DE958242C

DE958242C - Herstellung des Antibiotikums Cycloserin

Info

Publication number: DE958242C
Application number: DEC10524A
Authority: DE
Inventors: Roger D Harned; Eleanore K Labaw
Original assignee: Commercial Solvents Corp
Current assignee: Commercial Solvents Corp
Priority date: 1954-04-21
Filing date: 1955-01-04
Publication date: 1957-02-14

Description

AUSGEGEBEN AM 14. FEBRUAR 1957

C 10524 IV a 130 h

Die Erfindung betrifft die Herstellung des Antibiotikums Cycloserin.

In den letzten 10 Jahren sind zahlreiche neue Antibiotika entdeckt worden, die wertvolle therapeutische Eigenschaften besitzen. Gleichzeitig aber sind zahlreiche antibiotische Mittel aufgefunden worden, die wegen ihrer Giftigkeit und ihrer engen antibakteriellen Wirkungsbreite, wenn überhaupt, nur sehr geringen therapeutischen Wert haben. Viele Antibiotika, deren wertvolle therapeutische Eigenschaften festgestellt worden sind, sind nur gewissen pathogenen Organismen gegenüber wirksam, bzw. ihre Anwendbarkeit sinkt ab, weil sich widerstandsfähige Stämme pathogener Organismen entwickeln, die nicht mehr auf das betreffende Antibiotikum ansprechen. Diese Erwägungen lassen erkennen, daß neue Antibiotika gebraucht werden, um die durch pathogene Organismen ausgelösten Erkrankungen zu bekämpfen.

Das neue Antibiotikum ist ein antibakterielles Mittel mit großer Breitenwirkung, das sowohl gramnegativen als auch grampositiven Bakterien einschließlich der Mykobakterien, z. B. Mycobacterium ranae, gegenüber wirksam ist. Dieses neue Mittel

kann leicht aus einem bisher noch nicht beschriebenen Mikroorganismenstamm hergestellt werden, der als Streptomyces sp. JN-21 bezeichnet worden ist. Der Organismus wurde aus dem Boden einer Farm in Pennsylvania isoliert und die Kultur durch mehrfache Isolierung einzelner Kolonien gereinigt.

Cycloserin ist eine amphotere Substanz, die schwach saure und schwach basische Gruppen besitzt. Die antibiotische Verbindung ist in Wasser sehr gut und in Glykolen, Isopropylalkohol, Methanol, Äthanol und Aceton nur teilweise löslich. Sie ist unlöslich in Hexan, Benzol, Chloroform, Äther, Petroläther, Dioxan, i-Butanol, Äthylacetat und Äthylendichlorid.

Kristallines Cycloserin, das im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet worden war, enthielt auf Grund der chemischen Analyse Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff in folgenden Mengen: 35.14% C, 5.95% H, 26,6% N, 3L34% O (aus der Differenz), 0,97 °/₀ Asche.

Das neue Antibiotikum hat einen Stickstoffgehalt nach Van Slyke von 12,9% und die optische Drehung

(C = 2 %, L=I dm) in wäßriger Lösung. Das Antibiotikum ist in einer amorphen und in einer kristallinen Form isoliert worden; im letzteren Fall bildet es lange, ziemlich große, weiße Nadeln. Cycloserin hat das Molekulargewicht 102 und zeigt charakteristische UV-Licht-Absorption bei einer Wellenlänge von 224 Mikron. Das kristalline Antibiotikum erweicht bei 133,8° und schmilzt unter Zersetzung bei 137,2°. Der Schmelzpunkt wurde in einem Thiele-Rohr (Badtemperatur 130°) bestimmt, wobei die Temperatur des Antibiotikums je Minute um io° gesteigert wurde. Die Verbindung sublimiert im Vakuum bei ioo° langsam.

Reines, umkristallisiertes Cycloserin ist in Wasser löslich, in Glykolen, Isopropylalkohol,. Methanol, Äthanol, Dioxan, i-Butanol und Aceton etwas löslich und in Hexan, Benzol, Chloroform, Äther, Petroläther, Äthylacetat und Äthylendichlorid unlöslich. Auf Grund der chemischen Analyse enthielt reines, umkristallisiertes Cycloserin Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff in folgenden Mengen: 35.49% C, 6% H, 26,55% N, 31.96% O (aus der Differenz). Reines, umkristallisiertes Cycloserin hat die optische Drehung

(C = 5%, L = 2 dm, 2 n-NaOH-Lösung). Reines, umkristaliisiertes Cycloserin hat den scheinbaren Schmelzpunkt 155 bis 157°, wenn man ihn auf dem Schmelzpunktsblock nach Fisher-Johns bestimmt und die Temperatur des Cycloserine um 6° pro Minute steigert.

