DE2647158A1

DE2647158A1 - Antibioticum

Info

Publication number: DE2647158A1
Application number: DE19762647158
Authority: DE
Inventors: Katsuyuki Akasaki; Eisuke Ishihara; Katsumi Kobayashi; Masao Minowa; Hiroshi Yonehara
Original assignee: Kumiai Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kumiai Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1975-10-28
Filing date: 1976-10-19
Publication date: 1977-06-23
Also published as: DK488976A; IL50214A0; AU501828B2; SU685132A3; US4243661A; DK147569C; CH630663A5; DK147569B; SE421665B; DD130626A5; IL50214A; JPS5254013A; FR2361907B1; NL7609445A; US4276286A; BR7606978A; FR2361907A1; US4229535A; SE7611871L; NZ181668A

Description

KUMIAI CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD, Tokio (Japan)

Antibioticum

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen und Extrahieren von Multhiomycin, einem Antibioticum, sowie ein Multhiomycin als Wirkstoff enthaltendes Arzneimittel für die Tiermedizin. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen von Multhiomycin durch Züchten eines Multhiomycin erzeugenden Pilzes, wie des zur Gattung Streptomyces gehörenden Streptomyces SP 8446-CC1, in einem Nährmedium, das eine schwefelhaltige Aminosäure enthält, und durch Behandlung des Kulturmediums mit einem Lösungsmittelgemisch aus Alkoholen und halogenierten Kohlenwasserstoffen oder Ketonen.

Die Erfindung schafft ferner ein Multhiomycin als wesentlichen Bestandteil enthaltendes Arzneimittel, welches das Wachstum von Tieren fördert und verschiedene Tier-Krankheiten verhindert.

Die Erfinder haben umfangreiche Untersuchungen mit verschiedenartigen Antibiotica durchgeführt, die von Mikroorganismen erzeugt werden, und haben dabei auch das Multhiomycin untersucht. Dieses Antibioticum ist in dem

709825/0866

Journal of Antibiotics, Band XXIII, Ko. 5» So 231-237 (1970) von H. Yoriehara, einem der Erfinder Lind Mitarbeitern beschrieben "/orden»

In der genannten Veröffentlichung haben H. Yonehara und seine Mitarbeiter berichtet, dass d· s Multhiomycin ein neues Antibioticum ist, das aus dem Myzel des Streptomyces sp. 8446-COl durch Extraktion mit Lie than öl gewonnen und durch Chromatographie mit Kieselgel gereinigt wird. Es bildet gelbe Kristallnadeln, schmilzt oberhalb 30C-⁰O und hat keine oder nur eine vernachlässigbar kleine optische Aktivität» Auf Grund der ^lementaranalyse und der Molekulargewichtsbestimmung wird angenommen, dass es die Molekularformel C^H^,-Ο-^^^γ hat. Es hat sich gezeigt, dass dieses Antibioticum eine Hemmwirkung gegen grampositive Bakterien, aber keine V/irksamkeit gegen gramnegative Bakterien, sowie gegen Mykobakterien und Pilze hat» Die genannten Verfasser hatten jedoch nicht erkannt, d:-,ss lÄulthiomycin als Arzneimittel in der l'iermedizin verwendbar ist c

Die Erfindungen haben eine ausgedehnte weitere untersuchung des Multhiomycins und seiner Verwendung durchgeführt Diese Untersuchung hat zu der vorliegenden Erfindung geführt .

Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zum Erzeugen von Multhiomycin.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zur Extraktion des Multhiomycins in hoher Heinheit und mit guter Ausbeute aus der Kulturbrühe, in der es erzeugt worden ist.

.Ferner besteht eine Aufgabe der Erfindung in der Schaffung eines Multhiomycin als wesentlichen Bestandteil enthal-

709825/öVse

beiiden urzneimittels für die Tiermedizin.

.jchlieklich besieht eine Aufgabe uer Erfindung auch in der ,3_rhaf fung eines Verfahrens zum Reinigen von iuulthiomycin.

Die Erfindung schafft; ein Verfahren zum Erzeugen und Extrahieren von Ivlulthiomycin, einem Antibioticum, sowie ein Multhioniycin als '.wirkstoff enthaltendes Arzneimittel für die Tiermedizin. Insbesondere schafft die Erfindung zum Gewinnen von Ivlulthiomycin ein Verfahren, in den ein Lulthiomycin erzeugender filz, beispielsweise lex¹ zur G-atbung otreptomyces gehörende jtreptomyces sp. 6446-001, in einem u-^ hr medium -^s züchtet ;vir:l, u;-.s eine schwefelhaltige Oar'oonsäure enthält, worauf das ^uI bur medium üiit einem Lösungsmittel _;eüiisch aus Alkoholen und halogenierteü Kohlenwasserstoffen öler Ketonen Dehandelt wird. Die Erfindung schafft ferner ein jhulthioniycin als v/eüentlichen bestandteil enthaltendes Arzneimittel, welches daa „acliotura von Tieren, einschließlich von tischen und Schalentieren, fördert und verschiedene Krankheiten von Tieren, einschließlich von !Fischen und Schalenfcieren, verhindert.

In den Zeichnungen sind in

i'ig. 1 in einem Kurvenbild die Ultraviolettabsorptionskurven dss Kulthiomycins in alkalischem Leuhanol (A) und in neutralem oder saurem kethanol (B) und ist in

Fig. 2 eine bei Kessung an einer Kaliumbroiaidtablette erhaltene Infrarotabsorptionskurve aes Lulthiomycins aargestellt ₀

Eine Kultur des im Rahmen ier vorliegenden Erfindung verwendeten "Pilzes ütreptomyces sp. 8446-OCl ha"c folgende morphologische und physiologische Eigenschaften:

BAD ORIGINAL

709825/0866

-dgenschaften einer Kultur von 3treptomyces sp.8446-GGl in verschiedenen I-iährmedien

riährmedium Eigenschaften der Kultur

^ucrose-ITitrat- ;/: jjünn, farblos bis gelblichgrau LM: Heichlich, pulverig, weiß LP: ',j-ehx -,/enig, gelblichgrau

G-lycerin-Nitret-,";: Dünn, farblos bis gelblichgrau Ll: .;enig, pulverig, weiß LP: oehr vrenig, .;elblichgrau

Glucose- '.sparagin-Agar

V,^;: I/iäßig, gelblichgrau si it blaßgelblichbrauner Rückseite

LM: Heichlich, samtig, hellbraun bis hellbräunlichgrau

LP: Venig, blaßgelblichbraun

GIycerinli

*;;: Mäßig, sich ausbreitend und in das ügar eindringend, gelblichgrau

LM: ileichlich, samtig, hellbräunlichgelb :";it weißlichem D¹IeCk

LP: iehr wenig, gelblichgrau

Stärke-Agar V/: Mäßig, sich ausbreitend und in das Ägar eindringend, gelblichgrau mit hellbraunlichgrauer Rückseite

IM: Reichlich, samtig, hellgrau mit bräunlichem Stich

709825/0866 BAD

Ii khr medium

Eigenschaften der Kultur

lepton-Ilindfleischextrakt- Agar

LP: Sehr wenig, gelblichgrau

7J: Mäßig, blaßgelblichbraun mit gelblichbrauner Hückseite

LM: Gering, pulverig, am Hand der Kolonie weiß

LP: Gelblich-braun

Glucose-Pepton- Rindfleischextrakt- Agar

und faltig, gelblichgrau

LM: /Jenig, pulverig, am Rand der

Kolonie weiß
LP: Gelblichbraun

Glucose-Pepton- Agar

W: Dünn, blaßgelb

LM: Keine

LP: Gering, blaßgelb

Glucose-Caseindi- gestionsprodukt- Hefe-Rindfleisch-Agar

Hafermehl-Hefe ext rakt-Ag ar

LM:

