet:

_1S Bestandteile Menge

Taplocadextrln 30,0 g/Lltcr Glucose 15,0 g/Llter

Enzymhydrolysat von Casein 3,0 g/L!ler _4n (Amber EHC)

Enzymhydrolysal von Casein 1,0 g/Lltcr (NZ Amln A)

Heleexlrakt 2,5 g/Llter CaCO, 2,0 g/Lller MgSO₄ · 7H_;O 1,0 mg/Liter

" Rohrzuckermelassc 15,0 g/Llter

Raffiniertes Sojabohnenöl 5,0 ml/Liter Leitungswasser q. s. auf 1 Liter

Der pH-Wert des Mediums wird nach Sterilisieren in einem Autoklaven In der In Beispiel 6 beschriebenen Welse au! 6,4 eingestellt.

Beispiel 8 Abtrennung des durch S. aureofaclens NRRL 8092 produzierten A-28086 Antibiotikumkomplexes

Die nach dem Verfahren von Beispiel 6 erhaltene gesamte Fermentationsbrühe (60 Liter) wird durch Zugabe verdünnter Salzsäure auf pH 3 eingestellt. Die erhaltene LOsung wird unter Verwendung einer Filterhilfe auf

«* Basis von Diatomeenerde filtriert. Der abgetrennte Myzelkuchen wird mit 30 Liter Methanol extrahiert, worauf man den Extrakt unter Rühren mit 1,56 kg Natriumblcarbonat versetzt. Nach Abtrennen dieses Extraktes wird der Myzelkuchen wiederum mit weiteren 30 Liter Methanol extrahiert. Die beiden Methanolextrakte werden vereinigt und zur Entfernung des Methanols unter Vakuum konzentriert. Die erhaltene wäßrige LOsung (etwa Liter) wird mit verdünnter Salzsäure auf pH 7,5 eingestellt. Diese LOsung extrahiert man dann zweimal mit Ethylacetat (jeweils 7 Liter). Die Ethylacelatextrakte werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Ollgen Rückstand .konzentriert. Der ölige Rückstand wird In ISOOmI Aceton gelöst. Die AcetonlOsung versetzt man mit Wasser (1500 ml). Die erhaltene LOsung wird mit verdünnter Salzsäure auf pH 3 eingestellt und 1 Stunde gerührt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und dann In Aceton (1500 ml) gelöst, worauf man die

Lösung mit Wasser (400 ml) versetzt. Die erhaltene Lösung läßt man anschließend bis zum Kristallisieren 16 stunden stehen. Die entstandenen Kristalle werden abflilrlert und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 74 g 'ohes kristallines Produkt erhält, das A-28086 Faktoren A und B sowie andere kristalline Verunreinigungen :nthäll.

Das obige kristalline Produkt (40 g) wird In etwa 250 ml Benzol gelöst. Die Benzollösung wird dann auf eine Sllicagelsäule (9 χ 120 mm, Sillcagel, Sorte 62) gegeben. Die Säule wird der Reihe nach mit jeweils 40 1 folgender Lösungsmittel elulert:

1) Benzol w

2) Benzol: F.thylacetai (9:1)

3) Benzol: Ethylacetat (4:1)

4) Benzol: Ethylacetat (7 : 3)

5) Benzol: Ethylacetat (1:1)

6) Ethylacetat

7) Methanol

Es werden Fraktionen von jeweils 1 Liter gesammelt. Jede Fraktion wird durch einen entsprechenden Versuch gegenüber Bacillus subtills untersucht und zur Identifizierung der elulerten Verbindungen dUnnschlchtchromaiographlsch ausgewertet. Das A-28086-I wird mit einem Gemisch aus Benzol und Ethylacetat (4:1) elulert. Die Elulerung von A-28086 Fakior B erfolgt mit einem Gemisch aus Benzol und Ethylacetat (7 : 3). A-28086 Faktoren A und D werden In den Fraktionen elulert, die man mit den Gemischen aus Benzol und Ethylacetat (7 : 3 und 1:1), nämlich den Fraktionen 119 bis 156, erhält. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der dübel erhaltene Rückstand wird In Aceton (500 ml) gelöst. Die Acetonlösung versetzt man mit Wasser (500 ml), worauf man den pH-Wert der erhaltenen wäßrigen Lösung mit verdünnter Salzsäure auf pH 3 einstellt und die Lösung 1 Stunde rührt. Der dabei entstandene Niederschlag wird abflltrleri und aus Aceton (500 ml) sowie Wasser (180 ml) umkrlslalllslert. Die dabei entstandenen Kristalle werden abflltrlert und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 20,1 g eines Gemisches aus A-28086 Faktoren A sowie D erhält.