Bei der Ninhydrinprobe bildet die neue antibiotische Verbindung eine gelblichbraune Färbung. Der neue Stoff reagiert mit Cupri-Ionen unter Bildung einer grünen Färbung in wäßriger Lösung, mit Eisen entsteht in wäßriger Lösung eine rötlichbraune Färbung. In beiden Fällen wird die antibiotische Wirksamkeit zerstört.

Mit ι η-Salzsäure wird Cycloserin bei 140⁰ hydrolysiert. Wenn man das Hydrolysat auf Papier chromatographiert, ergibt die Substanz, die dann gebildet wird, eine Ninhydrinreaktion, die für α-Aminosäure typisch ist. Das neue Antibiotikum wird durch wäßrige Permanganatlösung und durch Bromwasser oxydiert; beide Lösungen werden durch Zusatz von Cycloserin entfärbt. Das Antibiotikum wird in wäßriger Lösung bei Zusatz von wenig Peroxyd nicht entaktiviert.

Die Infrarotabsorptionsspektren wurden an einer Suspension untersucht, die durch Aufschwemmung von hochreinem umkristallisiertem Cycloserin in Mineralöl erhalten wurde. Das Infrarotabsorptions-Spektrum der Substanz ist in der Fig. 1 wiedergegeben. Die Kurve zeigt charakteristische Absorptionen bei folgenden Wellenlängen (in Mikron): 6,15; 6,55; 6,65; 7,2; 7,4; 7,5; 7,85; 8,2; 8,6; 8,8; 9; 9,4; 10,65; 10,9; 11,3; 11,4; 12,05; 12,5; 13,25 (von der Kurve abgelesen).

Von diesem Antibiotikum kann man ein kristallines Silberderivat herstellen, indem man eine lösliche Silberverbindung, z. B. Silbernitrat, zu einer wäßrigen Lösung des Antibiotikums gibt, wobei deren p_H 6,5 sein soll. Das kristalline Silber derivat fällt aus der wäßrigen Lösung in Form quadratischer Plättchen aus. Das Silbersalz, um das es sich hier wahrscheinlich handelt, wurde dann ebenfalls in einer Mineralölemulsion auf sein Infrarotabsorptionsspektrum untersucht. Dieses wird in der Fig. 2 wiedergegeben. Wieder gibt die mit »A« bezeichnete Kurve das Spektrum des reinen Mineralöls und die mit »B« bezeichnete Kurve· das Spektrum der Mineralölemulsion des Silberderivates wieder. Bei folgenden (in Mikron bezeichneten) Wellenlängen sind charakteristische Absorptionsbanden festzustellen: 6,17; 6,3; 6,37; 7.09; 7.5; 7.9; ⁸.72; 9.05; 9.73; 10,15; 10,35; ιι,ιι; 12,17. Laut Analyse enthielt das Silbersalz: 50% Ag, I₇, 41% C, 2,81% H, 13,12% N, 16,66 °/₀ O (aus der Differenz), 50,44% Asche.

Cycloserin reagiert in einer Aceton-Wasser-Mi-SQhung unter Bildung eines kristallinen Derivats, das nicht biologisch aktiv ist. Dieses kristalline Derivat hat folgende Zusammensetzung 50,69% C, 7,2% H, 19,66% N, 21,64% O, 0,81% Asche.

Das neue Antibiotikum kann aus einer wäßrigen Lösung auf einem stark basischen Anionenaustauschharz in der OH-Form absorbiert und aus solchen Harzen durch andere Anionen als OH, z. B. Acetat, Formiat, Chlorid, Sulfat usw., eluiert werden. Das Antibiotikum kann auch durch stark saure Kationenaustauschharze in der Wasserstofform aus wäßriger Lösung adsorbiert werden.

Die antibakterielle Wirksamkeit des Cycloserine wird in Einheiten gemessen. Eine Einheit ist dabei der Wirksamkeit einer Penicillineinheit äquivalent, wenn die Penicillinplattenmethode mit Penicillin als Standard angewandt wird. Reines kristallines Cycloserin hat eine Aktivität von ungefähr 5 Einheiten/mg.