Mäßig und faltig, Rückseite blaßgelblichbraun

Mäßig, samtig, hellbrau mit bräunlichem Stich

LP: Wenig, blaßgelblichbraun

W: Mäßig, sich ausbreitend und in das Agar eindringed, gelblichbrau

LM: Reichlich, samtig, hellgrau mit bräunlichem Stich

LP: Sehr wenig, gelblich

- (5a-

709825/0866

BAD ORIGINÄR

Nährmedium

liigenschaften der Kultur

!,art off el- W: . Scheibe od. -Zapfen

Dick und faltig

Reichlich., hellgrau mit bräunlichem Stich

	LP:	jj unkelbraun
Loffler- Blutserium	Vi: LM: LP:	Mäßig, dunkelbraun Vi/enig, pulverig, weiß Dunkelbraun
Gelatinenmedium	W: LM:	Ring an der Oberfläch gelblichbraun Ke ins
	LP:	Braun

Milch

üT: Ring an der Oberfläche, blaßgelb-1ichbraun

LM: Reichlich, pulverig, weiß LP: Braun bis dunkelbraun

Gellulose-Nährmedium

¥: Dünn, farblos

LM: Reichlich, pulverig, hellgrau

LP: Keine

Glycerin-

Asparagin-Agar

W: Mäßig, gelblichgrau bis blaßgelb

LM: Reichlich, pulverig, bräunlichweiß bis hellbräunlichgrau

LP: Sehr wenig, gelblichgrau

Tyrosin-Agar

W: Mäßig, gräulichgelbbraun LM: Mäßig, pulverig, weiß LP: Dunkelgelbbraun

709825/0866

-Jg-

Nährmedium

Eigenschaften der Kultur

Hefe-Malz-Ag ar

■J: Dick, blaßgelbbraun bis gräulichgelblichbraun

LM: iieicilich, sambig, hellbräunlichgrau LP: Blaßge lbbr--«un

Hafermehl-Agar

V: Dünn, gelblichgriai

LM: Reichlich, samtig, hellbräunlichgrau

LP: ..enig, g

G = .'.'achstum

LU = Luftmyzel

LP = Lösliche Pigmente

In der vorstehenden Zusammenstellung wurden die Farben nachdem Verfahren bestimmt, das in dem "Color Harmony Manual", verlegt bei Container Corporation of ttorica, beschrieben ist„

Physiologische Eigenschaften

Optimale Bedingung für das Wachstum: pH-Wert 7,0 - aerob.

■Wachstum bei einem pH-wert von 6,2 bis 7»8.

Kein Wachstum unter 5°G und über 45 C.

Kein Wachstum unter aneroben Bedingungen.

(Kein Wachstum in der unteiaa Schicht einer Stichkultur in einem dicken Hefe-Malz-Agar-Nährmediura).

Farberzeugung: Erzeugung eira? tiefbraunen Farbe in einem natürlichen Nährmedium und von Melaminfarbe in einem Tyr ο s in-Nährme dium.

Hydrierung der Stärke: Verflüssigung.

Abbau der Cellulose: Kein Abbau.

709825/0 8"6

Reduktion iron Nitrat: Reduktion.

Eiv/eißabbauvermögen: Gelverflüssigung, Peptonisierung der Milch, Verflüssigung von Blutserum.

Verwertung von Kohlenwasserstoffen: Verwertung von Glucose, xTnamoae, Mannose, Lactose, Raffinose, Mannitol, Sucrose und Salicin als Kohlenstoffquelle. Keine Verwertung von Arabinose, Fructose und Cellulose.

Vorstehend sind die physiologischen und Kultureigenschaften des Stammes sp. 8446-CCl angegeben worden. Ss wurde festgestellt, dass dieser Staam zu der von TRESER und BACKUS ■beschriebenen "grauen Variante" gehört, v/eil die Farbe des Luftmyzels heilgrau bis bräunlichgrau war. Das substratseitige Myzel bzw. die Rückseite der Kolonie zeigte auf allen liährmedien keine markanten Farben (gelblichgrau bis gelblichbraun). Auf synthetischen und einigen or^aischen lährinedien wurden in geringen Mengen lösliche Pigmente erzeugt, die nicht markant waren (gelblichbraun bis blaßgelblichbraun). Auf den meisten organischen ITährmedien vmrden chromogene Pigmente (gelblichbraun bis dunkelbraun und auf Tyrosin-Agar wurde ein melanoidfarbiges Pigment erzeugt.

Angesichts der vorstehend angegebenen morphologischen und physiologischen Eigenschaften der Kulturen wird angenommen, daß der stamm Streptomyces sp. 8446-CCl zu der Art Streptomyces antibiotics gehört. Der Stamm wurde unter der Bezeichnung Strain Ferm-P No. 3,2» bei dem Fermentation Research Institute of Japan der Agency of Industrial Science & Technology deponiert. Proben des Stammes können an Dritte ausgegeben werden, wenn die die Priorität dieser Anmeldung begründende japanische Patentanmeldung Nr. 12891O/1975 offengelegt worden ist.

709825/0866

Der vorgenannte Stamm Streptomyces sp. 844-6-0Gl gehört zu der Gattung Streptomyces und ist nicht der einzige Stamm, der zur Erzeugung des MuItiomycins im Rahmen der Erfindung geeignet ist, da man auch jeden anderen zum Erzeugen von Multhiomycin befähigten Stamm der Gattung Streptomyces verwenden kann.

Zum Erzeugen von Multhiomycin wird ein Multhiomycin erzeugender Stamm der Gattung Streptomyces in einem Nährmedium gezüchtet, das eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Maltose, Fructose, Sucrose, Lactose, Melasse, Stärke, Dextrin oder dergleichen, ferner eine Stickstoffquelle, wie Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Hefe, Glutaminsäure, Harnstoff, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat oder dergleichen und als wesentlichen Nährstoff 0,0005 bis Gewichtsprozent, vorzugsweise 0,01 bis 5 Gewichtsprozent, einer schwefelhaltigen Carbonsäure oder ihrer Derivate, beispielsweise Thioglycolsäure, Thioglycolsäureamid, Thioapfelsäure, Thiobenzoesaure, Methionin, Cyctin, oder ein Ammonsalz, ein Alkalimetallsalz oder ein Erdalkalimetallsalz derselben, enthält. Die bei der Zugabe der genannten schwefelhaltigen Carbonsäure zu dem Nährmedium erzeugte Menge des Multhiomycins ist 2 bis 4-mal so groß wie die ohne diese Zugabe erzeugte Menge. Erforderlichenfalls kann man dem Nährmedium auch Natriumchlorid, Phosphat oder eine sehr kleine Menge von Metallionen zusetzen. Für die Erzeugung des Multhiomycins am besten geeignet sind ein Nährmedium, das Dextrin, Trockenhefe, Methionin, Natriumchlorid und Calciumcarbonat und ein Nährmedium, das Stärke, Baumwollsamenmehl, Methionin, Natriumchlorid und Calciumcarbonat enthält.

Man kann den Multhiomycin erzeugenden Stamm zwar auch in Form einer Festkultur züchten, doch ist zur Massenpro-

— Q _

709825/0863

duktion die Züchtung in' Form einer Flüssigkultur, insbesondere Submerskultur, besonders vorteilhaft. Die Züchtung kann unter aeroben oder halbaeroben Bedingungen erfolgen. Beispielsweise kann man die Züchtung unter einem Strom keimfreier Luft oder in Form einer nichtbelüfteten Oberflächenkultur durchführen. Gewöhnlich wird die Züchtung bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 50 C, vorzugsweise 23° bis 32° C, durchgeführt. In dem meisten Fällen hat sich eine Temperatur von etwa 27 C als optimal erwiesen»

Gewöhnlich erreicht die Erzeugung von Multhiomycins ihr Maximum bei einer Schütoelkultur nach etwa 1 bis 9 Tagen und bei einer Kultur in einem belüfteten Tank nach etwa bis 8 Tagen. Damit möglichst viel Multhiomycin erzeugt wird, halt man den pH-7.^rert der Kulturbrühe während der Züchtung durch Zusatz einer Mineralsäure, wie Salzsäure oder Schwefelsäure, oder einer organischen Säure, wie Essigsäure oder Oxalsäure, in^iner geeigneten Menge im Bereich von 4,0 bis 9,0, vorzugsweise von 5»5 bis 8,5·

Da das Multhiomycin sowohl in der Kulturbrühe als auch in den myzelhaltigen Feststoffen vorhanden ist, kann man nach der Züchtung das Multhiomycin aus dem Züchtungsprodukt erhalten, indem man nach dem Abfiltrieren der Feststoffe das Multhiomycin aus dem Filtrat und das Multhiomycin aus dem Feststoff getrennt gewinnt und dann die geivonnenen Multhiomycinmengen vereinigt oaer indem man das Multhiomycin direkt aus der die Feststoffe enthaltenden Kulturbrühe gewinnt. Man kann das Multhiomycin nach jedem geeigneten bekannten Verfahren gewinnen, das allgemein zum Abtrennen von Antibiotica von einer Kultur von Mikroorganismen verwendet wird, oder durch eine Kombination derartiger Verfahren.

