DE2703938C2 - Antibiotikamischung A-7413, Antibiotikum A-7413 Faktoren A, B, C und D und Verwendung der Antibiotikamischung oder ihrer isolierten Faktoren A, B, C und D als wachstumsförderndes Mittel bei Geflügel - Google Patents

Antibiotikamischung A-7413, Antibiotikum A-7413 Faktoren A, B, C und D und Verwendung der Antibiotikamischung oder ihrer isolierten Faktoren A, B, C und D als wachstumsförderndes Mittel bei Geflügel

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Description

Antibiotika werden nicht nur beim Menschen zur Behandlung von verschiedensten, von Mikroorganismen |
hervorgerufenen Erkrankungen angewandt, sondern auch in großem Umfang in der Veterinärmedizin und der Tieraufzucht eingesetzt. Neben einer Bekämpfung und Hemmung gesundheitsschädlicher und somit die Entwicklung von Tieren störender Mikroorganismen von bestimmten gramnegativen und vor allem gramposltl- |
ven Bakterien ist Hauptzweck einer Behandlung mit Antibiotika eine Verbesserung der Futterverwertung und somit Futterausnutzung und eine damit verbundene Wachstumsförderung bei Tieren, und vor allem bei landwirtschaftlichen Nutztieren. Gerade die zunehmende Verknappung In der Versorgung der Weltbevölkerung mit Lebensmitteln macht sowohl eine bessere Futterverwertung als auch höhere Fleischproduktlon zu einem immer dringender werdenden Problem. Es läßt sich hierdurch nämlich einmal Getreide einsparen, das auch zur Versorgung der Menschheit verwendet werden könnte, und andererseits trägt die erhöhte Fleischproduktion zu einem höheren Flelschangebot bei. Mittel, die die obigen Funktionen erfüllen, sind In der Landwirtschaft daher von großer wirtschaftlicher Bedeutung und für die ausreichende Versorgung der Menschheit mit Nahrung heute praktisch unerläßlich.
Eines der derzeit besten Mittel mit einem solchen Wirkungsspektrum ist das unter dem internationalen Freinamen Tylosin bekannte Makrolldantlbiotlkum, das sowohl veterinärmedizinisch als auch in der Tieraufzucht genutzt wird, und zwar unter anderem auch zur Wachstumsförderung bei Geflügel. Tylosin hat nun jedoch genauso wie praktisch alle Antibiotika den Nachteil, daß die damit zu behandelnden Mikroorganismen Im Laufe der Zelt dagegen eine Resistenz entwickeln, so daß sein antiblotisches Wirkungsspektrum zunehmend geringer wird, und damit verbunden ist auch eine zunehmende Einbuße der die Futterverwendung und Wachstumsförderung verbessernden Eigenschaften. Weiter sind Tylosin und auch die anderen bekannten Antibiotika mit vergleichbarem Wirkungsspektrum nicht als In jeder Hinsicht voll befriedigend anzusehen.
Aufgabe der Erfindung 1st nun die Schaffung eines neuen Antibiotikums, das als wachstumsförderndes Mittel bei Geflügel eingesetzt werden kann und sich hierbei gegenüber den bekannten Mitteln entsprechender Wirkungsrichtung durch eine überlegene Wirksamkeit auszeichnet.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die aus dem Anspruch 1 hervorgehende Antibiotikamischung A-7413, die in den Ansprüchen 2 bis 5 genannten Anbltiotlkum A-7413-Faktoren A, B, C und D und die Verwendung dieser Antibiotika als wachstumsförderndes Mittel bei Geflügel gemäß Anspruch 6 gelöst.
Die erfindungsgemäßen Antibiotika sind aufgrund Ihres chemischen Auibaus als schwefelhaltige Peptide anzusehen Andere Vertreter dieser Verbindungsklasse sind Siomycin, Taitomycln, Thiostrepton (H. Umezawa, Index of Antibiotics from Actlnomycetes, Un. erslty Park Press, Seiten 598, 634 und 654), Thiopeptin, Sporanglomycln Thermothiocin, Suliamycln, Antibiotikum A-59 [Journal of Antibiotics, Tokyo 23 (1970), Selten 113 bis 119] und Pepthlomycin [Journal of Antibiotics, Tokyo 21 (1968), Selten 429 bis 430]. Zu weiteren schwefelhaltigen Antibiotika gehören Bleomycin, Phleomycin (Index of Antibiotics from Actinomycetes, Seite 175 und
506) und Zobramycln [Journal of Antibiotics, Tokyo 24 (1971), Seite 543]. Alle diese Antibiotika unterscheiden sich jedoch sowohl hinsichtlich Ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften als auch In bezug auf Ihr
Wirkungsspektrum wesentlich von den erfindungsgemäßen Antibiotika.
Die erfindungsgemäßen Antibiotika zeichnen sich vor allem auch gegenüber dem auf dem gleichen Anwendungsgeblet praktisch als Mittel der ersten Wahl geltenden Tylosln durch eine überlegene Wirksamkeit aus, wie
unter anderem auch dem später folgenden Versuchsbericht entnommen werden kann.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Antibiotikamischung A-7413 und Ihrer
einzelnen Faktoren A, B, C und D gehen aus Anspruch 1 und teilweise auch aus den Parametern der Flg. I, 2
und 3 der Zeichnung hervor. Es erübrigt sich hler daher eine weitere Anführung dieser Daten. Der Stamm ίο Bacillus subtills ATCC 6633 1st auch Im Catalogue of Strains I, 1982, der ATCC als hlnterlegter Stamm aufgeführt. Ergänzend werden im folgenden nur noch die für die einzelnen Faktoren A, B und C des Antibiotikums A-7413 bei der nach saurer Hydrolyse durchgeführten Aminosäureanalyse gefundenen mengenmäßigen
(μΜοΙ/mg) Gehalte der einzelnen Substanzen angeführt:
Antibiotikum A-7413 Faktor A:
Ammoniak = 1,03 μΜοΙ/mg, Glycin = 0,33 μΜοΙ/g, Threonin = 0,40 μΜοΙ/mg, Asparaginsäure = 0,1 μΜοΙ/g
und eine noch nicht Identifizierte Aminosäure = etwa 0,4 μΜοΙ/mg.
Antibiotikum A-7413 Faktor B:
Ammoniak = 0,46 μΜοΙ/mg, Glycin = 0,1 lMol/mg, Threonin = 0,1 μΜοΙ/mg, Asparaginsäure = 0,02 μΜοΙ/mg
und eine noch nicht identifizierte Aminosäure = etwa 0,11 μΜοΙ/mg. 20 Antibiotikum A-7413 Faktor C:
Ammoniak = 0,24 μΜοΙ/g, Glycin = 0,05 μΜοΙ/mg, Threonin = 0,04 μΜοΙ/mg, Asparaginsäure = 0,01 μΜοΙ/mg
und Phenylalanin = 0,05 μΜοΙ/mg.
Die erfindungsgemäßen Antibiotika werden hergestellt. Indem man
(a) den Mikroorganismus Actlnoplanes sp. NRRL 8122 In einem Kulturmedium, das assirni^efbaid Quellen für Kohlenhydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, submers unter aeroben Bedingungen züchtet, bis eine wesentliche Menge Antibiotikum gebildet Ist,
(b) die Antibiotikamischung A-7413 von dem Kulturmedium abtrennt, und
(c) gegebenenfalls aus der Antibiotikamischung A-7413 die Antibiotikum A-7413-Faktoren A, B, C oder D isoliert.
Gewünschtenfalls können die Im Antibiotikagemisch vorhandenen Faktoren A, B und C durch übliche Umsetzung mit organischen Säuren auch In Ihre Ci-C4-Alkylester, Ci-Cs-Acylester oder Thiol-Cj-C^carbonsäurederlvate oder durch Umsetzung mit anorganischen Säuren In Ihre physiologisch verträglichen Salze überführt werden. Die Wirksamkeit solcher Verbindungen ist natürlich praktisch gleich wie die der Antibiotikamischung oder ihrer einzelnen Faktoren, so daß solche Verbindungen als dazu analog anzusehen sind.
Die Infrarotabsorptionsspektren der Antibiotikum A-7413-Faktoren A, B und C, die mit KBr-Preßllngen
erhalten wurden, gehen aus der Zeichnung hervor, nämlich aus Fig. 1 für das Antibiotikum A-7413 Faktor A,
Flg. 2 für das Antibiotikum A-7413 Faktor B und Fig. 3 für das Antibiotikum A-7413 Faktor C.
Die Züchtung des neuen Mikroorganismus Actlnoplanes sp. NRRL 8122 führt zur Antibiotikamischung A-7413, die die Faktoren A, B, C und D enthält. Das Antibiotikum A-7413 Faktor A wird dabei als Hauptfaktor gebildet, während demgegenüber die Faktoren B, C und D In geringerer Menge gebildet werden. Zusätzliche andere Faktoren sind nur in sehr geringen Mengen vorhanden oder verhältnismäßig Instabil. Das Verhältnis, in dem die einzelnen Faktoren In der Antibiotikamischung gebildet werden, schwankt In Abhängigkeit von den
« Fermentationsbedingungen. Die einzelnen Faktoren werden aus dem Antibiotikagemisch unter Anwendung
üblicher Methoden Isoliert.
Der neu aufgefundene und bislang nicht beschriebene Mikroorganismus, der den Antibiotikakomplex A-7413 bildet, konnte taxonomlsch als eine Spezies des Genus Actlnoplanes charakterisiert werden.
Die Actinoplanaceen stellen eine Familie von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales dar, die zuerst von Couch beschrieben wurde U. Elisha Mitchell ScI., Soc, 65, 315 bis 318 (1949); 66, 87 bis 92 (1950); Trans.
New York Acad. Sei. 16, 315 bis 318 (1954); J. Elisha Mitchell Sei. Soc, 71, 148 bis 155 und 269 (1955); »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 8. Auflage, 706 bis 711 (1974); J. Elisha Mitchell Sei. Soc,
79, 53 bis 70 ('963)].
Eine Kultur des das Antibiotikagemisch A-7413 und seine Faktoren bildenden Mikroorganismus Ist in der ständigen Sammlung des Nothern Regional Research Laboratory, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, V.St.A. unter der Nummer NRRL 8122 hinterlegt und von dort ohne Beschränkung über Ihre Zugängllchkeit frei beziehbar.