Das Antibiotikum ist sowohl grampositiven als auch gramnegativen Bakterien gegenüber wirksam. In der folgenden Tabelle ist die antibakterielle Wirkungsbreite angegeben, die nach der Agarverdünnungsmethode unter Verwendung von Streptomycinversuchsagar erhalten wurde.

Tabelle ι
Antibakterielle Wirkungsbreite

Organismus

Pseudomonas aeruginosa

Bodenheimers Bacillus

Bacillus mycoides

Micrococcus pyogenes var. aureus

Escherichia coli

Proteus vulgaris

Mycobacterium ranae

Streptococcus fäcalis

Streptomycin widerstehender
Micrococcus pyogenes var. aureus

Mindest-Hemmkonzentration Einheiten/ccm

o,8 1,6 0,2 0,2 0,2 0,2

0,1

Der Cycloserin erzeugende Organismus, Streptomyces sp. JN-2I, bringt ein langes sich verzweigendes Mycelium an der Luft hervor, das gut entwickelt ist und gewöhnlich-graurosa aussieht. Aus den Hyphen zweigen sich lange gerade Sporophoren ab. Die Konidien sind oval bis zylindrisch und 1 bis 1,5 χ i,5 bis 2 Mikron groß. Die Ketten setzen sich gewöhnlich aus 30 bis 50 Konidien zusammen. Der Organismus ist mesophil und zeigt über 37⁰ nur schwaches Wachstum. Er ist aerob und erzeugt in einigen Medien ein lösliches Pigment, das bei der Entstehung gewöhnlich braun ist.
In der Morphologie, den Wachstumseigentümlichkeiten und in den biochemischen Reaktionen wurden folgende Merkmale beobachtet, wenn der Organismus Streptomyces sp. JN-21 auf folgenden bei 28° gehaltenen Substraten wachsen gelassen wurde:

Glukose-Asparagin-A'gar: Mäßiges Wachstum, wobei der Hang mit graurosa Mycelium gut bedeckt ist, in welchem weiße Büschel eingestreut sind. Die Riesenkolonie hat ein gedrücktes Lavendelzentrum (schwachbläuliche blaurote Färbung). Die Kolonie ist graurosa mit einem weißen Rand. Ein lösliches Pigment wird nicht gebildet. Die Kolonie ist etwas erhöht und hat einen glatten Rand. Sporenbildung und Mycelwachstum an der Luft sind stark. Die Rückseite ist rosa mit gelber Mitte. Die Konidien bilden lange Ketten von 1 bis 1,5 χ i,5 bis 2 Mikron.

Auf der Oberfläche des Myceliums entsteht etwas Exudat. Die einzelne Kolonie weist nach istägigem Wachstum ungefähr einen Durchmesser von 16 mm auf.

Gelatinesubstrat: Das Wachstum ist mäßig. Etwa die Hälfte des Röhrchens wird innerhalb 15 Tagen verflüssigt. Dunkelgraues Mycelium haftet an der Oberfläche und der Seitenwand des Rohres. Mit fortschreitender Verflüssigung bildet sich innerhalb von 24 Stunden ein sehr dunkles Pigment, das nur in den flüssigen Teil hineindiffundiert.

Lackmusmilch: Das Wachstum ist ausreichend, wobei das olivgrüne Mycelium an der Rohrwand haftet. In der oberen Hälfte des Rohres bildet sich ein bläulichpurpurnes Gebilde, im unteren Teil ein braunes Gebilde aus. Geruch ist nicht wahrnehmbar. Ohne Flockung erfolgt eine Peptonisierung, wobei das p_H langsam alkalisch wird. Das Wachstum erfolgt langsam; 7 Tage sind erforderlich, ehe sich ein Häut^ chen bildet.

Glukosenähragar: Auf dem Hang entwickelt sich ein sehr starkes Wachstum. Die Riesenkolonie weist ein Lavendelzentrum mit einem kleinen weißen Rand auf. Der größte Teil der Kolonie ist grau. Ein Pigment entsteht nicht. Innerhalb von 15 Tagen hat die Kolonie einen Durchmesser von 25 mm. Die Konidien bilden zu 30 bis 50 gerade Ketten. Sie sind 1 bis 1,5 X 1,5 bis 2 Mikron groß und fast zylindrisch.