Zur Gewinnung des Multhiomycins aus der KuItürbrühe, von

- 10 -

709825/0866

der die myzelhalt igen Feststoffe abfiltriert worden sind, hat man im allgemeinen versucht, das Kulthiomycin mit einem in '"asser unlöslichen Lösungsmittel zu extrahiesn, beispielsweise rait intern, Butrmol, -vinylalkohol, Benzol, iaeth-rrlisobubylketon oder dergleichen. Von den Erfindern mit verschiedenen Lösungsmitteln durchgeführte Sxtraktionsversuche haben jedoch zu der Erkenntnis geführt, dass das in dem FiItrat enthaltene Multhiomycin mit höherem Jirkungsgrad extrahiert werden kann, wem man ein Lösungsmittelgemisch verwendet, zu dessen Hers bellung man ein alkoholisches Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol, n-Propanol, Butanol, Gellosolve oder dergleichen mit einem Lösungsmittel in Form eines halogenierten Kohlenwasserstoffes, wie Methylchlorid, Dichloräthan, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, Chlorbrommethan, Trichloräthan, Dichlorpropan, Chlorbutan oder dergleichen, in einem Mischungsverhältnis von 1:0,1 bis 1:10, vorzugsweise von 1:1 bis 1:7» mischt.

Wenn man beispielsweise eine durch die Züchtung erhaltene Kulturbrühe in zwei Teilmengen teilt und die eine Teilmenge dreimal nacheinander mit Butylacetat extrahiert und die Teilmenge mit einem Lösungsmittel^eiaisch aus 1 Teil Methanol und 4· Teilen Chloroform extrahiert, stellt man fest, dass mit dem Lösungsmittelgemisclyviermal so viel Multhiomycin extrahiert wird als mit dem Butylacetat allein. Auch aus den myzelhaltigen Feststoffen kann man das 3JuI-thiomycin mit einem einzigen Lösungsmittel extrahieren. Unsere Untersuchungen hinsichtlich der "Extraktion des Multhiomycins aus Feststoffen haben gedoch zu der Erkenntnis geführt, dass man zur Extraktion vorzugsweise ein Lösungsmittelgemisch verwendet, das aus einem Keton, wie Aceton, Methyläthylketon oder dergleichen, und einem alkoholischen Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Butanol, Phenol oder dergleichen, in einem Mischungsverhältnis von 1:0,1 bis 1:20 besteht, oder ein Lösungsmittelgemisch,

- 11 -

BAD ORIGINAL

709825/0866

2647161

das wie das zur Extraktion -jes MuI thiomy eins aus der Kulturbrühe verwendete Lösungsmittelgemisch aus einem Lösungsmittel in Form eines halogenierten Kohlenwasserstoffs und einem alkoholischen Lösungsmittel besteht. Beispielsweise wurde durch dreimalige Extraktion der pilzhaltigen Feststoffe Multhiomycin in einer Menge enthalten, die 2,62 g reinem Multhiomycin entpsricht. './enn man dagegen die üilzhaltigen Feststoffe zuerst mit Methanol und danach mit einem Lösungsmittelgemisch aus 1 Teil Methanol und 4 Teilen kethylenchlorid extrahierte, wurden 4,46 g Multhiomycin gewonnen.

Nachstehend werden in Äusführungsbeispielen Züchtungsverfahren und Verfahren zur Gewinnung von Multhiomycin gemäß der Erfindung beschriebenο

Beispiel 1

Erzeugung von Multhiomycin (Zusatz einer schwefelhaltigen Carbonsäure)

Methionin, Cystin bzw. Thioglycolsäure wurden in den in der Tabelle 1 angegebenen Mengen einer Basis-Nährlösung der folgenden Zusammensetzung zugesetzt:

Dextrin 2,5 % Trockenhefe 2,0 % Natriumchlorid 0,5 % Calciumcarbcnat 0,4 %

Jede der auf diese Weise erhaltenen Nährlösungen wurde mit dem Stamm Streptomyces sp.8446-CGl geimpft, der dann bei 28°C gezüchtet wurde. Am vierten Tag nach dem Beginn der Züchtung wurde die Multhiomycinpotenz gemessen. Die

- 12 _

709825/0866

Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben. Aus dem abzentrifugierten Myzel vu:-de dux'ch Extraktion mit einem Lösungsmittelgemisch aus 4- Teilen Aceton und 1 Teil Methanol das Multhiomycin gewonnen, das mit einer Pufferlösung aus 30>ü Aceton enthaltender, 0,1-molarer Phosphorsäure (pH-Wert 8) verdünnt wurde.

Die Potenz der Lösung wurde unter Verwendung des Bacillis subtilis als Prüf Organismus und einer zyliifcischen igarplatte bestimmt.

Tabelle 1

Mengen der dem Basis-Nahrmedium zugestzten Stoffe (Gew.%/Gew.%)

Mengen der dem Basis-Nährmedium zugesetzten Stoffe (Gew .%/Gew _o%)	Cyctin Thioglycol- säure	0,001	Konzentration am 4-. Tag
Methionin		709825/0866	( y / ml)
0,001		353
0,005		401
0,01		517
0,05		728
0,1		1 012
0,5		869
1,0		470
3,0	0,001	329
	0,01	305
	0,1	634-
	1,0	84-2
	3,0	54-0
	4-23
	282 BAD ORIGINAL

Forts. Tabelle 1" ..

-AJ-.

Mengen der dem Basis-Nährmedium Konzentration am

zugesetzten Stoffe (Gew.%/Gew*%) 4-, Tag

Methionin Cyctin Thioglycolsäure ^- O ' '

0,01 336

0,1 578

1,0 719

3,0 318

Basis-Nährmedium (ohne Zusatz) 235

Beispiel 2 Erzeugung von Multhiomycin (Einstellung des pH-Werts)

Ein Nährmedium folgender Zusammensetzung:

Stärke 2,5%

Baumwollsamenmehl 2, 0%

Natriumchlorid 0,5%

Calciumcarbonat 0,4%

wurde mit dem Stamm Streptomyces sp.844-6-001 geimpft. Durch automatische Zugabe von 2n-Sylzsäure mit Hilfe einer automatischen Dosiervorrichtung wurde der pH-¥ert der Kulturbrühe zwischen 6,0 und 8,0 gehalten. In einem ■Vergleichsversuch wurde der pH-7/ert des Nähr mediums zunächst auf 5,6 eingestellt.

Nach der bei 28 G erfolgten Züchtung wurde eine Extraktlckmg gewonnen, deren Multhiomycinpotenz bestimmt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse gehen aus der nachstehenden Tabelle 2 hervor.