Die kennzeichnenden Merkmale des Mikroorganismus Actlnoplanes sp. NRRL 8122 sind im folgenden angegeben. Neben gewissen zusätzlichen Untersuchungen wurden zur Ermittlung der Kennzeichen die Methoden 6« angewandt, die von den International Streptomyces Project [E. B. Shlrling und D. Gottleib, Intern. Bull. Systematic Bacterlol. 16 (1966) 313-340] zur Charakterisierung der Streptomycesarten empfohlen wurden. Die Farben wurden gemäß der I.S.C.C.-N.B.S.-Methode (K. L. Kelly und D. B. Judd, »The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names«, U.S. Dept. of Commerce Circular No. 553, Washington, D. C, USA) bezeichnet. Die Farbblöcke nach Maerz und Paul [A. Maerz und M. R. Paul »Dictionary of Color«, McGraw-Hill Book Company, New York, N. Y. (1950). USA] sind in Klammern angegeben.
Morphologie
Auf Storaxpollen (Llquidambar) werden in großem Umfang vegetative Myzelien und Sporanglen gebildet. Es gibt keinen Hinwels auf die Pollen durchdringende Hyphen. Auf Plnuspollen werden keine Sporanglen gebildet.
Die Sporanglen besitzen üblicherweise einen Durchmesser von 9 bis 14 μΐη und sind kugelig bis subkugelig bis unregelmäßig geformt. Die Hauptform Ist unregelmäßig. Die Sporen sind sphärisch mit vielen Geißeln und besitzen eine Größe von 1,4 μΐη bis 1,7 μην, nur wenige Sporen sind beweglich.
Hefe-Malz (ICP No. 2)
Ägar nach Czapek
Hafermchl-Agar
(ICP No. 3)
Anorganische Salze-Stärke
(ICP No. 4)
Glycerin-Asparagln
(ICP No. 5)
Medium nach Bennett
Tomatenmark-Hafermehl
T.TOSIn-Agar
Hefeextrakt-Agar
Glucose-Asparagln
Calciummalat
Nährstoff-Agar
Agar nach Emerson
Wirkung auf Magermilch
Nitratreduktion
Gelatineverflüssigung
Melaninbildung auf
Pepton-Eisen-Agar (ICP No.
Temperaturanforderungen auf
Glycerln-Asparagln-Agar
Züchtungsverhalten (nach 21 Tagen bei 3O0C)
starkes Wachstum, hellbraun (1218); kein lösliches Pigment; es werden Sporanglen gebildet
starkes Wachstum, mäßig orange (11J8); kein lösliches Pigment; es werden keine Sporanglen gebildet
mittleres Wachstum, hellgelbgrün (1OB1); kein lösliches Pigment; es werden Sporanglen gebildet
mäßiges Wachstum, bräun!
ches Pigment; es werden Sporangien gebildet
starkes Wachstum, mittelrötlichoranges Medium (10A10); kein lösliches
6) Pigment; es werden Sporangien gebildet
mittleres Wachstum, hellgelb {1 ICl); es werden weder ein lösliches Pigment noch Sporangien gebildet
schwaches Wachstum, es werden weder ein lösliches Pigment noch Sporanglen gebildet
mittleres Wachstum, gelblichgrau (12A2); es werden weder Sporanglen noch ein lösliches Pigment gebildet
starkes Wachstum, bräunlichorange (13B9), es werden weder ein lösliches Pigment noch Sporanglen gebildet
mäßiges Wachstum, hellorangegelb (11 A4); es werden weder ein lösliches Pigment noch Sporanglen gebildet
mäßiges Wachstum, hellgelbllchrosa (10A2); es werden weder Sporanglen noch ein lösliches Pigment gebildet
schwaches Wachstum, es werden weder ein lösliches Pigment noch Luft-
Hyphen gebildet mittleres Wachstum, hellbraun (13F8); schwach rötlichbraunes Pigment; es werden keine Sporangien gebildet
kein Wachstum
positiv keine nach 21 Tagen
positiv gutes Wachstum bei 26 bis 370C, Intensivste rötlichorange Färbung bei 26° C; kein Wachstum bei 43° C
Kohlenstoffverwertung
Bewertung: + = Verwertung
(+) = wahrscheinliche Verwertung (-) = zweifelhafte Verwertung (-) = keine Verwertung Rhamnose (+)
Cellobiose (-)
i-Inosit (-)
Cellulose
Melezltose -
Fructose (+)
Dextrose (+)
D-Xylose (+)
D-Mannit (+)
Rafflnose
Saccharose +
Maltose (-)
L-Arablnose (-) Lactose (+)
Zur Züchtung des Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 kann man irgendeines der vielen Kulturmedien verwenden. Wegen der wirtschaftlichen Produktion, einer optimalen Ausbeute bezüglich des Antibiotikums, und einer leichten Produktisolierung sind jedoch gewisse Kulturmedien bevorzugt. So !st beispielsweise
die für die Fermentation In großem Maßstab vorzugsweise angewandte Kohlenhydratquelle Dextt/n, wenngleich man auch Glucose, Fruktose Maltose, Saccharose oder dergleichen verwenden kann. Obwohl es für das Wachstum nicht erforderlich 1st, wird die Bildung des Antibiotikums durch ein Öi, wie Maisöl, gefördert. Weitere geeignete Kohlenst ifquellen sind Erdnußöl, Sojaöl, Fischöl und dergleichen. Eine bevorzugte Stickstoffquelle ist Sojabohnenmehl, obwohl man auch Sojabohnengrieß, Peptone, Hafermehl, Erdnußmehl, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenöl, Aminosäuren und dergleichen verwenden kann. Als anorganische Salze setzt man dem Kulturmedium die üblichen löslichen Salze zu, die Natrium-, Kalium-, Elsen-, Zink-, Kobalt-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat-, Nitrat-Ionen und dergleichen liefern.
Die für das Wachstum und die Entwicklung des Mikroorganismus erforderlichen Spurenelemente sollten ebenfalls in dem Kulturmedium vorhanden sein. Diese Spurenelemente treten üblicherweise als Verunreinigungen der anderen Bestandteile des Mediums in solchen Mengen auf, daß die Anforderungen des Mikroorganismus erfüllt werden.
Wenn das Schäumen der Medien bei einer Fermentation In großem Maßstab ein Problem darstellt, kann es erforderlich sein, ein Antischaummittel, wie Polypropylenglykol, in geringer Menge (d. h. In einer Menge von 0,2 ml/1) einzusetzen.
Für die Bildung erheblicher Mengen der Antlbiotlkamischung A-7413 1st eine submerse, aerobe Fermentation in Tanks oder Behältern bevorzugt. Geringe Mengen der Antibiotikamischung A-7413 kann man auch durch Schüttelflaschenkukuren herstellen. Wegen der Zellverzögerung, die bei der Bildung der Antibiotika auftritt, wenn man große Tanks oder Behälter mit den Sporen des Mikroorganismus animpft. Ist es bevorzugt, ein vegetatives Inokulum bzw. eine vegetative Impfkultur zu verwenden. Die vegetative Impfkultur bereitet man durch Animpfen eines geringen Volumens des Kulturmediums mit den Sporen oder mit Myzelfragmenten des Organismus, so daß man eine frische, aktiv wachsende Kultur des Organismus erhält. Die vegetative Impfkultur wird dann In einen größeren Behälter überführt. Das für das Wachstum de: vegetativen Impfkultur verwendete Medium kann das gleiche sein, das man für die Fermentation in größerem Maßstab verwendet, wenngleich man hierzu auch andere Medien einsetzen kann.
Dei die Anbitlotikamischung A-7413 bildende Organismus kann bei Temperaturen zwischen etwa 20° C und etwa 37° C gezüchtet werden. Die optimale Bildung der Antibiotikamischung A-7413 scheint bei einer Temperatur von etwa 25 bis 30° C zu erfolgen.
Wie bei submersen, aeroben Züchtungsverfahren üblich, wird sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen.
Um ein wirksames Wachstum des Organismus zu erreichen, soll das bei der Tankzüchtung angewandte Luftvolumen vorzugsweise dazu ausreichen, die Sättigung an gelöstem Sauerstoff bei mehr als 20% zu halten.
Der Anfangs-pH-Wert des nlchtangeimpften Kulturmedium* variiert mit dem eingesetzten Medium. Im allgemeinen sollte der pH-Wert Im Bereich von 6,5 bis 7,5 liegen. Gegen Ende der Fermentation Hegt der bei der Gewinnung angewandte pH-Wert geringfügig niedriger und im Bereich von 6,0 bis 7,0.
Während der Fermentation oder der Züchtung kann man die Rtldung der Antibiotika dadurch verfolgen, daß man Proben der KuHurbrühe odei von Extrakten der Myttiitstsioffe In bezug auf Ihre antlblotlsche Wirkung untersucht. Für diesen Zweck sind Organismen geeignet, von denen bekannt lsi. daß sie auf die Antibiotika A-7413 empfindlich reagieren. Ein besonder geeigneter Nachweisorganismus ist Bacillus subtills ATCC 6633. Die biologische Analyse wird in üblicher "Welse auf Papierscheiben oder Agar-Platten durchgeführt.
Im allgemeinen läßt sich die antlblotlsche Aktivität am zweiten Fermentationstag nachweisen. Die maximale Entfaltung der antlblotischen Aktivität tritt üblicherweise zwischen dem dritten und dem zehnten Tag auf. Nach ihrer Bildung unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen können die oben beschriebenen Antlblo'lka In üblicher Welse aus dem Fermentationsmedium gewonnen werden. Die während der Züchtung erzeugten Antibiotika finden sich überwiegend in der Myzelmasse. Eine bevorzugte Methode zur Gewinnung der Antlblotlka besteht somit In der Extraktion des abgetrennten Myzels. Die Extraktion der Myzelmasse erreicht man am besten mit Methanol, obwohl man auch andere niedrigmolekulare Alkohole u:id Chloroform verwenden kann. Die Antibiotika werden mit Hilfe von Routineverfahren aus dem Extraktionslösungsmittel gewonnen, so daß man eine Mischung der Antibiotika, d. h. die Antibiotikamischung A-7413 erhält.