Nähragar: Das Wachstum auf dem Hang ist äußerst dürftig. Die Riesenkolonie hat ein blaugraues Zentrum mit weißem Rand. In 15 Tagen beträgt der Durchmesser der Kolonie 11 mm, wobei sich am Außenrand fleischfarbenes, wie Pflanzen wachsendes Mycelium entwickelt. Die Rückseite weist eine lohfarbene Mitte auf; der Rest der Kolonie ist kremfarben. Ein Pigment entsteht nicht. Die Morphologie der Konidien und ihre Anordnung ähnelt der von Glukoseagar.

Kartoffelpfropf: Sehr starkes Wachstum von graugrüner Farbe und starker Kräuselung. Die Kultur hat eine glatte Oberfläche mit einigem weißem, an der Luft entwickeltem Mycelium. Innerhalb von 24 Stunden ist ein braunes Pigment erkennbar, das in Grünlichgrau übergeht und durch die Kartoffel diffundiert. Bleiacetatagar: Das Wachstum ist dürftig und weist sehr wenig an der Luft entwickeltes Mycelium und Sporen auf. H₂S wird nicht gebildet. Durch das Medium diffundiert etwas braunes Pigment. Nach 15 Tagen hat sich eine harte, glatte, blanke Oberfläche ausgebildet. Die Rückseite der Kolonie ist braun.

Calciummalat: Das Wachstum ist schlecht. An der Luft breitet sich das Mycelium strahlenförmig aus. Es entsteht kein lösliches Pigment. Auch wird keine Aufhellung um die Kolonie herum festgestellt. Man verwendet Calciummalat. In 15 Tagen weist die Kolonie einen Durchmesser von 10 mm auf. Sie ist dünn und verbreitet sich in einem Mycel, das weiß und körnig aussieht. Auf der Myceloberfläche entsteht ein schäumendes Exudat in sehr Meiner Menge. Die Rückseite ist hellgrün. Die Konidienketten sind kurz und enthalten 10 bis 20 Konidien pro Kette. Stärkenitratagar: Das Wachstum ist mäßig. Die Kolonie weist ein blaugraues Zentrum mit konzentrischen Ringen auf und ist matt zur Oberfläche des Agars. Ein lösliches Pigment entsteht nicht. Als Kohlenstoffquelle wird Stärke und als Stickstoffquelle NO₃ benutzt. Die Kolonie hat nach 15 Tagen einen Durchmesser von 14 mm.

Stärkeagar B: Das Wachstum ist mäßig, aber besser als bei Stärkenitratagar. Die Kolonie hat eine schwach bläuliche Oberfläche mit rauhen Kanten und weist

in 15 Tagen einen Durchmesser von 20 mm auf. Ein lösliches Pigment wird nicht gebildet. Der Organismus kann als Kohlenstoff quelle Stärke und/oder Asparagin benutzen. Er kann das Asparagin und/oder Nitrate auch zur Deckung seines Stickstoffbedarfs benutzen. Die Konidien bilden gerade Ketten mit 50 bis 80 Konidien pro Kette. Sie sind oval bis zylindrisch und ι bis 1,5 X i,5 bis 2 Mikron groß.
Emersons Agar: Das Wachstum ist mäßig. Es

bilden sich hellgraue Mycelien aus, die mit weißen Büscheln durchsetzt sind. Innerhalb von 24 Stunden tritt schnelles Wachstum ein. Die Rückseite ist nach 15 Tagen mittelbraun mit kremfarbenem Rand. Innerhalb von 15 Tagen wird ein hellbraunes Pigment erzeugt. Die verhältnismäßig kurzen Konidienketten enthalten 10 bis 20 Konidien je Kette, wobei das Konidium 1 bis 1,5 χ i,5 bis 2 Mikron groß ist.

Tyrosinagar: Das Wachstum ist sehr schlecht. Es bilden sich nur an der Luft Mycelien mit geringer Sporenbildung. Die Kolonie ist bakterienähnlich, sehr klein mit rauhen Rändern und einem Durchmesser von 5 mm. Die Rückseite der Kolonie ist gelb. Pigment entsteht nicht. Die Konidienketten sind gerade und enthalten 20 bis 25 Konidien je Kette.

as Tyrosin und/oder (NH₄)₂SO₄ sind schlechte Stickstoffquellen.