-3A-

70982B/0866

Tabelle 2

Ansatz

Am 3. Tag

Potenz pH-Wert /ml

Am 5· Tag

Potenz pH/Wert /ml

pH-7;"ert-Hegelung

(6,0-8,0)

173

6,0

769

8,0

ohne

pH-;/ert-Hegelung

(5,6-9,2)

157

5,9

248

9,2

Beispiel 3

Gewinnung des Multhiomycins mit Hilfe eines Lb'sungsmittelgemisch.es

100 1 eines auf einen pH-Wert von 5 »6 eingestellten Nährmediums, das 2,5% Stärke, 2% BaumwoIlsamenmehl, 0,1% Methionin, 0,5% Natriumchlorid und 0,4·% Calciumcarbonat enthielt, wurden mit einer Impfkultürlösung des Stammes Streptomyces sp. 8446-CCl geimpft. Die Kultur wurde bei 27°C gezüchtet, wobei das Kulturmedium mit 300 U/min gerührt und mit I5 l/min belüftet wurde. Nach einer Züchtungsdauer von 80 Stunden hatte die Erzeugung von Multhiomycins ihr Maximum erreicht. Jetzt wurde die Züchtung abgebrochen und das Myzel abfiltriert. Auf diese Weise wurden etwa 48 kg nasses Myzel gewonnen. Dieses Myzel wurde gut durchgemischt und in 27 Teilmengen von je 1 kg geteilt. Jede Teilmenge wurde mit 1,5 1 Methanol extrahiert und danach filtriert.

- 15 709825/0866

Danach wurde jede Teilmenge ein zweites Mal mit 1^5 1 je eines der in der Tabelle 3 angegebenen Lösungsmittelgemische extrahiert. Dann wurde jeweils eine Methanol-Extraktlösung und eine der Lösungsmittelgemisch-Extraktlösungen miteinander vereinigt und zum Abfraktionieren der verschiedenen Lösungsmittel von der Extraktlösung

O ⁷J

bei 60 C vakuumdestilliert. 50 cm der jeder verbleibenden wäßrigen Lösung wurde danach mit 100 cm Äthylacetat extrahiert, das danach von der so erhaltenen Athylacetat-Extraktlösung im Vakuum abdestilliert wurde. Die jeweils zurückbleibende ölige Substanz wurde in einem der in der T_abelle 3 angegebenen Lösungsmittelgemische aufgelöst. Der Lösung wurde η-Hexan in dem 1,5-fachen der Menge der Lösung zugesetzt, wobei gelbes Multhiomycin ausgefällt wurde. Dieser Niederschlag wurde mit einem Glasfilter abfiltdert und einmal mit 10 ml Methanol gewaschen, wobei MuIthiomycin-Rohkristalle erhalten wurden. Die Reinheit jeder Rohkristallmenge wurde dann nach dem vorerwähnten Topf-Verfahren bestimmt. Auf Grund des erhaltenen tfferts für die Reinheit und des Kristallgewichts wurde das Gesamtgewicht an reiner Substanz (die Bruttoaktivität) bestimmt.

	für	Tabelle 3	Umgerechnet auf Rein substanz
			Gesamtgewicht mg
Lösungsmittelgemisch 2. Extraktion	1 1 1	Rohkristalle	1538 1990 2041
	Gew. Reinheit mg %
Chloroform 10: methanol 5: 4: "	2242 68,6 2574 77,3 2231 91,5 - 16 -

709825/0866

	-	1	—·	Vb -	Reinheit	Umgerechnet auf Re in- substanz
JTortSo Tabelle 3	Lo sungsmittelgemi sch für 2. Extraktion	1		*< ko-*	%	Gesamtgewicht
			Rohkristalle		mg
Chloroform	1	Gew.	82,4
2: Methanol	1	mg	73,3	1895
1: "	1			2007
1,2-Dichloräthan	1	2299	70,5
10: Methanol	1	2738	82,0	1638
5:			80,2	2083
4: «	1	2324	63,5	2056
2: "	1	2540	• 71,3	1442
1: "	1	2563		1368
Trichloräthylen	1	2271	69,8
10: Methanol	1	1919	74,0	1335
5:	1		68,2	1786
4: "	1	1913	82,5	I715
2: "	1	2414	78,7	I503
1: »	1	2515	73,5	1574
Aceton 10: Methanol	1	1822	72,3	1523
5:		2000	70,5	1875
4: "	1	2072	93,0	2013
2: »	1	2593	88,3	2105
1: "	1	2855		1884
Chloroform	2263	63,2
10: Phenol	2134	83,6	1482
5:		94,5	2006
4: "	2345		2603
	2420
	2755

709825/0MS-

	Tabelle 3	Aceton	10:	Phenol	Äthanol	Äthanol	1	*	**·	Reinheit	2647158
Eorts.		5:		Trichloräthylen 4: Äthanol				Rohkristalle	%
		4:	It	Aceton 4:	1	Gew.	82,3	Umgerechnet auf Rein substanz
Lösungsmittelgemisch für 2. Extraktion	2:			mg		Gesamtgewicht
	1:	Phenol	1	2642	72,7	mg
Chloroform	Chloroform	ti	1			2174
2:	4:	Il	1	2015	50,7
1:		Il	1		84,2	1465
It	1	2445	91,5
		2721	86,4	1240
Äthanol	1	2863	75,6	2291
1,2-Dichloräthan		2821		2614
4:	1	2562	76,5	2457
1			1957
1	2239	75,7
		69,8	I7O8
2197	81,5
2440	1619
2716	I705
2208

Methanol als alleiniges Lösungsmittel

2067

55,5

1145

Äthanol als alleiniges Lö sungsmittel

2183

41,5

906

70982"B)%868

Beispiel 4-

Gewinnung von Multhiomycin mit Hilfe eines Lösungsmittelgeniisches

60 1 eines auf den pH-Wert 5>6 eingestellten Nährmediums, das 2,5% Dextrin, 2,0% Trockenhefe, 0,5% Natriumchlorid und 0,4·% Calciumcarbonat enthielt, wurden mit einer Impfkulturlösung des Stammes Streptomyces sp. 8446-CC1 geimpft, der in dem Nährmedium gezüchtet wurde, während dieses "bewegt und mit 15 l/min belüftet wurde. Fach 96 Stunden erreichte die MuIthiomycinerζeugung ihr Maxium. Die Züchtung wurde dann abgebrochen und die Kulturbrühe in zwei gleiche Teile geteilt.

(1) Extraktion mit einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Chloroform

Von dem einen der beiden Teile der Kulturbrühe wurden etwa 9,5 kg nasses Myzel abfiltriert. Dieses Myzel wurde zunächst mit 15 1 Methanol und danach mit 15 1 eines Lösungsmittelgemisches aus Methanol und Chloroform (Volumenverhältnis 1:4·) extrahiert. Die Extrakt lösung ?furde dann mit der Methanol-Extraktlösung gemischt und bei 60 C im Vakuum eingedampft. Dabei wurden 500 ml eines wasserhaltigen Rückstandes erhalten. Dieser wurde erneut mit 1 1 Äthylacetat extrahiert. Durch Eindampfen der Sxtraktlösung im Vakuum wurde eine ölige Substanz erhalten, die in einem Lösungsmittelgemisch von Methanol und Chloroform (Volumenverhältnis 1:4-) gelöst wurde. Zu dieser Lösung wurde nach und nach η-Hexan in der 1,5-fachen Menge zugesetzt, wobei gelbes Multhiomycin ausgefällt wurde. Dieser Niederschlag wurde abfiltriert, mit 10 ml Methanol gewaschen und getrocknet. Es wurden 4-,8 g Multhiomycin-Rohkristalle (Reinheit 93%) erhalten.

(2) Extraktion mit Methanol (Stand der Technik)

Von dem anderen Teil der KuI tür brühe wurden etwa 9,8 kg

709825/0866

- 19 -

nasses Myzel abfiltriert, div^ dann dreimal mit 15 1 Methanol extrahiert wurden. Durch eindampfen der Extraktlösung im Vakuum wurden 750 ml eines wasserhaltigen Rückstandes erhalten. Dieser Rückstand wurde mit 1 1 Äthylacetat extrahiert. Die Athylacetat-Extraktlösung wurde im Vakuum auf 120 ml eines Konzentrats eingedampft, zu dem nach und nach η-Hexan zugesetzt wurde, wobei gelbes Multhiomycin ausfiel. Dieser Niederschlag wurde abfiltriert und mit 10 ml Methanol gewaschen. Ss wurden 4,6 g Multhiomycin-Rohkristalle (Reinheit 57%) erhalten.