Die Antibiotikamischung A-7413 kann weiter gereinigt werden, und man kann die einzelnen Faktoren der Antibiotikamischung A-7430 unter Anwendung verschiedenartiger anerkannter Verfahren trennen, beispielsweise durch Extraktionsverfahren und Adsorptionsverfahren. Mit Vorteil verwendet man adsorptive Materlallen, wie Aluminiumoxid, Kieselgel, Ionenaustauscherharze, Cellulose oder verneiztes Dext'^n Beispielsweise kann man zur Trennung der Faktoren A, B, C und D eine präparative Dünnschlehtchromatographle über Kieseigel unter Verwendung einer Chloroform/Methanol-Mischung (9/1) als Lösungsmlttelsystem durchführen, wobei man jeden Faktor durc*i Elutlon mit Methanol erhält. Zur Trennung der Faktoren In großem Maßstab führt man vorzugsweise eine Säulenchfomatographie durch. Bei dieser Säulentrennung verwendet man vorzugsweise als Absorptionsmitte! Kieselgel und als Lösungsmittelsystem eine Chloroform/Methanol-Mischung (19/1). Der Faktor A, d. h. der Hauptfaktor, kann ohne weiteres mit dieser Methode abgetrennt werden. Die Reinigung der in geringerer Menge vorhandenen Faktoren B1 C und D erfordert jedoch eine anschließende Säulentrennung der angereicherten Fraktionen. Erneut verwendet man als bevorzugtes Adsorptionsmittel Kieselgel und als bevorzugtes Lösungsmittelsystem eine Chloroform/Methanc.Mlschung (19/!;.
Die eifindungsgemäßen Antibiotika sind antlmtkroblelle Mittel und besonders wirksam gegen grampositive Mikroorganismen. Die Antibiotika A-7413, Faktoren A, B und C wurden untor Anwendung der Standard-Scheiben-Untersuchungsmethode auf Ihre antlmlkroblelle Wirkung untersucht, wobei man sie In Mengen von 1 mg/ml auf Scheiben mti einem Durchmesser von 6,35 mm einsetzt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen, die als Durchmesser der beobachteten Hemmzone In Millimeter angegeben sind, sind In der folgenden Tabelle I zusammengestellt.
Tabelle I 27 03 938 20
18
19		 A-7413
Faktor C
Testorganismus A-7413 A-7413
Faktor A Faktor B		 14
16
16
Staphylokokkus
Bacillus subtilis
Sarcina lutea		 aureus 23
21
22
Wenn man das Antibiotikum A-7413 Faktor A subkutan an Mäuse injiziert, so übt es in-vivo eine antlmikroblelle Wirkung aus. Es wurden zwei Dosierungen des Antibiotikums A-7413 Faktor A an Mäuse verabreicht, die bestimmte Infektionen aufwiesen. Der hierdurch erreichte Schutz wird als EDso-Wert gemessen, d. h. die wirk same Dosis, die dazu ausreicht, 50% der Versuchstiere zu schützen [J. Bacteriol. 81 (1961) 223 bis 235]. Die mit dem Anbitiotlkum A-7413 Faktor A gegen diese Infektionen erreichten EDS0-Werte sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt:
Tabelle II
ED50-Wert*) Toxizität (mg/kg X 2) LD50
Streptokokkus pyogenes 0,42 161
Diplokokkus pneumoniae 0,39 387
Staphylokokkus aureus 31,00 4000
·) Behandlung eine und lunf Stunden nach der Infektion
20 25
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Antibiotika 1st Ihre Fähigkeit, Mikroorganismen, zu hemmen, die gegen andere Antibiotika reslstent sind. In der folgenden Tabelle III sind die Ergebnisse von Standard-Agar-Verdünnungsuntersuchungen (die unter Anwendung der ICS-Methode durchgeführt wurden) zusammengestellt, bei denen die Wirkung des Antibiotikums A-7413 Faktor A gegen verschiedene Stamms von Staphylokokkus aureus untersucht wurden. Die Ergebnisse sind als minimale Hemmkonzentration asrgegebea, bei der eine Hemmung des S. aureus-Stammes auftritt. Die bei der gleichen Untersuchung mit dem bekannten Antibiotikum Vancomycln erzielten Ergebnisse sind zu Vergleichszwecken ebenfalls angegeben.
Tabelle III Minimale Hemmkonzentration r A Vancomycin
fag/ml) 1,0
A-7413 Faktoi 1,0
S. aureus Stamm 0,125 1.0
3055 *) 0,125 1,0
3123*) 0,125 1,0
H290 *) 0,125 1,0
3074 **) 0,125 1,0
H43 **) 0,125 1,0
Hl 14**) 0,062 1,0
H541**) 0,125 1,0
3125***) 0,062 1,0
3130***) 0,062 1,0
3131***) 0,062 1,0
3132***) 0,062 0,5
3133***) 0,062 0,5
3134***) 0,062 1,0
3135***) 0,125 1.0
3136***) 0,125
3137***) 0.062
3138***)
45 50
60
65
Fortsetzung
S. aureus Stamm
Minimale Hemmkonzentration Gig/ml)
A-7413 Faktor A Vancomycin
3139 ***) 3140***)
0;125 0,125
1,0 0,5
*) spricht auf Penicillin G an
**) gegen Penicillin G resisteiu; spricht auf Methicillin an ***) resistent gegen Penicillin G und Methicillin
In der folgenden Tabelle IV sind die Ergebnisse von Agar-Verdünnungsuntersuchungen zusammengestellt, bei denen die Wirkung des Antibiotikums A-7413 Faktor A gegen verschiedene Streptokokkus-Arten untersucht wurden. Bei diesen Versuchen wurde ein Trypticase-Soja-Agar plus Blut In Form einer 10~2-Verdünnung einer über-Nacht-Kulturbrühe, in 0,3% Agar ils Impfkultur verwendet, die zu etwa 5000 Bakterien pro 7,5 mm Agaroberfläche führt. Erneut sind ium Vergleich die bei der gleichen Untersuchung mit Leucomycln erzielten Ergebnisse angegeben. Alle untersuchten Stämme sind gegen Penicillin G resistente Stämme der Gruppe D-Streptokokkus.
Tabelle IV
Minimale Hemmkonzeatration Streptokokkus sp. A-7413 Faktor A Vancomycin
238 0,25 2,0
282 0,25 2,0
9901 0,125 4,0
9913 0,25 2,0
9933 0,25 8,0
9960 0,25 4.0
12253F 0,125 2,0
Shrigley 0,125 4,0
Mitis 0,125 4,0
55992 0,125 4,0
8043 0,125 4,0
Weiterhin Ist das Antibiotikum A-7413 Faktor A wirksam gegen Nelsserla menlngltldes- Bei Agar-Verdünnungsuntersuchungen, bei denen Trypticase-Sojaagar mit 5% Kaninchenblut und 1% Isovltalex und eine 1 : 100-Verdünnung einer über Nacht gewonnenen Kulturbrühe als Impfkultur eingesetzt wurden, zeigt das Antibiotikum A-7413 Faktor A die folgenden Werte für die minimale Hemmkonzentration:
N. menlngltldes-Kultur
Minimale Hemmkonzenlratlon
Os
Sabderlln
4,0 2,0
Die erfindungsgemäßen Antibiotika sind relativ wenig toxisch. Beispielsweise liegt die akute Toxlzität des durch intraperitoneale Injektion an Mäuse verabreichten Antibiotikums A-7413 Faktor A bei mehr als 400 mg/kg.
Eine weitere wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen Antibiotika Ist Ihre Fähigkeit, die Futterverwertung von Tieren zu verbessern. Beispielsweise fördern die erfindungsgemäßen Antibiotika die Futterverwertung oder Futterausnutzung von Wiederkäuern mit einer ausgebildeten Pansenfunktion.
Es Ist bekannt, daß die Kohlenhydratverwertung bei Wiederkäuern dadurch gesteuert werden kann, daß man die Pansenflora der Tiere reizt, so daß sie statt Acetat- oder Butyratverblndungen Proplonatverblndungen bildet [bezüglich einer genaueren Diskussion sei auf Church et al. in »Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants«, Band 2 (1971), Selten 622 und 625 verwiesen].
Die Futterverwertung oder die Wirksamkeit der Futterausnutzung kann dadurch überwacht werden, daß man die Bildung und die Konzentration von Propionatverblndung im Pansen mit der In US-PS 37 94 732 (vgl. Beispiel 5) beschriebenen Methode beobachtet. In der folgenden Tabelle V sind die bei dieser Untersuchung ermittelten Verhältnisse der Konzentrationen der flüchtigen Fettsäuren In den mit dem erfindungsgemäßen Antibiotikum A-7413 Faktor A behandelten Kolben und in den Kontrollkolben angegeben.
Verhältnis der 27 03 938 l Molprozent
B u ty rat		 Gesamtmenge der
flüchtigen Fett
säuren (niMol/1)
Tabelle V Molprozent
Propionat		 0,95 1,02
1,23 0,98 1,03
Antibiotikum
A-7413
Faktor A
(μ/ml)		 1,17 0,84 1,05
10,00 1,24 behandelten Proben zu den Kontrollproben 0,94 1,04
2,00 1,05 Molprozenl
Acetat		 0,98 1,04
1,00 1,07 0,95
0,50 0,96
0,25 0,98
1,00
0,99
Die Kohlenhydratverwertung wird ferner mit in vivo-Untersuchungen bestimmt, die an Tieren durchgeführt werden, in deren Pansen eine Fistel angeordnet ist, die es ermöglicht, Proben des Panseninhalts zu entnehmen.
Das zur Untersuchung von Rindern angewandte Verfahren ist ebenfalls in der erwähnten US-PS 37 94 732 (Beispiel 7) beschrieben.
In der folgenden Tabelle VI sind die Ergebnisse dieser Untersuchung des Antibiotikums A-7413 Faktor A ingegeben, wobei die mittlere prozentuale Zunahme der Propionsäurekonzentration des Pansens als Mittelwert von sechs Analysen bei einer Behandlungsdauer von 14 Tagen aufgeführt ist.
Tabelle VI Propionsäure
konzentration (%)		 Steigerung gegen
über den
Kontrolltieren		 Relative Steigerung
gegenüber den
Kontrolltieren
Behandlung 20,8
25,4		 4,6 22,1%
Kontrolle
Antibiotikum
A-7413
Faktor A
100 mg/Tag
Bei einer ähnlichen Untersuchung an Schafen, bei der mit Fisteln versehene Hammel eingesetzt wurden, zeigt die Antibiotikamischung A-7413 ebenfalls eine gesteigerte Futterverwertung. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sine1 In der folgenden Tabelle VII angegeben.