Kobalt-Amidex-Agar: Das Wachstum ist innerhalb von 24 Stunden sehr stark, innerhalb von 15 Tagen entsteht eine tiefe Lavendelfarbe mit einem orangegelbbraunen Ring in der Nähe des hellgrauen Randes. Die Kolonie hat einen Durchmesser von 23 mm. Es wird ein hellbraunes Pigment gebildet. Die Rückseite der Kolonie ist hellohfarben mit kremfarbenem Rand. Die Konidienketten enthalten 30 bis 50 Konidien je Kette, wobei die Konidien 1 bis 1,2 χ i,3 bis 1,5 Mikron groß sind.

Bennetts Agar: Das Wachstum ist zuerst spärlich und weiß, wird aber dann stärker, graurosafarben, wobei die an der Luft entwickelten Mycelien weißgestreift sind. Die Kolonie hat innerhalb von 15 Tagen einen Durchmesser von 20 mm. Das Wachstum läßt nach und ist nach 3 Tagen erloschen. Die Kolonie ist graurosa mit einem weißen unregelmäßigen Rand. Die Rückseite ist kremfarben hellbraun. Es entsteht ein hellbraunes Pigment. Die geradkettigen Konidien bestehen aus 30 bis 50 Konidien und sind 0,8 bis 1 χ ι bis 1,5 Mikron groß. Die Konidien selbst sind oval bis zylindrisch.

Natriumalbuminatagar: Das Wachstum ist innerhalb von 15 Tagen dürftig bis mäßig. Die Mycelien sehen schön, grau und schimmelähnlich aus. Dieses Aussehen verschwindet langsam. Die Kolonie ist groß und weist nach 15 Tagen einen Durchmesser von 23 mm auf. Die Sporenbildung erfolgt strahlenförmig vom Koloniezentrum aus und geht in ein dünnes, farbloses Mycelwachstum über. Die Rückseite der Kolonie ist kremfarbenrosa. Der Durchmesser, der Konidien beträgt 1 bis 1,2 X 1,5 bis 1,7 Mikron. Ein Pigment wird nicht gebildet.

Bisher ist von keiner der bekannten Formen des Cycloserins gezeigt worden, daß sie in der Humantherapie anwendbar ist. Gezeigt worden ist jedoch, daß es als Ergänzung zum Futter von Tieren und ins-' besondere Geflügel als Wachstumsförderer wirkt. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse von Wachstumsuntersuchungen an Küken zusammengestellt, aus denen die mittlere Gewichtszunahme je Gruppe von 20 Küken, die mit dem üblichen Futter ernährt wurden, gegenüber dem durchschnittlichen Gewicht einer Gruppe von 20 Küken, die daneben als Ergänzung 1 % Futter mit 0,3 Einheiten von Cycloserin je mg erhielten, hervorgeht. Die Zahlen stellen den Durchschnitt der dreifachen Kükenmenge· für die Kontrollen und der doppelten Kükenmenge bei der Ernährung mit cycloserinhaltigem Futter dar. Die Küken wurden am Tage ihres Schlüpfens in die Prüfung aufgenommen, die 30 Tage danach abgeschlossen wurde.

Tabelle II

Kükenwachstumsuntersuchung mit Cycloserin

Ration

Grundnahrung..
Grundnahrung
+ Cycloserin.

Durchschnittliches Kükengewicht in g

weiblich männlich insgesamt

290
297

283
356

287
327

Das Antibiotikum wird durch den obenerwähnten Organismus Streptomyces sp. JN-21 in geeigneten Nährmedien erzeugt. Dabei befriedigen Medien, die eine geeignete Eiweiß- und eine geeignete Kohlenhydratquelle enthalten, wobei das Nährmedium mit Luft versorgt wird, nachdem es bei 20 bis 30⁰ bebrütet worden ist. Im allgemeinen wird im vorliegenden Fall eine bei 28° liegende Temperatur zur Kultivierung des Organismus in einem Nährmedium bevorzugt.