Man kann des in den Verfahren (1) und (2) erhaltene Rohmulthiomycin reinigen, indem man es aus einem Gemisch von Dimethylformamid und Äthylacetat umkristallisiert oder einer Säulenchromatographie mit Kieselgel und einem Lösungsmittelgemisch aus Dimethylformamid und Äthylacetat unterwirft. Das gereinigte Produkt wird in Form von Kristallnadeln erhalten.

Beispiel 5

30 1 eines auf den pH-<vert 5»6 eingestellten Nährmediums, das 2,5% Dextrin, 2,0,0 Trockenhefe, 0,5% Natriumchlorid und 0,4% Oalciumcarbonat enthielt, wurden mit einer Impfkulturlösung des Stammes Streptomyces sp. 8446-001 geimpft, der in dem Nährmedium gezüchtet wurde, während dieses mit 15 l/min belüftet und mittels eines Rührers bewegt wurde.

Nach einer Züchtungsdauer von 96 Stunden hatte die Erzeugung von Multhiomydn ihr Maximum erreicht. Jetzt wurde die Züchtung abgebrochen und v/urden etwa 10 kg nasses Myzel abfiltriert. Dieses Myzel wurde erst mit 15 1 Methanol und dann mit 15 1 eines Lösungsmittelgemisches von Aceton

- 20 -

709825/0866

und Methanol (Volumenverhältnis 4:1) extrahiert. Die beiden Extrakt lösungen wurden dann vereinigt und *·■··■ zum Abtrennen von Methanol und Aceton von der Mischlösung bei 60° vakuumdestilliert. 500 ml der verbleibenden Wäßrigen Lösung wurden mit 1 1 eines Lösungsmittelgemisches von Isopropanol und Dichloräthan (Volumenverhältnis 1:4) extrahiert. Von dieser Isopropanol-Dichloräthan-Mischextraktlösung wurden Isopropanol und Dichloräthan im Vakuum bei 60 0 abdestilliert. Der ölige Rückstand wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol und Dichloräthan (Volumenverhältnis 1:4) gelöst. Der Lösung wurde nach und nach η-Hexan in der 1,5-fachen Menge der Lösung zugesetzt, wobei gelbes Multhiomycin ausgefällt wurde. Dieser Niederschlag wurde auf einem G-lasfilter abfiltriert und einmal mit 10 ml Methanol gewaschen. Ss wurden 6,2 g Multhiomycin-Rohkristalle (Reinheit 90/j) erhalten.

1 g dieser Multhiomycin-Rohkristalle wurden in 800 ml Äthylacetat gelöst, dss lO/o Dimethylformamid enthielt, und dann zwei Tage lang bei Zimmertemperatur (etwa 20⁰G) stehengelassen. Dabei wurden 660 mg Multhiomycin (Reinheit 100%) in Form von Kristallnadeln erhalten.

Das erfindungsgemäß erhaltene Antibioticum Multhiomycin hat folgende physikalische und chemische Eigenschaften.

Die Elementaranalyse des Multhiomycins ergab folgende Bestandteile: 0 49,74; H 4,17; 0 16,74; N 15,15; S 15,03. Das mittels der Dampfdruckerniedrigung bestimmte Molekulargewicht betrug 1064. Auf Grund dieser Tatsachen wird angenommen, dass das Multhiomycin die Molekularformel -, -jjSi- hat. Der Schmelzpunkt (Zersetzungspunkt)

dieses Antibioticums liegt über 300 0.

- 21 -

709826/0866

Die Ultraviolettabsorptionskurve des Multhiomycins ist in Fig. 1 dargestellt. Aus dem Jlurvenbild erkennt man, dass das maximale Absorptionsvermögen in dem neutralen oder sauren Methanol (B) bei 328 nm (E¹''⁰ 220) und 4-20 nm (^^20) und in dem alkalischen Methanol (A) bei 292 nm (E^1;jf_m255) und 406 nm (E¹J_m132) liegt. Die Infrarotabsorptionskurve ies Multhiomycins (in einer Kaliumbromidtablette) istin Fig. 2 dargestellt, aus der hervorgeht, dass ein hohes Absorptionsvermögen bei 3380 cm"¹, 1660 cm"¹, 1520 cm"¹, 14-70 cm"¹, 1200 cm"¹, 1110 cm"¹, IOI5 cm" , 910 cm" und 750 cm" vorhanden ist.

Multhiomycin ist in Dimethylformamid, Dirnethylsulfoxid und Pyridin löslich, in Äthylacetat, Methanol, Äthanol und Dioxan nur sehr wenig löslich und im 7/asser, Essigsäure, η-Hexan, Äther, Chloroform und vielen anderen organischen Lösungsmitteln unlöslich.

Hinsichtlich der Farbreaktion des Multhiomycins sei festgestellt, dass es mit Hisen(III)-chlorid, dem Folin-Reagenz und dem Lemieux-Reagenz verschiedene Farben erzeugt. Dagegen erzeugt es mit dem Ninhydrin, der Fehlingschen Lösung und dem Ponceau-3R-Reagenz oder bei der Titration keine Farben.

Multhiomycin bleibt beständig, wenn es in einer wäßrigen Lösung mit einem pH-v/ert von 2 bis 5 fünf Minuten lang auf 100⁰G erhitzt wird. Ss ist schwach sauer und liegt in Form von gelben Kristallnadeln vor. In seiner l%igen Lösung zeigt es keine optische Aktivität.

Zur Verabreichung von Multhiomycin an Tiere, einschließlich von Fischen und 3chalentieren, können diese direkt mit dem Multhiomycin enthaltenden Pilz gefüttert werden, der durch die Züchtung des Stammes Streptomycin sp. 84-4-6-COl

_ 22 —

709825/0866

oder eines andeien Multhiomycin erzeugenden i-ilzes erhalten worden ist, oder ro.it .^ohmulthiomycin oder 3ereinigtem Liulthiomycin, und z7/ar in Form eine·¹ Lösung, einer Emulsion, einer suspension, eines benetzbaren xulvers, eines staubfreien i-ulvers oder von Tabletten. Die substanz kann den Tieren, einschließlich von irischen und Jchalentieren, auch injiziert oder ihrem Futter oder ihrem Trinkwasser zugesetzt vrerden. B^n kann das ilulthiomycin den verschiedenartigsten Tieren, einschließlich von Fischen und Schalentieren, auch zur Förderung ihres .;achsbums verabreichen, beispielsweise bei Geflügel, wie Legehennen, Fleischhühnern, Snten usw., ferner bei Vieh, wie Hindern, Pferden, S_chweinen, Schafen, Ziegen, !Terzen, usw., sowie bei in der ./ohnung gehaltenen Haustieren, wie Kunden, Katzen, Tauben usw., und bei Versuchstieren, wie Mausen, iiat'üen, Kaninchen usw., sowie bei Fischen und ßchalentieren, wie Karpfen, Forellen, ..alen, G-oldfischen, sweet fish, G-oldbru.ssen, fielbschwcirizen, mustern, Kammuscheln usw..

Das diesen Tieren, einschließlich von Fischen und Schalentieren, zu verabreichende Multhiomycin kann dem Futter oder dem Trinkwasser direkt beigemischt werden. Am besten wird das Multhiomycin in Form einer Lösung, einer emulsion, eines benetzbaren ±ulvers oder einer Suspension dem Futter oder dem Trinkwasser für die Tiere zugesetzt. V/enn das Lulthiomycin in fester Form, beispielsweise in Form eines benetzbaren -tulvers oder einer öuspension, verwendet wird, kann man gute Ergebnisse erzielen, v/enn das Multhiomycin in einer Korngröße im Bereich von 1 bis 100 um, vorzugsweise unter 5 um» vorliegt. Dies ist darauf zurückzuführen, dass das Multhiomycin in dem Körper des Tieres, dem es verabreicht worden ist, nicht absorbiert wird.