Tabelle VII
Behandlung
Molprozent Propionat
Steigerung gegenüber den Kontrolltieren
Relative Steigerung
gegenüber den
Kontrolltieren
Kontrolle 24,0
Antibiotikamischung 26,2 A-7413
(30 mg/Tag)
2,0
8,3%
') Proben von 6 Tagen, die während der Behandlungsdauer von 17 Tagen genommen wurden
Die Antibiotikamischung A-7413 und Ihre einzelnen Faktoren führen zu einer wirksamen Steigerung der Proplonatbildung und daher zu einer verbesserten Futterverwertung, wenn sie täglich in Dosierungen von etwa 0,05 mg/kg bis etwa 10 mg/kg oral an Wiederkäuer verabreicht werden. Die besten Ergebnisse erzielt man bei einer Dosis von etwa ! mg pro kg pro Tag. Eine bevorzugte Methode zur Verabreichung besteht darin, die Wirkstoffe mit dem Tierfutter zu vermischen. Man kann den Wirkstoff jedoch auch In anderer V/else verabreichen, beispielsweise als Tablette, als Arzneimittelpräparat, als Bolus oder als Kapsel. Die Formulierung In diesen verschiedenen Dosterungsformen kann unter Anwendung bekannter veterinärpharmazeutischer Methoden erreicht werden. Jede einzelne Dosiseinheit sollte eine Wirkstoffmenge enthalten, die in direkter Beziehung steht zu einer geeigneten Tagesdosis für das zu behandelnde Tier.
Ein Beispiel der nützlichen wachstumsfördernden Wirkung der Antibiotikamischung A-7413 und Ihrer einzelnen Faktoren zeigt sich bei Geflügel. Bei Innengehegeuntersuchungen unter Verwendung von Brathähnchen, bei denen das Antibiotikum A-7413 Faktor A in einer Menge von 10 g pro Tonne des Futters dem Futter zugesetzt wird, wird eine signifikante Verbesserung der Gewichtszunahme und der Futterverwertung beobachtet. Die
11
Antibiotikamischung A-7413 und ihre einzelnen Faktoren zeigen eine typische Wirksamkeit zur Förderung des Wachstums von Geflügel, wenn die Wirkstoffe In Dosierungen von 0,5 bis 50 g pro Tonne des Tierfutters In das Futter eingearbeitet werden. Die günstigsten Ergebnisse erzielt man dann, wenn man die Wirkstoffe In einer Menge von 2,5 bis 10 g In eine Tonne des Tierfutters einarbeitet.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel i
A. Schüttelkolbenfermentatlon zur Gewinnung der Antibiotikamischung A-7413
Man bereitet eine'Kultur des Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 durch Züchten des Organismus auf einem geneigten Agar-Medlum mit den Abmessungen 18 χ 150 mm und der folgenden Zusammensetzung:
Bestandteil Menge
Saccharose 30 g
Pepton 5g
K2HPO4 ig
Mineralgemischlösung nach Czapek *) 5 ml
Agar 25 g
Entionisiertes Wasser ad 1 Liter
*) Mineralgemlschlösung nach Czapek
100 g KCl
100 g MgSO4 ■ 7H2O
2 g FeSO4 · 7H2O
Auffüllen mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter
Man Impft das geneigte Medium mit dem Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122 an und Inkubiert das angeimpfte Medium während 10 bis 14 Tagen bei 25° C. Die gerelfte Kultur bedeckt man mit Wasser und kratzt die Oberfläche mit einer sterilen Öse ab, um das Myzel zu lösen und zu zerkleinern und die Sporen aus den Sporangien freizusetzen. Man verwendet die Hälfte der erhaltenen Suspension zum Animpfen von 50 ml eines flüssigen vegetativen Mediums der folgenden Zusammensetzung:
Bestandteil
Menge
Glucose Dextrin Sojabohnenmehl Hefeextrakt CaCO, Entionisiertes Wasser
10g 20 g 25 g 2,5 g 2,5 g ad 1000 ml
Das angeimpfte vegetative Medium Inkubiert man während 72 Stunden bei 25° C In einem 250-ml-Erlenmeyerkolben, der auf einer Schütteleinrichtung befestigt 1st, die um einen Bogen mit einem Durchmesser von 5,08 cm mit einer Drehzahl von 250 min"1 In Rotation versetzt wird.
Dieses inkubierte vegetative Medium kann man direkt dazu verwenden, das vegetative Medium der zweiten Stufe anzuimpfen. Alternativ und vorzugsweise kann man das inkubierte Medium zur späteren Verwendung lagern. Indem man die Kultur in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Die Kultur wird zum Zwecke dieser Lagerung in vieie kleine Ampullen verteilt. Hierzu bringt man in jede Ampulle 2 ml des inkubierten vegetativen Mediums und 2 ml einer Glycerin-Lactose-Lösung der folgenden Zusammensetzung ein:
Bestandteil
Menge
Glycerin Lactose Entionisiertes Wasser
205b 109b 10%
Die bereiteten Suspensionen lagert man in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff.
Man verwendet 1 ml einer in dieser Weise bereiteten und gelagerten Suspension zum Animpfen von 50 ml eines vegetativen Mediums der ersten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung wie das oben beschriebene vegetative Medium besitzt. Das angeimpfte vegetative Medium der ersten Stufe Inkubiert man während 72 Stunden bei 25° C in einem 250-ml-Weithalserlenmeyerkolben, der auf einer Schütteleinrichtung befestigt ist, die bei 250 min"1 einen Bogen mit einem Durchmesser von 5,08 cm durchläuft.
B. Tankfermentation zur Gewinnung der Antibiotikamischung A-7413
Zur Bereitung eines größeren Volumens der Impfkultur verwendet man 40 ml des oben beschriebenen inkubierten vegetativen Mediums zum Animpfen von 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung besitzt wie das vegetative Medium der ersten Stufe. Dieses angeimpfte vegetative Medium der zweiten Stufe wird während etwa 48 Stunden bei 45° C In einem 2-Llter-Kolben auf einer Schüttel-. einrichtung inkubiert, die bei 250 min"' um einen Bogen von 5,08 pm bewegt wird.
Dann verwendet man 1 1 der In dieser Welse gebildeten vegetativen Impfkultur der zweiten Stufe zum Animpfen von 1001 eines sterilen Produktionsmediums der folgenden Zusammensetzung:
Bestandteil Menge
Sojabohnenmehl 35 g
Maisöl 40 g
MgSO4 · 7H2O 2 g
CaCO3 2 g
FeCl2 · 4H2O 0,06 g
Entionisiertes Wasser ad 1 1
Nach dem Sterilisieren durch Erhitzen während 30 Minuten auf 120° C beträgt der pH-Wert des Mediums 7,0. Man läßt das angeimpfte Produktionsmedium, das In einem Fermentationstank mit einem Fassungsvermögen von 1651 vorliegt, während etwa 7 Tagen bei einer Temperatur von 250C gären. Man belüftet das Fermentationsmedium mit steriler Luft In einer Menge von etwa 0,5 bis 1,0 Volumen Luft pro Volumen des Kulturmediums pro Minute. Man rührt das Medium mit üblichen Rührern, die bei 250 min"1 betrieben werden.
Beispiel 2
Man bereitet die Antibiotikamischung A-7413 nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrenswelse, wozu man jedoch ein geneigtes Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung dazu verwendet, die Sporen oder das Myzel für die Anfangsimpfkultur zu bilden:
Bestandteil Menge
Na2S2O3 0,5 g
Hefeextrakt 2,0 g
CaCO3 3,0 g
Gemüsesaft 200 ml
Entionisiertes Wasser 800 ml
Durch Zugabe von verdünnter Natriumhydroxidlösung stellt man den pH-Wert auf 7,2 ein. -to
Beispiel 3
Man bereitet die Antibiotikamischung A-7413 nach der Verfahrenswelse des Beispiels 1, wobei man jedoch ein vegetatives Medium und ein vegetatives Medium der zweiten Stufe der folgenden Zusammensetzung verwendet:
50 55
Abtrennung der Antibiotikamischung A-7413
Man stellt die gemäß Beispiel 1 hergestellte gesamte Fermentationsbrühe (2001) durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure sauer (auf einen pH-Wert von 3,5). Die gerührte angesäuerte Brühe filtriert man unter Verwendung einer Diatomeenerde als Filterhilfsmittel. Dann setzt man 100 1 Methanol zu dem abgetrennten Myzelkuchen zu und rührt die gebildete Methanolsuspension während 30 Minuten, worauf man sie filtriert. Man versetzt den abgetrennten Myzelkuchen erneut mit 1001 Methanol, rührt während 30 Minuten und filtriert wieder. Die beiden Methanolextrakte engt man Im Vakuum ein, so daß man nach der Entfernung des Methanols 10,5 1 eines wäßrigen Konzentrats erhält. Dieses wäßrige Konzentrat kühlt man während 24 Stunden auf
Bestandteil Beispiel 4 Menge
Glucose 10,0 g
Dextrin 20,0 g
Sojabohnenmehl 15,0 g
Hefeextrakt 2,5 g
Sojabohnenöl (raffiniert) 5.0 g
CaCO, 2.5 g
Entionlsleirtes Wasser ad 1 1
S° C. Die dabei gebildete ölige obere Schicht wird abgetrennt und verworfen. Die untere wäßrige Schicht (2 1) stellt man durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,3 ein. Man extrahiert die gebildete Lösung zweimal mit der Hälfte des Volumens einer Chloroform/Methanol-Mischung (4/1). Diese beiden Extrakte vereinigt man und dampft sie im Vakuum zur Trockne ein. Den In dieser Welse erhaltenen Rückstand löst man In 150 ml Chloroform und gibt diese Lösung zu 1500 ml n-Pentan. Den gebildeten Nleder-
a schlag zentrifugiert man ab und trocknet ihn Im Vakuum, wobei man 15,8 g der Antibiotikamischung A-7413 In
I Form eines braunen Pulvers erhält.