Die besten Eiweißsubstanzen, die als Stickstoffquelle in Nährmedien zur Cycloserinerzeugung benutzt werden können, sind Sojabohnenprodukte, zu denen Sojabohnenölmehl, reguläres Sojabohnenmehl, völlig geröstetes Sojaschrot, feingemahlenes raffiniertes Protein aus Sojabohnen, ein trockenem Sojabohnenmehl ähnliches Produkt usw. gehören. Als weitere Quellen können benutzt werden Alfalfamehl, Aminosäurekuchen, Milchpulver, Weizennährmittel, getrocknete Weizenabfälle, gemahlener Weizen, Casein, Osseinkonzentrat (konzentriertes Albumin, das nach der Behandlung von Bohnen mit verdünnter H Cl zurückbleibt), enzymatische Produkte des Lactalbumins usw. Diese zuletzt genannten Stoffe erzeugen im allgemeinen aber geringere Cycloserinmengen als Sojabohnenprodukte.

Eine geeignete Kohlenhydratquelle in Nährmedien ist Glukose. Außerdem kann man Saccharose, Lactose, Maltose, Stärke, Glycerin usw. verwenden.

Es wurde gefunden, daß die Ausbeuten im allgemeinen größer werden, wenn man dem Nährmedium Calciumcarbonat zusetzt. Zur Höchsterzeugung von Cycloserin soll das Medium 0,25 bis 4% Kohlenhydrat und 0,25 bis 5 Gewichtsprozent eiweißhaltige Substanz enthalten. Es empfiehlt sich, 0,1 bis 1,5 Gewichtsprozent Calciumcarbonat anzuwenden. Bevorzugt wird zur Herstellung des neuen Antibiotikums ein

Medium benutzt, das 3 % raffiniertes Sojabohnenmehl, 2 % Glukose und 0,3 % Calciumcarbonat enthält.

Da der Streptomyces sp. NJ-21 ein aerober Organismus ist, muß dem Nährmedium Luft zugeführt werden, wobei sich ein Umrühren empfiehlt, um die Luft in dem Nährmedium gut zu verteilen. Diese Manipulationen sind in der Technik hinreichend bekannt. Gewöhnlich muß man zum Nährmedium während der Fermentation ein Antischaummittel geben, wozu sich z. B. Mineralöl, Specköl usw. eignen. Die folgenden Beispiele erläutern die Erzeugung von Cycloserin.

Beispiel 1

1040 1 Medium aus 3% Sojabohnenmehl, 2% Glukose, 0,5 % Calciumcarbonat, Specköl als Antischaummittel nach Bedarf wurden in einer Fermentiervorrichtung mit einer Kultur des Streptomyces sp. JN-21 beimpft. Das Medium wurde mit 0,55 cbm Luft je Minute unter einem Druck von 0,7 at belüftet. Die Fermentation wurde 96 Stunden lang bei 28⁰ fortgesetzt. In der folgenden Tabelle sind die nach verschiedenen Zeiten erhaltenen Cycloserinmengen angegeben.

Tabelle III

Stunden Einheiten/ccm

30

42
66
90
96

2,0
2,8
5,8
5,4
5,4

Das erzeugte Cycloserin kann aus dem Nährmedium gewonnen werden, wobei man sich der chemischen Eigenschaften dieser Substanz bedient. Bevorzugt wird im allgemeinen die Adsorption des Antibiotikums aus dem Nährmedium an einem stark basischen Anionenaustauscher in der OH-Form. Das Cycloserin wird dann aus dem Anionenaustauschharz durch ein anderes Anion verdrängt, mit Tierkohle entfärbt, worauf das Antibiotikum aus dem Eluat als kristallines Silberderivat mit Hilfe eines löslichen Silbersalzes ausgefällt wird. Dieses Silberderivat des Cycloserine wird dann mit Wasser vermischt und mit einer sauren Substanz versetzt, die mit Hilfe ihres Anions ein unlösliches Salz zu bilden vermag, wodurch das Silber ausfällt und das Antibiotikum in der Lösung verbleibt. Wenn man diese Lösung durch Gefrieren im Vakuum trocknet, erhält man den Stoff in fester amorpher Form. Oder aber man gibt ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, in welchem Cycloserin unlöslich oder nur wenig löslich ist, zu der Lösung, um es in kristalliner Form auszufällen. Wenn man als mischbares Lösungsmittel Aceton verwendet, kann das Filtrat nach Abscheidung des kristallinen Stoffes mehrere Stunden lang stehengelassen werden, worauf bei der Konzentrierung im Vakuum ein kristallines Acetonderivat von Cycloserin aus der Lösung ausfällt.