^T,7enn das Multhiomycin dem Futter oder dem Trinkwasser für die Tiere, einschließlich von Fischen und Schalentieren, bei gemischt wird, beträgt die optimale Dosierung gewöhnlich 0,1 bis 500 ppm, vorzugsweise 0,5 "bis 100 ppm, wobei die

7 0 9 8 2 5 /D §i> 6"

_BAD

Menge etwas von dem Wachstumszustand des jeweiligen Tieres abhängt. Diese konzentration ist viel niedriger als die Dosierung, die bei verschiedenen Krankheiten der Tiere, einschließlich von Fischen und !Schalentieren, erforderlich ist ο

Wenn Multhiomycin dem Futter beigemi oht wird, kann man d..s kulthiomycin allein im Gemisch mit einem Streckmittel, wie stärke, Traubenzucker, Dextrin, Jalciumcarbonat, Kaolin oder dergleichen, mit einer Zerkleinerungsmaschine, beispielsweise einer Strahlmühle, zu einem benetzbaren Pulver oder staubfeinen lulver o-ier einer suspension vermählen und nach Verdünnung mit einer geeigneten Menge Wasser in einem Futtermittel, .vie Sojabohnenmehl oder Fischmehl, absorbieren oder verteilen, wobei ein Futterzusatz erhalten wird, der 0,5 bis 10/ί Multhiomycin enthält. Diener Futterzusatz wird dann einem Futter in einer solchen Mange beigemischt, dass das Multhiomycin in der vorgeschriebenen Konzentration vorliegt« Wenn das Multhiomycin in Form einer Lösung oder Emulsion vorhanden ist, kann es direkt ooer nach Verdünnung mit Wasser einem Futtermittel in einer solchen Menge zugesetzt werden, dass ein etwa 0,5 bis lO.-j Multhiomycin enthaltender Futter zusatz erhalten wird. Dieser wird dann einem Futter in einer solchen Menge beigemischt, dass das Multhiomycin in der vorherbestimmten Konzentration vorliegt.

Man kann das Multhiomycin jedem allgemein für Tiere, einschließlich von Fischen und Schalentieren, verwendeten Futtermittel zusetzen. Beispielsweise kann es zu Mais, LiIo, ^ojabohnenmehl, Luzernemehl, Fischmehl, üeisklee, ■/eizenmehl, VJeizenkleie, Fetten, Baumwollsamenmehl uswo zugesetzt werden. Man kann es dem Futtermittel auch asammen mit anderen Zusatzstoffen beimischen, beispielsweise mit einem Tensid oder mit Hilfsstoffen, wie Watriumasparaginat, Sorbitanmonostearat, Sorbitanmonolaurat, Tween, Calcium-

7098 25/CT81V BADOR₁G₁NAL

carbonat, Natriumchlorid, Cholinchlorid, Vitamine, Calciumpanthothenat, Niko'tinsäureamid, Folsäure, fiisensulfat, Magnesiumsulfat, Zinksulfat, Kobaltsulfat, Aminosäuren usw. oder anderen Futterzusätzen, wie Sulfonamiden, verschiedenen Arten von Coccidiostatica und anderen Antibiotica und Antiparasitica.

Multhiomycin fördert nicht nur das Wachstum der Tiere, einschließlich von Fischen und Schalentieren, sondern verbessert auch die Futterverwertung, die Legeleistung und die Fruchtbarkeitsziffer und kann die Diarrhöe bei Geflügel verhindern.

Nachstehend seien auf Grund von Versuchen, welche die Förderung des Wachstums von Tieren einschließlich von Fischen und Schalentieren und andere Aspekte zum Gegestand hatten, die physiologischen Wirkungen des Multhiomycins beschrieben.

Beispiel 6

500 Hubbard-Küken (250 männliche und 250 weibliche) wurden dinen Tag nach dem Ausschlüpfen in fünf Gruppen zu je Küken (50 männliche und 50 weibliche) geteilt. Biese Gruppen wurden acht Wochen lang in Bodenlaufställen gefüttert. Das Futter für vier dieser Gruppen enthielt 0,5» 1, 2, bzw. 4- ppm Multhiomycin. Die fünfte Gruppe war eine Kontrollgruppe, deren Futter kein Multhiomycin zugesetzt wurde.

Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4- angegeben. Man erkennt, dass in den mit Multhiomycinzusatz gefütterten Gruppen das durchschnittliche Körpergewicht der 8 Wochen alten Hühner um 6,4 bis 9jO % höher war als bei der Kontrollgruppe und dass die Futterverwertungsziffer um 0,13 bis 0,24· höher war als bei der Kontrollgruppe.

- 25 709825/0866

Tabelle 4 Durchschnittsgewicht in Gramm und Futter-

	0	verwertung	Wochen	1330 1412	8	Futterver wertungs
MuIthiσ πίνο in-		Gewicht im Alter von 2 4 6	685 706	1419		ziffer
zusatζ	43 43		719	1423	1825 1942	2,44 2,31
Kontroll gruppe 0,5 ppm	43	245 245	723	1431	1951	2,30
1,0 ppm	43	247	726		1962	2,25
2,0 ppm	43	250			1989	2,20
4,0 ppm		247
Anme rkungen:

(1) Die in der Tabelle angegebenen Werte sind Mittelwerte

(2) Die Futterverwertungsziffer ist gleich der durch die Körpergewichtszunahme während der ganzen Versuchszeit geteilten Gesamtmenge des aufgenommenen Futters

Zusammensetzung des Grundfutters

(1) Anfangsfutter (in der 1. bis 4. Woche verfüttert)

Mais	24,5
Sojabohnenmehl	12,2
MiIo	4,0
Luzernmehl	6,5
Fischmehl	0,3
Natriumchlorid

- 26 -

709825/0866

Galciumcarbonat Ϊ, 5

Calciumphosphat 1,0

Zusatzgemisch ) 0,5

Zur Verhinderung der Goccidiose wurden

2 ferner 125 Ppm Amprolium plus ) zugesetzt.

(2) Mastfutter (in der 5- "bis 8. Joche verfüttert)

Mais	10,0
Sojabohnenmehl	14,5
MiIo	9,8
Fischmehl	7,0
Fette	3,5
Luzernmehl	0,2
Natriumchlorid	1,5
Galciumcarbonat	1,0
Calciumpho sphat	0,5
Zusatzgemisch )

Zur Verhinderung der Coccidiose vmrden ferner 125 ppm Amprolium plus ) zugesetzt.

' Das Zusatzgemisch enthielt Vitamin a, Vitamin D-,, Vitamin E, Vitamin B-, , Vitamin Bp, Vitamin B^-, Vitamin B-,ρ, Pantothensäure, Nicotinsäure, Cholinchlorid, Folsäure, liisensulf at, Kupfersulfat, Kobalt und Zink.

2)
' Amprolium plus ist ein Warenzeichen für ein Gemisch von Teilen l-(4-Amino-2-propyl-5-pyrimidinylmethyl)-2-picolium-hydrochlorid und 64 Teilen Methyl-4-acetamido-2-äthoxybenzoat.

- 27 -

709825/0866

Beispiel 7

34-

400 Fleischhuhnküken (200 Männchen und 200 w'eibchen) wurden in vier gleiche Gruppen zu je 100 Küken geteilt. Diese Gruppen wurden acht Wochen lang in -°odenlaufställen gefüttert. Dabei war eine Gruppe eine Kontrollgruppe, die mit dem von der Firma Zenno erzeugten, handelsüblichen Futter gefüttert wurde. Dem Futter für die anderen Gruppen war 2 ppm Multhiomycin in "bestimmten Korngrößen "beigemengt worden.

Das Multhiomycin enthaltende Futter wurde wie folgt hergestellt. Ein 2QP/o Multhiomycin in verschiedenen Korngrößen, 4Q# Calciumchlorid, 30% Dextrose, 15% Kaolin und 5?o Sorbitanmonostearat enthaltendes, "benetzbares Pulver wurde mit Wasser verdünnt und dann in Sojabohnenmehl verteilt, wobei ein 2% Multhiomycin enthaltender Futterzusatz erhalten wurde. Dieser Futterzusatz wurde dem Grundfutter in einer solchen Menge beigemengt, dass das Futter 2 ppm Multhiomycin enthielt.