I Beispiel 5
Isolierung der Faktoren aus der Anbltlotlkamischung A-7413
Man löst 26,4 g der gemäß Beispiel 4 erhaltenen Antibiotikamischung A-7413 In 200 ml einer Chloroform/Methanol-Lösung (19/1). Man trägt die erhaltene Lösung auf eine mit Kiesdgel (Qualität 62, mit 5% Wasser äqulllbrlert) beschickte Säule (5,8 χ 94,0 cm) auf, die man mit einer Chioroform/Methanol-Mlschung (19/1) bereitet hat. Man entwickelt unter Verwendung einer Chioroform/Methanol-Mlschung (19/1), wobei man 150 ml-Fraktionen auffängt. Man überwacht die Elutlon der Säule durch Bewerten der Wirkung der Fraktionen gegen Staphylokokkus aureus. Bacillus subtllls und Sarclna lutea und durch dünnschlchtchromatographlsche Bloautographie unter Verwendung von S. lutea als Nachweisorganismus. Man vereinigt die Fraktionen entsprechend dem Faktorgehalt und der nachgewiesenen Aktivität. Die vereinigten Fraktionen dampft man im Vakuum zur Trockne ein. Jeden der in dieser Weise erhaltenen Rückstände löst man in 50 ml Chloroform und versetzt jede Chloroformlösung mit 500 ml n-Pentan, um den gewünschten Faktor auszufällen. Die Ergebnisse der Säulenfraktlonlerung sind die folgenden:
Die unreinen Faktoren werden einer weiteren Chromatographie über Kieselgelsäulen unter Anwendung der obigen Verfahrenswelse unterzogen, so daß man die gereinigten Faktoren B und C und eine zusätzliche Menge des gereinigten Faktors A erhält.
Beispiel 6
40
Kristallisation des Antibiotikums A-7413 Faktor A
Man löst 1 g des gemäß Beispiel 1 erhaltenen gereinigten Faktors A In 10 ml Chloroform. Dann gibt man
10 ml absolutes Äthanol (das 0,5% Benzol enthält) zu. Man läßt die erhaltene Lösung während 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen und kühlt sie dann über Nacht auf 5° C ab. Die gebildeten Kristalle werden abzentrifuglert, mit Äthanol gewaschen und getrocknet, wobei man 513 mg des kristallinen Antibiotikums A-7413 Faktor
A erhält.
Das Antibiotikum A-7413 Faktor A kristallisiert in ähnlicher Weise bei Verwendung der folgenden Lösungsmittelmischungen:
50
Chloroform/sec.-Butanol Chloroform/n-Propanol Chloroform/lsopropylalkohol Dlmethylformamid/Aceton 55 Aceton/Äthanol
Wäßriges Äthanol
Versuchsbericht
ω Es wurden Vergleichsversuche durchgeführt, bei denen die Wirkung der erfindungsgemäßen Antibiotikamischung A-7413 auf die Wachstumsförderung von Geflügel Im Vergleich zu dem anerkannt gut wirksamen Vergleichsprodukt Tylosin untersucht wurde.
Im einzelnen wurde dabei wie folgt vorgegangen.
65 1. Materlallen und Methoden
Die Wirksamkeit von vier Antibiotika bezüglich der Wachstumsförderung von Brathähnchen wurde in einer Reihe von drei, Zelt-wiederholten Freigehegeuntersuchungen während 56 Tagen bewertet. Es wurden 4000 Brat-
14
Erhaltener Fraktionen Ausbeute Ungefähre
Faktor Reinheit
A 18-23 10,153 g rein
A 24-30 597,6 mg 60%
B 31-43 278,8 mg 80%
C 49-56 218,4 mg 60%
hähnchen (Vantress X Arbor Acres 70) verwendet. Die Untersuchungen erfolgten In 2,43 m χ 4,57 m-Bodengehegen, wobei zu Beginn der Untersuchungen jeweils 100 Vögel pro Gehege eingesetzt wurden, was einer Bodenfläche von etwa 0,11 m2 pro Vogel entspricht. Bei der Untersuchung CK-757 wurden 20 Vogelgehege angewandt, während bei den Untersuchungen CK-766 und CK-774 jeweils 10 Gehege angewandt wurden. Bei sämtlichen Untersuchungen wurden Futter und Wasser ad libitum verabreicht. Es svurden In sämtlichen Gehegen 3,8-l-TrUnkelnrlchtungen verwendet, bis die Vögel so weit gewachsen waren, daß sie aus den automatischen Wassertrögen trinken konnten. Das Futter wurde während der ersten 7 Tage In Hühnerfütterungsanlagen angeboten, wonach ausreichend viele Hängefüttereinrichtungen vorgesehen wurden, um 4,9 cm Fütterungselnrlchtungsraum pro Vogel bereitzustellen. Die Raumtemperatur wurde bei 24 ± 8° C gehalten, wobei jedes Gehege während der ersten 4 Wochen durch thermostatisch gesteuerte, gasbeheizte Infrarotheizeinrichtungen geheizt wurde. Die Ventilation erfolgte mit Hilfe von zeitgesteuerten Überkopf-Absaugegebläse mit einer Gesamtleistung von 780 mJ/mln. Während der Untersuchungen erfolgte die Beleuchtung während 23 Stunden pro Tag. Eine Hälfte der gewünschten Anzahl der Küken pro Gehege wurde dadurch ausgewählt, daß einer oder zwei Vögel aus jedem Bereich einer jeden Transportkiste entnommen wurden. Die Vögel wurden dann gruppenweise gewogen und in das entsprechende Gehege überführt. Dieses Vorgehen wurde dann für jedes Gehege wiederholt.
Während der ersten 4 Wochen wurde ein Brathähncher.-Startfutter [CK-12 (1.08), Tabelle VIII] als Grundfutter verabreicht, während im Verlaufe der letzten 4 Wochen ein Brathähnchen-Endfutter [CK-21 (1.04), Tabelle IX] verabreicht wurde. Die Vögel wurden anfänglich, dann nach 28 und 49 Untersuchungstagen und schließlich am Ende der 56tägigen Untersuchung gruppenweise gewogen. Der Futterverbrauch wurde nach 28, 49 und 56 Untersuchungstagen bestimmt. Die Futterverwertungsdaten wurden berechnet, nachdem eine entsprechende Berücksichtigung der Gesamtgewichtszunahme durch Mortalitäten durchgeführt wurden. Die Daten sämtlicher drei Untersuchungen wurden zur statistischen Analyse gesammelt. Die Behandlungsunterschiede wurden mit Hilfe des Duncan Multiple Range Tests ausgewertet.
Es wurden die folgenden Behandlungen durchgeführt:
1. Kontrolle
2. Tylosln in einer Menge von 10 g/t und
3. A-7413 (erfindungsgemäße Antibiotikamischung) In einer Menge von 10 g/t.
Sämtlichen Futtern wurde Monenslnnatrium in einer Menge von 110 g/t (MIlO) zugesetzt. Jede Behandlung wurde achtmal wiederholt (vier Wiederholungen bei der Untersuchung CK-757 und jeweils zwei Wiederholungen bei der Untersuchung CK-766 und der Untersuchung CK-774), wobei vier Wiederholungen pro Geschlecht durchgeführt wurden.
2. Ergebnisse und Diskussion
Die Wirkungen der verschiedenen Behandlungen auf die bei den einzelnen Untersuchungen erzielten Wachstumsleistungen während der Perioden vom 1. bis zum 28. Tag, vom 1. bis zum 49. Tag und vom 1. bis zum 56. Tag sind in den Tabellen 3, 4 und 5 angegeben. In der Tabelle 6 sind die Mittelwerte der Behandlungen der kombinierten Daten der drei Untersuchungen während der oben angegebenen Zeitdauern zusammengestellt. Zur Berechnung der statistischen Signifikanz wurden die mittleren Fehlerquadrate bei der Varianzanalyse dieser Daten angewandt, sind jedoch nicht dargestellt.
a) Vergleich der Gewichtszunahme
Wenn man die Daten sämtlicher drei Untersuchungen kombiniert, so ist festzuhalten, daß die mit der Antibiotikamischung A-7413 behandelten Küken am 28. Tag, am 49. Tag und am 56. Tag eine stärkere Gewichtszunahme zeigten als die Kontrollkülen oder die mit Tylosln behandelten. Die mit Tylosin behandelten Küken zeigten eine etwas geringere Gewichtszunahme als die Kontrollküken. Die Mittelwerte waren nicht signifikant unterschiedlich.
b) Fuiterverbrauch
Wenn man die Werte sämtlicher drei Untersuchungen vereinigt, so ist festzuhalten, daß die mit der erfindungsgemäßen Antibiotikamischung A-7413 und die mit Tylosin behandelten Küken zum 28. Tag, zum 49. Tag bzw. zum 56. Tag eine geringere Futtermenge verbrauchten als die Kontroll küken. Die mit der erfindungsgemäßen Antibiotikamischung A-7413 versorgten Kühe verbrauchten weniger Futter als die mit Tylosin behandelten Küken am 49. und am 50. Tag, jedoch etwas mehr am 28. Tag. Die Mittelwerte sind nicht signifikant unterschiedlich. ■
c) Futtermenge pro Gramm Gewichtszunahme
Wenn man die Daten sämtlicher drei Untersuchungen vereinigt, so Ist festzuhalten, daß die mit entweder der erfindungsgemäßen Antibiotikamischung A-7413 oder der Vergleichssubstanz Tylosin behandelten Küken am 28. Tag, am 49. Tag und am 56. Tag eine geringere Futtermenge pro Gramm Gewichtszunahme aufnahmen. Dabei zeigten in sämtlichen drei Fällen die mit der erfindungsgemäßer. Antibiotikamischung A-7413 behandelten Küken eine geringere Futterzunahme pro Gramm Gewichtszunahme als die mit Tylosln behandelten. Am
49. und am 56. Tag unterscheidet sich die Futtermenge pro Gewichtszunahme pro Gramm der mit der erfindungsgemäßen Antiblotikamljchung A-7413 behandelten Küken In statistisch signifikanter Welse (P < 0,05) von der der Kontrollküksn oder der jener Küken, die mit Tylosin behandelt worden sind.
d) Mortalität
Die für sämtliche drei Untersuchungen kombinierte Mortalität der Küken, die mit der erfindungsgemäßen
Antibiotikamischung A-7413 oder mit Tylosin behandelt wurden, war geringer als die der Kontrollküken am 28., am 49. und am 56. Tag. Die Mortalität der mit der erfindungsgemäßen Antibiotikamischung A-7413 behan-
IO delten Küken war am 56. Tag geringer als jene der Küken, die mit Tylosin behandelt worden sind, war jedoch höher am 28. und am 49. Tag. Die Mittelwerte waren statistisch nicht signifikant unterschiedlich.