Beispiel 9 Trennen und Reinigung der Einzelfaktoren A und D

Das nach Beispiel 8 erhaltene kristalline Gemisch der Faktoren A und D von A-28086 (18,8 g) wird in Benzol (50 ml) gelöst. Die Benzollösung wird auf eine Sllicagelsäule (7 χ 100 cm Säule, Sillcagel, Sorte 60, feiner als 0,062 mm) aufgegeben. Die Elulerung der Säule erfolgt bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 90 ml pro Stunde der Reihe nach mit folgenden Eluiermltteln:

1) 12 Liter Benzol

2) 12 Liter Benzo! . Ethylacetat (9:1)

3) 12 Liter Benzol: Ethylacetat (4:1)

4) 32 Liter Benzol Ethylacetai (7 : 3)

5) 10 Liter Methanol

Das Elulerverfahren wird durch Dünnschichtchromatographie mit Cellulose (Cellulose auf Aluminiumträger) sowie bloautographlsch unter Verwendung von B. subtills verfolgt. Man arbeitet mit folgenden Lösungsmittelsystemen: Wasser : Methanol : Aceton (12:3: 1), wobei der pH-WerOder Lösung mit Ammoniumhydroxid zuerst auf pH 10,5 und dann mit Salzsäure auf pH 7,5 eingestellt wird.

Bis zum Auffinden einer Aktivität werden Fraktionen von 1 bis 2 Liter aufgefangen, und dann sammelt man Fraktionen von 200 ml. Die Fraktionen, die lediglich A-28086 Faktor D enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zu einem Rückstand eingedampft. Der Rückstand wird aus Aceton-Wasser (1:1) umkrlslalllslert. Die Kristalle werden abgetrennt und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 140 mg kristallines A-28086 Faktor D erhält. Diejenigen Fraktionen, die A-28086 Faktor D mit einer Spur A-28086 Faktor A enthalten, werden genauso behandelt, wodurch man weitere 15o mg kristallines A-28086 Faktor D erhält, das eine geringe Menge A-28086 Faktor A enthält.

Die Fraktionen, die lediglich A-28086 Faktor A enthalten, werden ebenfalls in der gleichen Weise behandelt, wodurch man 4,7 g kristallines A-28086 Faktor A erhäH.

Beispiel 10

Nach dem In Beispiel 5 beschriebenen Verfahren werden A-28086 Antibiotika hergestellt, wobei man jedoch ein Schrägenmedium folgender Zusammensetzung vorwendet:

Zusammensetzung	Menge
Rlnderextrakl	2.00 g
Dextrin	20,00 g
Hefeexlrakt	2,00 g
Enzymhydrolysat von Casein	4,00 g
CoCl2 · 6H2O	0,02 g
Agar	20,00 g
Deionisiertes Wasser q. s. auf	1 Liter
Der pH-Wert Ist mit KOH auf
7,0 eingestellt
lrd bei einer Temperatur von 28°	C etwa 7 Tage inkubiei
Beispiel	11

Nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren werden die Anbltlotlka A-28086 hergestellt, wobei man jedoch ein Kolben-Produktions-Medium folgender Zusammensetzung verwendet:

²⁽¹ Bestandteile Menge

Taplocadextrln 80 r'Llier Enzymhydrolysai von Casein 15,0 g/Lller

(Amber HHC)