Tabelle 5 Durchschnittsgewicht in Gramm und Futter-

	Verwertung	Korngröße des Multhio- mycins um j	0	Gewicht im 2 4	Alter 6	1323 1380 1389 1438	von 8	Futter- verwer-
Ohne/mit Zusatz von Multhiomycin	52 - 44- 43 - 37 3-5			■Wochen			tungs- ziffer
ohne mit mit mit	42 42 42 42	236 227 242 252	689 695 705 733	1812 1891 1902 1975	2,44 2,34 2,32 2,21

- 28 -

709825/0866

(1) Die in der Tabelle angegebenen Verte sind Mittelwerte.

(2) Die Futterverwertungsziffer ist gleich der durch die Körpergewichtszunähme während der ganzen Versuchszeit geteilten Gesamtmenge des aufgenommenen Futters.

Zusammensetzung des Grundfutter

Futtermittel

Mais

Sojabohnenmehl MiIo

Fette

Luzernmehl Fischmehl Natr iumchlorid Calciumcarbonat Calciumphosphat Futterzusatz )

Amprolium ) (zur Verhinderung der Coccidiose)

) Das Zusatzgemisch enthielt Vitamin A, Vitamin D^, Vitamin E, Vitamin B-, , Vitamin Bp, Vitamin Bg, Vitamin B-, ρ, Pantothensäure, Nicotinsäure, Cholinchlorid, Folsäure, Sisensulfat, Kupfersulfat, Eobalt und Zink.

) Amprolium ist ein Warenzeichen für ein Gemisch von 1000 Teilen l-(4-Amino-2-propyl-5-pyi'imidinylmethyl)-2-picoliumhydrochlorid und 64 Teilen Methyl-^-acetamido^-äthoxybenzoat.

- 29 -

709825/0866

in der 1. bis 4.	m der 5* bis 8
Woche	,Vo ehe
49,5	52,0
24,5	10,0
12,2	14,5
-	7,0
4,0	3,5
6,5	9,8
0,3	0,2
1,5	1,5
1,0	1,0
0,5	0,5
	125 ppm

Beispiel 8 ·

600 Legehennen (weißes Leghorn) wurden im Alter von 180 Tagen in drei Gruppen zu je 200 Hennen geteilt. Diese Gruppen wurden sechs Monate lang gefüttert. Dabei war eine Gruppe eine Kontrollgruppe, die mit dem handelsüblichen futter für Legehennen gefüttert wurde. Das Futter für die beiden anderen Gruppen enthielt Multhiomycin in einer Menge von 2 ppm bzw. 10 ppm. Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 6 angegeben. Man erkennt, d^,ss die mit dem Multhiomycinzusatz gefütterten Gruppen eine viel bessere Legeleistung hatten.

Tabelle 6 Durchschnittliche Legeleistung (%)

Zusatz von Im

Multhio- ~T T. Jl Wl T. ST" myzin Monat nach Versuchsbeginn

?4-,2 80,5 81,2 82,1 82,0 82,5

2 ppm 75,0 82,3 83,5 84,5 85,0 86,4

10 ppm 74,8 82,9 85,4 85,6 85,7 87,1

Beispiel 9

40 entwöhnte Ferkel (21 Tage alt) wurden in vier Gruppen geteilt und vier Wochen lang mit einem handelsüblichen Ferkelfutter gefüttert. Die eine Gruppe war eine Kohtrollgruppe, deren Futter kein Multhiomycin enthielt. Dem Futter für die anderen Gruppen wurde Multhiomycin in einer kenre von 5, 10 bzw 20 ppm zugesetzt. Nach dem Versuch y.'iir 9ά ei?... ο "Körpec^cv/icht und die j'ut berverwertung ν es ti'mat.

709825/08¥k~ ^₀ original

Die Versuchserf/sünisse sind in lev ^r^belle 7 angegeben, kan erkennt, dass die nit dem Liulthionrycinzusatz gefütterten Ferkel ein um 12,3 bis 15,7 ,'» höheres Körpergewicht hatten als die Ilontrollgruppe und dass auch -die j?ut terver\»^rertungsziffer um 0,32 bis 0,37 höher lag als bei der Kontrollgruppe.

	Tabelle 7	rpergewicht in Kilogramm	6	Gewicht	nach	,21	4	,45	jfutterver-
	Ko	und Futterverwertung	6	12 3	,00		,10	vertungs-
Durchschnittliches			6	ü'ochen	,44	13	,35	ziffer
			6	,44 8,55 11	,31	15	,56
		bei		,90 9,20 12		15		2,02
Zusatz von		Versuchs		,52 9,44 12		15		1,70
Multhiomycin	beginn	,75 9,44 12				1,68
	4,43				1,65
	4,21
Kontroll gruppe	4,50
5 ppm	4,35
10 ppm
20 ppm
Anmerkung:

Die in der Tabelle angegebenen ,erte sind Littelwerte

Beispiel 10

80 Schweine, und zwar Bastarde der ersöen Jiliclgeneracion einer Kreuzung von Landra3..;e un.l Hampshire, In 11\;ü.;:· von zehn . ochen vvurden sie in vier Gruppen zu je 20 jch^einen (10 Männchen und 10 /eibchen) jeteilt und sehn .,"ochen I^iiq gefüttert. Die eine Gruppe »/ar eine i-ontroll, jruppe, lie rait gewöhnlichem B'utter gefüttert ,vurde. Dem ^u. teer für die

— '■ 1 —

709825/0866

sr-

anderen Gruppen wurde Multhiomycin in einer Menge von 5, 50 "bzw, 100 ppm zugesetzt. Die .Srgebnisse sind in der nachstehenden 'Tabelle 8 angegeben, äbi J3n&e des Versuches war das durchschnittliche Körpergewicht der mit dem Zusatz von Multiiiomycin gefütterten Schweine um 11,4- bis 16,1 %. höher als das der Schweine der Eontrollgruppe. Die j?utterveriiertungsziffer war auch um 0,25 "bis 0,4-5 höher als bei der Kontrollgruppe.

Tabelle 8 Durchschnittsgewicht in Kilogramm und Futter-

	verwertung	Gewicht	2	'if VV	nach	8	10	Futterver
Zusatz von			26,0 27,0 27,5 26,9	35,2 37,5 38,0 37,9	6 ochen	50,3 54-,5 56,2 57,8	60,4- 67,3 69,4- 70,1	wertungs
Multhiomycin	bei Versuchs beginn			4-3,2 4-5,5 4-7,8 4-5,9			ziffer
Kontroll- gruppe 5 ppm 50 ppm 100 ppm	21,3 20,1 20,9 21,0				3,66 3,4-1 3,38 3,21

Anmerkung: Die in der Tabelle angegebenen 77erte sind Mittelwerte .

Zusammensetzung des Grundfutters

Mais

Sojabohnenmehl 13,0 MiIo 10,0

Entfettete Heiskleie 5,0

- 32 -

709825/0866

•	Gerste	3t.
Fischmehl	8,0
Luzernmehl	8,0
G ale iumc art) ο nat	4,0
Calciumphosphat	1,4
Natriumchlorid	0,7
Zusatzgemisch	0,5
0,5

) Es wurde dasselbe Zusatzgemisch verwendet wie im Beispiel 6

Anmerkung:

In den Beispielen 6, 8, 9 und 10 wurde das Multhiomycin dem Futter zugesetzt, indem dieses mit einer Lösung von Multhiomycin in Aceton besprüht und das Aceton danach von dem Futter entfernt wurde.

Beispiel 11

In einer Zuchtfarm wurden 100 Hamachi (der japanische Farne für junge GeIbschwänze) 21 Tage lang gezüchtet, wobei sie mit einem Multhiomycin enthaltenden Futter gefüttert wurden, das als Grundfutter das von der Firma Japan Haigoshiryo Co., Ltd., erzeugte Futtermittel unter der Bezeichnung "Feed Stuff for Fingerlings" enthielt.