Bei den mit der erfindungsgemäßen Antibiotikamischung A-7413 behandelten Küken war 2,1% weniger Futter erforderlich im Vergleich zu den mit Tylosin behandelten Küken oder den Kontrollküken. Die Antibiotikamischung A-7413 steigert die Überlebensrate im Vergleich zu den Kontrollküken um 0,6% und im Vergleich 15 zu den mit Tylosin behandelten Kükdi. um 0,25%.
e) Schlußbetrachtung
Das mit der erfindungsgemäßen Antibiotikamischung A-7413 versetzte Futter zeigte sich dem mit Tylosin versetzten Futter oder dem Kontrollfutter in der Futterwirksamkeit (Einheitsgewichtszunahme pro Einheitsgewicht des Futters) bei der Aufzucht von Küken am 49. und am 56. Tag signlflksnt überlegen.
Tabelle VIII
CK-12 Brathähnchen-Startfutter
Bestandteile
Prozent
Gemahlener gelber Mals Sojabohnenmehl, mit Lösungsmittel extrahiert, von Hülsen befreit (50%) Tierisches Fett (Rindertalg) Fischmehl mit löslichen Anteilen (60%) Getrocknete !osliche Malsdestlllatlonsrückstände Dicalciumphosphat, Futterqualität Calcittmcarbonat (gemahlener Kalkstein) Vitaminmlschung TK-Ol (1,03)') Salz (NaCl) Spureiielementmischung TK-Ol (1,02)2) Methlonlnhydroxy-analoge Verbindung
Summe
50,1 30,9 ■ 6,5 5,0 4,0 1,8 0,8 0,5 0,2 0,1 0,1
100,0
') Die Vitaminmischung ergibt 3000 IE Vitamin A, 900 ICE Vitamin Dj, 40 mg Vitamin E, 0,7 mg Vitamin K, 1000 mg Cholln, 70 mg Nlacln, 4 mg Pantothensäure, 4 mg Riboflavin, 0,10 mg Vitamin Bu, 0,10 mg Biotin und 125 mg Elhoxyquln pie kg des fertigen Futters.
"1 Die Spurenelementmischung ergibt 75 mg Mangan, 50 mg Zink, 25 mg Elsen und 1 mg Jod pro kg des fertigen Futters.
Berechnete Anslysenwerte
Protein, % 23,99
Energlelnhalt, kcal/kg 3145,10
ME/P-Verhältnls 131,10
Fett, % 9,06
Faser, % 2,59
Asche, % 6,43
Calcium, % 1,03
Phosphor, % 0,85
Mangan, mg/kg 90,27
Elsen mg/kg 116,83
Kupfer, mg/kg 16,80
Zink, mg/kg 84,99
Jod, mg/kg 1,00
Magnesium, % 0,19
K.allum, % 0,88
Natrium, % 0,20
Selen, mg/kg 0,15
Vitamin A, IE/kg ') 4000
Vitamin D3, ICE/kg 900
Vitamin E. mg/kg2) 40
Vitamin K, mg/kg !) 0,70
16
Cholin, mg/kg 2450,84 (6,82)3)
Nlacln, mg/kg 96,03 (5,69)
Pantothensäure, mg/kg 12,28 (5,16)
Riboflavin, mg/kg 6,18 (2,21)
Vitamin Bi2, mg/kg 0,10 (1,50)
Biotin, mg/kg 0,29 (1,35)
Arginin, S 1,64
Lysin, % 1,37
Glycin, % 1,24
Methionin, % 0,53
Cystin, % 0,36
Tryptophan, % 0,32
Linolsäure, % 1,19
10 B
') 3000 ΙΕ/kg aus der Vitaminmischung und mindestens 1000 ΙΕ/kg Futter aus anderen Futterbestandteilen. 15
) Aus der Vitaminmischung zugeführt; der Gehalt anderer Futterbestandteile ist nicht eingeschlossen.
3) Die in Klammern gestellten Werte stehen für die Aminosäuremenge als Prozentsatz des Futterproteins.
Tabelle IX
CK-2I Brathähnchen-Endfutter _*__
Bestandteile I ai?rozenl
Gemahlener gelber Mals 56,1
Sojabohnenmehl, mit Lösungsmittel extrahiert, von Hülsen befreit (50ib) 26,3 25
Fischmehl mit löslichen Anteilen. (60%) 5,0
Getrocknete lösliche Rückstände der Malsdestlllatlon 4,0
Alfalfamehl, entwässert (17%) 1,5
Tierisches Fett (Rindertalg) 6,5
Dicalciumphosphat, Futterqualität 2,0 -io
Calciumcarbonat (gemahlener Kalkstein) 0,6
Vitaminmischung TK-Ol (1,03)') 0,5
Methlonlnhydroxy-analoge Verbindung 0,2
Salz (NaCl) 0,2
Spurenelementmischung TK-01 (1,01)2) 0,1 35
Summe !00,0
') Die Vitaminmischung ergibt 3000 IE Vitamin A, 900 ICE Vitamin D1, 40 mg Vitamin E. 0.7 mg Vitamin K, 1000 mg |
Cholin, 70 mg Nlacln, 4 mg Pantothensäure, 4 mg Riboflavin. 0,1 mg Vitamin Bu, 0.1 mg Biotin und 125 mg Etlioxyquin |
pro kg des fertigen Futters. 40
2) Die Spurenelementmischung ergibt 75 mg Mangan, 50 mg Zink, 25 mg Elsen und 1 mg Jod pro kg des fertigen Putters.
Berechnete Analysenwerte
45
50
S t
Protein, % 20,99
Energlelnhalt, kcal/kg 3192,80
ME/P-Verhältnls 152.10
Fett, % 9,29
Faser, % 2,59
Asche, % 6,31
Cacllum, % 1,00
Phosphor, % 0,86
Mangan, mg/kg 88,87
Elsen, mg/kg 118,02
Kupfer, mg/kg 14,40
Zink, mg/kg 81.38
Jod. mg/kg 1,00
Magnesium, % 0.18
Kalium, % 0.79
Natrium, % 0,18
Selen, mg/kg 0,16
Vitamin A, IE/kg') 4000
Vitamin Dj, ICE/kg 900
Vitamin E, mg/kg !) 40
Vitamin K, mg/kg2) 0,70
Cholin, mg/kg 2264,88
Nlacln, mg/kg 92,17
Pantothensäure, mg/kg 12,06
65 m
27 03 938
Riboflavin, mg/kg 6,20
Vitamin B!2, mg/kg 0,10
Biotin, mg/kg 0,28
Arginin, % 1,39 (6,62)J)
Lysin. % 1,15 (5,47)
Glycin, % 1,07 (5,08)
Methionin, % 0,59 (2,82)
Cystin, % 0,32 (1,50)
Tryptophan, t 0,28 (1,32)
Llnolsäure, % 1,28
') 3000 IE/kg aus der Vitaminmischung und mindestens 1000 IE/kg Futter aus anderen Futterbestandteilen. 2) Aus der Vitaminmischung zugeführt; der Gehalt anderer Futterbestandtelle Ist nicht eingeschlossen. ') Die In Klammern gestellten Werte stehen für die Aminosäuremenge als Prozentsatz des Futterproteins.
Die bei obigen Versuchen erhaltenen Ergebnisse sind In den folgenden Tabellen X bis XIII zusammengestellt.
Alle Tiere waren zu Beginn der Untersuchung 1 Tag alt. Die Untersuchungsdauer betrug durchweg 56 Tage.
Ef wurde jeweils mit 100 Tieien pro Gehege gearbeitet, wobei bei Tabelle X vier Gehege (jeweils zwei mit männlichen und zwei mit weiblichen Tieren), bei Tabelle Xi und Tabelle XII zwei Gehege (jeweils eines mit
20 männlichen und eines mit weiblichen Tieren) und bei Tabelle XIII acht Gehege (jeweils vier mit männlichen
-und vier mit weiblichen Tieren) verwendet Wurden.
DIeMn diesen Tabellen gegebenenfalls enthaltenen Indizes haben folgende Bedeutung:
') Monenslnnatrium wurde In einer Konzentralion von 110 g/t zu sämtlichen Futtern zugesetzt 25 2) Alle Werte stellen Mittelwerte bezüglich der einzelnen Geschlechter dar
a), b) Die Mittelwerte mit gleichen Indizes unterscheiden sich nicht signifikant (P < 0,05) bei dem Duncan Multiple Range Test
18
Tabelle X
Beeinflussung des Wachstums von Brathähnchen durch Antibiotikazugabe CK-757
Behand Menge Geschlecht 1 bis 28 Tage Futter F/G Morta 1 bis 49 Tage Futter F/G Morta ., 1 bis 56 Tage Futter F/G Morta- KJ
lung mit (g/t) Gew.-Zu- menge, lität Gew.-Zu- menge, lität 3,50 Gew.-Zu- menge, lilüt -J
nahme. g % nahme. g % 1,00 nahme, g % O
f »
g g g
Kon 1014 1,472 3,50 3264 1,876 2,25») 4244 2,008 5,00 VO
OJ
trolle 1 0 M 689 924 1,532 1,00 1740 2826 1,968 2,00 2114 3637 2,120 1,00 OO
W 602 1436 0,50 1716
Durchschnittswert 969"» 1,502"' 2,25"» 3045»' 1,922=) 3940»' 2,064«) 3,00">
der Behandlung 646"» 1023 1,504 1,50 1588"» 3270 1,861 1,25») 1915"> 4225 2,009 2,50
Tylosin 10 M 680 904 1,521 0,50 1757 2784 1,942 1,00 2102 3574 2,079 0,50
W 594 1434 1,00 1719
Durchschnittswert 964") 1,513"» 1,00"» 3026») l,901b"' 3899») 2,044b») 1,50»)
der Behandlung 637"» 1006 1,463 0,50 1595"' 3237 1,832 1,00"» 1911») 4198 1,954 1,00
A-7413 10 M 688 898 1,516 0,50 1767 2763 1,933 2148 3610 2,084 1,00
W 592 1430 1732
Durchschnittswert 952"' 1,490"» 0,50"' 3000»' l,882h> 3904»' 2,0l9b> 1,00")
der Behandlung 640"' 1598"' 1940»)
Tabelle XI
Beeinflussung des Wachstums von Brathähnchen durch Antibiotikazugabe CK-766
Behandlung mit
Menge
(g/l)
Geschlecht
1 bis 28 Tage
Gew.-Zu- Futternahme, menge, g g
1 bis 49 Tage
F/G Morta- Gew.-Zu- Futter-
lität nähme, menge,
% g g
1 bis 5(i Tage
F/G Morta- Gew.-Zu- Futter-
lität nähme, menge,
o/o g g
F/G
Kontrolle 1
Tylosin
A-7413
M
W
Durchschnittswert
der Behandlung
M
Durchschnittswert
der Behandlung
M
Durchschnittswert
der Behandlung
668
577
622
689 604
646»)
701
587
644»)
1051 879
965») 1013 914
964») 1069 881
1,574 1,524
1,549")
1,470
1,515
1,492»)
1,524 1,501
975") 1,512») l,50a»
1741 1404
1572»»
1692
1408
1550»)
1786 1420
1603»)
1,921
1,964
1,942»)
1,931
2,002
1,966»)
1,873
1,880
0,G0
1,00
0,50»'
3,03
1,00
2,02«)
0,00
3,00
3008») 1,876») 1,50»)
2082
1682
1882")
2050
1673
1862»»
2136
1689
1912»)
4253
3509
3881a>
4178
3581
3880»)
4240
3376
3808»)
2,043 2,087
2,065»)
2,038 2,140
2,089">
1,985 2,000
Mortalität
0,00 1,00
0,50»)
4,04
2,00
3,02»)
0,00
3,00
1,992») 1,50
Tabelle XII
Beeinflussung des Wachstums von Brathähnchen durch Antibiotikazugabe CK-774
Behänd- Menge Geschlecht 1 bis 28 Tage
lung mit (g/t) Gew.-Zu- Futter-
nahmi3, menge,
g g
1 bis 49 Tage
F/G Morta- Gew.-Zu- Futter-
lität nähme, menge.