Rohrzuckermelassc 15,0 g/Llter

Calciumcarbonat 2,0 g/Lltcr Ammoniumsulfat l,Og/Llter

Magnesiumsulfat 0,5 g/Lltcr Raffiniertes Sojabohnenöl 4,6 g/L.itcr

Beispiel 12

Nach dem In Beispiel 10 beschriebenen Verfahren werden Λ-28Ο86 Antibiotika hergestellt, wobei man als dazwischen befindliche dritte Stufe jedoch ein vegetatives Medium folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteile Menge Dextrose 20,0 g/Llter Malsquellwasser (NaUgcwlchl) 10,0 g/Llter Sojabohnenschrot 15,0 g/Llter CaCO, 2,0 g/Llter Hefe 2,0 g/Llter Zuckerrübcnmelassc 5,0 g/Lltcr

Beispiel 13

Mit A-28086 modifiziertes Hühnerfutter zur Bekämpfung von Kokzldlose

Nach folgender Rezeptur stellt man ein für eine rasche Gewichtszunahme geeignetes ausgewogenes Huhne kraftfutter her:

Bestandteile '». kg Gemahlener gelber Reis Sojabohnenmehl, mit Lösungsmittel extrahiert und

enthülst, fein gemahlen, 50% Protein w> Tierfutter (Rindertalg)

Getrocknetes Fischmehl mit löslichen Bestandteilen

(60% Protein)

Lösliche getrocknete Malsschlempe Dicalciumphosphat, als Futlermlttelzusatzqualltät i>5 Calciumcarbonat

Vitaminmischung

(Vitamin A, D, E. K und B_n. Cholln, Nlacln, Pantothensäure. Riboflavin, Biotin, mit Glucose gefüllt)

24

50	454
31,09	282,3
6,5	59
5.0	45,4
4,0	36.3
1,8	16,34
0.8	7.26
0.5	4.54

Fortsetzung

Bestandteile Spurenmlneralvormlschung (MnSO₄, ZnO, FeSO₄. CaCOj) 0,2 1,81

2-Amlno-4-hydroxybuuersäure 0,1 0,90

(Hydroxyanalog von Methionin)

A-28086 Faktor A 0,01 0,09

Die obigen Substanzen werden in üblicher Welse miteinander vermischt. Die mit einem solchen Futter gefütterten Hühnchen, wobei Wasser ad libitum gegeben wird, sind gegen Kokzldiose geschützt. Die Gewichtszunahme der Tiere Ist vergleichbar zu derjenigen kokzldlosefreler Hühnchen, die mit einem ähnlichen, jedoch nicht wlrkstoffhaltlgen Futter gefüttert werden.

Beispiel

A-28086 enthaltendes Rinderfutter Aus folgenden Bestandteilen wird ein ausgewogenes Rinderfutter mit hohem Korngehalt hergestellt:

Bestandteile 't. kg

Fein gemahlener Mals Gemahlene Maiskolben Entwässertes Luzernemehl 17% Protein Mehl aus enthülsten Sojabohnen,

mit Lösungsmittel extrahiert, 50% Protein Rohzuckermelasse Harnstoff A-28086 Faktor Λ Dicalciumphosphat, Futterqualität Calclumcarbonat Natriumchlorid Spurenmlneralvormlschung Vormischung aus Vitamin A und D₁') Vormischung aus Vitamin F.²) Calclumproplonat

67,8	615,6
IO	90,7
5	45.4
9,9956	90,76
5	45,4
0,6	5,44
0,0044	0,04
0,5	4,54
0,5	4,54
0,3	2,72
0,03	0,27
0,07	0,63
0,05	0,45
0,15	1,36

') Rnthall pro kg: 4 405 300 I. !·. Vitamin Λ. 5 004 400 I. Ii. Vitamin I), und 849,5 g Sojabohnenfutter mit K öl/usal/. ²) Lösliche getrocknete Mnlsschlempe die 440 530 I. Ii. d-alpha-Tocopherylaceial pro kg enthalt.