Nach dem Versuch wurden verschiedene Faktoren, beispielsweise die Körpergewichtszunähme, gemessen, und wurde die Anzahl der noch am Leben befindlichen Fische ermittelt.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 angegeben.

- 32a -

709825/0868

Tabelle 9

Mit Multhiomycin Kontrollgruppe

E enthaltendem (nur mit dem

Futter gefütterte Grundfutter

Fische gefüttert

Anzahl der anfänglich

eingesetzten Hamachi 100

Anfängliches durchschnittliches Körpergewicht (g) 10,6

Gesamtgewicht der eingesetzten Fische (g) Anzahl der toten Fische Anzahl der lebenden Fische

Gesamtgewicht der lebenden Fische bei Versuchsende (g)

Durchschnittliches Körpergewicht der lebenden fische
bei Versuchsende (g) 38,9

Zunahme des Gesamtgewichts der
lebenden Fische (g) 2752

Gesamtmenge des verabreichten
Futters (g) 18438

100

10,5

1060	1050
2	13
98	87
3812	3L58

Futterverwertungsziffer

6,7

36,3 2108

17920 8,5

Aus der Tabelle 9 geht hervor, dass bei den Fischen, die mit einem Multhiomycin enthaltenden Futter gefüttert wurden, die durchschnittliche Körpergewichtszunahme um ψ/ο und die Gesamtkörpergewichtszunahme um 51$ größer war als bei den Fischen der Kontrollgruppe, die mit einem kein Multhiomycin enthaltenden Futter gefütuert wurden, und

- 32b 7 09825/0866

dass auch hinsichtlich der Überlebensrate und der j'utterverwertungszifier eine beträchtliche Verbesserung erzielt wurde.

Beispiel 12

In einer Zuchtfarm wurden 20ü Aale 70 Tage lang gezüchtet und dabei mit einem butter gefüttert, das neben einem G-rundf utter, das aus dein von der Firma Japan Haigoshiryo Co., Ltd. erzeugten ^!t.7eed „tuff for "^eI Fingerlings" bestand, 2CO ppm llul-chiom.ycin enthielt.

Nach dem Versuch wurden verschiedene .'/erte bestimmt, beispielsweise die Körpergewichtszunähme und die Anzahl der noch am Leben befindlichen Aale.

Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 10 angegeben.

- 32c -

BAD ORIGINAL

709825/0866

33.

Tabelle 10

Anzahl der anfänglich eingesetzten Aale

Mit Multhiomycin δ enthaltendem butter gefütterte Fische

200

Kontrollgruppe (nur mit dem Grundfutter gefüttert)

200

Anfängliches durchschnittliches Körpergewicht (g)

1,30

1,31

,esaiatge\7icht der eingesetzten Aale (g)

Anzahl der toten Aale 260
0

262 14

Anzahl der lebenden Aale 260

186

Gesamtgewicht der lebenden ixale bei Yersuchsende (g)

1989

1209

Durchschnittliches Körpergewicht der lebenden Aale bei Versuchsende (g)

Zunahme des Gesamtgewichts der lebenden Aale (g)

Gesamtmenge des verabreichten Futters (g)

Futterverv/ertungs ziffer

7,65	7	,65
1726	1231
2098	1956
1,22	1	,62

Aus der Tabelle 10 geht hervor, dass bei den Aalen, die

mit einem Multhiomycin enthaltenden Futter gefüttert wurden, die durchschnittliche Körpergewichtszunahme l&fo und die

- 32d-

709825/0866

NACHQEREICHT

P 26 47 158.9 18 804 W/li

vom 19. Oktober 1976 9. März 1977

Gesamtkörpergewichtszunähme 27 % größer war als bei den Fischen der Kontrollgruppe, die mit einem kein Multhiomycin enthaltenden Futter gefüttert worden waren, und daß auch hinsichtlich der Überlebensrate und der Futterverwertungsziffer eine beträchtliche Verbesserung erzielt
wurde.

Die Verwertung der Erfindung kann durch gesetzliche Bestimmungen, insbesondere durch das Futtermittelgesetz,
beschränkt sein.

709825/0866

Claims

1." Verfahren zur Förderung des achstums von Tieren, einschließlich von Fischen und jchalentieren, dadurch gekennzeichnet, dass den Tieren aas .-ircibioticuia Lultliio mycin verabreicht wird.

2. Verfahren nach ,mspruch 1, dadurch r^ekennzoichnet, dass las MulthioEiycin in einem /racer oder Trinkwasser für die Liere, einschließlich von -"'ischen und Schalentieren, in einer Menge von 0,1 bis 500 ppm enthalten ist.

'!). Ltoffzusammensetzung zur itör-ierung des .achstums von Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass es Multhioiaycin und einen inerten Träger enthält.

4. Et of !Zusammensetzung ny.ch Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form einer Suspension, Emulsion, Lösung, eines benetzbaren Pulvers, eines staubfeinen Pulvers oder von Tabletten vorliegt.

•j. Gtoffzusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie iZulthiomycin in einer Korngröße von 1 bis 100 um enthält.

6. butter oder Trinkwasser, dadurch gekennzeichnet, dass es Iv'ulthioiii/cin in einer Horngröße von 1 bis ICG ui.: in jform eines benetzbaren Pulvers, eines staubfeinen Pulvers oder einer Suspension enthält.

7. !Futter oder Trinkwasser nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es 0,00005 bis 10 G-ewichtsprozent Multhiomycin enthält.

8. !Verfahren zum Erzeugen von Mulbhiomycin, dadurch ge- ^-^ kennzeichnet, dass ein otamm der Gattung Streptomyces

ORIGINAL INSPECTED

709825/0866

2647 Ib8

'L-

in einem liährjredium -^ezilchr.et wird, das eine schwefel haltige Carbonsäure enthalt.

9· Verfahren nach ...ncpruch S, dadurch ^ek^n dass d'ij .".ch./ef elh^r-l .:i-";e Carbonsäure eine .?clr»vefelhslüi^e Amineüaur; iub.

10. '/"erfahren nach .nspruch c, dnäurch .;eV.ennzclehnet, dass el .κ 3 J uhr medium, -'ie sch. ^eTsIh ilji^e >rbons?"u.re in einer Menrje von C,CCOJ? bis 5 Gewichtsprozent enthält .

11. ¥erfe.hren zum biologischen Erzeugen von k

dadurch gekennzeichnet, dass d.io ITährmedium ?.ui* oinen pH-..^rert von 4,0 bis 9₅O eingesoellt wird.

12. '/erfahren nach Anspruch 11, dadurch gekenazeicb.net, dass zum liinstellen aes pH- "erts eine MineralsÜ.ura ver ■»venöet wird.

13ο Verfahren zum IZxirrnhieren von Multhiomycin, dadurch gekennzeichnet, dass als Lüsung.smituel ein Gemisch aus einem .,Ikoliol und einem hnlo^enierten Eohlen-a.-acser stoff ver^:--7endet ;.^rird.

14. '/"erfahren zum ixtrehieren von liulthiomycin, dadurch gekennzeichnet, c.ass als Lös ^n-j3mitbel ein Go-iaisch -,.us einem Keton un-_ oinem ,-.lkohol "/er;, rundet u-ira.

15· Verfahren nach ,.nspruch 1$, dadurch gekennzeichnet, dass als Alkohol ein Alkohol mit 1 bis vier C-Atomen oder Methylcellosolve und als halogenierter Eohlen-7/asserstof J ein mono- oder polyhalogeniertes Alkyl verwendet wird.

709825/0866 bad original

Ί'ί. i^r::-r-Vliren n-.cli einem 'er Ji.jj_yrüche 1) bio 1?, oadu.-ch -/skeiirzcicanet, a-iOb r .? -."renisch 1 'I'eil llko-Iiol and 0,1 "bis 2ü !.'eile h-ilo_b-'5nierten ..ohlenv;asser- ■ζιοϊ± o.rrch-^:--lto

BAD ORIGINAL

70982S/0666