% g g
1 bis 56 Tage
F/G Morta- Gew.-Zu- Futter-
lität nähme, menge,
% g g
F/G
Mortalität
Kontrolle 1
Ty losin
M
W
Durchschnittswert
der Behandlung
M
Durchschnittswert
der Behandlung
M
Durchschnittswert
der Behandlung
62!
553
587")
616
539
578"'
634
558
596"»
950
859
930
852
891")
977
853
915"»
1,531
1,555
1,543")
1,511
1,582
1,546"»
1,542
1,529
1,00 0,00
0,50"»
1,00 0,00
0,50"»
2,00 2,00
1,536"» 2,00"»
1544 1260
1402"»
1521
1236
1378"»
1520
1269
1394"»
2,00
0,00
1,00"'
1,00
0,00
0,50")
2,00
2,00
1,852"» 2,00"'
1895
1509
1702")
1863
1474
1668")
1846
1526
1686")
3609 3003
3306»)
3522 2985
3254"»
3542 2989
1,905 1,990
1,948"»
1,890
2,025
1,958"»
1,919 1,959
3,00 0,00
1,50"»
1,00
0,00
0,50")
2,00 2,00
3266») 1,939") 2,00")
Tabelle XIlI
Beeinnussung des Wachstums von Bfatfiätincrien durch Antibiötifcazugabe CK-757, CK-7W und CK-774
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
Behand Menge Geschlecht 1 bis 215 Tage Futter F/G Morta 1 bis 49 Tage Futter F/G Morta 1 bis 56 Tage Futter F/G Morta >
I		 O
f 1 1		 !
lung mit (g/t) Gew.-2;u- menge, lität Gew.-Zu- menge, lität Gew.-5Lu- menge, lität
nahme, g % nahme, g % nahme, g % Vu
g g g OO
Kon 1008 1,512 2,00 3168 1,871 2,25 4087 1,991 3,25
trolle 1 0 M 687' 896 1,536 0,75 1691 2702 1,950 0,75 2051 3446 2,079»' 0,75 j
W 584 1384 1656
Durchschnittswert 952») 1,524«) l,38a> 2935") 1,911») 1,50») 3767") 2,035»> 2,00»)
der Behandlung 625»») 997 1,498 1,25 1538») 3138 1,864 2,01 1853») 4038 1,986 2,51
Tylosin 10 M 666 894 1,535 0,50 1682 2690 1,951 0,50 2030 3428 2,081 0,75
W 583 1378 1646
Durchschnittswert 945") 1,516"» 0,88»> 2914») 1,908"· 1,25») 3733°) 2,034") 1,63»)
der Behandlung 624») 1015 1,498 0,75 1530»' 3152 1,843 1,00 1838a>' 4044 1,953 1,00
A-7413 10 M 678 882 1,516 1,50 1710 2642 1,904 1,75 2070 3396 2,032 1,75
W 582 1387 1670
Durchschnittswert 948») 1,507») l,12»> 2897»' 1,873 1,38») 3720») 1,992 1,38»)
der Behandlung 630") 1548») 1870^

Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    kristallines Material, das In Methanol, Chloroform, Dimethylformamid, Dlchloräthan und Dimethylsulfoxid löslich. In Äthanol und wäßrigem Äthanl schwach löslich und In Aceton, Benzol, Tetrachlorkohlen-
    10 stoff, Dichlormethan, Methyllsobutylketon, Äthylacetat, Dläthyläther und Wasser unlöslich ist, bei etwa
    B) gemäß der Elementaranalyse etwa 51,92% Kohlenstoff, 5,259b Wasserstoff, 9,85Sb Stickstoff, 22,63s, Sauerstoff und 9,66« Schwefel enthält,
    C) die Summenformel C72HSiN12O23S5 aufweist,
    D) einen spezifischen Drehwert [«$ von + 54,5° (c = 2,0 In CHCl1) besitzt,
    E) ein Infrarotabsorptionsspektrum, gemessen in einem KBr-Preßling, mit den folgenden Absorptionsmaxima besitzt:
    20 2,93 (Schulter), 2,98 (mittel), 3,24 (schwach), 3,38 (Schulter), 3,44 (mittel), 3,53 (schwach), 5,78
    (schwach), 6,03 (stark), 6,56 (stark), 6,79 (mittel), 7,08 (mittel), 7,27 (schwach), 7,49 (schwach), 7,65 (schwach), 8,08 (mittel), 8,41 (schwach), 8,62 (schwach), 8,81 (mittel), 9,03 (schwach), 9,35 (mittel), 9,60 (mittel), 9,92 (schwach), 10,20 (schwach), 12,05 (schwach), 12,66 (schwach) und 13,51 μπι (schwach),
    F) ein Ultravlolettabsorptlonsspektrum mit den folgenden Absorptlonsmaxima aufweist:
    a) In neutralem, 85prozentlgem wäßrigem Äthanol: 215 nm (E^m = 485); 260 nm (Schulter; E^n, = 240); 300 nm (Schulter; E^m = 170); 358 nm (Schulter; Eftra = 112,5);
    b) In saurem Äthanol:
    217 nm (Ej^m = 440); 265 nm (E^m = 227,5); 293 nm (Ei^n = 210); 358 nm (h\\m = 95);
    c) In basischem Methanol:
    278 nm (Schulter; E\\m = 255); 408 nm (E^m = 80);
    G) eine titrierbare Gruppe mit einem ρΛΓ,,-Wert von 7,9 in 80prozentigem wäßrigem Dimethylformamid 40 besitzt,
    H) dessen Aminosäureanalyse nach der sauren Hydrolyse die Anwesenheit von Ammoniak, Glycin,
    Threonin, Asparaginsäure und einer noch nicht Identifizierten Aminosäure erkennen läßt,
    I) ein charakteristisches Röntgen-Pulverbeugungsdlagramm (Cu^-Strahlung, 1,54505 lambda, Nickelfilter) mit den folgenden Netzebenenabständen d In Angström besitzt:
    Relative Intensität
    12,44 100
    10,77 70
    7,96 100
    5,71 50
    5,09 80
    4,53 100
    4,25 80
    3,88 80
    3,61 10
    3,44 10
    3.03 5
    J) die folgenden /?rWerte bei der Parplerchromatographle mit den Im folgenden angegebenen Werten unter Verwendung von Bacillus subtills ATCC 6633 als Nachweisorganismus besitzt:
    /{/■-Wert Lösungsmltlelsystem
    -1
    0,57 mit Wasser gesättigtes Butanol
    0,49 Methyllsobutylketon/Butanol/Wasser-Mlschung (25/21/4)
    0,62 Methanol/Wasser-Mlschung (1 /1)
    Fortsetzung
    Äy^Wert Lösungsmittelsystem
    0,30 Wasser/Methanol/Aceton-Mischung (12/3/1) mit NH4/OH auf einen pH-Wert
    von 10,5 eingestellt und dann mit H3PO4 auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht 5
    0,71 Methano!/0,l 11-HCl-Mischung (3/1)
    K) die folgenden ÄrWen;. bei der Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung der im folgenden angegebenen Systeme unter Verwendung von Bacillus subtills als Nachweisorganismus besitzt: 10
    R/Wen Lösungsmittelsystetn
    0,26 Chloroform/Methanol-Mischung (9/1)
    0,23 Acetonitril/Wasser-Mischung (9/1) 15
    L) eine Säurefunktion aufweist, die die Bildung von Salzen und Esterderivaten ermöglicht,
    M) mindestens eine Hydroxylgruppe aufweist, die zur Veresterung geeignet ist, und
    N) die Fähigkeit besitzt, mit Thiolcarbonsäuren Derivate zu bilden; 2) das Antibiotikum A-7413 Faktor B, ein weißes bis hellgelbes amorphes Material, das bei einer Tempera- 20 tür von mehr als 3000C schmilzt und das in Methanol, Chloroform, Dimethylformamid, Dichloräthan 'und Dimethylsulfoxid löslich, in Äthanol und wäßrigem Äthanol schwach löslich und in Aceton, ,Benzol, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlormethan, Methylisobutylketon, Älhylacetat, Dläthyläther und
    Wasser unlöslich ist, und
    A) bei der Elementaranalyse etwa folgende Zusammensetzung zeigt: 66,34% Kohlenstoff, 8,73% 25 Wasserstoff, 2,98% Stickstoff, 19,39% Sauerstoff und 2,83% Schwefel,
    B) einen spezifischen Drehwert [<z$T von - 26,2° (c = 7,5, Dimethylsulfoxid) aufweist,
    C) ein In einem KBr-Preßling aufgenommenes Infrarot-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorptlonsmaxlma besitzt:
    2,97 (stark), 3,38 (stark), 3,42 (stark), 3,50 (stark), 5,78 (Schulter), 5,99 (mittel), 6,50 (mittel), 6,80 ^o (mittel), 6,90 (Schulter), 7,00 (Schulter), 7,22 (mittel), 7,27 (Schulter), 7,42 (schwach), 7,58 (schwach), 7,78 (Schulter), 7,97 (miuel), 8,33 (Schulter), 8,53 (mittel), 9,00 (Schulter), 9,26 (stark), 9,71 (stark), 11,11 (schwach), 11,79 (schwach), 12,35 (schwach) und 13,25 \im (schwach),
    D) ein Ullravlolett-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorptionsmaxlma besitzt:
    a) in neutralem, 95prozentlgem wäßrigem Äthanol: 35 268 nm (Ei*™ = 104,3);
    357 nm (Schulter; EJ^n, = 30);
    b) In saurem Äthanol: 268 nm (E\\m = 108,5);
    357 nm (Schulter; EJ% cm = 35); 40
    c) In basischem Äthanol:
    268 nm (Schulter; Eun, = 178,6)
    E) eine Aminosäureanalyse nach der sauren Hydrolyse besitzt, die die Anwesenheit von Ammoniak, Glycin, Threonin, Asparaginsäure und einer noch nicht Identifizierten Aminosäure anzeigt,
    F) bei Anwendung der im folgenden angegebenen paplerchromatographischen Systeme unter der 45 Verwendung von Bacillus subtills ATCC 6633 als Nachweisorganismus die folgenden Λ,-Werte besitzt:
    Λ,.-Wert Lösungsmittelsystem
    0,46 mit Wasser gesättigtes Butanol
    0,33 Methyllsobutylketon/Butanol/Wasser-Mischung (25/21/4)
    0,58 Methanol/Wasser-Mischung (1/1)
    0.26 Wasser/Methanol/Aceton-Mischung (12/3/1), mit NH4OH auf einen pH-
    Wert von 10,5 eingestellt und dann mit H3PO4 auf einen pH-Wert von 7,5 55
    gebracht
    0,71 Methanol/0.1 n-HCl-Mischung (3/1)
    G) bei Anwendung der Im folgenden angegebenen Kleselgel-Dünnschlchtchromatographiesysteme und
    bei Verwendung von Bacillus subtills als Nachweisorganismus die folgenden Λ^-Werte besitzt: 60
    #rWert Lösungsmittelsystem
    0,09 Chloroform/Methanol-Mischung (9/1)
    0,03 Acetonitril/Wasser-Mischung (9/1) 65
    H) eine Säurefunktion aufweist, die die Bildung von Salzen und Esterderivaten ermöglicht, I) mindestens eine Hydroxylgruppe trägt, die verestert werden kann, und
    J) mit Thiolcarbonsäuren Derivate bildet.