Das Futtergemisch wird zu Pellets verpreßt. Bei einer mittleren täglichen Freßmenge von 6,8 kg Futter pro Tier erhält man mit diesem Futter etwa 300 mg Λ-28086 Faktor A pro Tier und Tag.

Beispiel 15 A-28086 Faktor D enthaltendes Hühnerfutter zur Bekämpfung von Kokzldiose

Unter Verwendung folgender Bestandteile wird ein für eine rasche Gewichtszunahme geeignetes ausgewogenes Hühnerkraftfutter hergestellt:

Bestandteile

kg

Gemahlener gelber Mals Sojabohnenmehl, mit Losungsmittel extrahiert und

enthülst, fein gemahlen, 50% Protein Tierfutter (Rindertalg) Getrocknetes Fischmehl mit löslichen Bestandteilen (60% Protein)

Lösliche getrocknete Malsschlempc Dicalciumphosphat, als Futterzusatzqualltät Calclumcarbonat Vltamlnvomilschung (Vitamin A. D, L-, K und B_n, Chulln, Niacln,

Pantothensäure, Riboflavin, Biotin, mit Glucose gefüllt)

50	454
31,09	282,3
6,5	59
5,0	45,4
4,0	36,3
1,8	16,34
0,8	7,26
0.5	4,54

25

Fortsetzung

Bestandteile χ kg

^ Spurenmlneralmlschung 0,2 1,81

(MnSO₄, ZnO, KJ, FeSO₄, CaCO,) 2-Amino-4-hydroxybuttcrsüure 0,! 0,90

(Hydroxyanalog von Methionin) A-28086 Faktor D 0,01 0,09

Die obigen Substanzen werden In bekannter Welse miteinander vermischt. Mit einem derartigen Futter gefütterte Hühner, denen man Wasser ad libitum gibt, sind gegen Kokzidlose geschützt. Die Gewichtszunahme der Tiere 1st vergleichbar mit derjenigen kokzldioscfreler Hühnchen, die man mit einem ähnlichen jedoch nicht wirkstoffhaltlgen Futter füllen.

Beispiel 16

A-28086 Faktor I) enthaltendes Rlndcrfuiter i'· Aus folgenden Bestandteilen wird ein ausgewogenes Rlnderfuiicr mit hohem Korngehall hergestellt:

Bestandteile ■·,, ku J5 Fein gemahlener Mals Gemahlene Maiskolben F.ntwässcrics Lu/.crnemchl 17λ, l'roicln Mehl aus enthülsten Sojabohnen,

mit Lösungsmittel extrahiert, 50% Protein .Vi Rohrzuckcrmassc

Harnstoff

Λ-28Ο86 Faktor P

Dicalciumphosphat, l^;uttcrqualliill

Calciumcarbonat J? Natriumchlorid

Spurenniincral vormischung Vormischung aus Vitamin Λ und I),') Vormischung aus Vitamin F.*') Calclumproplonal

') !!nthilll pro kg: 4 405 300 I. K. Vitamin Λ. 5 (KM 4(Kl I I Vitamin I).. und 849,5 μ SojahohncnjV fuller mit I¹V Ölzusal/.

ι ^!) Lösliche getrocknete Malsschlcmpc die 440 530 I I il-alpha-THuipherylaccliit pro 1<μ enthalt

Das vermischte Futter wird /.u Pellets verpreßt. Bei einer Im Mittel täglich gefressenen Futlermengc von 6,8 kg Futter pro Tier liefert dieses Futtermittel etwa 300 mg A-2KO86 Faktor D pro Tier und Tag.

67,8	615,6
IO	90,76
5	45,4
9,9956	90,7
5	45,4
0,6	5,44
0,0044	0,040
0,5	4,54
0,5	4,54
0.3	2,72
0,03	0,27
0,07	0,63
0,05	0.45
0.25	1,36

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

26

Claims (1)

1. Patentansprüche: 1. Polyetherantibtotika A-28086 A, B und D der allgemeinen Forme!

   CH₃ O CH₂

   OH
   HO-C-CHY ΥCH-CH-CH-C-CH