Das folgende Beispiel erläutert die Gewinnung von Cycloserin aus einem Nährmedium, in welchem es erzeugt wurde.

Beispiel II

288 1 Nährmedium, in welchem das Antibiotikum erzeugt worden war und das 4,8 Einheiten je ecm enthielt, wurden filtriert und durch 10 1 eines stark basischen Anionenaustauschharzes in der OH-Form in einer 15-cm-Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 1200 ecm je Minute gegeben. Die Säule wurde dann mit Wasser gewaschen und das Cycloserin aus dem Harz mit 0,2 η-Schwefelsäure bei einer Geschwindigkeit von 1200 ecm je Minute eluiert. Das Eluat wurde in 18 Zweiliterfraktionen aufgefangen. Das p_H dieser wurde auf 7 eingestellt. Sie wurden dann mit 1 Gewichtsprozent Entfärbungskohle vermischt und filtriert. Zu dem entfärbten Eluat wurden 0,5 mg Silbernitrat je Einheit des in dem Eluat enthaltenen Antibiotikums gegeben, wobei das p_H mit Natriumhydroxyd auf 6,5 gehalten wurde. Der aus dem Eluat ausfallende Niederschlag des kristallinen Silberderivats von Cycloserin wurde filtriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die folgende Tabelle enthält die Ergebnisse, die bei neun der Eluatfraktionen erhalten wurden.

TabeUe IV

Eluat	Eluat- volumen	Einheiten	Mit Tierkohle behandeltes Filtratvolum en	Einheiten	AgNO₃	Produkt	Einheiten
Nr.	in ecm	je ecm	in ecm	je ecm	in g	in g	in mg
IO	2260	15	2400	12	22,6	12,8	1,92
II	2280	27	—	21	24,0	24,4	1,23
12	2180	54	2340	31	35,o	33,9	I,8o
13	2020	i-7	2120	—	43,4	29,7	2,12
14	2220	55	24OO		53,3	38,2	2,5
IS	2160	32	2465	28	36,7	29,4	2,4
l6	2130	25	237O	20	28,8	24,4	2,0
17	2050	*7	222O	13	22,6	21,8	I,l8
l8	i960	II'	2100	8	12,7	10,4	O

10 g des kristallinen Silberderivats aus dem Eluat 14 der Tabelle IV wurden mit 60 ecm Wasser vermischt, worauf 89 ecm 0,5165 n-H Cl zugegeben wurden. Das ausfallende Silberchlorid wurde abfiltriert. Die restliche Lösung wurde in der Kälte im Vakuum getrocknet

und ergab 4,4 g des festen, amorphen Cycloserine mit 5,15 Einheiten/mg.

ι g des amorphen Stoffes wurde in 7,5 ecm Wasser gelöst und diese Lösung mit 5 ecm Aceton versetzt. Aus der Lösung fiel kristallines Cycloserin aus. Da-

nach wurden nochmals zwecks vollständiger Kristallisation 5 ecm Aceton dazugegeben. Die Kristalle wurden aus der Lösung abfiltriert und mit Aceton gewaschen. Erhalten wurden 0,6177 S ^von ³^ der Luft getrockneten Kristallen mit 4,32 Einheiten/mgund 14 % Feuchtigkeitsgehalt. Nach Entfernung der Feuchtigkeit durch Trocknen besaß das Material 5,02 Einheiten/mg. Das nach Abscheidung des kristallinen Cycloserine verbleibende Filtrat wurde über Nacht stehengelassen und dann im Vakuum konzentriert. Dabei fielen 5 ecm eines kristallinen Acetonderivats aus der Lösung aus. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet·. Erhalten wurden 0,1468 g Substanz, die aber nicht biologisch aktiv waren.

Der Mikroorganismus, aus dem das Antibiotikum hergestellt wird und der hier als »Streptomyces sp. JN-2idr bezeichnet ist, hat den Namen »Streptomyces orchidaceus« erhalten.

Die Erfindung wird durch die obige Beschreibung in keiner Weise begrenzt. ao

Claims

PATENTANSPRUCH:

Die Verwendung von Streptomyces orchidaceus zur Herstellung des Antibiotikums Cycloserin, wo- as bei die Züchtung des.Mikroorganismus unter submersen Bedingungen in einem wäßrigen, CaCO₃ enthaltenden Nährmedium bei 20 bis 30⁰ erfolgt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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