    das Antibiotikum A-7413 Faktor C, ein weißes bis hellgelbes amorphes Material, das oberhalb 250° C schmilzt, und das In Methanol, Chloroform, Dimethylformamid, Dlchloräthan und Dlmethylsulfoxld löslich, In Äthanol und wäßrigem Äthanol schwach löslich und In Aceton, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff, Dlchlormethan, Methyllsobutylketon, Äthylacetat, Dläihyläther und Wasser unlöslich ist, und
    A) B)
    C)
    D) E)
    4)
    bei der Elementaranalyse etwa folgende Zusammensetzung besitzt:
    69,38% Kohlenstoff, 9,92% Wasserstoff, 2,34% Stickstoff, 16,58% Sauerstoff und 1,73% Schwefel,
    ein In einem KBr-Preßllng aufgenommenes Infrarot-Absorptionsspektrum mit den folgenden
    Absorptonsmaxlma aufweist:
    3,00 (mittel), 3,38 (Schulter), 3,42 (stark), 3,51 (stark), 5,73 (mittel), 6,02 (mittel), 6,14 (Schulter).
    6,52 (schwach), 6,56 (schwach), 6,77 (mittel), 6,80 (Schulter), 6,97 (schwach), 7,20 (schwach), 8,25 (schwach), 8,33 (schwach), 8,40 (schwach), 8,86 (schwach), 9,39 (schwach), 10,05 (schwach), 10,53
    (schwach), 10,70 (schwach), 11,77 (schwach) und 13,66 pm (schwach),
    ein Ultravioleti-Absorptlonsspektrum mit den folgenden Absorptlonsmaxima aufweist:
    a) In neutralem, 95prozentlgem wäßrigem Äthanol: 205 nm (Ej1Jm = 356); 235 nm (Schulter; E\\m = 180); 260 nm (Schulter; EJ^m = 127); 290 nm (Schulter; Eftm = 104);
    b) In saurem Äthanol: 205 nm (Eftm = 356); 235 nm (Schulter; E^m = 180); 260 nm (Schulter; Ei™ = 127); 290 nm (Schulter; E\\m = 103); 355 nm (Schulter; E!*cm = 40);
    c) In basischem Äthanol:
    260 nm (Schulter; E\"em = 268); 325 nm (Schulter; E\°°cm = 189);
    dessen Aminosäureanalyse nach der sauren Hydrolyse die Anwesenheit von Ammoniak, Glycin, Threonin, Asparaginsäure und Phenylalanin anzeigt,
    bei Anwendung der im folgenden angegebenen paplerchromatographischen Systeme und unter Benutzung von Bacillus subtllls ATCC 6633 als Nachweisorganismus die folgenden /?rWerte besitzt:
    ÄrWert Lösungsmlttelsystem
    0,82 mit Wasser gesättigtes Butanol
    0,90 Methyllsobutylketon/Butanol/Wasser-Mischung (25/21/4)
    0,31 Methanol/Wasser-Mischung (1/1)
    0,06 Wasser/Methanol/Aceton-Mlschung (12/3/1), mit NH4OH auf einen pH-
    Wert von 10,5 eingestellt und dann mit HjPO4 auf einen pH-Wert von 7,5
    gebracht
    0,42 Methanol/0.1 n-HCl-Mischung (3/1)
    unter Verwendung der im folgenden angegebenen Kieselgel-Dünnschichtchromatographlesysteme und bei Anwendung von Bacillus subtllls als Nachweisorganismus die folgenden Λ,-Werte besitzt:
    Rj-Wen Lösungsmlttelsystem
    0,46 Chloroform/Methanol-Mlschung (9/1)
    0,42 Acetonitril/Wasser-Mlschung (9/1)
    G) eine Säurefunktion aufweist, die zur Bildung von Salzen und Esterderivaten geeignet ist.
    H) mindestens eine Hydroxylgruppe aufweist, die eine Veresterung ermöglicht, und
    I) mit Thlolcarbonsäure Derivate bildet; und
    das Antibiotikum A-7413 Faktor D, das
    A) bei den Im folgenden angegebenen papierchromatographlchen Systemen und bei Verwendung von Bacillus subtllis ATCC 6633 als Nachweisorganismus die folgenden /?rWerte besitzt:
    ÄrWert Lösungsmlttelsystem
    0,61 mit Wasser gesättigtes Butanol
    0,61 Methylisobutylketon/Butanol/Wasser-Mischung (25/21/4)
    0,62 Methanol/Wasser-Mischung (1 /1)
    0,20 Wasser/Methanol/Aceton-Mlschung (12/3/1), mit NH4OH auf einen pH-
    Wert von 10.5 eingestellt und dann mit H5PO4 auf einen pH-Wert von 7,5
    gebracht.
    0.71 Methanol/0,1 n-HCl-Mlschung (3/1)
    F)
    B) bei Verwendung der im folgenden angegebenen Kleselgel-Dünnschlchtchromatographlesysteme und bei Anwendung von Bacillus subtllis als Nachweisorganismus die folgenden RrWerte besitzt:
    RrWen Lösungsmittelsystem
    0,55 Chloroform/Methanol-Mischung (9/1)
    0,48 Acetonltrll/Wasser-Mlschung (9/1).
    2. Antibiotikum A-7413 Faktor A, dadurch gekennzeichnet, daß es durch submerses, aerobes Züchten des Mikroorganismus Actlnoplanes sp. NRRL 8122, Abtrennung und Isolierung der Antibiotikamischung vom Kulturgemisch und Auftrennung der Antibiotikamischung unter Gewinnung des Faktors A erhalten worden ist, der die In Anspruch 1 unter Ziffer 1) angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweist.
    3. Antibiotikum A-7413 Faktor B, dadurch gekennzeichnet, daß es durch submerses, aerobes Züchten des 'S Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122, Abtrennung und Isolierung der Antibiotikamischung vom Kulturgemisch und Auftrennung der Antibiotikamischung unter Gewinnung des Faktors B erhalten worden 1st, der die In Anspruch 1 unter Ziffer 2) angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweist.
    4. Antibiotikum A-7413 Faktor C, dadurch gekennzeichnet, daß es durch submerses, aerobes Züchten des Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122, Abtrennung und Isolierung der Antibiotikamischung vom Kulturgemisch und Auftrennung der Antibiotikamischung unter Gewinnung des Faktors C erhalten worden 1st, der die In Anspruch 1 unter Ziffer 3) angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweist.
    5. Antibiotikum A-7413 Faktor D, dadurch gekennzeichnet, daß es durch submerses, aerobes Züchten des Mikroorganismus Actinoplanes sp. NRRL 8122, Abtrennung und Isolierung der Antibiotikamischung vom Kulturgemisch und Auftrennung der Antibiotikamischung unter Gewinnung des Faktors D erhalten worden 1st, der die in Anspruch 1 unter Ziffer 4) angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweist.
    6. Verwendung der Antibiotikamischung A-7413 gemäß Anspruch 1 oder der Antlblotlkum-A-7413-Fakloren A, B, C und D gemäß den Ansprüchen 2, 3, 4, und 5 als wachstumsförderndes Mittel bei Geflügel.
DE2703938A 1976-02-04 1977-01-31 Antibiotikamischung A-7413, Antibiotikum A-7413 Faktoren A, B, C und D und Verwendung der Antibiotikamischung oder ihrer isolierten Faktoren A, B, C und D als wachstumsförderndes Mittel bei Geflügel Expired DE2703938C2 (de)

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